TripleTOF® LC/MS/MS System シリーズ

SWATH™ を用いた測定・解析方法

Analyst® TF Software / PeakView® Software /

MasterView Software

株式会社 エービー・サイエックス

アプリケーションサポート

2017 年 05 月版 rev2

1

本マニュアルについて 本マニュアルは、SWATH™ を用いた測定、解析を行うための補足マニュアルと Tips に

なります。TripleTOF® LC/MS/MS System、Analyst® TF ソフトウェアを用いた測定、お

よび、PeakView®ソフトウェア、MasterViewTM ソフトウェアを用いた解析についての基

本操作を習得された方を対象としています。基本操作につきましては、TripleTOF® LC/MS/MS System 取扱説明書を参照ください。

TripleTOF® LC/MS/MS System / Analyst® TF / PeakView® / MasterViewTMソフ

トウェアについて 研究用にのみ使用できます。診断目的およびその手続き上での使用は出来ません。 本文書は、SCIEX 製装置を購入した顧客が、本 SCIEX 製装置を操作するときに活用する

ものとして提供されています。本文書は著作権で保護されており、本文書の一部または

全部を複製することは、SCIEX が書面で許可する場合を除き、厳しく禁止されています。 本文書に記載の装置は、米国、カナダおよびその他の国で申請された単数または複数の

特許のもとに保護されています。さらなる特許が出願中です。 本文書に記載のソフトウェアは、ライセンス契約のもとに提供されます。ライセンス契

約で特別に許可される場合を除き、ソフトウェアの複製、変更または配布は、いかなる

媒体においても法律に違反します。さらに、ライセンス契約では、ソフトウェアの逆ア

センブル、リバースエンジニアリング、逆コンパイルを、いかなる目的においても禁止

します。

2

目次 1 Fixed Window の SWATH™ 測定 Method の作成 ..................................................... 3

ワ-クフロー .............................................................................................................. 3 Method 作成の準備、Peak 幅の確認（Option） ................................................... 3 SWATH™ Method の作成 ....................................................................................... 4 SWATH™ Method を用いた測定（Training では行いません。） .......................... 6

2 Variable Window を用いた SWATH™ 測定 Method の作成 ..................................... 7 ワ-クフロー .............................................................................................................. 7 Method 作成の準備-1、Peak 幅の確認（Option） ................................................ 7 Method 作成の準備-2、Text Data の作成 .............................................................. 8 Method 作成の準備-3、Variable Window の List File の作成 .............................. 8 SWATH™ Method の作成 ..................................................................................... 10 SWATH™ Method を用いた測定（Training では行いません。） ........................ 12

3 PeakView® Software を使用した Manual 解析-1 溶出時間からの解析 ............... 13 4 PeakView® Software を使用した Manual 解析-2 目的の m/z からの解析........... 15 5 MasterView® Software を使用した LibrarySearch の解析の Tips ......................... 17

Fixed Window Variable Window

3

測定-1: Fixed Window の SWATH™ 測定 Method の作成

1 Fixed Window の SWATH™ 測定 Method の作成 ワ-クフロー

必要に応じ、以前同じ LC 条件で測定した Data がある場合、適当な Peak の

Peak 幅を確認します。

TOFMS あるいは IDA の Method を開く、あるいは作成します。

SWATH™の Method に編集します。

Method 作成の準備、Peak 幅の確認（Option）

PeakViewで以前同じ LC 条件で測定した適当な Data を開き、適当な Peak の

XIC を表示します（Training では、Training の Project 内の IDA の Data を開き、

右のように m/z 609.3 の XIC を表示してください。）

Peak 幅を確認しま

す。（例では約 0.1分になります。）

Tips: Peak 幅、Data Point 数の確認方法

PeakViewでは Graph Selection Windowから、各 Peak の詳細な情

報を確認することができます。

￭ Tool bar の Windowから Graph Selection Windowを開きます。

￭ Window 内の〇のアイコンを

2 回クリックすることで、XIC上に Data 取得ポイントが表示

されます。

￭ 目的の Peak を選択することで、

Graph Selection Window内に

Peak 幅などの詳細な情報が表

示されます。

4

SWATH™ Method の作成

TOFMS あるいは IDA の Method を開きます。（Training では Training の Project内の IDA の Method を開きます。）

