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UNIVERSIDADE FEDERAL DE JUIZ DE FORA

FACULDADE DE FARMÁCIA

AVALIAÇÃO DAS ATIVIDADES ANTIOXIDANTE E FOTOPROTETORA DE

EXTRATO DE Eugenia uniflora L. (MYRTACEAE) VISANDO APLICAÇÕES

COSMÉTICAS

TAMIRES CALAES OLIVEIRA

Juiz de Fora

2016

2

Tamires Calaes Oliveira

AVALIAÇÃO DAS ATIVIDADES ANTIOXIDANTE E FOTOPROTETORA DE

EXTRATO DE Eugenia uniflora L. (MYRTACEAE) VISANDO APLICAÇÕES

COSMÉTICAS

Trabalho de Conclusão de Curso apresentado

a Faculdade de Farmácia da Universidade

Federal de Juiz de Fora como requisito parcial

a obtenção do título de Farmacêutica.

Orientadora: Profª. Drª. Fabiola Dutra Rocha

Juiz de Fora

2016

3

Tamires Calaes Oliveira

AVALIAÇÃO DAS ATIVIDADES ANTIOXIDANTE E FOTOPROTETORA DE

EXTRATO DE Eugenia uniflora L. (MYRTACEAE) VISANDO APLICAÇÕES

COSMÉTICAS

Trabalho de Conclusão de Curso

apresentado à Faculdade de Farmácia da

Universidade Federal de Juiz de Fora

como requisito parcial a obtenção do título

de Farmacêutica.

Aprovada em _____ de____________ de 2016

BANCA EXAMINADORA

_______________________________________

Profª. Drª. Fabiola Dutra Rocha - Orientador

Universidade Federal de Juiz de Fora

________________________________________

Prof. Dr. Guilherme Diniz Tavares

Universidade Federal de Juiz de Fora

________________________________________

Mestre Jordana Abreu Lazzarini

Universidade Federal de Juiz de Fora

4

AGRADECIMENTOS

Agradeço primeiramente Deus, pelo amor incondicional, pela força e amparo

em momentos tão difíceis.

Ao meu pai José Romeu e minha mãe Vera pelo exemplo de vida, carinho e

atenção em todos os momentos dessa jornada!

Aos meus irmãos Viviane e Paulo Henrique pelo incentivo, exemplo e carinho

sempre que precisei. À minha grande família, pelo amor e apoio de sempre.

Às minhas grandes amigas IgGs que sempre me ouviram, deram força, me

empurrando para frente e me aturando nos momentos de “picos” de estresse!!

Ao meu namorado Thomaz pelo apoio, carinho e compreensão.

À minha orientadora, Profª Drª Fabíola, não somente por toda sua

contribuição neste trabalho, mas por sua amizade, paciência, dedicação e pelos

ensinamentos tanto profissionais quanto pessoais. Você sempre será para mim um

modelo de profissional que um dia pretendo ser.

A toda equipe do laboratório de Farmacognosia, professora Magda, Celinha e

alunos de iniciação científica, pela ajuda e amizade em todos os momentos sem os

quais não seria possível a conclusão desse trabalho.

Aos professores e alunos da UFRJ que coletaram e identificaram as plantas

estudadas e que forneceram alguns dos extratos e frações que foram testados.

A PROPESQ pelo apoio financeiro à iniciação científica.

Ao CNPq e FAPERJ pelo apoio financeiro que possibilitou adquirirmos

reagentes e equipamentos para a realização dos ensaios.

Aos membros da banca pela disponibilidade e boa vontade.

E por último, a todos que torceram por mim para a conquista dessa nova

etapa.

MUITO OBRIGADA!!

5

RESUMO

A exposição à radiação solar traz vários benefícios a saúde, uma vez que

estimula a produção de vitamina D, ajuda a controlar algumas doenças crônicas da

pele e provoca uma sensação de bem-estar. No entanto, quando em excesso, pode

causar danos cutâneos agudos e crônicos, como queimaduras solares,

aparecimento de rugas e outras mudanças associadas com o envelhecimento da

pele, além de certos tipos de tumores. O uso de fotoprotetores é uma das principais

abordagens na prevenção dos efeitos prejudiciais da radiação ultravioleta (UV). A

busca por alternativas mais eficientes, multifuncionais (fotoproteção, antioxidante,

antienvelhecimento), bem como menor uso de agentes sintéticos e com menor

potencial irritante, tem despertado o interesse de muitos pesquisadores. Nesse

sentido, os extratos vegetais ricos em quantidade e variedade de metabólitos

fenólicos, associado com pronunciada atividade antioxidante, com baixa toxicidade e

impacto ambiental insignificante, surgem como alternativa promissora. A espécie

Eugenia uniflora L. (Myrtaceae), popularmente conhecida como pitangueira,

pertence a um gênero que é conhecidamente rico em metabólitos fenólicos

(flavonoides, taninos, fenólicos simples) e com grande potencial antioxidante. Desta

forma, o presente trabalho teve como principal objetivo avaliar as atividades

antioxidante e fotoprotetora, in vitro, do extrato hidroalcoólico dos ramos em forma

de galhos de E. uniflora (EEAgEu) e suas frações, bem como desenvolver uma

formulação a base de silicone, contendo tal extrato incorporado. O perfil químico do

EEAgEu e suas frações em hexano (FHgEu), em diclorometano (FDgEu), em

acetato de etila (FAgEu) e fração residual (FRgEu) foi estabelecido quali e

quantitativamente através, respectivamente, de CCD e de determinação do teor de

metabólitos fenólicos totais pelo método espectrofotométrico com o reagente de

Folin-Ciocalteu. A atividade antioxidante das amostras foi estabelecida pelo método

de redução do radical DPPH. Já o potencial fotoprotetor do EEAgEu foi avaliado pelo

método espectrofotométrico in vitro do Fator de Proteção Solar (FPS). A análise dos

cromatogramas por CCD revelou a presença predominante e diversificada de

metabólitos polifenólicos no EEAgEu e suas frações. O teor total de substâncias

fenólicas encontrado foi de 23 a 376 mg EAG/g de amostra e as CE50 no teste com

DPPH variaram de 9 a 52 µg/mL, sendo que os melhores resultados foram para o

EEAgEu (376 mg EAG/g ±64,5 e CE50 = 9 µg/mL ±0,35). O valor de FPS (espectrométrico)

para o EEAgEu a uma concentração de 200mg/L, diluído em etanol, foi de 7. O

EEAgEu foi incorporado a uma formulação a base de silicone em concentrações de

2,5, 5 e 10% p/p, a qual demonstrou ser estável preliminarmente após a adição do

extrato, quanto a características físico-químicas (análises macroscópicas, ensaio de

centrifugação e pH). A formulação contendo 100 mg/g de EEAgEu teve um valor de

FPS(espectrométrico) de 6. Os resultados indicam que o EEAgEu pode ser fonte de

substâncias bioativas com pronunciada atividade antioxidante, além de interessante

atividade fotoprotetora e dessa forma constitui uma alternativa para futuras

aplicações cosméticas.

Palavras-chaves: Eugenia uniflora L., substâncias fenólicas, potencial antioxidante;

atividade fotoprotetora.

