CÔNG NGHỆ VẬT LIỆU TRONG Y SINH HỌCThS. Trần Lê Bảo Hà

I. VẬT LIỆU SINH HỌC1. Khái niệm

Một vật liệu sinh học là bất kỳ chất hoặc hợp chất nào (không phải là thuốc) có nguồn gốc tổng hợp hoặc tự nhiên, được dùng để điều trị, tăng cường hoặc thay thế mô, cơ quan hoặc chức năng của cơ thể (NIH)

Vật liệu sinh học là các vật liệu (tổng hợp và tự nhiên, rắn và lỏng) được sử dụng trong các thiết bị y học (medical device) hoặc trong tiếp xúc với hệ sinh học (University of Washington Engineered Biomaterials).

Mặc dù các vật liệu sinh học chủ yếu được ứng dụng trong y học nhưng chúng cũng được sử dụng trong nuôi cấy tế bào, xử lý các phân tử sinh học trong công nghệ sinh học, thủy sản, nông nghiệp…

2. Phân loạiVật liệu sinh học được phân thành: vật liệu sinh học có nguồn gốc sinh học và vật liệu sinh học tổng hợp.

- Vật liệu sinh học có nguồn gốc sinh học: vật liệu mô mềm và mô cứng

- Vật liệu sinh học tổng hợp: kim loại, polymer, gốm, composit

2.1. Sự khác biệt giữa vật liệu sinh học có nguồn gốc sinh học và vật liệu sinh học tổng hợp

Vật liệu sinh học có nguồn gốc sinh học và vật liệu sinh học tổng hợp có các đặc tính khác nhau đáng kể. Ví dụ, mô gồm nhiều tế bào; kim loại, gốm, polymer thì không có tế bào. Mô có khả năng tự sửa chữa một phần hoặc toàn bộ; kim loại, gốm, polymer thì không…

Vật liệu sinh học có nguồn gốc sinh học Vật liệu sinh học tổng hợp

Có tế bào

Có nước

Không đẳng hướng

Không đồng nhất

Viscoelastic

Có khả năng tự sửa chữa/sống

Không có tế bào

Khan

Đẳng hướng

Đồng nhất

Mềm dẻo, đàn hồi

Không sống

1

Ví dụ về sự khác nhau giữa mô và vật thay thế mô: thành mạch máu. Lót trong lòng mạch máu là các tế bào nội mô. Các thành phần cấu trúc chính dưới nội mô gồm các tế bào cơ trơn, collagen và elastin. Số lượng các thành phần này và hướng của các sợi phụ thuộc vào vị trí trong mô mạch, loại mạch (động mạch, tĩnh mạch) và kích thước của mạch máu. Để thay thế mô phức tạp này, các ống polymer polytetrafluoroethylene hoặc poly(ethylene terephthalate) thường được sử dụng làm vật ghép tổng hợp.

Các loại mô và một số vật liệu sinh học được sử dụng để thay thế

Mô Vật liệu tổng hợp thay thế

Mạch máu

Kính sát tròng

Hông

Răng

Polytetrafluoroethylene

Poly(ethylene terephthalate)

Polymethylmethacrylate

Ti-6Al-4V

Co-Cr-Mo

Amalgam

Ti

2.2. Phân loại vật liệu sinh học

I. Vật liệu sinh học có nguồn gốc sinh học

II. Vật liệu sinh học tổng hợp

1. Mô mềm

Da, gân, màng ngoài tim, giác mạc

1. Polymer

Ultra High Molecular Weight Polyethylene

( UHM WPE), Polymethylmethacarylate

(PMMA), Polyethyletherketone (PEEK),

Silicone, Polyurethane (PU),

Polytetrafluoroethylene (PTFE)

2. Mô cứng

Xương, răng

2. Kim loại

Thép không gỉ, hợp kim Cobalt (Co-Cr-Mo), hợp kim Titan (Ti-Al-V),vàng, bạch kim

2

3. Gốm

Alumina (A 1203), Zirconia (Zr02), Carbon,

Hydroxylapatite [CalO( PO&( OH)z],

Tricalcium Phosphate [Caj(PO4)2],

Bioglass [Na20( CaO)(P203)(Si02)],

Calcium Aluminate [Ca(A1204)]

4. Composit

Carbon Fiber (CF)/PEEK, CF/UHMWPE,

CF/PMMA , Zircon idSil icdB IS –GMA

3. Yêu cầuCác vật liệu sinh học phải có các đặc tính đặc biệt như: tính tương hợp sinh

học, không sinh khối u, kháng xói mòn, có độc tính thấp. Tuy nhiên, tùy thuộc vào ứng dụng, các vật liệu cần đạt các yêu cầu khác nhau. Đôi khi, các yêu cầu này ngược nhau hoàn toàn. Ví dụ: trong công nghệ mô xương, khung (scaffold) polymer cần có khả năng phân hủy sinh học để khi các tế bào tạo ra chất nền ngoại bào của riêng chúng thì vật liệu polymer sẽ được thay thế hoàn toàn. Trong van tim cơ học, các vật liệu cần có tính ổn định sinh học, kháng xói mòn và không phân hủy theo thời gian (tồn tại hơn 20 năm).

Nói chung, các yêu cầu của vật liệu sinh học có thể được phân thành 4 nhóm:

1) Tính tương hợp sinh học: vật liệu phải không gây phản ứng không tốt của vật chủ nhưng kích thích sự hòa hợp mô - vật ghép tốt. Sự xuất hiện phản ứng viêm là điều cần thiết trong tiến trình lành hóa vết thương. Tuy nhiên, sự viêm kéo dài có thể chỉ ra sự hoại tử mô hoặc không có tính tương hợp.

2) Có thể khử trùng: vật liệu có thể chịu được sự khử trùng. Các kỹ thuật khử trùng gồm: tia gamma, khí (ethylene oxid) và hấp hơi nước. Một số polymer như polyacetal sẽ khử polymer hóa và sinh ra khí độc formaldehyd khi được chiếu dưới tia gamma năng lượng cao. Do đó, cách tốt nhất để khử trùng các polymer này là khí ethylene oxid.

3) Có tính chức năng: Tính có chức năng của một bộ phận giả tùy thuộc vào khả năng tạo được hình dáng phù hợp với một chức năng đặc biệt. Do đó, vật liệu phải được tạo hình dáng bằng các quy trình chế tạo công nghệ. Sự thành công của stent động mạch vành (loại vật liệu y học được sử dụng rộng rãi nhất) được cho là nhờ quy trình chế tạo hiệu quả thép từ việc xử lý nhiệt để tăng độ bền của nó.

3

4) Có thể chế tạo: Nhiều vật liệu có tính tương hợp sinh học nhưng trong khâu cuối cùng (khâu chế tạo thành công cụ) không thực hiện được.

II. TÍNH TƯƠNG HỢP SINH HỌC CỦA VẬT LIỆU II.1. TỔNG QUÁT VỀ ĐÁP ỨNG MIỄN DỊCH ĐẶC HIỆU (THE SPECIFIC IMMUNE RESPONSE)

Đáp ứng miễn dịch đặc hiệu là phản ứng bình thường của động vật có xương sống khi một vật lạ được đưa vào cơ thể. Đây là một phản ứng bảo vệ để giải độc, trung hòa và giúp loại trừ vật lạ.

Tuy nhiên, trong một số trường hợp, các phản ứng với những vật không độc có thể gây hại cho cơ thể chủ như các phản ứng dị ứng hoặc quá mẫn.

Các đáp ứng được phân thành bốn loại: loại I, loại II, loại III, loại IV. Bốn đáp ứng này theo một cơ chế thông thường, được kích động do sự hiện diện của một vật lạ là kháng nguyên (antigen). Các tế bào trình diện kháng nguyên (antigen processing cell - APC), thường là tế bào đơn nhân (monocyte) hoặc đại thực bào (macrophage) hay tế bào bạch tuộc (dendritic) da, bắt kháng nguyên, xử lý nó (cắt bằng enzym) và chuyển nó (trình diện) đến tế bào khác là tế bào lympho T hỗ trợ (T helper cell - Th). Sau đó, tế bào Th trình diện kháng nguyên đã được xử lý cho một tế bào lympho T khác là tế bào T độc (T cytotoxic cell - Tc ) hoặc cho tế bào lympho B (tế bào B). Tế bào nhận (tế bào T hoặc B) bắt đầu một đáp ứng tác động kháng nguyên đã được xử lý, tạo một phức hợp hoạt động. Trong trường hợp tế bào nhận là tế bào T thì đáp ứng miễn dịch là loại IV hay miễn dịch qua trung gian tế bào. Trường hợp tế bào nhận là tế bào B, kết quả cuối cùng là giải phóng kháng thể tự do, dẫn đến đáp ứng loại I, II, III thuộc thể dịch. Trong đáp ứng tế bào T, các tế bào T sẽ tập trung ở vùng hiện diện vật lạ. Trong khi các tế bào B vẫn ở xa (trong các mô bạch huyết), các kháng thể lưu thông và xuất hiện tại vùng có vật lạ.

Các đặc điểm chính của bốn loại đáp ứng:

Loại Kháng thể

Các tế bào liên quan

Các chất trung gian

Kết quả

I IgE Tế bào B Histamin, các amin vận mạch

Ngứa, viêm mũi, giãn mạch

II IgG, IgM Tế bào B Histamin, các amin vận mạch

Giãn mạch

III IgG, IgM Tế bào B Các amin vận mạch

Đau, sưng, nghẽn mạch, giãn mạch

IV Không có Tế bào T Cytokin Đau, sưng

4

Tế bào T và tế bào B tăng sinh từ một tế bào gốc và trải qua quá trình xử lý trong tuyến ức để trở thành các tế bào T hoặc trong một vùng chưa biết (có lẽ là tủy xương) để trở thành các tế bào B. Rất khó phân biệt hai loại tế bào này. Có thể nhận diện các tế bào T thông qua các marker duy nhất trên bề mặt tế bào nhờ sử dụng các kháng thể đơn dòng. Các kháng nguyên này là các dấu ấn cụm biệt hóa (cluster differentiation markers - CDs). Có nhiều loại CD và tầm quan trọng của mỗi loại đang được đánh giá. Tuy nhiên, tất cả tế bào T đều biểu hiện CD3 và được xem là dấu ấn tế bào T Pan (Pan = all - tất cả). CD2 cũng có thể là một dấu ấn tế bào T Pan. Ngoài ra, tế bào Th còn biểu hiện CD4, trong khi tế bào Tc biểu hiện CD8.

Tế bào B có một ít kháng thể trên bề mặt và có thể nhận diện tế bào B dựa vào các kháng thể này. Đáp ứng tế bào B dẫn đến biệt hóa thành tương bào sản xuất nhiều kháng thể hơn. Kháng thể là một globulin miễn dịch (Immunoglobulin - Ig) có các vùng kết hợp đặc hiệu với kháng nguyên. Kháng thể có thể hòa tan, tuần hoàn trong huyết tương.

Có 5 lớp Ig. Nồng độ Ig trong máu người bình thường từ cao nhất đến thấp nhất là IgG, IgM, IgA, IgE, IgD. IgE là kháng thể có liên quan đến đáp ứng loại I. IgA là một Ig tiết, có nồng độ cao trong nước bọt, dạ dày-ruột, sữa và các cơ quan liên quan. IgG và IgM có nồng độ cao trong máu và là các kháng thể “xuất sắc” cho thử nghiệm miễn dịch học vì chúng có thể tham gia đáp ứng loại II và loại III.

Kết quả của đáp ứng loại I và loại II là giống nhau nhưng cơ chế khác nhau. Đáp ứng loại I được biết rõ nhất là sốt và dị ứng bụi và là đáp ứng miễn dịch với các kháng nguyên qua trung gian kháng thể cố định trên da (IgE). Đáp ứng loại II liên quan đến phản ứng của IgG (hiếm khi IgM) với một kháng nguyên bề mặt tế bào. Kết quả là ly giải tế bào cùng với giải phóng các sản phẩm. Điều này thường thấy trong dị ứng thuốc mà gắn với tiểu cầu máu.

Đáp ứng loại III được xem là các phản ứng phức hợp miễn dịch và xảy ra khi cả kháng nguyên và kháng thể hiện diện cùng một lúc với số lượng lớn. Trong đáp ứng miễn dịch bình thường, kháng nguyên được xử lý, đáp ứng miễn dịch bắt đầu và kháng nguyên nhanh chóng biến mất. Tuy nhiên, nếu kháng nguyên bền thì số lượng rất lớn các phức hợp miễn dịch có thể được tạo ra làm tắc nghẽn các mạch máu nhỏ và kết quả là hư hỏng mô hoặc cơ quan.

Đáp ứng loại IV liên quan đến sự hiện diện thường xuyên của vật ngoại lai, như là một vật liệu sinh học ghép. Điển hình là chứng viêm da tiếp xúc do cây thường xuân (ivy) độc.

Trong mỗi trường hợp, một kháng nguyên kích thích đáp ứng miễn dịch và đáp ứng miễn dịch trở lại phản ứng đặc hiệu với kháng nguyên. Mỗi tế bào T, mỗi tế bào B và mỗi kháng thể lưu thông chỉ nhận biết một kháng nguyên. Để một chất là sinh kháng nguyên, nó phải lạ với cơ thể chủ, trọng lượng phân tử cao (> 3000),

5

và có thể được xử lý bởi một APC. Tuy nhiên, một số chất nhỏ cũng có thể trở thành sinh kháng nguyên nhờ gắn với các phân tử vật mang lớn hơn, thường là các protein, trong cơ thể chủ. Một chất nhỏ như vậy được gọi là hapten và đáp ứng miễn dịch xảy ra với phức hợp vật mang – hapten.

II.2. PHÁT HIỆN ĐÁP ỨNG MIỄN DỊCH ĐẶC HIỆUII.2.1. Phát hiện kháng thể

Để đánh giá một bệnh nhân có sản xuất kháng thể chống lại một vật lạ (như vật ghép) hay không, bệnh nhân cần được lấy và kiểm tra mẫu máu, sau đó kết quả được so sánh với nhóm đối chứng. Chọn lựa đối chứng thích hợp là một vấn đề lớn. Quy trình kiểm tra yêu cầu một đối chứng dương đã biết (thường khó để đạt được một đánh giá đáp ứng với vật ghép), và một đối chứng âm đã biết (thường là nước muối, môi trường nuôi cấy mô hoặc huyết thanh bò, ngựa dùng trong nuôi cấy mô). Các mẫu đối chứng cho bệnh nhân được thu nhận từ các cá thể bình thường không ghép và không bệnh, các cá thể bị bệnh (ví dụ viêm khớp) nhưng không ghép (ví dụ thay thế khớp toàn bộ), các cá thể ghép và không có trục trặc, các cá thể đã được chẩn đoán ghép thất bại. Các kết quả cần được phân tích để chắc chắn liệu kháng thể có tăng ở bệnh nhân hay không và liệu sự hiện diện của kháng thể có liên quan đến sự thất bại vật ghép hay không.