File / Save as…から別名で保存します。（Training では SWATH で保存してくださ

い。）

Create SWATHTM Exp をクリックし、画面を開きます。

Manual Tab で Fragment Conditions に目的の CE、CES、Start mass, Stop mass に取

得する MS/MS のレンジを入力し、High Resolution/Sensitivity を選択します。

（Training では以下に設定してください。）

Tips: 弊社で提供しているライブラリの CE と CES について

￭ Metabolite Library は+/-35V, CES20V、その他のライブラリは+/-35V, CES15V を主

に使用しています。

①

③

②

④

MS/MS のマスレンジ

20

5

Total Cycle Time が適切になるよう、Start Mass, Stop Mass, SWATH Width, Accumulation Time を設定します。（Training では以下に設定してください。）

OKをクリックすると、This Method…の Message が表示されます。OKで終了す

ることで Method が作成されます。

Tips: Total Cycle Time について

￭ Start Mass, Stop Mass, SWATH Width, Accumulation Time から自動計算されます。

￭ 2 で確認した Peak 幅内で取得できる Data Point 数を考慮して、Start Mass, Stop Mass, SWATH Width, Accumulation Time の設定を行います。

￭ 定量を行う場合は特に Point 数に注意してください。

注意） CES を使用する場合：

Accumulation Time の

推奨は 25msec 以上

MS/MS の測定時間

自動計算

自動計算

Precursor Ion のマスレンジ

Swath の幅

20

6

必要に応じて、TOF MS の積算時間を変更します。（SWATH™ の Method を作成

した場合、自動で 0.05sec に変更されます。上図では 0.1sec に変更しています。）

File から Save で保存します。

SWATH™ Method を用いた測定（Training では行いません。）

Batch を作成、Method に SWATH を選択し、測定を行います。

⑦

作成された

Method ⑧

7

測定-2: Variable Window を用いた

SWATH™ 測定 Method の作成

※ Variable Window の使用には、同サンプル (ない場合は類似サンプル) の TOFMS の

取得済みの Data（推奨は同じ LC 条件の Data）が必要になります。

※ SWATH Variable Calculator が必要になります。使用される方は以下から Downloadください。

http://sciex.com/software-downloads?d=SWATH_Variable_Window_Calculator_V1.0.zip&asset=software&bh=buyingHorizon&bhs=buyingHorizonService&bhcega=buyingHorizonCEGA&bhlc=buyingHorizonLC

2 Variable Window を用いた SWATH™ 測定 Method の作成 ワ-クフロー

必要に応じ、以前同じ LC 条件で測定した Data がある場合、適当な Peak の

Peak 幅を確認します。

同サンプル (ない場合は類似サンプル) の取得済みの Data の TOFMS で目的の全

溶出時間のイオンの平均を表示、m/z と平均強度の Text File を作成します。

SWATH Variable Calculator に作成したリストをペーストし、Calculator で SWATH Window を計算、SWATH Windowの List File を作成します。