6

ABSTRACT

Exposure to solar radiation has several health benefits, since it stimulates the

production of vitamin D, helps control certain chronic diseases of the skin and causes

a feeling of well-being. However, when excessive, can cause acute and chronic skin

damage such as sunburn, appearance of wrinkles and other changes associated with

skin aging, and certain types of tumors. The use of sunscreens is a major approach

in preventing the damaging effects of ultraviolet (UV) radiation. The search for more

efficient, multifunctional alternative (photoprotection, antioxidant, anti-aging) and less

use of synthetic agents and less irritation potential has aroused the interest of many

researchers. In this sense, the plant extracts rich in quantity and variety of phenolic

metabolites associated with pronounced antioxidant activity, low toxicity and

negligible environmental impact, emerge as a promising alternative. The species

Eugenia uniflora L. (Myrtaceae), popularly known as Surinam cherry, belongs to a

genre that is known to be rich in phenolic metabolites (flavonoids, tannins, simple

phenols) with great potential antioxidant. Thus, this study aimed to evaluate the

antioxidant activity and fotoprotera, in vitro, the hydroalcoholic extract of the branches

in the form of E. uniflora branches (EEAgEu) and its fractions, as well as develop a

formulation based on silicone, containing such embedded statement. The chemical

profile EEAgEu and its fractions in hexane (FHgEu) in dichloromethane (FDgEu) in

ethyl acetate (FAgEu) and residual (FRgEu) was established qualitatively and

quantitatively by, respectively, CCD and determining the content phenolic metabolites

by the spectrophotometric method with the Folin Ciocalteu method. The antioxidant

activity of the samples was established by the reduction of the DPPH method. But the

potential of photoprotective EEAgEu was evaluated by spectrophotometric method in

vitro Sun Protection Factor (SPF). The analysis of chromatograms by TLC revealed

the predominant and diverse presence of polyphenol metabolites in EEAgEu and its

fractions. The total content of phenolic compounds was found to be 23-376 mg

GAE/g of sample and EC50 in the test with DPPH varied 9 to 52 µg/mL, and the best

results were to EEAgEu (376 mg GAE/g ± EC50 = 9 and 64.5 µg/mL ± 0.35). The

value of SPF (spectrometric) for EEAgEu at a concentration of 200mg/L diluted in ethanol

was 7. The EEAgEu was incorporated into a silicone formulation in concentrations of

2.5, 5 and 10% p/p, which proved to be stable after the addition of the extract, as the

physicochemical characteristics (macroscopic analysis, assay centrifugation and pH).

The formulation containing 100 mg/g EEAgEu had an value SPF(spectrometric) 6. The

results indicate that the EEAgEu can be a source of bioactive substances with a

pronounced antioxidant activity, and interesting photoprotective activity and therefore

constitute an alternative for future cosmetic applications.

Keywords: Eugenia uniflora L., phenolic substances, antioxidant potential;

photoprotective activity.

7

LISTA DE FIGURAS

Figura 1. Foto de exemplares da planta Eugenia uniflora L. – PITANGA. 16

Figura 2. Flor de Eugenia uniflora L. 17

Figura 3. Fruto de Eugenia uniflora L. 18

Figura 4. Estruturas químicas de (1) galocatequina e (2) miricitrina. 19

Figura 5. Estruturas químicas de (1) oenoteína B, (2) eugeniflorina D1 e (3)

eugeniflorina D2. 19

Figura 6. Estruturas químicas de (1) galoil-2,3-di-O-galoil-β-D-glicose; (2) 1,2,3,4,6-

penta-O-galoil-β-D-glicose; (3) gemina D; (4) hippomanina A; (5) camptotina A; (6)

canferol-3-α-L-ramnopiranosídeo; (7) miricetina-3-O-(2”-O-galoil)-α-L-

ramnopiranosídeo. 20

Figura 7. Estruturas químicas. Carotenoides: (A) Licopeno e (B) β-Caroteno; (C)

Rubixantina. 22

Figura 8. Estruturas de antocianinas descritas para espécies de Eugenia. 22

Figura 9. Estruturas químicas de (1) miricetina, (2) canferol e (3) quercetina. 23

Figura 10. Estruturas químicas de alguns constituintes identificados no óleo

essencial de E. uniflora. (A) Citronelol; (B) Geraniol; (C) Cineol; (D) e (E)

Sesquiterpenos: Germacreno B e curzereno e furanodieno. 24

Figura 11. Estruturas das substâncias (1) germacrona, (2) curzereno, (3)

furanodieno, (4) germacreno B, (5) β-elemenona, (6) γ-elemeno e (7) β-cariofileno

presentes no óleo essencial das folhas de Eugenia uniflora L. 24

Figura 12. Exemplos das principais classes de metabólitos fenólicos: ácidos

fenólicos (1), fenilpropanoides (2), flavonoides (3) e taninos (4). 26

Figura 13. Estrutura química geral de derivados do ácido benzóico. 27

Figura 14. Estrutura química geral de derivados do ácido cinâmico. 28

Figura 15. Estrutura básica dos flavonoides. 28

Figura 16. Exemplos das principais subclasses de flavonoides. 29

Figura 17. Esquema simplificado da respiração celular. 31

Figura 18. Reações de Fenton [1] e Haber-Weiss [2]. 32

Figura 19. Esquema exemplificador da estabilização do radical fenoxila por

ressonância. 33

Figura 20. Representação das camadas da pele. 35

8

Figura 21: Representação do espectro de radiação eletromagnética emitido pelo sol.

37

Figura 22. Mecanismos de interação dos filtros ultravioleta com a radiação solar.

40

Figura 23. Forma de ação dos filtros UV inorgânicos e orgânicos. 40

Figura 24. Obtenção dos extratos e frações a partir dos ramos em forma de galhos

E. uniflora. 48

Figura 25. Incorporação do EEAgEu à formulação 1. 56

Figura 26. Cromatogramas em CCD. Fase estacionária: sílica GF254. Fase móvel

hexano:acetato de etíla 8:2 para (A), (B) e (C); cloroformio metanol 9:1 para (D).

Reveladores utilizados (A): sulfato cérico (B): anisaldeído sulfúrico (C): cloreto férrico

(D): NP/PEG. 60

Figura 27. Cromatograma CCD. Fase estacionária: sílica C18 (fase inversa). Fase

móvel: Butanol : ácido acético: água (4: 1: 5). Revelador: NP/PEG. 60

Figura 28. Varredura do extrato de E. uniflora na região do ultravioleta (200 a

400nm). 61

Figura 29. Esquema de desprotonação do ácido gálico em meio alcalino e posterior

reação com molibdênio presente no reagente de Folin Ciocaulteu. 62

Figura 30. Redução do radical livre DPPH. 66

Figura 31. Varredura na região do ultravioleta (200 a 400nm) das formulações 1 e 2.

72

Figura 32. Filtro solar UVA/UVB hidrossolúvel incorporado à formulação 1 a 10%v/p.

73

Figura 33. EEAgEu incorporado a formulação 1 nas concentrações de: (A) 2,5%; (B)

5% e (C) 10%p/p. 73

9

LISTA DE GRÁFICOS

Gráfico 1. Curvas analíticas sobrepostas de ácido gálico, obtidas para a

quantificação de substâncias fenólicas por espectrofotometria no ultravioleta-visível

em λ 760 nm. 63

Gráfico 2. Curva analítica de ácido gálico equivalente aos três dias de ensaio. Os

valores representam a média ± desvio padrão. A equação da reta e o R2 se referem

à resultante dos três dias de ensaio. 63

Gráfico 3. Resultados de FPS das formulações com EEAgEu comparados com o

valor mínimo de atividade fotoprotetora UVB de 6. 75

10

LISTA DE TABELAS

Tabela 1. Fontes endógenas e exógenas das espécies reativas de oxigênio no corpo

humano. 29

Tabela 2. Constante EE x I empregada no cálculo por espectrofotometria. 54

Tabela 3. Formulação 1- com silicone 9011 54

Tabela 4. Formulação 2- com silicone 5225. 55

Tabela 5. Doseamento de substâncias fenólicas expressos em equivalente em ácido

gálico (EAG mg/g amostra). 64

Tabela 6. CE50 do EEAgEu, suas frações e extrato de G. Biloba frente ao radical

DPPH. 67

Tabela 7. Análise estatística pela Correlação de Pearson entre o teor de derivados