Thử nghiệm phổ biến nhất dựa trên sự cố định kháng nguyên vào một bề mặt rắn như là polystyren. Quy trình chung được chỉ ra trong Hình 1

Phát hiện kháng thể gắn bằng cách sử dụng enzym (thử nghiệm EIA hoặc ELISA) hay một kháng thể đánh dấu đồng vị phóng xạ (RIA).

II.2.2. Phát hiện đáp ứng qua trung gian tế bào (loại IV)Phương pháp phát hiện các đáp ứng qua trung gian tế bào phức tạp và khó

khăn hơn nhiều so với phát hiện kháng thể. Phần lớn các xét nghiệm cần sử dụng

6

Hình 1: Thử nghiệm miễn dịch chuẩn. Một kháng nguyên được cố định với một giá thể rắn và gắn với một kháng thể đặc hiệu trong dung dịch. Kháng thể gắn kết được phát hiện nhờ gắn với một kháng thể thứ cấp được đánh dấu (enzym, đồng vị…)

tế bào sống nên phải thực hiện nhanh sau khi thu tế bào. Các đối chứng có thể thực hiện tại thời điểm khác.

Hai phương pháp thử nghiệm in vitro được sử dụng thông thường nhất là thử nghiệm ức chế sự di cư và tăng sinh tế bào lympho. Cơ sở lý thuyết của cả hai phương pháp này là trên bề mặt các tế bào T có các thụ quan (receptor), mỗi thụ quan đáp ứng với một kháng nguyên đặc hiệu. Trong quá trình đáp ứng, các chất có thể hòa tan (các cytokin hoặc lymphokin) được sản xuất và được phóng thích. Các chất này, chủ yếu là yếu tố tạo phôi (blastogenic factor) và yếu tố ức chế sự di cư, hoạt động trên các tế bào khác kể cả các tế bào T khác.

Yếu tố tạo phôi (Lymphocyte transformation factor - Yếu tố chuyển dạng tế bào lympho):

Yếu tố này làm các tế bào lympho khác chuyển dạng và phân chia. Số lượng tế bào tăng lên. Nếu bổ sung thymidin H3 vào môi trường nuôi thì các tế bào đang phân chia sẽ hấp thu đồng vị và số đếm tăng lên. Thử nghiệm này, thường được gọi là LTT cho thử nghiệm chuyển dạng tế bào lympho, cần các tế bào sống để sản xuất và đáp ứng với yếu tố. Thử nghiệm này mất 7 ngày (7 ngày là khoảng thời gian bình thường cho một đáp ứng với kháng nguyên). Một số chất kích thích (mitogen) đối chứng như là PHA (phytohemagglutinin) hoạt động trong 4 – 5 ngày.

Yếu tố ức chế sự di cư (Migration inhibition factor - MIF)

Các tế bào T được kích thích sẽ sản xuất MIF. MIF hoạt động trên các tế bào thường di động là dòng tế bào đơn nhân/ đại thực bào và các bạch cầu đa hình nhân polys (polymorphonuclear leukocyte). Do đó, thử nghiệm, thường được gọi là thử nghiệm yếu tố ức chế bạch cầu (leukocyte inhibition factor - LIF), cần các tế bào lympho sống và các tế bào đang di cư sống được thu nhận từ máu toàn phần tươi. Thử nghiệm LIF sẽ có kết quả trong 18 – 24 giờ. Nếu máu không chứa đủ tế bào đơn nhân để đánh giá sự ức chế di cư của chúng thì tế bào chỉ thị này thường được thu nhận từ khoang bụng của những động vật khác như chuột hoặc bọ. Tế bào này có thể kích thích các tế bào lympho người nuôi cấy trong 24 – 48 giờ, sau đó thu nhận dịch nuôi cấy và bổ sung vào các đại thực bào được thu nhận từ động vật. Sự di cư (hoặc sự ức chế di cư) của các tế bào được quan sát bằng cách đặt chúng trong môi trường nuôi mô đã được hóa cứng bằng agarose tinh và quan sát dưới kính hiển vi trong 18 – 24 giờ hoặc đưa vào ống mao quản và quan sát sau vài giờ.

Thử nghiệm trực tiếp lymphokin hoặc cytokin

Vì các thử nghiệm LTT và LIF hoặc MIF có hạn chế là cần sử dụng tế bào sống nên thử nghiệm lý tưởng là dùng lymphokin. Các thử nghiệm dựa trên ELISA hoặc RIA có thể được sử dụng để phát hiện và định lượng cytokin.

Thử nghiệm sự sản xuất cytokin

7

Hiện tại có một thử nghiệm được sử dụng là khảo sát các cytokin được tạo ra để đáp ứng với vật liệu, đặc biệt là các phần tử nhỏ do phân hủy vật liệu. Nhìn chung, thử nghiệm được thực hiện dựa trên ELISA hoặc RIA.

Hình 2: Định lượng kháng nguyên bằng thử nghiệm cạnh tranh. Một kháng nguyên cố định gắn với một kháng thể đặc hiệu trong dung dịch. Tuy nhiên, nhiều kháng nguyên được cho vào dung dịch và lượng kháng thể kết hợp

với kháng nguyên cố định sẽ giảm theo lượng kháng nguyên tự do. Phát hiện kháng thể gắn bằng một kháng thể thứ cấp được đánh dấu (enzym, đồng vị…)

Thử nghiệm in vivo

Thử nghiệm kinh điển cho miễn dịch qua trung gian tế bào (Cell-mediated immunity - CMI) là thử da. Các kháng nguyên được đưa lên da hoặc được tiêm dưới da và quan sát nốt phồng sau 24 – 72 giờ nếu có CMI. Đáp ứng này khác với đáp ứng loại I qua IgE. Đáp ứng loại I xảy ra nhanh (trong vài phút) và thường biến mất sau 24 giờ. CMI bắt đầu sau 24 giờ, có nốt phồng.

Thử da là một quy trình chẩn đoán tuyệt vời cho các bệnh nhân bị nghi ngờ quá mẫn. Tuy nhiên, thử da với các hapten, như các ion kim loại, liên quan đến rủi ro nhạy cảm. Để phát hiện được đáp ứng miễn dịch, hapten phải gắn với các tế bào trung bì hoặc các protein. Tuy nhiên, việc gắn này tạo ra một kháng nguyên hoàn toàn, có thể kích thích một đáp ứng miễn dịch. Vì phải mất nhiều thời gian để đáp ứng miễn dịch này xảy ra nên thử da sẽ âm tính, nhưng các thử nghiệm tiếp theo sau đó sẽ dương tính. Do đó, các thử nghiệm lặp lại có khả năng cảm ứng tính nhạy cảm và nên tránh.

Các kỹ thuật hóa mô

Có nhiều khảo sát để đánh giá các mô được lấy từ những vùng kế cận vật ghép. Có thể sử dụng các kỹ thuật miễn dịch để xác định loại tế bào và các sản phẩm tế bào được tạo ra tại vùng đó. Một kỹ thuật được sử dụng là dùng kháng huyết thanh kháng các dấu ấn CD để phát hiện và phân loại tế bào lympho. Một thử nghiệm tương tự đang được đề xuất để phát hiện các cytokin trong mô.

II.2.3. Phát hiện đáp ứng miễn dịch với haptenHiện tại có một vài kỹ thuật đặc biệt để phát hiện đáp ứng miễn dịch với

hapten. Một phức hợp hapten-vật mang có thể được chuẩn bị in vitro bằng cách kết hợp trong dung dịch với một protein lớn như albumin hoặc một phân tử nhỏ

8

hơn như glutathione. Sau đó, các phức hợp này có thể được sử dụng để phủ một cơ chất rắn. Một phương pháp khác là vật mang protein được phủ lên cơ chất, thêm hapten và thực hiện thử nghiệm.

II.2.4. Đáp ứng miễn dịch của người với các vật liệuII.2.4.1. Nhựa

Vật liệu nhựa được dùng để chế tạo găng, bao cao su… là cao su (elastomer) trích từ thực vật. Dị ứng với nhựa thường là loại I (đáp ứng qua trung gian IgE) với phản ứng tức thì (trong vòng vài phút) có thể đe dọa sự sống. Tuy nhiên, nhựa không được sử dụng để chế tạo vật liệu ghép trong thời gian dài nên các đáp ứng thời gian dài không được chú ý.

II.2.4.2. Collagen

Collagen được thu nhận từ các nguồn vật liệu tự nhiên như da, mô bò… Đây là một protein ngoại lai nên nó có khả năng kích thích nhiều đáp ứng miễn dịch. Các kháng thể của lớp IgE, IgM, IgG và các đáp ứng miễn dịch qua trung gian tế bào đã được quan sát. Phòng ngừa quan trọng là loại bỏ càng nhiều vật liệu ngoại lai càng tốt. Do collagen của các loài động vật có vú có cấu trúc tương tự nên có thể loại bỏ các protein nhiễm và để lại vật liệu không sinh dị ứng. Xử lý hóa học và khâu mạch collagen có thể làm giảm tính sinh kháng nguyên. Các sản phẩm collagen cần được đánh giá cẩn thận về khả năng khởi động các đáp ứng miễn dịch.

II.2.4.3. Các polymer tổng hợp

Các vật liệu này dựa trên nền tảng các thành phần carbon, hydro, nitơ và oxy tạo nên hệ sinh học. Do đó việc tạo ra các vật liệu có tính kháng nguyên là không thể xảy ra. Tuy nhiên, một số vật liệu polymer có nửa hóa học là đáng quan tâm như polysiloxane (silicone elastomer), polyurethane, poly(methyl)methacrylate…

II.3. KẾT QUẢ CỦA MỘT ĐÁP ỨNG MIỄN DỊCHĐáp ứng miễn dịch dường như có khuynh hướng trung hòa, khử độc tính và

giúp loại trừ một vật liệu ngoại lai. Tuy nhiên, thỉnh thoảng đáp ứng miễn dịch có thể gây hại.

II.3.1. Hư hỏng vật ghépSự viêm, phần khởi đầu của đáp ứng miễn dịch, là một phản ứng oxy hóa.

Các vật ghép bằng polyurethane và polyethylene có thể bị phân hủy.

II.3.2. Hư hỏng các mô kế cậnCác sản phẩm, đặc biệt từ các đáp ứng loại II và IV, có thể khởi động sự

phồng và các đáp ứng mạch khác tại vùng ghép. Giải quyết tiếp theo có thể không có hại nữa hoặc là gây hoại tử mô và/hoặc mất sinh khối mô cùng với sự lỏng lẻo và di chuyển của vật ghép.

9

II.3.3. Các đáp ứng hệ thốngCác đáp ứng miễn dịch loại I và loại II sinh ra các chất vận mạch. Các

chất này tuần hoàn và có thể gây giãn mạch. Có thể nhận thấy điều này trong đáp ứng với các vật liệu nhựa và các thuốc kết hợp với tiểu cầu, tế bào mast hoặc các bạch cầu ưa acid, dẫn đến một đáp ứng miễn dịch và giải phóng các chất vận mạch này.

II.3.4. Các bệnh tự miễnĐây là một kết quả gây tranh cãi nhất của đáp ứng miễn dịch với các vật

ghép. Bệnh tự miễn là kết quả của một đáp ứng miễn dịch với mô chủ. Các bệnh tự miễn như chứng viêm khớp, viêm cầu thận… xảy ra ở các cá thể do nguyên nhân nào vẫn chưa biết mặc dù có một số liên quan đến nhiễm trước đó (đặc biệt là nhiễm streptococci). Việc chứng minh nguyên nhân và hậu quả là một vấn đề dịch tể học với các nghiên cứu quần thể lớn. Vấn đề quan trọng là phải cải tiến kỹ thuật thử nghiệm miễn dịch để giải thích nguyên nhân, hậu quả liên quan đến các vật ghép và thực hiện kỹ các khảo sát dịch tể học.

Các đáp ứng này có thể do vài cơ chế. Hai cơ chế có thể xảy ra nhất đối với vật ghép là (i) vật ghép gắn với mô chủ làm cho nó trở thành một vật ngoại lai như là phức hợp hapten - vật mang hoặc (ii) biến đổi mô chủ thông qua cuộn (gấp) protein, phân hủy tế bào hay protein tạo kháng nguyên đối với mô chủ. Đây là hậu quả chính của việc bơm ngực silicon.

II.4. QUY TRÌNH ĐÁNH GIÁ TÍNH TƯƠNG HỢP SINH HỌC CỦA VẬT LIỆUKhi vật ghép tiếp xúc với hệ sinh học, các phản ứng sau được quan sát:

(1) Trong vòng vài giây đầu tiên, các protein từ dịch cơ thể sẽ lắng đọng. Lớp protein này điều hòa nhiều phản ứng của hệ thống tế bào. Cấu trúc của các protein hấp phụ phụ thuộc vào các đặc tính bề mặt của vật ghép.

(2) Mô xung quanh vật ghép phản ứng giống như phản ứng của cơ thể với tổn thương hoặc nhiễm trùng. Do các kích thích cơ học và hoá học, vật ghép có thể gây ra viêm kéo dài. Kết quả là mô hạt hình thành xung quanh vật ghép.

(3) Trong suốt quá trình tiếp xúc giữa vật liệu sinh học và cơ thể, môi trường cơ

thể sẽ gây ra sự phân hủy. Các quá trình thủy phân và oxid hóa có thể làm mất

tính ổn định cơ học và giải phóng các sản phẩm phân hủy.

(4) Kết quả của sự chuyển vận các sản phẩm phân hủy có khả năng hòa tan qua hệ

mạch và bạch huyết là phản ứng của toàn cơ thể với vật ghép là không thể

tránh khỏi. Ngoài ra, sự nhiễm khuẩn của vật ghép cũng được xem là một trở

10

ngại.

II.4.1. Các thử nghiệm tiên quyết để đánh giá tính tương hợp sinh học

Các thử nghiệm thành công về đặc tính in vitro của các vật liệu và các sản phẩm đầu tiên là điều kiện tiên quyết để đánh giá tính tương hợp sinh học. Đặc tính lý hóa (như bề mặt, diện tích) và các đặc tính thích hợp khác (như cơ, điện, vận chuyển, phân hủy sinh học nếu có thể ứng dụng) phải được đánh giá trên vật liệu thô. Các dữ liệu này phải được so sánh với các kết quả tại các thời điểm chế tạo, tiệt trùng, đóng gói, bảo quản và bất kỳ tiến trình nào có thể ảnh hưởng bất lợi đến tính ổn định của sản phẩm, tính an toàn và hiệu quả sau khi ghép. Các vật liệu không qua các thử nghiệm tiên quyết này thì không được đánh giá tính tương hợp sinh học.

