TALAJVIZSGÁLAT KATALÁZ AKTIVITÁS MÉRÉSSEL

Enzimvizsgálati módszerek

1

A kataláz enzim (1)

A kataláz gyakori enzim, mely szinte minden élő szervezetben megtalálható, ami oxigénnek van kitéve.

2

A kataláz enzim (2)

Katalizálja a hidrogén-peroxid lebomlását vízzé és oxigénné. Egy kataláz enzim 40 millió hirdogén-peroxid molekulát tud

vízzé és oxigénné bontani. 4 azonos polipeptid láncból felépülő enzim, minden egység

több, mint 500 aminosav hosszú. Működési mechanizmusa:

3

A kataláz aktivitás mérés elméleti alapjai (1)

A kataláz funkciója a mérgező hidrogén-peroxid bontása:H2O2 → H2O + 1/2 O2

A gerjesztett hidrogén-peroxid mérgező a sejtekre, oxidálja a fehérjék SH-csoportjait.

Az aerob sejtek rendszerint tartalmazzák a szuperoxid dizmutáz enzimet, mely átalakítja a szuperoxidot hidrogén-peroxiddá és molekuláris oxigénné:2O2

- 2H+ → H2O2 + O2

4

Az L- és D-amino sav oxidáz redukált formái közvetlenül képesek reoxidálódni hidrogén peroxid formába molekuláros oxigénnel:E-FMNH2 + O2 → E-FMN +H2O2

E-FADH2 + O2 → E-FAD +H2O2 Minden aerob baktérium és a fakultatív anaerob

baktériumok zöme foglal magában kataláz aktivitást. Az enzim nem észlelhető obligált anaerob

baktériumokban. A kataláz volt az első enzim, amit vizsgáltak a talajban.

Ez alapozta meg az O2 kibocsátás meghatározását.

A kataláz aktivitás mérés elméleti alapjai (2)5

A kataláz aktivitást észlelték növényi és állati sejtekben.

Ráadásul, a Mn és a Fe, valamint a szerves anyagok a talajokban katalizálják az O2 felszabadulását a hidrogén-peroxidból.

A kataláz aktivitás nagyon stabil a talajban. Ezt mutatják a fontos összefüggések a szerves szén tartalommal és a talaj mélységének csökkenésével.

Nem találtak összefüggést a kataláz aktivitás és a talaj termékenysége között

A kataláz aktivitás mérés elméleti alapjai (3)6

Az eljárás alapelve

A módszer a talaj hidrogén-peroxiddal, három percig, szobahőmérsékleten történő inkubálása után felszabaduló oxigén térfogatbecslésén alapul.

7

Anyagok és segédeszközök

Erlenmeyer lombikok (200ml) Mágneses keverő Scheibler berendezés Ha a Scheibler berendezés nem érhető el, egy U-üveg

cső, Brodie oldattal töltve felhasználható a térfogat mérésére.

8

Vegyszerek és oldatok

Foszfát puffer (0,2 M, pH 6,8)Oldjunk 35,63 g Na2 hidrogén fosztfátot 700 ml desztillált vízben, igazítsuk a pH-t 6,8-ra HCl-el és 1000 ml desztillált víz higítással.

Nátrium karbonát oldat (10%)Oldjunk 100g Na2CO3-ot körülbelül 800 ml desztillált vízben és öntsük fel desztillált vízzel 1000 ml-ig.

H2O2 (3%)Közvetlenül a használat előtt készítsük elő.

Nátrium azid oldat (6,5%)6,5 g 100 ml-1 desztillált víz

Brodie oldat MnO2

9

Az eljárás (1)

Helyezzünk 5-10 g nedves vagy száraz talajt egy Erlenmeyer lombikba (200 ml) és adjunk hozzá 20 ml foszfát puffert.

Készítsük elő az ellenőrzőket, adjunk hozzá 2 ml azid oldatot és 20 ml foszfát puffert.

Forgassuk meg a lombikot és hagyjuk állni 30 percig.  Pipettáljunk 10 ml H2O2-ot (3%) a Scheibler berendezés

kis tartályába. A lombik bezárása után keverjük a hidrogén-peroxidot a

talaj mintával és inkubáljuk folytonos keverés mellett 3 percig szobahőmérsékleten (20 oC).

10

Az eljárás (2)

Majd olvassuk le a gáz térfogatváltozását a Scheibler berendezésben vagy az U-üveg csőben.

Az átalakult oxigén meghatározásához tegyünk 0,5 g MnO2 és 20 ml nátrium karbonát oldatot (10 %) a talaj helyett egy Erlenmeyer lombikba, adjunk hozzá 10 ml H2O2-ot (3 %) és olvassuk le a térfogat változását a Scheibler berendezésben (vagy az U-üveg csőben).

Az átalakult oxigént tekintjük 100 %-nak.

11

Számítás

Ahol: D0 az azid hiányában fejlődő O2 mililiterben, DA azid jelenlétében fejlődő O2 mililiterben, DMn a Mn jelenlétében fejlődött O2 mililiterben, dwt a talaj száraz tömege (%).

1000

dwtDDD

exKatalázindnM

A

12

Diszkusszió

Az azid használható az abiotikus H2O2 hidrolízis számításához.

A nedves vagy levegőn szárított talajok szobahőmérsékleten 4 hónapig raktározva nem mutatnak kataláz aktivitást.

A peszticidek gátolhatják vagy aktiválhatják is a talaj kataláz aktivitását, az összetételtől függően.

Összefüggést találtak a kataláz és a dehidrogenáz aktivitás között, azonban a kataláz és az amiláz aktivitás vagy a baktérium szám között csupán gyenge az összefüggés, vagy nincs.

13

Források

Alef K. and Nannipieri P. (Editors): Methods in Applied Soil Microbiology and Biochemistry, Academic Press Limited, London, 1995

Catalase:http://en.wikipedia.org/wiki/Catalase A kataláz enzim szerkezete és működése:

http://www.chem.science.unideb.hu/Oktatas/K3125/K3125Eload5.pdf (20.oldal)

Catalase structure: http://en.wikipedia.org/wiki/File:Catalase_Structure.png

Növényélettan jegyzet: marssoniella.uw.hu/4elettan.doc AP Biology Lab 2: Enzyme catalysis:

http://biowithberkeley.blogspot.com/2007/10/ap-biology-lab-2-enzyme-catalysis.html

14