fenólicos total e a atividade antioxidante obtida pelo método DPPH. 69

Tabela 8: Resultados de FPS das soluções em etanol de EEAgEu, por leitura em

espectrofotômetro. 70

Tabela 9. Resultados de FPS das formulações com EEAgEu, por leitura em

espectrofotômetro. 74

11

SUMÁRIO

1. INTRODUÇÃO 13

2. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA 14

2.1. Gênero Eugenia 14

2.2. Eugenia uniflora Linnaus 15

2.3. Metabólitos fenólicos 25

2.4. Estresse oxidativo e antioxidantes 29

2.5. Efeitos da radiação solar sobre a pele 34

2.6. Proteção solar 39

3. OBJETIVOS 43

3.1. Objetivo Geral 43

3.2. Objetivos Específicos 43

4. MATERIAL E MÉTODOS 44

4.1. Material vegetal 44

4.1.1. Autorizações 44

4.1.2. Eugenia uniflora Linnaeus 44

4.2. Equipamentos e reagentes 44

4.3. Preparação de reagentes 46

4.4. Obtenção dos extratos e frações 47

4.5. Análise por Cromatografia em Camada Delgada (CCD) do extrato e das frações

48

4.6. Obtenção do espectro de varredura na região do ultravioleta 48

4.7. Determinação do teor total de metabólitos fenólicos 49

4.8. Avaliação da atividade antioxidante pelo ensaio espectrofotométrico de redução

do radical 2,2-difenil-1-picrilidrazila (DPPH•) 51

4.9. Determinação do fator de proteção solar espectrofotométrico (FPS

espectrofotométrico) in vitro do extrato 53

4.10. Preparação das formulações 54

4.10.1. Verificação das características físicas e químicas das formulações 55

4.10.2. Incorporação do EEAgEu a formulação 1. 55

4.11. Determinação do fator de proteção solar espectrofotométrico (FPS

espectrofotométrico) in vitro 56

5. RESULTADOS E DISCUSSÃO 58

12

5.1. Caracterização Química de Eugenia uniflora 58

5.2. Determinação do teor total de metabólitos fenólicos 61

5.3. Avaliação da atividade antioxidante pelo ensaio espectrofotométrico de redução

do radical 1,1-difenil-2-picrilidrazila (DPPH) 65

5.4. Determinação do fator de proteção solar espectrofotométrico (FPS espectrofotométrico)

in vitro do extrato 70

5.5. Obtenção das formulações 71

5.5.1. Verificação das características físicas e químicas das formulações 72

5.6. Determinação do fator de proteção solar espectrofotométrico (FPS

espectrofotométrico) in vitro 73

6. CONSIDERAÇÕES FINAIS E CONCLUSÃO 77

REFERÊNCIAS 79

13

1. INTRODUÇÃO

A espécie Eugenia uniflora L., de nome popular pitangueira, é uma árvore

nativa no Brasil, mas muito cultivada e difundida em outros países da América do Sul

(SANTOS, FILHO & CASTRO, 2015). Essa espécie possui muitos constituintes já

identificados, dentre eles muitos metabólicos fenólicos (CARVALHO, 2013). Em

geral, substâncias fenólicas são descritas como potentes antioxidantes, agindo por

diversos mecanismos como: doação de elétrons, interrupção da cadeia de reações

de oxidação e quelação de metais (MARTOS et al., 2010; SOUZA, 2013).

A teoria de que o envelhecimento é resultado de danos causados por radicais

livres baseia-se na observação de que a irradiação da luz solar, dependendo da

energia, em seres vivos induz a formação de radicais livres. Uma produção

exacerbada de radicais livres diminui o tempo de vida desses seres e produz

mudança que conduz ao envelhecimento. De acordo com esta teoria, o lento

desenvolvimento de danos celulares irreversíveis leva ao envelhecimento (HIRATA,

SATO & SANTOS, 2004).

A exposição da pele à radiação ultravioleta (UV) é responsável por alterações

cutâneas relacionadas com o envelhecimento precoce, sendo que a maioria é

resultante da ação das espécies reativas de oxigênio (ERO). Embora muitas

formulações cosméticas contenham filtros para radiação UV, estes não

proporcionam uma proteção total da pele, principalmente quando são considerados

efeitos crônicos como o fotoenvelhecimento (DAMIANI et al., 2006). Desta maneira,

os antioxidantes, com extratos vegetais ricos em metabólitos fenólicos, têm sido

empregados em formulações fotoprotetoras com finalidade de proteger a pele contra

os ERO.

Nesse contexto, formulações fotoprotetoras com associações de extratos

vegetais ricos em constituintes fenólicos e outros filtros químicos de radiação UV têm

despertado grande interesse na área dermocosmética. Esse interesse surge a partir

da comprovação de sua capacidade tanto de absorver a radiação solar como a

antioxidante, que juntas podem intensificar a proteção final do produto e/ou

neutralizar os radicais livres produzidos na pele após exposição ao sol (SOUZA et

al., 2013). Assim, os resultados desta pesquisa poderão contribuir para um melhor

entendimento dos efeitos fotoprotetores dos extratos de Eugenia uniflora, quando

estes são adicionados a uma formulação cosmética.

14

2. REVISÃO DA LITERATURA

2.1. Gênero Eugenia

Eugenia é um dos 145 gêneros que compõem a família Myrtaceae. A família

Myrtaceae tem grande distribuição, sendo encontrada na sua maioria em zonas

tropicais e subtropicais e é representada por 5.970 espécies (THE PLANT LIST

2010). No Brasil, são registrados 23 gêneros e 1.034 espécies. Os gêneros de maior

representatividade em espécies são: Eugenia com 2.218 espécies e Myrcia com

1.227 espécies (THE PLANT LIST 2010; SOBRAL et al., 2016).

Uma grande variedade de Myrtaceae é registrada nas restingas brasileiras,

podendo ser considerada a família mais representativa da restinga do Rio de

Janeiro. Também o gênero Eugenia é o mais representativo da região (PLAZA,

2007).

O gênero Eugenia se destaca por seu grande potencial econômico,

farmacológico e possui grande exploração comercial dos seus frutos (que são

comestíveis), de sua madeira, do óleo essencial, além do uso como plantas

ornamentais (QUEIROZ et al., 2015).

Uma grande gama de plantas do gênero Eugenia tiveram suas atividades

biológicas registradas, como atividades antimicrobiana, antifúngica (SÁ, 2008),

hipoglicemiante (COUTO et al., 2009), diurética (TIMBOLA et al., 2002), adstringente

(REVILLA, 2002), anti-inflamatória (HUSSEIN et al., 2003), desordens gástricas

(CONSOLINI, BALDINI & AMAT, 1999), anticonvulsivante (DIAS et al., 2012),

carminativa (LEE et al., 1997), ente outras atividades. Esses registros conduziram a

vários estudos relativos à variabilidade genética, análise de composição e atividades

biológicas dos constituintes que integram as plantas, com finalidade de comprovação

terapêutica (DONATO & MORRETES, 2007; SLAVIERO et al., 2009; STEFANELLO,

PASCOAL & SALVADOR, 2011; QUEIROZ et al., 2015).

A composição dos óleos essenciais de espécies de Eugenia, bem como outras

plantas da família Myrtaceae já foi amplamente estudada. Existe uma grande

predominância de monoterpenos e sesquiterpenos nos óleos essenciais de espécies

desta família (LIMBERGER et al., 2004). Diferenças quantitativas e qualitativas nos

óleos essenciais entre espécies de Eugenia têm sido propostas como dado útil para

melhor caracterização taxonômica de espécies do gênero (COLE, HARBER &

SETZER, 2007).

15

O perfil químico do gênero Eugenia revela-se rico em substâncias fenólicas,

como taninos, substâncias fenólicas simples e flavonoides. Por possuir alto teor de

derivados polifenólicos, as espécies do gênero Eugenia têm como característica

importante a atividade antioxidante, relacionada a estas substâncias (EINBOND et

al., 2004). Além de substâncias fenólicas, como taninos (LEE et al., 1997; YANG,

LEE & YEN, 2000) e flavonoides (EINBOND et al., 2004), foram descritos para o

gênero Eugenia substâncias derivados do metabolismo dos terpenos, como os

triterpenos e esteroides (GU et al., 2001; LUNARDI et al., 2001), carotenoides

(AZEVEDO-MELEIRO & RODRIGUEZ-AMAYA, 2004), entre outros metabólitos

(CRUZ & KAPLAN, 2005).