II.4.2. Các phương pháp thử nghiệm và đánh giá tính tương hợp sinh học

Đánh giá tính tương hợp sinh học của vật liệu gồm nhiều thử nghiệm: in vitro (sử dụng tế bào và mô), ex vivo, mô hình động vật và các thử nghiệm lâm sàng. Các tổ chức tiêu chuẩn quốc tế và quốc gia có thể cung cấp những thông tin thích hợp: the American Society for Testing and Materials (ASTM), the International Organization for Standardization (ISO), FDA và the National Institutes of Health (NIH).

II.4.2.1. Thử nghiệm In Vitro

Ưu điểm chính của phương pháp này là giá cả hợp lý, đầu tư nhỏ trong phòng thí nghiệm, và quan trọng nhất là quá trình thực hiện nhanh với số lượng lớn vật liệu.

- Tính tương hợp máu của vật liệu: được xác định bằng cách sử dụng máu chống đông (một hạn chế không thể tránh của các thử nghiệm này) và đánh giá sự hình thành cục máu đông trên bề mặt vật liệu cũng như sự hoạt hóa đông huyết tương, sự bám dính và tụ tập tiểu cầu, sự tổng hợp và giải phóng đồng thời các hợp chất hóa học hoạt động sinh học (như các tác nhân tụ tập, các nhân tố tăng trưởng), sự hoạt hóa bổ thể và các bạch cầu khi các thành phần này tương tác với các vật liệu tổng hợp. Tùy thuộc vào mục đích sử dụng cuối cùng của vật liệu, các thử nghiệm tính tương hợp máu phải được bố trí dưới điều kiện tĩnh hay dòng chảy trong các thử nghiệm cấp và mãn tính. Hồng cầu vỡ sẽ giải phóng hemoglobin dưới điều kiện dòng chảy trong bộ phận giả, sự hóa vôi liên quan đến các bộ phận di chuyển cơ học (các lá của van tim) cũng phải được xác định. Tuy nhiên, không thể loại trừ các phản ứng này khi máu tiếp xúc với các vật liệu tổng hợp. Do đó, kiểm soát và tổi thiểu các phản ứng này là mục tiêu trong việc thiết kế các vật liệu tương hợp máu.

- Những tiến bộ trong kỹ thuật nuôi cấy tế bào đã cung cấp một mô hình in vitro hữu ích để đánh giá tính tương hợp sinh học của vật liệu trong tiến trình lành

11

hóa vết thương. Các tế bào động vật có vú được sử dụng để xác định các chức năng của tế bào (bám dính, di cư, tăng sinh, tổng hợp và lắng đọng các chất nền ngoại bào…) trên vật liệu. Nếu mục tiêu của việc thiết kế và đánh giá các vật liệu mới là những liên kết mạnh giữa mô xung quanh và vật liệu cấy ghép hoặc có sự tạo thành mô mới thì chỉ những vật liệu hỗ trợ chức năng của các tế bào đặc biệt và tối thiếu sự tương tác của các dòng tế bào cạnh tranh mới được đánh giá nhiều hơn. Ví dụ, chỉ những vật liệu tăng cường chức năng nguyên bào xương (tế bào tạo xương) nhưng giảm tối thiểu chức năng của các nguyên bào sợi (tế bào cạnh tranh) mới trở thành “ứng cử viên” cho các ứng dụng trong chỉnh hình hoặc nha khoa.

- Mô hình tế bào động vật in vitro cũng được sử dụng để xác định ảnh hưởng của các hợp chất hóa học (như loại ion, hàm lượng ion được giải phóng khi kim loại bị xói mòn, các đại phân tử và các monomer được giải phóng trong suốt quá trình phân hủy của các polymer có thể tái hấp thu sinh học) được giải phóng dưới các điều kiện của môi trường sinh lý. Các vật liệu bị thất bại trong thử nghiệm độc tính cấp sẽ không được đánh giá cũng như xem xét tiếp tục. Ngay cả khi vật liệu đã qua thử nghiệm khả năng sống của tế bào thì ảnh hưởng của các sản phẩm được giải phóng đến hình thái (gồm sự tích lũy nội bào của các sản phẩm phân hủy), sự tăng sinh và các chức năng khác của tế bào từ đầu cho đến kết thúc sử dụng vật liệu cũng phải được đánh giá.

Các mô hình này rất tốt để khảo sát các chức năng và các cơ chế thích hợp của một dòng tế bào tại một thời điểm nhưng bị hạn chế trong môi trường phức tạp của cơ thể. Do đó, cần thiết sử dụng các mô hình khác (như mô hình động vật) để làm sáng tỏ các sự kiện nhiều khía cạnh, tương tác và linh động mà trực tiếp, trung gian kiểm soát các tương tác mô – vật liệu bên trong cơ thể.

II.4.2.2. Các mô hình động vật

Tính nhân đạo và các yêu cầu hợp phápCác mô hình động vật được sử dụng để xác định tính tương hợp in vivo của các

vật liệu. Các kết quả âm tính (không có kết quả) quyết định khả năng không chấp nhận hệ thống được thử nghiệm. Tuy nhiên, các kết quả dương tính không nhất thiết chứng minh tính tương hợp ở người. Do sự khác biệt về loài, việc ngoại suy các kết luận từ thử nghiệm động vật để tiên đoán các đáp ứng của con người là không chắc chắn và nguy hiểm. Mô hình động vật thích hợp nhất là linh trưởng do sự tương đồng của chúng với người, thậm chí sự khan hiếm, giá cả và duy trì… bầy động vật này.

Việc thử nghiệm trên mô hình động vật chỉ được tiến hành sau khi đã thực hiện thành công các thử nghiệm tiên quyết về đặc tính vật liệu và các thí nghiệm in vitro. Các nhà nghiên cứu nên xác định loài thích hợp nhất cho mục đích khảo sát, cẩn thận bố trí thí nghiệm sao cho số lượng động vật sử dụng nhỏ nhất nhưng thu được kết quả thống kê cao và tránh lặp lại thí nghiệm không cần thiết.

12

Phân loại các thử nghiệmCác thử nghiệm động vật để đánh giá tính tương hợp sinh học của vật liệu có

thể được phân thành 3 cách chính:

i) Các thử nghiệm không chức năng

Trong trường hợp này, các mẫu có hình dạng bất kỳ được ghép vào mô mềm (dưới da, trong cơ, trong bụng) qua quy trình tiểu phẫu. Nghiên cứu này cần khoảng thời gian ngắn (vài ngày đến vài tháng) nhưng cung cấp thông tin giá trị về các tương tác mô – vật liệu sinh học tại chỗ và các biến chứng hệ thống.

ii) Các thử nghiệm ex vivo

Các shunt động mạch – tĩnh mạch và tĩnh mạch – tĩnh mạch được lấy từ máu của động vật, qua thử nghiệm vật liệu và đưa trở lại cơ thể động vật. Trong trường hợp này, các dữ liệu thu nhận được để xác định tính tương hợp sinh học máu của vật liệu là sự tích lũy protein, sự bám dính tế bào máu và sự đóng cục trên bề mặt vật liệu.

iii) Các thử nghiệm chức năng

Thử nghiệm này cần ghép một vật liệu có chức năng, ví dụ ghép khớp háng và tim trong những vùng tổ chức của động vật theo cách phẫu thuật tương tự của người. Các thử nghiệm chức năng là các nghiên cứu thời gian dài, cần những suy xét đặc biệt (như thiết kế, chế tạo và thử nghiệm bộ phận giả), phức tạp và đắt tiền.

Các đáp ứng sinh học tại chỗ và hệ thống Sự cấy ghép vật liệu trên động vật cung cấp các thông tin quan trọng về sự

tương tác với tính tương hợp máu, cấp tính, mãn tính, sự viêm tại chỗ và hệ thống, độ nhạy cảm và tiến trình lành hóa vết thương. Các đáp ứng gây sốt, miễn dịch, độc tính và sinh khối u của động vật cấy ghép vật liệu cũng có thể được xác định. các phương pháp và quy trình chi tiết của các thử nghiệm này được ASTM, NIH và các tổ chức chuyên nghiệp khác cung cấp.

Minh họa một khung thử nghiệm dựa trên các nguyên tắc của FDA và ISO

Loại vật liệu Đánh giá ban đầu Đánh giá bổ sung

Tiếp xúc cơ thể

Thời gian tiếp

Độc tính tế

Độ nhạy

Độ kích ứng

Độc tính hệ thống

Độc tính dư

Độc tính di truyền

Sự cấy ghép

Tính tương hợp

Độc tính mã

Sự sinh khối

13

xúc bào

da (cấp)

ới mãn tính

máu n tính

uV

ật li

ệu b

ề m

ặt

Da A

B

C

Màng nhầy A

B o o o

C o o o

Bề mặt bị tổn thương

A o

B o o o

C o o o

Vật

liệu

thôn

g tin

bên

ngo

ài

Blood path indirect

A

B o

C O o

Tissue, Bone dentin communicating

A o

B O o o

C O o o o

Máu tuần hoàn

A O

B o o

C o

Vật

liệu

cấy

ghé

p

Xương/ Mô A o

B O o o

C O o o

Máu A

B o

C

A – Tiếp xúc ngắn (≤ 24 giờ); B – Tiếp xúc kéo dài (24 giờ - 30 ngày); C – Tiếp xúc lâu dài (> 30 ngày)

14

- Các thử nghiệm đánh giá FDA và ISO; o – Các thử nghiệm bổ sung do FDA yêu cầu

II.4.2.3. Các thử nghiệm lâm sàng Các quy trình và các quy định

Nếu các thử nghiệm in vitro và trên động vật đã thành công thì cũng không thể tiên đoán được tác động của vật liệu trên người nếu không có các thử nghiệm lâm sàng. Các thử nghiệm lâm sàng phải thành công trước khi các bộ phận giả được sử dụng rộng rãi cho bệnh nhân.

Ngoài các tiêu chuẩn khoa học, các đánh giá lâm sàng phải tuân theo quy định pháp luật. Các kết quả thử nghiệm in vitro, ex vivo và in vivo (động vật) phải được lưu giữ cẩn thận để hỗ trợ cho các thử nghiệm lâm sàng. Người nhận phải được mua bảo hiểm cho các rủi ro khi cấy ghép vật liệu mới. Hơn nữa, các quy trình chi tiết mô tả vật liệu, quá trình phẫu thuật, xử lý hậu phẫu, chăm sóc người nhận và các đánh giá khác như so sánh sức khỏe của ngưới nhận trước và sau khi cấy ghép, so sánh người nhận với người khỏe mạnh cùng nhóm thích hợp (tuổi, giới tính, môi trường sống và làm việc…) phải phù hợp với các quy định của FDA, quốc tế nhằm bảo vệ quyền lợi của những người tham gia trong thử nghiệm lâm sàng

Sự thất bại khi cấy ghép, sự phục hồi và đánh giáMột thông tin khác quan trọng và có giá trị có thể được thu nhận từ việc

đánh giá vật liệu cũng như các mô sinh học xung quanh là sự phục hồi của bộ phận giả từ cơ thể vào cuối đời của người nhận.

Mặc dù các vật liệu sinh học được thiết kế dựa trên cơ sở sinh lý của người khỏe mạnh bình thường nhưng người nhận các vật liệu này lại chủ yếu là người lớn tuổi hoặc người bệnh. Do đó, không thể dự đoán hết được tác động của vật liệu dưới tất cả tình trạng người nhận với nhiều bệnh lý và đơn thuốc khác nhau. Dưới những trường hợp như thế, các biến chứng không dự kiến trước có thể xảy ra như là mất chức năng, rối loạn hóa lý… Ngoài ra, những biến chứng như là đau hoặc gây bất tiện có thể kết hợp với viêm nhiễm và các triệu chứng lâm sàng khác gây nguy hiểm cho sức khỏe người nhận. Khi đó, sự can thiệp của phẫu thuật là không thể tránh khỏi.

II.5. Các biến chứng (complication) liên quan đến sự lành hóa vết thương xung quanh vật ghép

Nhiều trường hợp có thể phức tạp, trì hoãn hoặc thậm chí ngừng tiến trình lành hóa vết thương xung quanh vật liệu cấy ghép. Ví dụ khi máu tiếp xúc với các vật liệu sinh học cấy ghép, các thành phần bổ thể có thể được hoạt hóa và huy

15

động bạch cầu. Trong khi sự viêm cấp là một phần thiết yếu trong tiến trình lành hóa thì sự viêm mãn (kéo dài hàng tuần đến hàng tháng sau cấy ghép ) có thể làm trì hoãn hoặc ngăn chặn sự lành hóa vết thương tại vùng cấy ghép. Sự viêm mãn có thể trở thành một vấn đề lâm sàng nghiêm trọng và có thể yêu cầu phẫu thuật để loại bỏ vật liệu cấy ghép.

Sự tiếp xúc của các vật liệu sinh học trong môi trường làm lành vết thương (giàu hóa chất phản ứng và các hợp chất hoạt động sinh học) có thể gây ra xói mòn kim loại và phân hủy polymer làm giải phóng các ion và các monomer (các chất ổn định, yếu tố polymer hóa, chất nhũ tương…), hoạt động hóa học của các hợp chất này có thể ảnh hưởng đến hóa học và làm thay đổi hình thể bề mặt vật liệu.

Một vật liệu cấy ghép có thể là nguồn kích thích viêm vì nhiều lý do. Ví dụ: vật liệu không được bao bọc và bị ngăn cách hoàn toàn với phần còn lại của cơ thể; vật liệu lọc các hóa chất tiền viêm (pro-inflammatory); vật liệu bị rã thành nhiều phần tử nhỏ. Các hạt được tạo ra tại mặt phân cách mô – vật ghép do động lực, liên quan đến ma sát của hai bề mặt khớp nối (ví dụ trường hợp khớp háng, khớp hàm tạm thời…). Loại, hàm lượng và hoạt tính sinh hóa của các hợp chất giải phóng này có thể độc đối với tế bào, cảm ứng viêm và ngăn cản tiến trình lành hóa vết thương; quan trọng nhất, các hợp chất này cũng có thể gây viêm, dị ứng và gây phản ứng miễn dịch hệ thống. Ví dụ, sự hiện diện các ion kim loại (như nickel, chromium, cobalt) có thể gây dị ứng và các phản ứng quá mẫn; các biến chứng này thường thấy trong lâm sàng khi sử dụng các hợp kim (như cobalt-chromium-

16

Hình : Các bạch cầu được hoạt hóa làm thay đổi bề mặt vật liệu cấy ghép. (A) Hình kính hiển vi điện tử quét bề mặt của đĩa poly(etherurethane urea) (PEUU) đối chứng, không cấy ghép. (B) Hình kính hiển vi điện tử quét bề mặt của đĩa PEUU sau khi ghép 28 ngày dưới da của chuột. Người ta tin rằng cấu trúc bề mặt xù xì là do hoạt động của các bạch cầu được hoạt hóa

molybden) trong nha khoa. Cơ chế chính xác của sự hoạt hóa hệ miễn dịch của các ion kim loại vẫn chưa được hiểu rõ.