作成した Windowの File を Create SWATHTM Experiment で Import します。

Method 作成の準備-1、Peak 幅の確認（Option）

3 ページを参考に確認してください。

MS の平均

Valuable Window

②

③

③

④

8

Method 作成の準備-2、Text Data の作成

同サンプル (ない場合は類似サンプ

ル) の目的の全溶出時間のイオンの

TOFMS の平均を表示します。（右

の例では RT0.2-4.6 分を前後を

Background として差し引いて表示

しています。）

スペクトル上をクリックし、Tool Bar の Showから Data and Peaks Table を選択し、Data を表示します。

Data 上で右クリック、Export Data as Text…を選択します。

Add zero…の Windowが立ち上がり

ますので、No を選択後、適当な名

前で Data を保存します。（Trainingでは TextData というファイル名で

DeskTop に保存してください。）

Method 作成の準備-3、Variable Window の List File の作成

前述で作成した

Data の Text File をExel で開きます。

SWATH Variable Window Calculatorを開き、INPUT…の tab に、TextDataの 2 列をコピーし

ます。

②

①

③

9

SWATH Variable Window Calculator の Instruction and Control Tab で SWATH の条

件を入力します（Training では以下で入力してください。）

キーボードの F9 を打つことで計算が始まります。画面右下に Calculating と%が

表示されますので、終了まで待ちます。

注意）操作することで、計算が停止しますので、計算終了まで、操作は何も行わ

ないでください。

終了後、OUTPUT for Analyst の Tab を開き、作

成された Window (A～C列)を Copyし、新しく立

ち上げた Excel File（右で

は Book3）に数字として

Paste します。

注意）通常の Paste は推

奨しません。

Paste した File を適当な名前で Text (Tab delimited)形式で保存します。（Trianingでは SWATH_Variable_Windowで保存してください。）

Window 数

Precursor Ion の マスレンジ

Window の刻み幅

Window の重なり

最小 Window 幅

CES

③

10

Tips: SWATH Variable Calculator について

￭ Visualization of Var Win Assayの Tab でスペクトルの Data密度と、計算された Window 幅

のグラフを見ることができま

す。

SWATH™ Method の作成

TOFMS あるいは IDA の Method を開きます。（Training では Training の Project内の IDA の Method を開きます。）

File / Save as…から別名で保存します。（Training では SWATH_Var で保存してく

ださい。）

Create SWATHTM Exp をクリックし、画面を開きます。

Manual Tab で Read SWATH Windows from Text File にチェックをかけ、前項で作

成した Variable Window の List File（Training では SWATH_Variable_Window.txt）を開きます。

①

③

②

11

Manual Tab で Fragment Conditions に目的の CE、SWATH Detection Parameters のStart mass, Stop mass に取得する MS/MS のレンジを入力し、High Resolution/Sensitivity を選択します。（Training では上記に設定してください。）

※ 他の部分は自動設定あるいは、Text File の数値が読み込まれ、グレーアウトされま

す。

OKをクリックすると、This Method…の Message が表示されます。OKで終了す

ることで Method が作成されます。

20

④

自動計算

自動設定

⑤

⑤

12

TOF MS の測定範囲を確認、修正します。（SWATH の範囲と異なっても問題あ

りません。）

必要に応じて、TOF MS の積算時間を変更します。（SWATH™ の Method を作成

した場合、自動で 0.05sec に変更されます。）

File から Save で保存します。

SWATH™ Method を用いた測定（Training では行いません。）

Batch を作成、Method に SWATH を選択し、測定を行います。

複数 Method を使用する場合は、Use Maltiple Method にチェックをかけ、

Acquision Method のカラムで目的の Method を選択してください。

⑧

作成された

Method ⑨

⑦

13

RT3.5 分のスペクトル

の重ね書き

②

TIC の足し合わせの拡大

TIC の足し合わせ ①

②

RT3.5 分のスペクトル

の重ね書き(複製)

③

⑥ ④ RT3.5 分の MS RT3.5 分の

m/z 379-430 の

MS/MS

解析-1：PeakView® Software を使用

した Manual 解析 3 PeakView® Software を使用した Manual 解析-1 溶出時間からの解析 Training では、Training の Project 内の 12_SWATH/116_BH_4h_SWATH_50Da25ms の Data を使用し、RT3.5 分付近の解析を行います。