A presença de metabólitos flavonoidicos é descrita em várias espécies do

gênero Eugenia, sendo que são formados principalmente pelas agliconas quercetina

e miricetina. Muitas agliconas são relacionadas às atividades biológicas

apresentadas para estas espécies, como anti-inflamatória, inibidora da xantina-

oxidase (enzima relacionada a patologia da artrite e gota) e também à atividade

antioxidante (THEODULOZ et al., 1988; EINBOND et al., 2004).

2.2. Eugenia uniflora Linnaus

A espécie Eugenia uniflora L. (Figura 1), a popular pitangueira, é uma árvore

nativa no Brasil, contudo muito cultivada e difundida em outros países da América do

Sul (SANTOS et al., 2015). No Brasil, essa espécie ocorre desde o estado de Minas

Gerais até o Rio Grande do Sul, sendo abundante em matas ciliares, florestas de

ilhas da costa litorânea e nos biomas caatinga e restinga (FIUZA et al., 2008; DIAS

et al., 2011).

16

Figura 1. Foto de exemplares da planta Eugenia uniflora L. – PITANGA.

Fonte: LOPES, 2008.

É uma planta semidecídua, heliófita e higrófita seletiva, tendo arbustos ou

arvoretas de até 8 m e com 20-50 cm de altura. O fruto possui sabor agradável e

refrescante, com um aroma atrativo, o que desperta interesse em relação ao cultivo

dessa espécie, como uma promissora atividade econômica (BRUN & MOSSI, 2010;

DIAS et al., 2011).

A espécie E. uniflora possui folhas jovens de coloração bronze que passa a

verde escuro de acordo com seu envelhecimento. São plantas glabras de folhas

mais ou menos coriáceas, elípticas ou ovadas, com ápice agudo ou acuminado e

base obtusa ou aguda, opostas simples com pequenas espículas. São peninérveas

com uma nervura que acompanha a base do limbo, de 3 a 7 cm de comprimento e

com aroma característico (BRUN & MOSSI, 2010; SANTOS et al., 2015). As flores

(Figura 2) são brancas, podendo ser encontrada sozinhas ou em grupos de 2 ou 3

flores nas axilas e nas extremidades dos ramos (FIUZA et al., 2008).

17

Figura 2: Flor de Eugenia uniflora L.

FONTE: FLORARS, 2012.

Os frutos (Figura 3) são bagas arredondadas e relativamente pequenas, de

cor vermelha, amarela ou preta, contendo 1 a 2 sementes, tendo como parte

comestível a sua polpa carnosa e agridoce. A polpa possui sabor exótico e é rica em

cálcio, fósforo, antocianinas, flavonoides, carotenoides e vitamina C, o que indica

seu elevado poder antioxidante (FIUZA et al., 2008; BIERHALS et al., 2012).

18

Figura 3: Fruto de Eugenia uniflora L.

FONTE: FLORARS, 2008.

Os primeiros registros do uso de E. uniflora na medicina popular brasileira

datam do século XV, pelos índios Guaranis contra diversas enfermidades. A espécie

é preconizada na medicina tradicional como anti-hipertensiva, diurética, adstringente,

antipirético e para o tratamento de desordens digestivas. Na Ilha da Madeira as

folhas de E. uniflora têm seu uso no tratamento de bronquites, gripes e problemas

no intestino e na Nigéria como um febrífugo (FIUZA et al., 2008).

As folhas têm seu uso na medicina popular na forma de infusões ou

decocções para controlar a diarreia e a tosse, como hipotensor, antigota e

hipoglicemiante (SANTOS et al., 2015; BRUN & MOSSI, 2010). Os frutos podem ser

consumidos in natura, polpa integral congelada, suco engarrafado, sorvetes, picolés,

licores, geleias, vinho entre outros. A pitangueira também pode fornecer madeira,

além de servir como planta ornamental e cerca viva por possuir copa densa e

compacta (DIAS et al., 2011; BIERHALS et al., 2012).

Nos trabalhos realizados por Lee e colaboradores (1997) foram verificados, a

partir das folhas de pitanga, constituintes fenólicos no extrato metanólico, entre eles

os derivados flavonoidicos galocatequina e miricitrina, (figura 4) além de taninos

como oenoteína B, eugeniflorina D1 e eugeniflorina D2 (figura 5).

19

Figura 4. Estruturas químicas de (1) galocatequina e (2) miricitrina.

(1) (2)

Fonte: LEE et al., 1997; MEOTTI, 2006.

Figura 5. Estruturas químicas de (1) oenoteína B, (2) eugeniflorina D1 e (3)

eugeniflorina D2.

(1)

(2) (3)

Fonte: LEE et .al., 1997.

20

Em um estudo recente, foram identificados a partir de extratos de folhas de

Eugenia uniflora L. diversos metabólitos fenólicos, entre eles o galoil-2,3-di-O-galoil-

β-D-glicose, o 1,2,3,4,6-penta-O-galoil-β-D-glicose, gemina D, hippomanina A,

camptotina A, canferol-3-α-L-ramnopiranosídeo e miricetina-3-O- (2”-O-galoil) -α-L-

ramnopiranosídeo (Figura 6) (CARVALHO, 2013).

Figura 6. Estruturas químicas de (1) galoil-2,3-di-O-galoil-β-D-glicose; (2) 1,2,3,4,6-

penta-O-galoil-β-D-glicose; (3) gemina D; (4) hippomanina A; (5) camptotina A; (6)

canferol-3-α-L-ramnopiranosídeo; (7) miricetina-3-O- (2”-O-galoil) -α-L-

ramnopiranosídeo.

(1) (2)

(3) (4)

21

(5)

(6) (7)

Fonte: CARVALHO, 2013.

Os frutos são ricos em carotenoides, como o licopeno, β-caroteno e

rubixantina, (Figura 7) (AZEVEDO-MELEIRO & RODRIGUEZ-AMAYA, 2004). Em

outra publicação, tendo como material de estudo a polpa congelada de pitanga, foi

encontrado alto ter de substâncias fenólicas e carotenoides. A pitanga contém

antocianidinas, as quais têm função importante na pigmentação tanto das flores

como dos frutos e apresentaram ação antioxidante. Vários pigmentos antociânicos

derivados de cianidina-3-O-β-glicopiranosídeo e delfinidina-3-O-β-glicopiranosídeo

têm sido descritos para espécies de Eugenia (Figura 8) (EINBOND et al., 2004). Em

pesquisas realizadas por HOFFMANN-RIBANI e colaboradores (2009) foram

identificados nos frutos de pitangueira os flavonoides miricetina, canferol e

quercetina (figura 9).

22

Figura 7: Estruturas químicas. Carotenoides: (A) Licopeno e (B) β-Caroteno; (C)

Rubixantina.

FONTE: Adaptado de AMBROSIO, CAMPOS & FARO, 2006; Adaptado de ARPIN &

LIAAEN-JENSEN SIMAS, 1969.

Figura 8. Estruturas de antocianinas descritas para espécies de Eugenia.

Fonte: KUSKOSKI et al., 2003.

(B)

(A)

(C)

23

Figura 9. Estruturas químicas de (1) miricetina, (2) canferol e (3) quercetina.

(1) (2) (3)

Fonte: PESSANHA, 2010.

No extrato em acetona dos frutos de Eugenia uniflora foram encontrados

carotenoides, sendo que o predominante foi o licopeno, seguido por derubixantina,

cis-rubixantina, β-criptoxantina, cis-licopeno, β-caroteno, γ-caroteno, zeaxantina,

luteína, violaxantina e β-caroteno-5,6-epóxido (AZEVEDO-MELEIRO &

RODRIGUEZ-AMAYA, 2004).