Phần lớn các polymer sử dụng trong các ứng dụng y sinh hiện tại không gây phản ứng miễn dịch quan trọng. Các vật liệu được thiết kế từ các polymer có thể phân hủy sinh học và khi phân hủy sinh ra các sản phẩm phụ (như acid lactic, acid glycolic, acid caproic) có tính tương hợp sinh học hoặc đã có sẵn trong cơ thể và sẽ được thải ra ngoài qua con đường trao đổi chất bình thường.

Một số ion kim loại (đặc biệt là nickel) và các monomer (như benzyl chloride) là những tác nhân gây ung thư. Thông qua hoạt động hóa học, các hợp chất này có thể tham gia chuyển dạng các tế bào bình thường. Sự phát triển khối u tại chỗ hoặc gần bề mặt vật ghép phụ thuộc vào hình dạng và đặc tính vật lý của vật ghép.

Các biến chứng thông thường nhất trong tiến trình lành hóa vết thương xung quanh vật ghép liên quan đến bao sợi vật ghép. Do mô tổn thương không lành hoàn toàn, một lượng lớn mô hạt, sợi xơ và sẹo được tạo thành. Sự cô lập vật ghép bởi bao sợi là một tiến trình bình thường mà cơ thể đối phó với sự xâm nhập của vật ghép. Tuy nhiên, các biến chứng có thể tăng khi mô dày, không thấm làm suy giảm các chức năng cơ học của vật ghép hoặc ức chế sự giải phóng các tác nhân liệu pháp trong trường hợp hệ phân phát thuốc. Vị trí bị cô lập trở nên khó giải quyết trong trường hợp nhiễm, vi khuẩn và các vi sinh vật khác tìm thấy một nơi ẩn náu bên trong bao sợi và phát triển mạnh, kháng sinh và các dược phẩm khác không thể tác động đến do không thấm qua rào cản mô sợi cũng như không đủ lượng để có hiệu quả. Dưới trường hợp này, phải phẫu thuật loại bỏ vật ghép. Nếu được ghép dưới da, vật ghép cô lập trong bao sợi rất gần da và có thể bị đẩy ra ngoài cơ thể.

III. CÁC VẬT LIỆU SINH HỌC TIẾP XÚC MÁU: CÁC Ý TƯỞNG ĐỂ CẢI TẠO KHẢ NĂNG TƯƠNG HỢP MÁU

Hiện nay, các vật liệu được sử dụng trong lâm sàng đã đạt yêu cầu về các đặc tính cơ học nhưng tính tương hợp tuyệt đối của chúng với máu vẫn chưa đạt được. Do đó, các vật liệu polymer như polyurethane, silicone, polyolefin, polu(vinyl chloride) chỉ sử dụng trong thời gian ngắn đã gây đông và cần chất chống đông máu.

Các vật liệu sử dụng thời gian dài tương tự tác nhân tạo cục máu đông như DacronTM [poly(ethylene terephthalate)] có cấu trúc mạng sợi tạo thành mạch máu giả có đường kính lớn hơn 6mm. Cục đông tạo thành để đóng các lỗ mở trong cấu trúc sợi, fibroblast và fibrin tạo ra sẽ ngăn ngừa máu chảy vào bên trong cấu trúc.

17

Do dòng máu chảy mạnh và đường kính mạch lớn nên không xảy ra sự đóng mạch như là kết quả của sự hình thành cục máu đông. Nguyên tắc này không có giá trị đối với những mạch có đường kính nhỏ hơn 6mm.

Dưới điều kiện sinh lý, bề mặt của mạch tiếp xúc với máu là một lớp tế bào nội mô. Các tế bào này thực hiện các chức năng điều hòa sự nghẽn mạch, tham gia tổng hợp, vận chuyển các chất hoạt động trong chuyển hóa. Đặc điểm chính của các tế bào nội mô là tính tương hợp máu. Do đó, việc phủ bề mặt vật liệu với một lớp đơn tế bào nội mô người là quan điểm hứa hẹn nhất để tạo được một bề mặt tương hợp sinh học. Tuy nhiên, việc phát triển một cơ quan lai như vậy vẫn chưa thực hiện được vì hiện tại các tế bào nội mô người không tăng trưởng trên các bề mặt lạ.

Trong mạch bình thường, các tế bào nội mô tăng trưởng trên màng cơ bản tự tạo gồm collagen (loại I, III. IV), proteoglycan, glycoprotein fibronectin và laminin. Một đoạn fibronectin có trình tự RGD có vai trò trong sự bám dính của các tế bào nội mô. Nhiều nhóm nghiên cứu đã cố gắng tăng sinh các tế bào nội mô trên các polymer tổng hợp bằng cách phủ bề mặt polymer với fibronectin hoặc collagen hoặc bằng cách kết hợp đồng hóa trị các oligopeptide chứa trình tự tripeptide RGD đặc hiệu.

Việc phát triển một vật liệu cấy ghép có phủ tế bào nội mô để ứng dụng thời gian dài có lẽ là công việc phức tạp và tiêu tốn nhiều thời gian nhất. Nhiều ý tưởng đã được thực hiện để cải tạo tính tương hợp máu của vật liệu.

Hình : Các ý tưởng để cải tạo tính tương hợp máu của bề mặt vật liệu

III.1. Tối thiểu sự tương tácMột phương pháp cải tạo tính tương hợp máu của polymer là căn cứ vào bề

mặt polymer có tính ưa nước cao hơn sẽ giảm sự hấp thụ protein và giảm bám dính tế bào. Để phát triển các hệ polymer tương hợp máu mới, các domain ưa nước và kỵ nước được điều chỉnh để giảm năng lượng bề mặt. Một thành phần thích hợp của hỗn hợp polymer hoặc chiều dài các đoạn trong copolymer khối

18

kiểm soát hình dạng của polymer. Người ta đã quan sát được sự bám dính tiểu cầu giảm đáng kể trên bề mặt copolymer khối ABA của HEMA ưa nước (A) và styren kỵ nước (B). Sự thay đổi các đoạn ưa nước mềm và cứng khác nhau của polyurethane chỉ ra sự hấp thu fibrinogen thấp và albumin cao giúp cải tạo tính tương hợp máu.

Ngoài ra, có thể tối thiểu sự tương tác hệ sinh học/vật liệu sinh học bằng cách biến đổi bề mặt của polymer mà không thay đổi các đặc tính khối của polymer. Ví dụ, bề mặt polymer được ghép với PEO thì tính ưa nước sẽ tăng, làm giảm hoạt hóa bổ thể và bám dính tiểu cầu. Tương tự, polymer kỵ nước được phủ một lớp hydrogel như PHEMA sẽ cải thiện tính không nghẽn mạch của polymer. Việc cố định các nhóm chức như nhóm hydroxyl, carboxyl, amino không chỉ làm giảm năng lượng bề mặt mà còn hoạt động như là nhóm liên kết đẩy mạnh sự biến đổi bề mặt hóa học.

III.2. Ghép thuốcTính tương hợp máu của các vật liệu sinh học có thể được cải thiện bằng

cách phủ hoặc ghép các chất chống đông, các chất ức chế sự bám dính tiểu cầu hoặc các chất hoạt hóa tiêu fibrin. Ví dụ phổ biến nhất là bắt cặp ion hoặc đồng hóa trị của heparin với bề mặt của catheter hoặc stent tiếp xúc với máu. Theo nguyên tắc này, các chất sinh oxy có heparin gắn đồng hóa trị đã được kiểm tra trong thử nghiệm lâm sàng. Do hoạt tính của heparin giảm theo thời gian tiếp xúc nên các ứng dụng thời gian dài vẫn chưa thành công. Nguyên tắc này cũng có thể được ứng dụng để cố định albumin, urokinase hoặc prostaglandin trên vật liệu sinh học. Sự bám dính tiểu cầu giảm khi cố định phosphorylcholine, một thành phần chính của màng tiểu cầu và hồng cầu, trên bề mặt polymer.

III.3. Bắt chước 1 màng sinh họcMột phương pháp đầy hứa hẹn để tránh bất kỳ phản ứng nào chống lại các

bề mặt lạ là bắt chước màng tế bào hồng cầu ở bề mặt tiếp xúc máu.

IV. GIAÛI QUYEÁT SÖÏ NHIEÃM TRUØNG CAÁP TÍNH VAØ MAÕN TÍNH TRONG CAÙC CA GHEÙP VAÄT LIEÄU SINH HOÏC

Taùc haïi do söï sinh saûn töï nhieân cuûa vi khuaån bao goàm söï baøo moøn vaø hö hoûng thaønh phaàn kim loaïi. Söï taïo thaønh biofilm coøn laø moät vaán ñeà nghieâm troïng cuûa y hoïc, theå hieän ôû söï nhieãm truøng maûnh caáy nhö laø oáng khí quaûn, oáng thoâng tónh maïch, thuyû tinh theå tieáp

19

xuùc, oáng nieäu vaø nhöõng maûnh gheùp phuï trôï nhö van tim, khôùp thay theá, maûnh gheùp nha khoa vaø maûnh gheùp xöông soáng.

Trong thöïc teá, vieäc gia taêng söû duïng maûnh gheùp laøm baèng vaät lieäu sinh hoïc cho con ngöôøi trong nhöõng naêm gaàn ñaây thöôøng ñi keøm vôùi söï nhieãm truøng vi khuaån, thöôøng do Staphylococcus epidermis gaây ra. Tuyø thuoäc vaøo nhöõng cô cheá lieân quan, nhöõng aûnh höôûng naøy coù theå laø caáp tính hoaëc maõn tính (xuaát hieän nhanh hay chaäm sau khi caáy gheùp). Söï hình thaønh biofilm thöôøng daãn ñeán vieäc loaïi boû hoaëc raø soaùt laïi maûnh gheùp gaây taùc ñoäng, keát quaû gaây ra söï toån thöông ôû beänh nhaân.IV.1. Biofilm laø gì ?

Chaát nhaày hình thaønh treân beà maët cuûa caùc maûnh gheùp y hoïc (nuùt xoang nhó, khôùp nhaân taïo, oáng thoâng…) thöôøng laø nôi aån naùu cuaû caùc loaïi vi sinh vaät, chuùng coù theå toàn taïi dai daúng baát chaáp söï hieän dieän cuaû thuoác khaùng khuaån hoaëc khaùng naám. Nhöõng vi sinh vaät naøy (thöôøng laø caùc hoï vi khuaån, naám, vaø caùc vi sinh vaät khaùc) taïo thaønh moät quaán theå thöôøng ñöôïc bieát vôùi teân goïi biofilm.

Biofilms are multilayered colonies of bacteria that often form on biomedical implants, manifesting themselves as acute or chronic infections in a patient. This atomic force microscope (AFM) image of the surface structure of a hydrated biofilm reveals microcolonies of bacteria, with channels that are believed to act as passageways carrying nutrients to the bacteria. Institute scientists were the first to generate and study AFM images of hydrated biofilms.

20

Biofilm hình thaønh trong moâi tröôøng coù nöôùc khi caùc vi sinh vaät tieáp xuùc vôùi caùc beà maët raén vaø vi sinh vaät tieáp xuùc vôùi nhau thoâng qua caùc polymer ngoaïi baøo (EPS). Chuùng taïo thaønh moät chuoãi lôùn treân caùc beà maët (kim loaïi, plastic, ñaù, moâ soáng hoaëc cheát). Thuaät ngöõ biofilm coù theå gaây hieåu laàm vì noù nguï yù raèng caùc teá baøo hình thaønh neân lôùp ñôn. Thaät ra, theo quan saùt döôùi kính hieån vi, biofilm bao goàm nhieàu chaát coù caáu truùc khoâng gian ba chieàu phöùc taïp. Trong töï nhieân, biofilm coù theå goàm nhieàu loaøi khaùc nhau, thoâng thöôøng chuùng saép xeáp laïi thaønh daõy ngay ngaén. Ví duï nhö caùc veät tan treân raêng ngöôøi. Coù hôn 400 loaøi vi khuaån khaùc nhau, moät soá tieáp xuùc vôùi beà maët raêng, soá khaùc tieáp xuùc vôùi caùc vi khuaån gaàn beân caïnh noù baèng caùc noäi phaûn öùng phaân töû ñaëc bieät nhö söï gaén chaët vaø caùc receptor phuø hôïp vôùi chuùng.

Polysacharide ñöôïc taïo ra bôûi caùc vi sinh vaät thöôøng truù hình thaønh neân thaønh phaàn ngoaïi baøo chính cuaû biofilm. Thaønh phaàn caùc chaát cô baûn cuûa biofilm coù theå khaùc nhau, phuï thuoäc vaøo sinh vaät lieân quan: vi khuaån gram aâm taïo thaønh biofilm trung tính hoaëc mang tính anion, vi khuaån gram döông thì taïo biofilm coù tính cation.

Ngöôïc laïi, thaønh phaàn cuaû polysacharide coù theå quy ñònh cho khaû naêng oån ñònh baåm sinh cuaû noù. Ví duï nhö polyanionic EPS phaûn öùng lieân keát cheùo vôùi caùc ion kim loaïi (ví duï Fe…), vì vaäy oån ñònh caùc chaát. Gaàn ñaây ngöôøi ta nhaän thaáy raèng lactoferrin, moät protein giaøu chaát saét (Fe) laø saûn phaåm cuûa heä mieãn dòch baåm sinh cuûa ñoäng vaät coù vuù, coù theå ngaên khoâng cho Pseudomonas aeruginosa hình thaønh biofilm. Nhöõng phaùt hieän môùi naøy cho moät caùi nhìn roõ raøng hôn veà moái lieân keát phaân töû giöõa chuû theå vaø biofilm, vaø chuùng coù theå chöùa ñöïng nhieàu manh moái cho nhöõng can thieäp trong töông lai.