PeakViewから Data を開きます。（Training では、Training の Project 内の

12_SWATH / BH SWATH_50 の

Da25msecwCES の Data を開いて

ください。）

目的（3.5 分）付近を解析し、ス

ペクトルを表示します。

スペクトル上で、Tool Bar のGraph から Duplicate Graph を選

択し、スペクトルを複製します。

②の重ね書きのタイトル上で

Experiment-1（1 番上）を選択し、

Remove All Traces…で他を消去し、

MS を表示します。

④で得られたスペクトル中、興味

のある Peak (Training では m/z 424)を選択して W クリックし

XIC を表示します（次頁）。

③上で⑤で選択した m/z が含まれ

るタイトル（Training では

Experiment-8）を選択後、Remove All Traces… で他を消去し、目的

のイオンが含まれる MS/MS を表

示します。

14

Tips: Fragment の確認について

￭ SWATH では複数の Precursor Ion か

らの Product Ion がスペクトル内に

混在する可能性があります。この

ため、選択した Precursor Ion、得ら

れた Product Ion の XIC を作成し、

RT、Peak 形状などを確認されるこ

とを推奨します。

￭ MasterViewTM, MetabolitePilot 2.0alpha software では、自動で XICを作成、MS/MS の再構築を行いま

す。

RT3.5 分の MS

RT3.5 分

の m/z 379-430

の MS/MS

m/z 424 の XIC

Product Ion の

XIC の重ね書き

⑤

15

4 PeakView® Software を使用した Manual 解析-2 目的の m/z からの解析 Training では行いません。

以降の例は Project 内の 12_SWATH/116_BH_4h_SWATH_50Da25ms の Data を使用し、

Bromhexine (MF: C14H20Br2N2, m/z: 375.00660)の解析を行った例になります。

Peak Viewから Data を開きます。

（Training では、Training の

Project内の 12_SWATH / BH SWATH_50 の Da25msecwCES の

Data を開いてください。）

TIC の下の のアイコンを

クリックし、各 Experiment の TICの重ね書きを表示します。

TIC の重ね書き上で Experiment-1（TOF MS、1 番上）を選択しま

す。

Tool Bar の Showから XIC を選択

し、目的成分の XIC を表示させま

す。 (Training では以下を入力し、

OKしてください。)

TIC の重ね書き上で目的の

Precursor Ion が含まれる MS/MSの Experiment (Training では

Experiment7) を選択し、Remove All Traces…で他を消去します。

&のアイコンを使用し、④の上に

⑤を重ねます。

④

②

TIC の足し合わせ

各 Experiment のTIC の重ね書き

③

④

⑤

Precursor Ion の

XIC

m/z 329-380 の

MS/MS の TIC

⑥④、⑤の重ね書き

16

⑥を拡大し、目的 Peak 付近のスペ

クトルを表示します。

必要に応じて、Tool bar の Graph か

ら Split Trace…を選択し、スペクト

ルを分割します。

⑦

⑦

④、⑤の重ね書きの拡大

RT4.4 分付近の MS、MS/MS の重ね書き

⑧

⑧

RT4.4 分

付近の MS

RT4.4 分付近

の MS/MS

17

解析-2：MasterView® Software 使用

時の Tips 5 MasterView® Software を使用した Library Search の解析の Tips SWATH™の Data では、Product Ion Spectrum は複数の Precursor Ion から得られた

Product Ion の混合 Spectrum になります。MasterView®では、Spectrum の構築が自動

で行われますが、完全な処理ができない場合があることから、解析の設定に際し、以下の

□内を適時変更することを推奨します。Parameter の詳細につきましては、TripleTOF® LC/MS/MS System 取扱説明書を参照ください。

推奨は Fit になります。

通常より小さい値に

設定する必要がある

場合があります。

18

◆製品サポートのご案内◆

株式会社エービー・サイエックス / アプリケーションサポート部まで、

ご使用の装置名（TripleTOF® System）に関する問い合わせとお伝えください｡

（Tel）0120-318-551（Fax）0120-318-040

（E-mail) jp_support@sciex.com

◆オンライントレーニング動画のご案内◆

下記サイトから、メンテナンス、ソフトウェアの使用法など、各種トレーニング

動画を視聴できます。是非ご活用ください。

http://training.sciex.com/Welcome.aspx

研究用にのみ使用できます。診断目的およびその手続き上での使用は出来ません。

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さい。

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