Nos óleos essenciais das folhas de E. uniflora foram encontrados

monoterpenos como citronelol, geraniol, cineol e sesquiterpenos (germacreno B,

curzereno e furanodieno) (Figura 10) (AURICCHIO et al., 2007; FIUZA et al., 2008;

LOPES, 2008 ALMEIDA, FARIA & SILVA, 2012). Em outro trabalho realizado com as

folhas, foi encontrado no óleo essencial a presença de β-ocimeno (7,4%), α-selineno

(7,2%), β-selineno (5,2%), germacreno B (7,2%) e ácido hexadecanóico (11,7%)

(BAGETTI, 2009). Santos e colaboradores (2015) identificaram no óleo essencial

das folhas jovens e maduras de E. uniflora, como principais constituintes, o

curzereno, a germacrona, o furanodieno, o germacreno B, a β-elemenona, o γ-

elemeno e o β-cariofileno (Figura 11).

24

Figura 10: Estruturas químicas de alguns constituintes identificados no óleo

essencial de E. uniflora. (A) Citronelol; (B) Geraniol; (C) Cineol; (D) e (E)

Sesquiterpenos: Germacreno B e curzereno e furanodieno.

Fonte: (A) Adaptado de MACIEL et al, 2010; (B) Adaptado de SIMAS et al, 2004; (C)

Adaptado de MORAIS et al, 2006; (D) Adaptado de LOPES, 2008; Adaptado de

MELO et al, 2007.

Figura 11. Estruturas das substâncias (1)germacrona, (2)curzereno, (3) furanodieno,

(4) germacreno B,(5) β-elemenona, (6) γ-elemeno e (7) β-cariofileno presentes no

óleo essencial das folhas de Eugenia unifloraL.

Fonte: SANTOS et al., 2015.

(B) (A) (C)

(D) Germacreno B Curzereno Furanodieno

25

Em relação ao uso na medicina tradicional da espécie E. uniflora, as folhas

têm sido citadas como eficientes no tratamento de diversas enfermidades como

febre, doenças estomacais e hipertensão (BANDONI et al., 1972; ALICE, 1991),

reumatismo (ALICE, 1991), bronquite (RIVERA & OBON, 1995), como atividade

calmante (CONSOLINI & SARUBBIO, 2002) e anti-inflamatória (SCHAPOVAL et al.,

1994).

Ensaios farmacológicos realizados com os extratos das folhas da E. uniflora

permitiram evidenciar atividade inibitória da enzima xantina-oxidase por ação dos

flavonoides (FIUZA et al., 2008). Também foi observada a ação das folhas na

medicina como diurético através de métodos in vitro (AMAT & YAJIA, 1991;

CONSOLINI et al., 1999), antimicrobiano e também como antifúngico (ADEBAJO,

OLOREK & ALADESANMI, 1989; HOLETZ et al., 2002; COELHO DE SOUZA et al.,

2004).

Também foi observado que o extrato de folhas age na inibição da digestão de

açúcares e gorduras, reduzindo a absorção gastrintestinal destes nutrientes, o que

pode ser eficiente no tratamento de diabete e obesidade (ARAI et al., 1999;

MATSUMURA et al., 2000).

Extratos dos frutos da pitangueira, assim como das folhas, também

demonstraram ter alta atividade antimicrobiana contra Lactobacillus casei,

Escherichia coli, Streptococcus pyogenes, Providencia spp., Proteus mirabilis,

Shigella sonnei, Staphylococcus aureus e Staphylococcus spp. (Auricchio & Bacchi,

2003, Castro et al., 2010).

Estudos com óleos essenciais extraídos de folha de pitanga demonstram

atividades biológicas, tais como antimicrobiana, antioxidante, hepatoprotetora,

antifúngica e inseticida (SANTOS et al., 2015).

Com o seu grande uso em diversas áreas no tratamento tradicional e a

identificação de metabólitos biologicamente ativos, é possível inferir que E. uniflora

L. possui um elevado atrativo para pesquisas no campo medicinal e na área

cosmética (SANTOS et al., 2015).

2.3. Metabólitos fenólicos

As plantas, dentre alguns seres vivos, possuem dois tipos de metabolismo,

sendo eles classificados como primário e secundário. O metabolismo primário tem

26

como função a sobrevivência da planta, estando ligado à fotossíntese, à respiração

e à fixação de nutrientes. Já o denominado metabolismo secundário, se torna

responsável pelos mecanismos de defesa, perpetuação, adaptação, crescimento e

reprodução (SOUZA, 2013). Dessa forma, os metabólitos secundários, dentre eles

os metabólitos fenólicos, são essenciais para a sobrevivência da planta, tendo sua

produção aumentada em condições de estresse como infecções, ferimentos e

incidência de radiação ultravioleta (ANGELO & JORGE, 2007; SOUZA, 2013).

Os metabólitos fenólicos estão distribuídos em diversas espécies na natureza,

tendo-se uma estimativa de mais de 8000 substâncias fenólicas já identificadas em

plantas. Essas substâncias podem assumir função de pigmento, conferindo

aparência colorida aos alimentos ou agir no seu metabolismo secundário, atuando

no crescimento e reprodução além de agirem como agentes antipatogênico (SILVA

et al., 2010; SOUZA, 2013).

Quimicamente, substâncias fenólicas são definidas como aquelas que

possuem em sua estrutura um (ou mais) anel aromático com um ou mais substituinte

hidroxila (ANGELO & JORGE, 2007). Essas substâncias possuem estrutura variável

e, portanto, são multifuncionais. Dentre os metabólitos fenólicos, destacam-se os

ácidos fenólicos, os flavonoides, os fenólicos simples, os fenilpropanoides, as

cumarinas, os taninos, as ligninas e tocoferóis (Figura 12) (SOOBRATTEE et al,

2005; ANGELO & JORGE, 2007).

Figura 12. Exemplos das principais classes de metabólitos fenólicos: ácidos

fenólicos (1), fenilpropanoides (2), flavonoides (3) e taninos (4).

27

Fonte: Adaptado de SOOBRATTE et al., 2005.

Em geral, substâncias fenólicas são descritas como potentes antioxidantes,

agindo por diversos mecanismos como: doação de elétrons, interrupção da cadeia

de reações de oxidação e quelação de metais (MARTOS et al., 2010; SOUZA,

2013).

Além de sua capacidade antioxidante, as substâncias fenólicas, principalmente

ácidos fenólicos, flavonoides e taninos possuem outras propriedades benéficas à

saúde como anticancerígena, antimicrobiana, antialérgica, hepatoprotetora,

antitrombótica, antiviral, vasodilatador, antimutagênica e atividade anti-inflamatória.

Visto que, muitas destas funções biológicas têm sido correlacionadas com a sua

capacidade antioxidante (SOOBRATTEE et al., 2005; BAGETTI, 2009).

Entre os metabólitos fenólicos com grande potencial antioxidante, destacam-se

dois grandes grupos, os flavonoides e seus derivados e os ácidos fenólicos (ácidos

benzóico, cinâmico e seus derivados) (SOARES, 2002).

Os ácidos fenólicos podem ser divididos em duas categorias principais. A

primeira é composta pelos derivados do ácido benzóico (Figura 13), que possuem

sete átomos de carbono e são os ácidos fenólicos mais simples encontrados na

natureza. A segunda é formada pelos derivados do ácido cinâmico (Figura 14),

também chamados fenilpropanoides, que possuem nove átomos de carbono

(SOARES, 2002).

Figura 13. Estrutura química geral de derivados do ácido benzóico.

Fonte: SOARES, 2002.

28

Figura 14. Estrutura química geral de derivados do ácido cinâmico.

Fonte: SOARES, 2002.

Os derivados flavonoidicos (Figura 15) possuem uma estrutura básica formada

por C6-C3-C6, sendo uma das classes de metabólitos secundários mais diversificada

do reino vegetal (SOARES, 2002).

Figura 15. Estrutura básica dos flavonoides.

Fonte: LEE et al., 2004.

Entre as principais subclasses de flavonoides (Figura 16), encontram-se as

antocianidinas, flavonas, flavonóis e, com menor frequência, as auronas, chalconas

e isoflavonas, dependendo do lugar, número e combinação dos grupamentos

participantes da estrutura da molécula (SOARES, 2002).