Nhöõng nghieân cöùu gaàn ñaây treân vi khuaån gram aâm P. aeruginosa vaø vi khuaån gram döông Staphylococus epidermis ñaõ cho ra nhöõng thoâng tin veà ñaëc tröng sinh lyù vaø phaân töû cuûa caùc biofilm vi khuaån, bao goàm caû nhöõng ñaëc tính toång quaùt cuûa biofilm vaø caû nhöõng daáu hieäu quan troïng ñeå choïn loïc loaøi. P.aeruginosa ñaõ ñöôïc taäp trung nghieân cöùu vì noù laø taùc nhaân gaây caùc beänh cô hoäi thoâng thöôøng bôûi söï nhieãm truøng taäp nhieãm

21

trong beänh vieän vaø noù hình thaønh caùc biofilm nguy hieåm khoâng theå chöõa trò ñöôïc trong phoåi ngöôøi vôùi söï hoaù xô caùc nang.

S.epidermis chieám öu theá trong söï nhieãm truøng caáp vaø maõn tính lieân quan ñeán vieäc caáy gheùp cô quan.IV.2. Cô cheá hình thaønh biofilmFigure : The five stages of bacterial biofilm formation.

(A) Bacteria reversibly attach to solid support. (B) Bacteria become irreversibly attached, and aggregate to form matrix. (C) Maturation phase: cells become layered and effects of quorum sensing begin. (D) Clusters reach maximum thickness. (E) Escape of planktonic bacteria from matrix dispersion.

Vieäc hình thaønh biofilm khoâng chæ lieân quan ñeán vieäc caùc vi khuaån tieáp xuùc vôùi beà maët raén; caùc caù theå rieâng leû keát hôïp vôùi hoï haøng cuûa chuùng vaø thöôøng taäp

hôïp laïi vôùi caùc thaønh vieân thuoäc nhieàu loaøi khaùc. Vi khuaån thöïc hieän vieäc naøy thoâng qua cô cheá truyeàn tín hieäu. Khi noàng ñoä ngoaïi baøo cuaû caùc tín hieäu hoaù hoïc ñaït ñeán ngöôõng, soá löôïng vi sinh vaät cuõng ñaït ñeán maät ñoä trung bình (quorum), quaàn theå sinh vaät traûi qua söï bieán ñoåi kieåu hình. Quaù trình ñieàu chænh maät ñoä “daân soá” vi sinh vaät baèng taùc nhaân hoaù hoïc goïi laø quorum-sensing.IV.3. Söï khaùng khaùng sinh ôû Biofilm

22

Vi khuaån trôû neân khaùng khaùng sinh nhôø caùc cô cheá taäp nhieãm hoaëc noäi taïi. Söï khaùng taäp nhieãm laø keát quaû cuûa ñoät bieán di truyeàn hoaëc söï chuyeån caùc vaät lieäu di truyeàn (ví duï: plasmid). Söï khaùng noäi taïi xuaát hieän bôûi söï thay ñoåi kieåu hình, ñieàu naøy taïo ra söï khaùc caùc vaät lieäu di truyeàn hieän coù. Coù theå minh hoaï yù naøy baèng ví duï: vi khuaån töø daïng töï do lô löûng hình thaønh neân biofilm vaø keát quaû laø taïo ra söï khaùng khaùng sinh.

Ôû daïng biofilm, vi khuaån coù theå khaùng khaùng sinh maïnh hôn ôû daïng sinh vaät lô löûng. Haàu heát caùc khaùng sinh ñeàu ñöôïc thieát keá ñeå tieâu dieät caùc sinh vaät phaùt trieån nhanh nhöng neùt ñaëc bieät quan troïng cuûa vi khuaån trong biofilm laø chuùng sinh saûn raát chaäm so vôùi vi khuaån ôû daïng lô löûng. Trong khi nhieàu caùch giaûi thích ñaõ ñöôïc ñöa ra thì vaãn khoâng coù nguyeân nhaân thaät söï naøo coù theå giaûi thích taát caû caùc kieåu khaùng thuoác cuaû biofilm. Caùc enzyme bieán ñoåi thuoác vaø caùc ñoät bieán khoâng ñöôïc coi laø nguyeân nhaân khaùng thuoác ôû vi khuaån trong biofilm. Söï khaùng khaùng sinh ôû biofilm ñöôïc moâ taû nhö laø söï soáng soùt nhôø baùm chaéc hôn laø nhôø ñoäc tính taán coâng.

Caùc nhaø khoa hoïc ñöa ra caùc giaû thuyeát raèng: Thuoác khoâng xaâm nhaäp saâu vaøo lôùp beà maët cuaû

biofilm. Moät soá vi khuaån bieán ñoåi thaønh caùc traïng thaùi

kieåu hình coù tính baûo veä. Khaùng sinh bò phaûn taùc duïng trong khu vöïc ngheøo

chaát dinh döôõng hoaëc khu vöïc coù chaát thaûi baõ. Söï taêng cöôøng bieåu hieän gen ñieàu hoaø PvrR. Gen

naøy giöõ vi khuaån ôû daïng biofilm vaø laøm cho vi khuaån trô vôùi khaùng sinh.

Baèng cô cheá khaùng thuoác naøo ñi nöõa thì vi khuaån trong biofilm vaãn thöôøng soáng soùt sau trò lieäu. Khi trò lieäu baèng khaùng sinh chaám döùt, chæ coù moät ít vi khuaån bò bong ra khoûi biofilm vaø trôû veà daïng lô löûng. Vieäc taùi trò lieäu nhanh choùng cho beänh nhaân vôùi moät taùc nhaân môùi seõ dieät ñöôïc söï nhieãm truøng môùi ñöôïc gaây ra bôûi caùc

23

vi sinh vaät lô löûng nhöng khoâng chaïm ñöôïc vaøo nguoàn cuûa biofilm.IV.4. Caùc phöông phaùp giaûi quyeát vaán ñeà Biofilm

Söï lan toaû cuûa heä thoáng biofilm laø moät hieän töôïng vaãn chöa ñöôïc tìm hieåu roõ, ñieàu naøy daãn ñeán vieäc khoù nghieân cöùu vaø choáng laïi chuùng. Ñieåm coát yeáu trong söï hình thaønh biofilm laø nhöõng noäi phaûn öùng giöõa cô theå vaø maûnh gheùp. Nhöõng nhaø khoa hoïc ôû vieän nghieân cöùu UTHSCSA ñang nghieân cöùu söï hình thaønh biofilm treân nhieàu vaät lieäu sinh hoïc khaùc nhau (UHMWPE, polyvinyl chloride, titanium, cobalt chronium) vaø ñang thay ñoåi taïo vaät lieäu môùi coù theå choáng hoaëc khoaù söï hình thaønh biofilm.

Ñeå giaûi quyeát vaán ñeà biofilm, caùc nhaø khoa hoïc cuûa SwRI ñaõ thay ñoåi beà maët cuûa moät soá vaät lieäu sinh hoïc, laøm cho chuùng ít haáp daãn vi khuaån hôn. Moät loaït caùc phöông phaùp xöû lyù baèng hoaù chaát, boïc phuû lôùp moûng, thay ñoåi tia ion treân beà maët ñaõ ñöôïc Dr. Sanford thöû nghieäm. Phöông phaùp thaønh coâng nhaát laø phuû moät lôùp boïc moûng (>>10 mm) treân PVC. Baïc ñöôïc bieát ñeán nhö laø chaát dieät khuaån trong nhieàu naêm qua, nhöng noù maéc tieàn vaø trong moät soá tröôøng hôïp noù coù theå gaây ñoäc. Moâ hình maãu PVC phuû baïc cuûa SwRI gaén chaët vaøo giaù theå vaø coù ñoä beàn hoaù hoïc. Thöû nghieäm choïn maãu phuû baïc vôùi Staphycoccus epidermidis cho thaáy söï hình thaønh biofilm ít so vôùi maãu khoâng phuû baïc. Nhöõng nghieân cöùu seõ ñöôïc tieáp tuïc phaùt trieån ñeå ñeà ra nhöõng phöông phaùp xöû lyù beà maët vaø taùc ñoäng cuûa noù treân nhieàu doøng vi khuaån.IV.4.1. Baèng caùc chaát öùc cheá töï nhieân

Trong khi biofilm coù theå hình thaønh treân haàu heát caùc beà maët aåm, nhieàu loaïi thöïc vaät bieån taïo caùc hôïp chaát öùc cheá söï hình thaønh biofilm, coù theå laø caùc hôïp chaát naøy ngaên khoâng cho vi sinh vaät tieáp xuùc vôùi nhau. Heä thoáng coù caùc ñaëc tính toát nhaát laø taûo ñoû, Delisea pulchra, chuùng coù theå taïo halogenated furanones ñeå ngaên chaën söï hình thaønh biofilm vi khuaån.IV.4.2. Baèng caùc hôïp chaát tieâu dieät biofilm

24

AP158 (saûn phaåm cuûa coâng ty Antex Biologicals) tieâu dieät biofilm. AP158 laø khaùng sinh coù nguoàn goác töø Staphylococcus coù theå tieâu dieät caùc doøng khaùng khaùng sinh.IV.4.3. Baèng caùch xöû lyù caùc choã gheùp

Bao phuû maûnh gheùp y hoïc ñeå ngaên söï hình thaønh biofilm.

Maãn caûm hoaù caùc noái trong biofilm cuaû vi khuaån ñeå khaùng sinh hoaït ñoäng.

V. VẬT LIỆU SINH HỌC TẠO KHUNG (SCAFFOLD) TRONG KỸ NGHỆ MÔ Kỹ nghệ mô (Tissue engineering) là một lĩnh vực liên quan đến “ứng dụng các nguyên tắc và các phương pháp kỹ nghệ và khoa học sự sống hướng tới hiểu biết cơ bản các mối quan hệ cấu trúc – chức năng của các mô động vật có vú bình thường và bệnh lý để phát triển các vật thay thế sinh học mà khôi phục, duy trì hoặc cải thiện chức năng của mô’. Mục tiêu của kỹ nghệ mô là khắc phục những hạn chế của các phương pháp điều trị truyền thống dựa trên cấy ghép cơ quan và vật liệu sinh học. Nó có tiềm năng để tạo ra các vật thay thế cơ quan và mô ‘nhân tạo’ chịu được đáp ứng miễn dịch. Điều này đưa đến một giải pháp lâu dài cho cơ quan hay mô bị hư hỏng mà không cần liệu pháp bổ sung.

Một trong những phương pháp chính của kỹ nghệ mô liên quan đến việc tăng trưởng các tế bào thích hợp in vitro thành cơ quan hay mô 3D yêu cầu. Nhưng các tế bào thiếu khả năng tăng trưởng theo các hướng 3D mà chúng di cư ngẫu nhiên để tạo thành lớp tế bào 2D. Để tạo mô 3D, cần nuôi tế bào vào các nền xốp (scaffold). Vì vậy, scaffold là một thành phần rất quan trọng trong kỹ nghệ mô.

V.1. Tổng quátCác tế bào được nuôi cấy truyền thống trong một môi trường nhân tạo có

thể tăng trưởng và sao chép để tạo thành các cụm tế bào lớn hơn nhưng không được tổ chức thành mô hay cơ quan. Các cụm tế bào này cần các tín hiệu bên ngòai để tăng trưởng thành các mô hay cơ quan 3 chiều chức năng. Trong cơ thể, các tế bào chịu tác động thường xuyên của các tín hiệu cơ học, điện, cấu trúc và hóa học. Tín hiệu cấu trúc bao gồm tương tác của các tế bào với khuôn nền ngọai bào (Extracellular matrix - ECM). Thông tin vật lý giữa tế bào và ECM tác động trực tiếp hoặc gián tiếp đến hình dạng và chức năng của tế bào.

25

Kỹ thuật nuôi cấy tế bào 3D được ứng dụng nhằm phát triển các mô và cơ quan thay thế. Các kỹ thuật này liên quan đến việc đưa các tế bào và/hoặc các nhân tố tăng trưởng vào trong các scaffold tổng hợp (họat động như ECM tạm thời) để giúp các tế bào tổ chức thành mô hay thậm chí là cả cơ quan.

Một scaffold là một khuôn ngọai bào nhân tạo có cấu trúc lỗ xốp giúp điều tiết tế bào, hướng dẫn tăng trưởng và tái tạo mô ba chiều. Sau khi được đưa vào scaffold, các tế bào sẽ bám, sau đó sao chép, biệt hóa và tổ chức thành mô khỏe mạnh bình thường cùng với việc tiết ra các thành phần nền ngọai bào cần để tạo mô. Vì vậy, việc chọn lựa scaffold là cốt yếu để tạo ra các mô và cơ quan có hình dạng và kích thước mong muốn.

Phương pháp này được sử dụng để tạo các lọai mô khác nhau như da, sụn, xương, gan, thần kinh, mạch máu….

V.2. Các đặc tính lý tưởng của scaffold (1) Có cấu trúc lỗ xốp bên trong (đường kính lỗ ít nhất 60 - 100mm): tăng trưởng mô, phân bố mạch, cung cấp dưỡng chất.

(2) Được chế tạo từ vật liệu có khả năng phân hủy sinh học hoặc khả năng hấp thu sinh học được kiểm sóat để mô sẽ thay thế scaffold.

(3) Có hóa học bề mặt thích hợp để giúp các tế bào bám, biệt hóa và tăng sinh.

(4) Có các đặc tính cơ học thích hợp để tương xứng với vùng ghép.

(5) Không kích thích bất kỳ phản ứng có hại nào.

(6) Dễ tạo theo hình dáng và kích thước mong muốn.

V.3. Các vật liệu scaffoldV.3.1. Các scaffold sinh học

Các mô, cơ quan tự thân, đồng loại, dị loại được sử dụng để tạo scaffold. Các mô, cơ quan được hủy tất cả tế bào và thành phần tế bào, thu bộ khung ECM.

V.3.2. Các polymer tổng hợp

Các nghiên cứu sử dụng vật liệu gốm vô cơ tự nhiên và tổng hợp (như hydroxyapatite và tricalcium phosphate) để chế tạo scaffold trong kỹ nghệ mô xương do các vật liệu này giống với thành phần vô cơ tự nhiên của xương và có các đặc tính dẫn xương. Tuy nhiên, các gốm này có tính giòn (dễ gãy) và không phù hợp với các đặc tính cơ học của xương. Xương là một composite gồm khuôn

26

nền polymer được tăng cường với các phần tử gốm. Polymer là collagen và hydroxyapatite. Hơn nữa, scaffold gốm không thích hợp cho sự tăng trưởng của mô xốp (như mô cơ tim) vì các mô này có các receptor tế bào và các các yêu cầu đặc tính cơ học khác. Các polymer tự nhiên và tổng hợp là lựa chọn hấp dẫn và linh họat về ứng dụng cho sự tăng trưởng phần lớn mô.