29

Figura 16. Exemplos das principais subclasses de flavonoides.

Fonte: CERQUEIRA et al., 2007.

2.4. Estresse oxidativo e antioxidantes

O metabolismo oxidativo, que ocorre naturalmente no organismo de

mamíferos, tem como um de seus produtos as espécies reativas de oxigênio (ERO).

A formação das ERO acontece através da ação de enzimas no processo de

transferência de elétrons, além da exposição a outros fatores, entre eles, o ozônio,

radiação gama e ultravioleta, medicamentos, dieta e tabagismo (Tabela 1)

(BAGETTI, 2009).

Tabela 1. Fontes endógenas e exógenas das espécies reativas de oxigênio no corpo

humano.

Fonte: BIANCHI et al., 1999.

30

Radicais livres são espécies definidas como aquelas que possuem em sua

estrutura um ou mais elétrons não emparelhados, com alta reatividade e capacidade

de formar outros radicais através de reações químicas em cadeia. (SELLÉS, 2011).

A presença de elétron não pareado confere ao radical livre instabilidade energética e

cinética, pois para que se mantenham estáveis precisam doar ou retirar um elétron

de outra molécula (COTINGUIBA et al., 2013).

As espécies reativas de oxigênio incluem radicais livres como o radical

hidroxila (HO•), o ânion superóxido (O2•), o radical hidroperoxila (HO2

•) os radicais

alcoxila (RO•) e peroxila (ROO•), além de substâncias não radicalares, entre elas o

peroxido de hidrogênio (H2O2), ânion hidroxila (HO-), o oxigênio singleto (1O2) e o

ozônio (O3) (LIMA & ABDALLA, 2001; PESSANHA, 2010).

Outras espécies reativas produzidas no organismo de mamíferos são, por

exemplo, as espécies reativas do nitrogênio (ERN). Entre as ERN, estão incluídos o

íon peroxinitrito (ONOO-), o óxido nítrico (NO•), o radical dióxido de nitrogênio (NO2•)

e o ânion peroxinitrito (ONOO-) (LIMA e ABDALLA, 2001). Além disso, radicais tiíla

(RS•), cloraminas (R2NCl e RNCl2- onde R representa um grupo orgânico ou o

hidrogênio), cloreto de nitrila (NO2Cl) e metais de transição (Fe, Cu, Mn, etc.) podem

desencadear reações via radicais livres (VASCONCELOS et al, 2007).

Durante o processo de respiração aeróbica, é fornecido às células do

organismo o oxigênio necessário para produção de energia, através do processo de

metabolismo oxidativo. Em suma, o oxigênio é reduzido e as ligações covalentes da

glicose são clivadas, gerando como produtos gás carbônico, água e energia (Figura

17). A principal organela envolvida é a mitocôndria, onde atuam diversas enzimas

responsáveis por catalisar as etapas desse processo. Nessas etapas, ocorre a

formação de subprodutos que, em sua maioria, são benéficos. No entanto,

aproximadamente 5% podem ser tóxicos para a célula, quando em altas

concentrações (SILVA & JASIULIONES, 2014).

31

Figura 17. Esquema simplificado da respiração celular.

Fonte: CÉSAR & SEZAR, 1988.

O radical hidroxila (•OH) é o mais reativo dentre as ERO e interage

rapidamente com moléculas próximas. Uma vez formado, o organismo humano não

dispõe de mecanismo de defesa que neutralize esse radical livre. A alta reatividade

dessa ERO pode causar modificação no DNA, danos nas proteínas e inativação

enzimática, além de desencadear a peroxidação lipídica. Essa espécie reativa é

formada no organismo principalmente por dois mecanismos: reação de H2O2 com

metais de transição e hidrólise da água por exposição à radiação ionizante.

(FERREIRA & MATSUBARA, 1997; BARREIROS, DAVID & DAVID, 2006;

GUARATINI, MEDEIROS & COLEPICIOLO, 2007; VASCONCELOS et al., 2007).

O organismo humano possui um sistema eficaz no controle da produção de

substâncias reativas de oxigênio, o qual neutraliza os efeitos danosos vindos do

metabolismo de oxigênio e da oxidação lipídica. Tais ações podem ser alcançadas

por meio de diferentes mecanismos: inibição da formação dos radicais livres ou

espécies não-radicalares (sistemas de prevenção), impedimento da ação das

espécies reativas (sistemas de neutralização) ou, ainda, favorecimento do reparo e a

reconstituição das estruturas biológicas lesadas (sistemas de reparo). Esse controle

pode acontecer pela remoção enzimática dos intermediários reativos, através da

ação conjunta de enzimas intracelulares (BAGETTI, 2009; BARBOSA et al., 2010).

Estresse oxidativo é definido como o desequilíbrio entre a produção de

substâncias oxidantes e sua degradação. Normalmente, ocorre quando a produção

de espécies reativas está acelerada ou quando os sistemas de defesa antioxidante

encontram-se deteriorados ou são insuficientes. Fatores genéticos, exposição a

32

fatores ambientais (como radiação UV) e propriedades intrínsecas específicas de

grupos celulares podem exacerbar o dano oxidativo, ou diminuir a capacidade das

células de degradar estes agentes agressores (VICENTINO & MENEZES, 2007).

O sistema de defesa enzimático é representado principalmente pelas enzimas:

superóxido dismutase (SOD), catalase (CAT), glutationaperoxidase (GPx) e

glutationa redutase (GR) (COTINGUIBA et al., 2013).

Outro mecanismo de defesa são os antioxidantes não enzimáticos, o qual é

constituído por grande variedade de substâncias que podem ter origem endógena ou

exógena. Os antioxidantes podem ser definidos como substâncias que, mesmo

presentes em baixas concentrações, podem evitar a oxidação do substrato. Entre os

antioxidantes endógenos incluem: a glutationa, o ácido úrico e a ubiquinona. Entre

os antioxidantes exógenos podemos citar as substâncias fenólicas, vitamina C (ácido

ascórbico), carotenoides, entre outros (VASCONCELOS et al., 2007; BAGETTI,

2009).

Os antioxidantes podem atuar em diferentes mecanismos de defesa no

organismo. Seu primeiro mecanismo de defesa contra os radicais livres é impedir

sua formação, o que acontece pela inibição em cadeia com o ferro e o cobre

(formação do radical HO•, pela redução do ferro ou cobre, nas reações de Fenton e

Haber-Weiss como demonstrado na Figura 18) (GUARATINI et al., 2007). O

segundo mecanismo seria a intercepção de radicais livres gerados pelo metabolismo

celular ou por outras fontes. Nesse último caso, o antioxidante interage com as

espécies radicalares e são consumidos durante a reação, impedindo os danos às

células do corpo humano. Nesta classificação, incluem-se os antioxidantes naturais

e sintéticos. (BAGETTI, 2009; LUZIA, BERTANHA & JORGE 2010; PESSANHA,

2010).

Figura 18. Reações de Fenton[1] e Haber-Weiss [2].

Fonte: VASCONCELOS et al, 2007.

33

As substâncias fenólicas são conhecidamente possuidoras de ação

antioxidante, podendo agir tanto na inibição da peroxidação lipídica como também

da lipoxigenase. As substâncias fenólicas desempenham um papel importante,

agindo tanto na primeira etapa de iniciação como na segunda etapa que é a de

propagação do processo oxidativo. Esses antioxidantes fenólicos podem agir como

neutralizadores de radicais livres, doando um átomo de hidrogênio a um radical

lipídico, e podendo agir também como quelantes de metais. Os produtos

intermediários, formados através dessas reações, são relativamente estáveis devido

a ressonância do anel aromático apresentado por estas substâncias. A eficiência

desses antioxidantes é determinada pelos grupos funcionais presentes e pela

posição que ocupam no anel aromático (LUZIA, BERTANHA & JORGE, 2010).

Na etapa onde ocorre a autoxidação (oxidação de lipídeos) os antioxidantes

fenólicos interagem preferencialmente com o radical peroxila (formando pelos

radicais de carbono que reagem espontaneamente com o oxigênio, propagando a

cadeia de peroxidação lipídica), por ele ser o mais prevalente e por possuir menor

energia do que outros radicais (JIALAL & GRUNDY, 1992). Como resultado da

reação, é formado o radical fenoxila, embora relativamente estável, pode interferir na

reação de propagação, ao reagir com um radical peroxila, via interação entre

radicais (Figura 19). (ANGELO & JORGE, 2007).

Figura 19. Esquema exemplificador da estabilização do radical fenoxila por

ressonância.

Fonte: Sociedade Brasileira de Química – Resveratrol. Disponível

em:<http://qnint.sbq.org.br/sbq_uploads/layers/imagem2403.png> Acesso em: 27 de

maio de 2016.

34

A atividade antioxidante dos ácidos fenólicos e dos taninos está relacionada

com a posição dos grupos hidroxilas e também com a proximidade do grupo –CO2H

em relação ao grupo fenila. Quanto maior a proximidade com grupo fenila, maior

será a capacidade antioxidante do grupo hidroxila em posição meta (SOOBRATTE

et al., 2005).

Existem muitos métodos in vitro para avaliar a atividade antioxidante de

produtos naturais, os quais envolvem desde ensaios químicos simples baseados em

reações colorimétricas a ensaios mais complexos, utilizando as mais diversas

técnicas instrumentais (ALVES et al, 2010).

Levando-se em conta a complexidade envolvida na ação in vivo de

antioxidantes, diferentes métodos in vitro têm sido desenvolvidos para estimar, de

uma forma experimental simples, o potencial antioxidante das amostras. Os ensaios

baseiam-se em diversas estratégias como: avaliar a capacidade do antioxidante em

neutralizar radicais livres; o potencial de redução de íons cúpricos ou férricos; a

capacidade de antioxidantes em inibir a oxidação de lipídeos, entre outros (LÓPEZ-

ALARCÓN & DENICOLA, 2013).

2.5. Efeitos da radiação solar sobre a pele

A pele é o maior órgão do corpo humano com uma área de superfície de

aproximadamente 1,7 m2 no individuo adulto, o que corresponde a aproximadamente

5,5% da massa corporal (GOLDSMITH, 1990; HARRIS, 2009). A pele exerce

diversas funções, sendo uma delas a proteção do organismo contra a radiação

ultravioleta e contra as agressões mecânicas, químicas e térmicas. Além disso, sua

superfície, relativamente impermeável, impede a desidratação em excesso e age

como um obstáculo à invasão microbiana. Nos humanos, a pele é o principal órgão

termorregulador, exercendo tal função por meio de tecido adiposo e dos pêlos que

juntos impedem a diminuição excessiva de temperatura. Outro mecanismo

termorregulador é a secreção das glândulas sudoríparas, que ao ser lançada na

superfície cutânea e evaporar-se, garante a diminuição da temperatura corporal

quando isso se faz necessário. A pele exerce ainda diversas funções metabólicas,

pois os triglicerídeos no tecido adiposo (hipoderme) representam importante reserva

de energia, enquanto que a síntese de vitamina D, que ocorre na epiderme, é

35

indispensável para complementar a quantidade desta vitamina obtida na dieta

alimentar (BECHELLI & CURBAN, 1975; HALLER, 1989; BLATTEIS, 2012).

A pele é constituída por três camadas de tecido: a epiderme , a derme e a

hipoderme (figura 20). A epiderme está estruturada por um grupo de células vivas,

denominado epiderme viável e por um conjunto de células mortas que formam o

estrato córneo. A epiderme viável é constituída de células metabolicamente ativas

que formam outras três camadas distintas: granulosa, espinhosa e basal. Em locais

do organismo onde a pele é mais espessa, por exemplo, nas regiões palmar existe

mais uma camada epidérmica chamada lúcida, que se localiza entre as camadas

granulosa e córnea (EDWARDS & MARKS, 1995; AZULAY & AZULAY, 2006).

Figura 20: Representação das camadas da pele.

Fonte: <http://clinicalposters.com/anatomy/body/038.html> Acesso em: 18/06/2016.

A camada basal é a mais interna e consiste de uma fileira única de células

cubicas que possuem uma alta atividade reprodutiva, tendo por função garantir a

renovação da epiderme. A camada espinhosa é formada por células volumosas e

poliédricas que se encontram em fase de crescimento e no início da síntese de

queratina. A camada granulosa, por sua vez, é constituída por células em seu último

estágio de diferenciação, que ao serem totalmente queratinizadas, tornam-se

anucleadas e perdem sua capacidade metabólica, passando a formar o estrato

córneo, onde sofrem um processo de esfoliação. O estrato córneo é, então, formado

por camadas extremamente coesas de corpos de células epidérmicas, os

corneócitos, que desempenham o papel fundamental de proteger os tecidos vivos da

36

perda de água, mantendo-os adequadamente hidratados. Dessa forma, a principal

função desempenhada pelo estrato córneo é garantir a homeostase cutânea

(EDWARDS & MARKS, 1995; KHAVKIN & ELLIS, 2011).

A derme é uma camada vascularizada de cido conjuntivo denso fibroelástico,

possuindo arteríolas e vênulas, por onde circula o sangue. Há presença de vasos

linfáticos, que são responsáveis pelo transporte de substâncias formadas durante os

processos metabólicos realizados na pele. Esta camada é composta por fibroblastos,

glicosaminoglicanos e macromoléculas, tais como, o colágeno e a elastina. O

colágeno presente na derme papilar aparece como uma rede de fibras finas

aleatoriamente orientadas, enquanto que, na derme reticular, consiste de fibras

maiores e onduladas. Já a elastina é o componente essencial das fibras que formam

os tecidos elásticos, sendo extremamente insolúvel e estável quimicamente

(HOLBROOK & WOLFF, 1993; BRAZ, 2005).

O processo de envelhecimento é definido como um acúmulo de modificações

moleculares no organismo que resultam em manifestações clínicas macroscópicas

(GIACOMONI, 1995). Em relação ao envelhecimento cutâneo ocorre uma

combinação de fatores intrínsecos e extrínsecos (BEITNER, 2003). Os fatores

extrínsecos consistem na exposição da pele a diversas agressões como radiação

ultravioleta (fotoenvelhecimento), poluição atmosférica, traumatismos, fumo e

metabólitos de substâncias ingeridas ou inaladas. Esses fatores são causadores de

modificações moleculares e induzem alterações das propriedades morfológicas e

biofísicas da pele, podendo resultar elastose e atrofia da derme com perda de

colágeno. As manifestações clínicas incluem hiperpigmentação, rugas, mudanças na

textura da pele e formação de comedões (BEITNER, 2003). O envelhecimento

extrínseco é um intensificador do envelhecimento cronológico, sendo esse o motivo

pelo qual, áreas expostas e não expostas à radiação UV costumam apresentar

aspectos muito diferentes (STEINER, 1995; ENJELKE et al., 1997; ORIÁ et al.,

2003).

Com o envelhecimento da pele é verificado na camada basal células

heterogêneas em tamanho e volume (BRÉGÉGÈRE et al., 2003), além de terem

uma atividade mitótica reduzida, o que aumenta o tempo renovação epidérmica em

50% (ENKELKE et al., 1997; NAMAZI & FEILY, 2011). Esta alteração chamada de

discrasia epidérmica é acentuada na pele fotodanificada (NAMAZI & FEILY, 2011). O

Processo de envelhecimento também altera o número, a morfologia e a função dos

37

melanócitos, sendo estes melanócitos inativos mais abundantes nos folículos pilosos

(BUSHAN et al., 2002).

O efeito solar imediato sobre a pele é a hiperpigmentação cutânea, com atraso

na formação de nova melanina, sendo esse efeito reversível. Enquanto a exposição

solar prolongada e recorrente implica em alterações definitivas na quantidade e

distribuição de melanina na pele (MONTAGNER & COSTA, 2009).