Các polyester như polyglycolic acid (PGA), polylactic acid (PLLA), các copolymer (như PLGA) và polycaprolactone (PCL) thường được sử dụng để thiết kế các scaffold. Sản phẩm phân hủy của các polymer này (glycolic acid và lactic acid) hiện diện trong cơ thể người và được thải lọai thông qua con đường trao đổi chất tự nhiên.

V.3.3. Các polymer tự nhiên

Các polymer là protein hoặc carbohydrate có nguồn gốc tự nhiên được sử dụng làm scaffold cho sự tăng trưởng của vài lọai mô. Polymer tự nhiên phổ biến nhất được sử dụng tạo scaffold kỹ nghệ mô là collagen.

V.4. Các phương pháp chế tạo scaffold truyền thống V.4.1. Lọc gián đọan qua khuôn dung môi (solvent-casting particulate-leaching)

Kỹ thuật này bao gồm tạo ra một dung dịch PLLA trong chloroform và thêm các hạt muối có đường kính đặc biệt để tạo ra một dịch huyền phù đồng nhất. Cho dung môi bay hơi để còn lại khuôn nền polymer với các hạt muối ở khắp bên trong. Sau đó, ngâm composite trong nước để lọai muối ra và còn lại cấu trúc lỗ xốp.

V.4.2. Bọt khí (Gas foaming)

Một polymer có khả năng phân hủy sinh học như là PLGA được bão hòa với CO2 ở áp suất cao. Sau đó, làm giảm nhanh khả năng hòa tan của khí trong polymer bằng cách đưa áp suất CO2 trở về áp suất khí quyển. Điều này dẫn đến sự tạo nhân và khuếch trương bọt khí với kích thước 100 – 500 µm trong polymer.

V.4.3. Mạng lưới sợi (Fibre meshes/fibre bonding)

Các sợi từ công nghiệp dệt được sử dụng để chế tạo scaffold từ PGA và PLLA. Tuy nhiên, các scaffold này không ổn định về cấu trúc nên thường gây ra sự biến dạng nghiêm trọng do các lực co rút của tế bào được nuôi trên scaffold. Điều này đã dẫn đến việc phát triển kỹ thuật liên kết sợi để tăng cường các đặc tính cơ học của scaffold. Quy trình như sau: hòa tan PLLA trong methylene chloride và đổ khuôn qua lưới PGA. Cho dung môi bay hơi và sau đó làm nóng khuôn với nhiệt độ trên điểm nóng chảy của PGA. Khi khuôn PGA-PLLA nguội, lọai PLLA bằng cách hòa tan trong methylene chloride một lần nữa. Kết quả là tạo ra một mạng lưới các sợi PGA được nối mạch.

V.4.4. Tách pha (Phase separation)

27

Hòa tan một polymer tổng hợp có khả năng phân hủy sinh học trong phenol hoặc naphthalene và bổ sung thêm các phân tử có họat tính sinh học như alkaline phosphatase vào dung dịch. Sau đó hạ nhiệt độ thấp hơn để tạo ra một sự tách pha lỏng - lỏng và làm nguội để tạo thể rắn hai pha. Lọai dung môi bằng sự thăng hoa để có một scaffold xốp với các phân tử họat động sinh học bên trong cấu trúc.

V.4.5. Làm khuôn tan chảy (Melt moulding)

Dùng bột PLGA và các vi cầu gelatin có đường kính đặc biệt lấp đầy một khuôn Teflon. Sau đó làm nóng khuôn ở nhiệt độ trên nhiệt độ chuyển tiếp thủy tinh của PLGA cùng với dùng sức ép lên hỗn hợp. Phương pháp này làm cho các hạt PLGA gắn kết lại với nhau. Khi lọai bỏ khuôn, thành phần gelatin được lọc ra bằng cách ngâm trong nước và sau đó làm khô scaffold. Scaffold được tạo ra theo cách này có hình dạng của khuôn.

Quy trình làm tan chảy khuôn được biết đổi để kết hợp các sợi HA ngắn. Sự phân bố đều của các sợi HA trong khắp scaffold PLGA chỉ có thể được thực hiện bằng kỹ thuật khuôn dung môi để chuẩn bị vật liệu sợi HA, khuôn nền PLGA và gelatin hoặc tạo lỗ bằng muối, sau đó ứng dụng quy trình làm khuôn tan chảy.

V.4.6. Làm khô lạnh nhũ tương

Quy trình này gồm thêm nước siêu sạch vào dung dịch methylene chloride và PGA. Sau đó, đồng nhất hai lớp không trộn lẫn này để tạo nhũ tương nước - dầu. Tiếp tục làm lạnh trong nitơ lỏng và làm khô lạnh để tạo cấu trúc lỗ xốp.

V.4.7. Đúc khuôn dung dịch (Solution Casting)

Hòa tan PLGA trong chloroform, sau đó tủa bằng cách thêm methanol vào. Xương làm khô lạnh đã được khử khóang có thể kết hợp với PLGA, và sau đó vật liệu composite được ép vào khuôn, làm nóng đến 45 – 48oC trong 24 giờ để tạo scaffold.

V.4.8. Làm khô lạnh

Hòa tan các polymer tổng hợp như PLGA trong acid acetic lạnh hoặc benzen. Sau đó làm đông lạnh dung dịch và làm khô lạnh để tạo ra khuôn nền lỗ xốp.

Tương tự, các scaffold collagen cũng được chế tạo bằng cách làm đông lạnh dung dịch collagen và sau đó làm khô lạnh. Sự đông lạnh dung dịch sẽ làm hình thành các tinh thể đá mà sẽ ép và tập trung các phân tử collagen vào các khỏang khe. Sau đó, lọai các tinh thể đá bằng cách làm khô lạnh. Có thể kiểm sóat kích thước lỗ theo tốc độ đông lạnh và pH, tốc độ đông lạnh nhanh tạo ra các lỗ nhỏ hơn. Dùng ethanol để khử nước của collagen đông lạnh và làm khô tại điểm tới hạn để tạo scaffold collagen. Sau đó, các scaffold này được khâu mạch bằng tác nhân vật lý hay hóa học để giảm khả năng hòa tan, tính kháng nguyên và tốc độ phân hủy.

28

Các phương pháp khâu mạch vật lý gồm chiếu tia UV, chiếu xạ tia gamma hoặc phương pháp nhiệt lọai hydro.

Các phương pháp khâu mạch hóa học liên quan đến việc sử dụng các tác nhân hai chức năng như glutaraldehyde (GTA) và hexamethylene diisocyanate hoặc bằng phương pháp họat hóa nhóm carboxyl với carbodiimide. Các polymer tự nhiên khác như chitin và alginat cũng được dùng để chế tạo scaffold bằng phương pháp làm khô lạnh.

V.5. Các hạn chế của scaffold kỹ nghệ mô- Sự phân hủy các polymer tổng hợp, cả trong điều kiện in vitro và in vivo,

giải phóng các sản phẩm phụ có tính acid khiến cho vi môi trường scaffold không lý tưởng cho sự tăng trưởng mô. PLLA phân hủy sẽ giải phóng acid lactic làm giảm pH, điều này thúc đẩy tốc độ phân hủy do tự xúc tác, kết quả là môi trường acid cao kề sát polymer. Một môi trường như thế có hại đến chức năng của tế bào. Các tế bào bám trên scaffold được nuôi cấy in vitro trong vài tuần trước khi khối mô thích hợp cho việc cấy ghép. Trong suốt thời gian này, ngay cả các thay đổi nhỏ về pH trong vi môi trường scaffold cũng có ảnh hưởng đáng kể đến các tế bào. Hơn nữa, các polymer tổng hợp hiện tại không có hóa bề mặt tương tự với tế bào mà phát triển mạnh trên nền ngọai bào bằng collagen, elastin, glycoprotein, proteoglycans, laminin và fibronectin. Giống như các polymer tự nhiên khác, collagen có thể gây ra đáp ứng miễn dịch. Có thể làm giảm tính kháng nguyên của collagen bằng cách xử lý pepsin để lọai những vùng telopeptid hoặc bằng cách khâu mạch.

- Các phương pháp chế tạo scaffold không thể kiểm sóat chính xác kích thước lỗ, hình dạng lỗ, sự phân bố không gian của các lỗ và cấu trúc các kênh bên trong scaffold. Phương pháp lọc gián đọan qua khuôn dung môi không thể đảm bảo nội liên kết của các lỗ vì điều này phụ thuộc vào các hạt muối kế cận có tiếp xúc hay không. Hơn nữa, các lớp vỏ tạo thành trong suốt quá trình bốc hơi và kết tụ các hạt muối khiến cho việc kiểm sóat kích thước lỗ khó khăn. Ngòai ra, chỉ có thể tạo ra các lớp scaffold mỏng vì khó lọai được các hạt muối sâu bên trong khuôn nền. Đối với phương pháp bọt khí, chỉ có 10 – 30% lỗ được nội liên kết. Các lưới sợi có tính cơ học yếu. Trừ phương pháp bọt khí và phương pháp khuôn tan chảy, các phương pháp chế tạo scaffold đều sử dụng các dung môi hữu cơ như chloroform và methylene chloride để hòa tan các polymer tổng hợp trong một số giai đọan của quy trình. Sự hiện diện của dung môi hữu cơ còn dư lại là vấn đề quan trọng nhất mà các phương pháp này phải đương đầu vì nguy cơ độc tố và gây ung thư đối với tế bào.

- Các phương pháp này tạo ra các scaffold có cấu trúc lỗ xốp. Sau đó, cấy tế bào và các tế bào này tăng trưởng trong scaffold. Tuy nhiên, phương pháp này chỉ tạo ra các mô tăng trưởng in vitro có thiết diện dưới 500µm từ bề mặt. Điều này có lẽ do sự kiềm chế khuếch tán của xốp. Các tế bào có thể dễ

29

dàng di chuyển vào những phần bên ngòai nhất của scaffold và không thể phân bố đồng nhất trong khắp scaffold vì tính di động ngẫu nhiên và sự khuếch tán dưỡng chất hạn chế. Hầu hết các tế bào không thể di cư vào bên trong sâu hơn 500mm. Để khắc phục tình trạng này, thêm tế bào vào scaffold trong suốt quá trình thiết kế để kiểm sóat tốt hơn sự phân bố tế bào. Tuy nhiên, điều này không thể thực hiện được với hầu hết các quy trình thiết kế scaffold vì có liên quan đến các hóa chất độc và nhiệt mà sẽ làm tổn thương các tế bào sống.

Sơ đồ sau đây thể hiện sự kiềm chế khuếch tán của các scaffold kỹ nghệ mô

Scaffold kỹ nghệ mô có cấu trúc xốp mở. Oxy và dưỡng chất được cung cấp từ môi trường lỏng nuôi cấy tế bào.

Cấy tế bào trên scaffold.

Các tế bào bắt đầu tăng sinh và di cư vào các lỗ của scaffold.

Các tế bào lấp đầy các lỗ và bắt đầu tiết ECM của riêng chúng.

Lớp tế bào trên cùng tiêu thụ phần lớn oxy và dưỡng chất, làm hạn chế sự khuếch tán của các thành phần này, do đó làm giảm số tế bào tiên

phong di cư sâu vào bên trong scaffold. Cuối cùng, sự di cư của tế bào bị dừng lại do thiếu oxy và dưỡng chất cung cấp. Lớp tế bào có thể sống sót nhờ sự khuếch

30

tán của oxy và dưỡng chất từ môi trường được gọi là độ sâu thâm nhập tế bào (Cellular penetration depth - Dp).

Đối với kỹ nghệ mô xương, tốc độ chuyển dưỡng chất và oxy nhanh tại bề mặt scaffold kích thích sự khoáng hóa bề mặt scaffold, làm hạn chế sự chuyển khối vào bên trong scaffold. Do đó, các tế bào chỉ có thể sống sót gần bề mặt. Không có tế bào nào, ngoại trừ tế bào sụn, tồn tại cách xa nguồn cung cấp máu 25 – 100 µm. Nhu cầu thấp về oxy của tế bào sụn có thể là lý do tại sao chỉ có mô này được tăng trưởng thành công invitro với thiết diện dày hơn 1mm bằng cách sử dụng các phương pháp chế tạo scaffold truyền thống.

Da là một mô 2D nên không yêu cầu thiết diện dày. Điều đó giải thích sự thành công của việc sản xuất mô da với các phương pháp chế tạo scaffold truyền thống.

- Ngay cả khi các tế bào đã phân bố khắp scaffold quy mô lớn, vẫn cần cung cấp mạch máu để nuôi dưỡng các tế bào ở sâu bên trong scaffold. Các mô mạch xung quanh có thể tăng trưởng vào trong một scaffold cấy ghép nhưng phải mất thời gian cho quá trình phát triển mạch này, do đó các tế bào ở sâu bên trong có thể chết khi mạch máu phát triển tới.

V.6. Kỹ thuật chế tạo dạng tự do rắn (Solid Freeform Farbrication - SFF)SFF sử dụng cách chế tạo lớp để tạo trực tiếp các vật thể từ mô hình được

tạo ra trên máy tính. Phương pháp này kiểm sóat được các thông số scaffold như kích thước lỗ, trạng thái xốp và sự phân bố lỗ cũng như hợp thành tổ chức hệ thống mạch nhân tạo, do đó làm tăng sự vận chuyển oxy và dưỡng chất vào phần bên trong của scaffold, cung cấp cho sự tăng trưởng của tế bào trong vùng đó.

Sử dụng phần mềm CAD (Computer-aided design) để xây dựng mô hình trên máy tính. Sau đó, mô hình CAD này được biểu thị thành một loạt các lớp thiết diện. Dữ liệu được chuyển qua máy SFF để tạo ra mô hình vật lý. Bắt đầu từ lớp dưới cùng xây lên, mỗi lớp mới tạo sẽ gắn với lớp trước đó.

V.6.1. Hệ thống in 3 chiều (Three Dimensional Printing – 3DP)

3DP kết hợp với kỹ thuật in phun mực truyền thống (kiểm soát trục x, y) để phát ra chất gắn từ đầu phun (chuyển động tương xứng với dữ liệu thiết diện CAD) lên trên bề mặt bột polymer. Chất gắn hòa tan và kết hợp với các hạt bột kế cận. Buồng piston được hạ xuống

31

(kiểm soát trục z) và được làm cho đầy lại với một lớp bột khác, quá trình được lặp lại. Bột không dính có vai trò nâng đỡ phần nhô ra hay phần không liên kết và cần loại bỏ sau khi hoàn tất.

Sơ đồ hệ thống 3DP

V.6.2.Hệ thống Stereolithography (SLA)

Quá trình liên quan đến polymer hóa chọn lọc một monomer photocurable lỏng bằng tia UV. Tia UV đươc chiếu (kiểm soát trục x, y) trên bề mặt monomer lỏng tương xứng với dữ liệu thiết diện CAD. Sau khi tạo được lớp đầu tiên, trục đang giữ mô hình được hạ xuống vào trong bể (kiểm soát trục z) để quang polymer dung dịch phủ bề mặt. Sau đó, một “wiper arm” được thay thế phía trên dung dịch để dát phẳng bề mặt. Quy trình được lặp lại cho đến khi hoàn tất mô hình. Hệ thống này cần cấu trúc nâng đỡ hỗ trợ cho mô hình để ngăn ngừa bất kỳ phần nhô ra hay phần không liên kết nào rơi vào đáy bể chứa đầy dung dịch. Sau khi hoàn tất, mô hình được nâng lên và loại bỏ các cấu trúc nâng đỡ.

Sơ đồ hệ thống SLA

V.6.3. Hệ thống Mô hình lắng đọng hợp nhất (Fused Deposition Modelling - FDM)

FDM sử dụng một vòi di động để đẩy một sợi của vật liệu polymer (kiểm soát trục x, y) từ mô hình vật lý được xây dựng thành từng lớp. Mô hình được hạ xuống (kiểm soát trục z) và quy trình lặp lại. Mặc dù sợi cũng phải tạo ra cấu trúc bên ngoài để nâng đỡ những phần nhô ra hoặc không liên kết và cần được loại bỏ. Kích thước lỗ trong scaffold kỹ nghệ mô đủ nhỏ cho sợi bắc ngang qua mà không cần thêm cấu trúc nâng đỡ nào.

Sơ đồ hệ thống FDM

32

V.6.4. Hệ thống Plotter 3D

Hệ thống này gồm một đầu nhô ra di động (kiểm soát trục x, y và z) và sử dụng không khí nén để ép một môi trường dạng bột nhão hoặc dung dịch. Đầu nhô ra có thể được làm nóng đến nhiệt độ yêu cầu. Môi trường đông đặc lại khi tiếp xúc với cơ chất hoặc lớp trước đó.

Sơ đồ hệ thống Bioplotter 3D

V.6.5. Hệ thống in phun đổi phase (Phase-change Jet Printing)

Hệ thống này gồm hai đầu in phun mực, mỗi đầu phun ra một vật liệu khác nhau: một vật liệu để xây dựng mô hình thật, một vật liệu để nâng đỡ cho những phần nhô ra hay không liên kết. Những vi giọt tan chảy tạo ra từ đầu phun được làm nóng trên nhiệt độ tan chảy của vật liệu và lắng đọng theo kiểu nhỏ giọt theo yêu cầu. Các vi giọt đông đặc va chạm để tạo thành hạt. Các hạt kế cận gối lên nhau tạo thành một hàng và các hàng kế cận gối lên nhau tạo thành một lớp. Sau khi tạo thành lớp, có thể sử dụng một cần cắt quay ngang để dát phẳng bề mặt và kiểm soát bề dày của lớp. Nền được hạ xuống và quá trình lặp lại để tạo lớp kế tiếp gắn với lớp trước đó cho đến

33

khi hình dáng của mô hình hoàn tất. Sau đó, có thể ngâm mô hình trong một dung môi chọn lọc đối với vật liệu nâng đỡ, không ngâm dung môi đối với vật liệu xây dựng để cho mô hình vật lý có hình dạng mong muốn.

Sơ đồ hệ thống in phun đổi phase

V.7. SFF trong kỹ nghệ mô (2003)Việc kiểm soát bằng máy tính những phần bên trong phức tạp của scaffold,

như là kích thước lỗ, trạng thái xốp, sự phân bố lỗ và một hệ thống mạch nhân tạo bằng kỹ thuật SFF là một thuận lợi lớn cho kỹ nghệ mô. Ở đây, một hệ thống mạch nhân tạo được định nghĩa là bất kỳ cấu trúc nào chứa bên trong scaffold mà cung cấp và duy trì sự vận chuyển đầy đủ oxy và dưỡng chất cho tế bào, loại bỏ các chất thải từ tế bào trong khắp scaffold.

Tạo các scaffold từ PLLA và PLGA bằng cách in chloroform lên trên một nền các hạt này. Chloroform làm polymer trương phồng, hòa tan và cuối cùng gắn với các hạt kế cận khi dung môi bay hơi. Các scaffold PLGA được chế tạo bằng kỹ thuật 3DP và dùng trong kỹ nghệ mô gan. 3DP được sử dụng để tạo ra một mạng lưới phức tạp gồm các kênh dài và tròn trong khắp chiều dài của scaffold. Các kênh có đường kính khoảng 800µm. Bột PLGA cũng chứa các hạt NaCl mà được loại bỏ bằng cách lọc qua nước cất để tạo các vi lỗ bên trong scaffold. 3DP có trở ngại do đây là quy trình dựa trên bột nên khó loại bỏ phần bột nâng đỡ từ các phần kênh phức tạp sâu bên trong scaffold. Hơn nữa, các dung môi hữu cơ được sử dụng làm tác nhân kết dính. Sau khi làm khô 1 tuần, vẫn còn lại 0.5% wt (5000ppm) chloroform trên mẫu. Trong khi theo US Pharmacopoeia thì dư lượng chloroform cho phép trong thuốc là 60ppm. Gần đây, các nghiên cứu đã sử dụng CO2 lỏng để trích chloroform thừa. Kỹ thuật này làm giảm mức chloroform xuống dưới 50ppm. Nước cũng đã được sử dụng làm tác nhân kết dính trong 3DP để chế tạo scaffold polymer dựa trên tinh bột. Tuy nhiên, cần có dung dịch PLLA và PCL trong methylene chloride ngấm qua các scaffold xốp để làm tăng độ bền cơ học.

Sử dụng SLA để chế tạo các bộ phận bằng gốm. Sử dụng kỹ thuật SLA để tạo các dung dịch alumin, silicon nitride và hạt silica chứa trong monomer UV-photocurable. Việc xử lý monomer khiến cho các hạt gốm kết dính với một khối màu xanh. Tác nhân kết dính được loại bỏ bằng sự nhiệt phân và các bộ phận gốm được nung kết. Một dung dịch hydroxyapatite (HA) trong monomer photocurable được đưa ra để tạo các scaffold HA cho bộ phận hốc mắt giả bằng kỹ thuật này.

Các scaffold dạng tổ ong được tạo ra từ các sợi PCL bằng kỹ thuật FDM. Độ xốp khoảng 48 – 77% phụ thuộc vào đường kính của đầu phun. Kích thước của kênh khoảng 160mm theo chiều dọc và 700µm theo chiều ngang. Các fibroblast người được nuôi cấy trên scaffold PCL này đã bám trên các thanh và hình thành mạng lưới nội liên kết tế bào - tế bào và tế bào – ECM trong khắp cấu trúc dạng tổ ong 3D. FDM là một kỹ thuật thu hút cho scaffold kỹ nghệ mô vì không sử dụng các dung môi hữu cơ độc. Tuy nhiên, do FDM hoạt động ở nhiệt độ cao (1200C)

34

nên không thể đưa các phân tử sinh học vào quy trình. Scaffold poly(ethylene glycol terephthalate)/ poly(butylenes terephthalate) được chế tạo bằng kỹ thuật FDM.

Một hệ thống toàn diện hơn mà có khả năng tạo dạng tan chảy nóng, dung dịch, keo nhão, dạng phân tán của các polymer cũng như các monomer và các oligomer phản ứng là Plotter 3D. Các scaffold được chế tạo từ PLA, PLGA và PCL bằng hệ thống này. Tuy nhiên, có lẽ điểm hấp dẫn nhất của Plotter 3D là dùng để tạo các scaffold hydrogel. Các sợi hydrogel mỏng được nâng đỡ bằng việc hòa agar trong môi trường lỏng có tỷ trọng và sự phân cực tương xứng. Dung dịch agar được làm nóng đến 700C và sau đó pha thành dung dịch gel lỏng được giữ ở 200C. Sự gel hóa agar để tạo một gel ổn định về cơ học. Các fibroblast và tế bào sarcom xương bám dính trên các scaffold agar được cải tiến bằng cách tạo một lớp phủ dựa trên phản ứng của ion calci với acid hyaluronic và acid alginic. Việc xử lý làm cho bề mặt scaffold nhám hơn và làm tăng sự bám dính của tế bào. Tuy nhiên, việc tạo các scaffold hydrogel dạng gel rất khó vì gel không ổn định ở 370C. Các scaffold hydrogel sợicũng được chế tạo theo phương pháp phản ứng Plotter. 3D Plotter hòa một dung dịch acid alginic và fibrinogen vào trong một dịch lỏng chứa thrombin và ion calci. Thrombin là enzym xúc tác phản ứng polymer hóa fibrinogen thành fibrin. Trong cơ thể người, fibrin cũng được tạo thành theo quá trình này khi hình thành cục máu đông. Do phản ứng plot thực hiện được ở 370C nên có thể đưa tế bào vào dung dịch pha và tạo ra các hydrogel có các loại tế bào khác nhau trong khắp scaffold.

Có một hệ thống gọi là hệ thống Rapid prototyping robotic dispensing (RPBOD) hoạt động giống nguyên tắc của 3D Plotter. RPBOD được sử dụng để chế tạo scaffold chitosan 3D và chitosan-HA. Các dung dịch chitosan hoặc chitosan-HA được đưa vào môi trường NaOH và ethanol để tủa chitosan. Nồng độ NaOH là quan trọng trong việc kiểm soát sự bám dính giữa các lớp. Sau đó, các scaffold được hydrat hóa, đông lạnh và làm khô lạnh. Trước khi nuôi cấy tế bào, các scaffold được phủ với keo fibrin.

V.8. Sử dụng khuôn chế tạo dạng tự do rắn để tạo scaffoldCác phương pháp nêu trên tập trung vào tạo scaffold trực tiếp từ hệ thống

SFF. Tuy nhiên, có thể sử dụng hệ thống SFF để tạo ra khuôn và rót một vật liệu có khả năng tương hợp sinh học, phân hủy sinh học vào khuôn, sau đó loại bỏ khuôn.

35

Nguyên tắc của việc sử dụng khuôn được chế tạo từ SFF để tạo scaffold kỹ nghệ mô

Scaffold ảo

Khuôn, có hình dạng bản âm của scaffold ảo được thiết kế trên máy tính bằng phần mềm CAD. Khuôn được tạo ra bằng kỹ thuật SFF.

Vật liệu có khả năng phân hủy sinh học được rót vào khuôn và cứng lại.

Loại bỏ khuôn bằng nhiệt hoặc dùng hóa chất hòa tan để thu scaffold.

36

Khái niệm về việc sử dụng khuôn để tạo scaffold kỹ nghệ mô là không mới. Năm 1997, alginat được sử dụng làm khuôn tai của một em bé 3 tuổi. Năm 2001, khuôn nhôm được chế tạo giống hình dạng van động mạch người. Dịch huyền phù nguyên bào sợi cơ và fibrinogen được rót vào khuôn và cảm ứng polymer hóa fibrin.

Tuy nhiên, kỹ thuật dựa trên khuôn này chỉ được sử dụng để kiểm soát hình dạng bên ngoài của scaffold mà không thể tạo cấu trúc “chạm trổ” bên trong scaffold. Các khuôn bằng nhựa epoxy thương mại được chế tạo bằng hệ thống SLA. Rót dịch huyền phù HA 40%v vào khuôn và chất kết dính dựa trên acrylic được xử lý nhiệt. Loại bỏ khuôn epoxy và chất kết dính acrylic bằng nhiệt phân, HA còn lại được nung kết. Các kênh trong scaffold HA có chiều cao khoảng 469 ± 20µm và chiều rộng 334 ± 10 µm.

Dung dịch PLLA và chloroform được rót vào khuôn gốm và sáp để tạo cấu trúc kênh. Các hạt muối được cho vào khuôn và được loại bỏ bằng cách lọc qua nước để tạo lỗ bên trong nền polymer. Hợp chất PLLA/PGA cũng được tạo ra bằng quy trình đúc chảy 2 bước (a two-step melt casting) khi sử dụng khuôn gốm. Hợp chất HA/PLLA được tạo ra theo quy trình tương tự. Loại bỏ khuôn gốm bằng cách hòa tan hóa học với RDO (một chất làm mất calci thương mại). Quy trình này có sử dụng dung môi hữu cơ nên độc tố còn lại trên scaffold.

Các scaffold collagen được tạo ra với hình thái bên trong được kiểm soát và được định trước. sử dụng máy in phun mực đổi pha để tạo ra khuôn. Khuôn có một loạt thân phân nhánh và nội liên kết chạy ngang qua thành. Rót collagen vào khuôn và đông lạnh ở -200C. Sau đó ngâm khuôn chứa collagen đông lạnh trong ethanol để hòa tan khuôn và các tinh thể đá, còn lại cấu trúc collagen xốp có các kênh đã được định trước. Có lẽ ethanol là một dung môi hữu cơ thích hợp cho scaffold kỹ nghệ mô do phần thừa không quá độc đối với tế bào. Tiếp tục loại ethanol bằng cách làm khô với CO2 lỏng. Kết quả là tạo được scaffold collagen khô sẵn sàng cho việc khâu mạch, tái hydrat và nuôi cấy tế bào. Ưu điểm của phương pháp này là nhiệt độ không bao giờ đạt đến 360C, vì vậy ngăn ngừa được sự biến tính của các phân tử collagen và có thể kết hợp với các phân tử sinh học khác như là các nhân tố tăng trưởng. Các scaffold collagen này nhằm ứng dụng trong kỹ nghệ mô xốp.

Hình SEM một scaffold collagen được làm từ khuôn SFF. Các kênh vuông và kích thước các kênh khoảng 170 - 450µm.

37

V.9. Các ứng dụng cụ thể V.9.1. Van tim dựa trên scaffold sinh học

- Các van tim từ người cho hoặc từ động vật mất các kháng nguyên tế bào nên không gây đáp ứng miễn dịch có thể được sử dụng làm vật liệu scaffold. Để xử lý các scaffold này, tiến hành lọai bỏ các thành phần tế bào, còn lại các protein nền ngọai bào làm khuôn nội tại cho các tế bào bám dính. Các kỹ thuật lọai tế bào như làm khô lạnh, xử lý trypsin/EDTA, dùng thuốc tẩy, xử lý enzym nhiều bước. Tuy nhiên, việc sử dụng trypsin làm biến đổi cấu trúc của chất nền và không lọai được tế bào hòan tòan. Các phương pháp lọai tế bào khác nhau được ứng dụng không thống nhất có lẽ do sự hiện diện của các protease trong mô tự nhiên. Khi các protease này họat động dẫn đến tự phân giải các protein nền ngọai bào làm hư hỏng cấu trúc và chức năng của scaffold nền. Vì thế, cần phải sử dụng các nhân tố ức chế protease thích hợp. Nuclease được dùng để phân hủy DNA và RNA từ chất nền. Các tế bào nội mô được nuôi cấy trên khuôn nền vô bào đã tạo ra lớp confluent (nhập dòng) phủ trên van. Sau khi cấy ghép 3 tháng, các van tim dày lên do sự tạo thành nền ngọai bào và tăng sinh tế bào.

- Tạo ra van tim thay thế từ mô tự thân, vật liệu scaffold phải phân hủy trong khi mô van tim mới đang phát triển. Collagen là một trong những vật liệu sinh học thể hiện khả năng phân hủy sinh học và có thể được sử dụng như là bọt (foam), gel hay phiến (sheet), xốp (sponge) hay thậm chí là một scaffold dựa trên sợi. Tuy nhiên collagen có nhược điểm là khó thu nhận từ bệnh nhân. Hiện tại, phần lớn scaffold collagen có nguồn gốc từ động vật. Do collagen chậm phân hủy nên vật liệu scaffold vẫn tồn tại vào thời điểm cấy ghép. Điều này dẫn đến nguy cơ nhiễm bệnh từ động vật, gây phản ứng miễn dịch và hiện tượng viêm.

- Fibrin là một vật liệu sinh học khác mà thể hiện khả năng phân hủy sinh học có thể kiểm sóat tốt. Gel fibrin có thể được thu nhận từ máu của bệnh nhân nên đó là scaffold tự thân, sẽ không độc và không gây viêm. Có thể tạo ra cấu trúc ba chiều từ hỗn hợp tế bào – gel, sau đó polymer hóa fibrinogen bằng enzym. Sự phân hủy được kiểm sóat bằng cách thêm aprotonin, một nhân tố ức chế proteinase mà làm chậm lại hoặc thậm chí làm ngừng phân giải fibrin. Có thể cố định các nhân tố tăng trưởng lên các vùng đặc hiệu của scaffold. Tuy nhiên vật liệu scaffold cũng có nhược điểm là sự khuếch tán và rửa sạch các chất vào môi trường xung quanh giảm so với những nền xốp khác. Ngòai ra, fibrin còn có khuynh hướng co lại và có đặc tính cơ học yếu. Điều này có thể được khắc phục bằng cách sử dụng poly-L-lysin cố định gel. Bên cạnh tiềm năng như một vật liệu scaffold sinh học,

38

gel fibrin có thể được sử dụng như một vật mang tế bào trong các scaffold tổng hợp.

V.9.2. Lớp apatite với protein huyết thanh làm scaffold cho sự tăng trưởng của nguyên bào xương

Mặc dù phương pháp ghép tự thân được xem là tốt nhất để điều trị khiếm khuyết xương nhưng phương pháp này vẫn có nhiều khuyết điểm như hạn chế mô ghép, phải phẫu thuật nhiều…. Trong những năm gần đây, số lượng các trường hợp ghép xương nhân tạo tăng lên và các mô được nuôi cấy exvivo đã gây được sự chú ý. Vì vậy, các thiết bị nuôi cấy mô nhân tạo càng trở nên quan trọng hơn. Tế bào mầm phôi, tế bào mầm trung mô và tế bào mầm từ tủy xương có thể được sử dụng để tạo ra mô xương vì các tế bào này biệt hóa thành tế bào xương. Lớp apatite lắng trên hydroxyapatite không ức chế sự tăng trưởng của tế bào trong nuôi cấy. Lớp apatite này được xử lý theo quy trình “bắt chước” sinh học, cơ bản dựa trên biến đổi bề mặt và tiếp theo là ngâm trong dịch cơ thể. Vật liệu thu nhận được giống với mô tự nhiên hơn là vật liệu tổng hợp.

Quy trình cụ thể: Hydroxyapatite (HA) gốm và titanium biến đổi bề mặt được sử dụng làm cơ chất của các lớp apatite. Chuẩn bị HA gốm từ bột HA được tổng hợp bởi phản ứng kết tủa Ca(NO3)2và (NH4)2HPO4. Chuẩn bị titanium biến đổi bề mặt bằng cách xử lý trong dung dịch NaOH 10N và nhiệt độ 6000C. Môi trường nuôi cấy có bổ sung 10% huyết thanh bò có thai (FBS – Fetal bovine serum) được rót vào đĩa 24 giếng có cơ chất để tạo thành các lớp apatite. Các lớp này được chia thành lớp apatite có protein huyết thanh và lớp apatite không có protein huyết thanh. Sau khi ngâm 7 ngày, các lớp hình thành trên tiêu bản được đánh giá bằng nhiễu xạ tia X lớp mỏng (Thin film X-ray diffraction – TF-XRD), kính hiển vi điện tử quét (Scanning electron microscopy - SEM) và phổ kế phát tán năng lượng (Energy dispersive spectromethory - EDS). Các nguyên bào xương (MC3T3-E1), nguyên bào sợi (L929) và tế bào thần kinh (SK-N-SH) được sử dụng để đánh giá khả năng tương hợp tế bào của các lớp tạo thành. Mỗi lọai tế bào được nuôi trong đĩa 24 giếng với các mẫu riêng biệt. Đếm số tế bào bám sau 3 ngày nuôi cấy bằng phòng đếm hồng cầu và sau đó tính tóan tỷ lệ tăng sinh. Quan sát hình thái tế bào bám bằng SEM sau khi cố định, khử nước và làm khô. Khảo sát sự phân bố các sợi actin để đánh giá điều kiện bám dính. Các tế bào MC3T3-E1 bám dính được nhuộm bằng rhodamine-phalloidin sau khi cố định formol 10%. Quan sát sợi actin nhuộm màu bằng kính hiển vi hùynh quang. Kết quả, các tế bào dạng thoi trải ra theo nhiều hướng tạo các liên kết giữa tế bào trên HA gốm. các tế bào trải rộng trên lớp apatite có protein huyết thanh. Tuy nhiên, chỉ có các tế bào MC3T3-E1 là có khả năng tăng trưởng trên lớp apatite có protein huyết thanh. Vì vậy, sự khác biệt trong đáp ứng của tế bào trên lớp apatite được cảm ứng bởi protein dính và sự thực bào. Apatite lắng có đặc tính là hấp thu mạnh với các protein dính tế bào như fibronectin và vitronectin. Hơn nữa, các tế bào MC33-E1 với khả năng thực bào

39

có thể sử dụng phần bên trong của lớp tạo thành chứa protein dính. Như vậy, lớp apatite có protein huyết thanh có thể được sử dụng làm scaffold tăng trưởng tế bào trong kỹ nghệ mô xương.

V.9.3. Kỹ nghệ mô cơ vân

Cơ vân bao gồm các bó sợi cơ, tế bào cơ đa nhân được biệt hóa từ nguyên bào cơ. Sau khi tổn thương cơ, các sợi cơ bị hoại tử và các macrophage thực bào. Một quần thể phụ nguyên bào cơ chuyên biệt được gọi là các tế bào vệ tinh rải rác bên dưới màng cơ bản của các sợi cơ có khả năng tái sinh. Tỷ lệ mắc bệnh của các tế bào vệ tinh trong sợi cơ là rất thấp (1% - 5%) và phụ thuộc vào tuổi, thành phần sợi cơ. Các tế bào này vẫn trong tình trạng im lặng và chưa biệt hóa, có thể đi vào chu trình gián phân để đáp ứng với các nhân tố tại chỗ đặc hiệu. Điều này cảm ứng sự tăng sinh và dung hợp của các nguyên bào cơ tạo thành các ống cơ dài, đa nhân và tự tập trung lại hình thành cấu trúc có tổ chức hơn gọi là sợi cơ. Bên cạnh đó, các tế bào vệ tinh di cư, tăng sinh vào trong vùng bị tổn thương và có thể tạo thành mạng lưới mô liên kết. Quá trình này được gọi là “sự hình thành mô sẹo” và bị mất chức năng.

Kỹ nghệ mô cơ vân phụ thuộc vào các đặc tính tái sinh của các tế bào vệ tinh và khả năng tăng sinh, biệt hóa của chúng vì các tế bào cơ vân sơ khởi này có thể được thu nhận từ cơ trưởng thành và tăng trưởng in vitro. Các nguyên bào cơ được nuôi và cảm ứng biệt hóa trong một scaffold 3D bằng collagen và Matrigel

(trích từ sacoma chuột), lưới acid polyglycolic (PGA), hydrogel alginat. Một phương pháp khác là đồng nuôi cấy nguyên bào cơ và nguyên bào sợi. Các nguyên bào sợi sẽ tạo ECM bao quanh các ống cơ.

40

Khái niệm về kỹ nghệ mô in vitro (A) và in vivo (B)

Các scaffold thương mại:PuramatrixTM (hydrogel peptid tổng hợp), Matrigel

(màng cơ bản)

Töông lai cuûa caùc vaät lieäu sinh hoïc

41

Nghieân cöùu vaät lieäu sinh hoïc laø moät lónh vöïc ñang phaùt trieån nhanh choùng vaø thu huùt. Nhöõng kieän caùo choáng laïi caùc nhaø saûn xuaát thieát bò y hoïc, söï toå chöùc laïi caùc tieán trình pheâ chuaån cuûa FDA, söï mong ñôïi cuûa beänh nhaân, xu höôùng caûi thieän vieäc chaêm soùc söùc khoûe… ñang thay ñoåi töông lai cuûa caùc thieát bò y khoa vaø ñang hình thaønh höôùng nghieân cöùu caùc vaät lieäu sinh hoïc.

Ví duï, nhöõng kieän caùo ñaõ thuùc giuïc caùc nhaø cung caáp vaät lieäu daøi haïn vaø caùc nhaø saûn xuaát thieát bò khoâng söû duïng caùc saûn phaåm cuûa chính hoï trong caùc öùng duïng y hoïc. Nhö moät heä quaû, nhöõng vaät lieäu môùi vaø caùc nhaø cung caáp seõ phaûi tieáp caän nhöõng tieâu chuaån FDA.

Ngöôøi tieâu duøng (beänh nhaân) yeâu caàu vaät thay theá y hoïc an toaøn. Ñeå ngaên chaën caùc vaät thay theá vaø vaät lieäu khoâng ñöôïc thöû nghieäm ñaày ñuû coù maët treân thò tröôøng cuõng nhö ñeå saøng loïc caùc coâng ty rieâng leõ taïo ra vaät lieäu sinh hoïc keùm chaát löôïng, moät heä thoáng quy ñònh phöùc taïp caáp quoác gia ñaõ ñöôïc thieát laäp trong chính phuû moãi nöôùc (Cô quan quaûn lyù thöïc phaåm vaø döôïc phaåm FDA ôû Myõ).

Thoâng qua Toå chöùc tieâu chuaån quoác teá (ISO), caùc tieâu chuaån quy ñònh quoác teá ñaõ ñöôïc phaùt trieån khaép nôi treân theá giôùi. Roõ raøng laø neàn taûng chuû yeáu veà kieán thöùc vaät lieäu sinh hoïc ñaõ trôû thaønh caùc tieâu chuaån naøy. Giaù thaønh raát lôùn cho vieäc thoûa maõn tieâu chuaån ñeå taïo söï chaáp thuaän vôùi caùc thöû nghieäm vaät lieäu sinh hoïc vaø laâm saøng. Vieäc ñöa vaät hay theá y sinh môùi vaøo thò tröôøng caàn söï ñaàu tö lôùn vôùi nhieàu trieäu USD.

Coù phaûi caùc quy ñònh vaø tieâu chuaån thaät söï ñaõ chæ ra vaán ñeà an toaøn hay khoâng? Coù phaûi vieäc thoåi phoàng quy ñònh seõ laøm taêng giaù thaønh vieäc chaêm soùc söùa khoûe vaø ngaên chaën caùc vaät thay theá tieán boä ñeán vôùi nhöõng ngöôøi thaät söï caàn chuùng hay khoâng?

Döôùi chuû ñeà veà quy ñònh naøy, chuùng ta thaáy giao ñieåm cuûa taát caû nhöõng lieân heä coù trong coäng

42

ñoàng vaät lieäu sinh hoïc laø: chính phuû, kyõ ngheä, ñaïo ñöùc vaø khoa hoïc cô baûn. Caâu traû lôøi thaät khoâng ñôn giaûn nhöng vaán ñeà naøy ñöôïc neâu ra moãi ngaøy.

Toång keát

Vieän Materials Strategy Commission on Materials Technology Foresight in Biomaterials cho bieát “Vaät lieäu sinh hoïc tieát kieäm cuoäc soáng, giuùp ngöôøi beänh an taâm vaø caûi thieän chaát löôïng cuoäc soáng cho beänh nhaân” Chöông trình döï ñoaùn kyõ thuaät veà vaät lieäu cuõng nhaän ñònh “Vaät lieäu sinh hoïc laø moät lónh vöïc öu theá, ñaày trieån voïng, nhöõng theá heä vaät lieäu môùi seõ khuyeán khích naâng cao söï hoài phuïc vaø söõa chöõa nhöõng chöùc naêng cuûa moâ cô theå”.

TÀI LIỆU THAM KHẢO

Craig Halberstadt, Dwaine Emerich (2007) Cellular Transplantation from Laboratory to Clinic. Elsevier Inc.

Teoh Swee Hin (2004) Biomaterials Engineering and Processing Series – Vol. 1

Engineering materials for biomedical applications. World Scientific Publishing Co. Pte. Ltd.

Kay C Dee, David A. Puleo, Rena Bizios (2002) An Introduction to Tissue-Biomaterial Interactions. John Wiley & Sons, Inc.

Pathiraja A.Gunatillake and Raju Adhikari (2003) Biodegradable synthetic polymers for tissue engineering. European Cells and Materials .

Doris Klee, Hartwig Höcker (2000) Polymers for Biomedical Applications: Improvement of the Interface Compatibility. Springer-Verlag Berlin Heidelberg.

W. Mark Saltzman (2004) Tissue Engineering: Engineering Principles for the Design of Replacement Organs and Tissues. Oxford University Press, Inc.

43