Existem evidências de que o estresse oxidativo exerce papel relevante nos

processos de envelhecimento. Além disso, as substâncias reativas em excesso

também estão relacionadas com a transformação e morte celular, consequências

diretas em muitas patologias, dentre elas, a indução do câncer e a propagação de

AIDS em pacientes soropositivos (HIV+), bem como na fisiopatologia de muitas

doenças crônicas, entre as quais, doenças autoimunes, cardiopatias, doenças

pulmonares, intoxicação por xenobióticos e muitas outras (VASCONCELOS et al,

2007).

A teoria de que o envelhecimento é resultado de danos causados por radicais

livres é creditada a Denham Harman que, em 1956, baseou-se na observação de

que a irradiação em seres vivos leva à indução da formação de radicais livres, os

quais diminuíam o tempo de vida desses seres e produziam mudanças semelhantes

ao envelhecimento. De acordo com esta teoria, o lento desenvolvimento de danos

celulares irreversíveis leva ao envelhecimento (HIRATA, SATO & SANTOS, 2004).

O sol emite um amplo espectro de radiação eletromagnética, que é desviado

ou atenuado pelas camadas atmosféricas da Terra. As radiações que chegam à

superfície são classificadas como não ionizantes e subdivididas em infravermelho (>

780nm), visível (400-780nm) e ultravioleta (UV) (100-400nm) (figura 21) (RIBEIRO,

2004; BALOGH, 2011).

Figura 21. Representação do espectro de radiação eletromagnética emitido pelo sol.

Fonte: Instituto Schulman de investigação científica. Disponível em: <http://isic.net.br/artigo-32>. Acesso em: 31/07/2016.

38

A radiação ultravioleta é ainda subdividida de acordo com o comprimento de

onda. A radiação UVA (comprimento de onda de 320 a 400nm) age na pele através

do efeito pigmentogênico, porém seu acúmulo, ao longo dos anos, provoca

alterações das fibras colágenas e elásticas, favorecendo o envelhecimento precoce,

podendo causar fotossensibilidade (BILLHIMER, 1989; GUARATINI, MEDEIROS &

COLEPICOLO, 2007). A radiação UVB (comprimento de onda de 290 a 320nm)

causa reação eritematosa, sendo uma reação de defesa do organismo. Essa

radiação provoca um aumento na formação de melanina (efeito pigmentogênico),

mas também causa queimaduras solar e inflamação cutânea, podendo resultar em

carcinogênese (RIEGER, 1989). A radiação UVC (comprimento de onda de 200 a

290nm) é germicida, por sua ação esterilizante, é prejudicial ao tecido cutâneo,

porém é “filtrada” pela camada de ozônio (RIBEIRO, 2004).

O estresse oxidativo acelera o fenômeno do envelhecimento por danos ao

DNA e por atuarem nas reações de desidrogenação, hidroxilação e na glicação

proteica. A última reação envolve a perda das funções biológicas de proteínas, como

o colágeno e proteoglicanas, resultando em alterações da estrutura da membrana e

aumento da flacidez da pele. Dentre as várias fontes exógenas de radicais livres os

efeitos da radiação solar são a mais importante causa do envelhecimento cutâneo,

uma vez que a luz ultravioleta (UV) atua na produção de radicais livres (HIRATA,

SATO & SANTOS, 2004).

Exposição à radiação UV provoca alterações físicas na pele em função dos

danos ao tecido conjuntivo, causados pela formação de peróxidos de lipídeos e

espécies reativas do oxigênio (ERO). Peróxidos de lipídeos podem ser

metabolizados para formar produtos secundários que prejudiquem a matriz

extracelular (ECM), enquanto as ERO estão envolvidas na perda de elasticidade e

alguns tipos de câncer de pele (JENKINS, 2002).

A radiação ultravioleta (UV) penetra a pele e, de acordo com o comprimento

de onda, interage com as diferentes células localizadas nas diversas camadas. A

radiação de ondas curtas (UVB: 290-320nm) é mais absorvida na epiderme e afeta

predominantemente os queratinócitos, enquanto as ondas mais longas (UVA: 320-

400nm) penetram de modo mais profundo e atingem queratinócitos da epiderme e

fibroblastos da derme (HERNANDEZ-PIGEON et al., 2007).

A radiação UVA age indiretamente através da geração de ERO que atuam na

ativação de fatores envolvidos na transcrição do DNA. Esse processo resulta em

39

mutações no DNA mitocondrial. A radiação UVB, por sua vez, também gera

espécies reativas, porém sua principal ação é a indução direta de danos ao DNA,

resultando em mutação (STEGE et al., 2000; HERNANDEZ-PIGEON et al., 2007).

Assim, mesmo a radiação solar sendo indispensável à vida, uma vez que é

necessária à fotossíntese nos vegetais, assim como à saúde e bem estar no homem,

a radiação ultravioleta pode ter efeitos nocivos, dependendo da duração e

frequência de exposição a ela, bem como, de sua intensidade (em relação à latitude)

e da sensibilidade do indivíduo aos seus efeitos. Ela atinge pele, olhos e mucosas,

podendo causar queimaduras (eritemas), envelhecimento precoce e até alguns

cânceres de pele. (SHAATH, 1997; SOUZA et al., 2013).

2.6. Proteção solar

Segundo González e colaboradores (2008), fotoproteção é um elemento

profilático e terapêutico frente aos efeitos danosos da radiação ultravioleta. A

abordagem é realizada por meio do uso de protetores solares, vestimentas

protetoras e exposição restrita a luz solar. A primeira linha de defesa contra estes

efeitos nocivos é a utilização dos fotoprotetores, também denominados protetores

solares. Estudos diversos evidenciam que o uso adequado e regular de

fotoprotetores evita o envelhecimento precoce da pele (BALOGH, 2011).

Pelos conceitos atuais, fotoprotetores tópicos, ou protetores solares (ou ainda

filtros solares), são substâncias de aplicação cutânea, em diferentes apresentações,

que contenham em sua formulação ingredientes capazes de interferir na radiação

solar, reduzindo seus efeitos deletérios (SCHALKA & REIS, 2011).

Os filtros solares (filtros UV) são os ingredientes presentes nos fotoprotetores,

os quais interagem com a radiação incidente através de três mecanismos básicos:

reflexão, dispersão e absorção, conforme apresentado na figura 22 (RIBEIRO et al.,

2004; SCHALKA & REIS, 2011).

40

FIGURA 22: Mecanismos de interação dos filtros ultravioleta com a radiação solar.

Fonte: SCHALKA & REIS, 2011.

Esses filtros são divididos em inorgânicos e orgânicos. Os filtros inorgânicos

podem abranger também os bloqueadores físicos, os quais dispersam a luz

incidente, não a deixando passar ou diminuindo sua passagem através das camadas

da pele, tendo como exemplo o dióxido de titânio (TiO2) e óxido de zinco (ZnO). Já

os filtros orgânicos são substâncias com bons cromóforos, os quais absorvem a

radiação de alta energia, diminuindo sua intensidade e seus efeitos prejudiciais

(Figura 23) (GONZÁLEZ, FERNÁNDEZ-LORENTE & GILABERTE-CALZADA, 2008).

Figura 23. Forma de ação dos filtros UV orgânicos e inorgânicos.

Fonte: Informativo técnico. Filtros solares inorgânicos.

<http://volp.com.br/site/br/informativo/Filtros%20Solares%20Inorganicos/> Acesso

em: 01/08/2016.

Os filtros orgânicos têm como mecanismo de ação a interferência com a

radiação incidente por meio da absorção da radiação UV. Quando um filtro atua

41

como cromóforo exógeno, ao absorver um fóton de energia, ocorre excitação do

orbital π HOMO (orbital preenchido de mais alta energia) com transferência de

elétron para orbital π* LUMO (orbital vazio de mais baixa energia). Ao retornar para

estado estável (não excitado), ocorre à liberação de energia em um comprimento de

onda mais longo, seja na faixa da luz visível (como fluorescência), seja na faixa da

radiação infravermelha (como calor). O processo pode repetir-se inúmeras vezes

pelo mecanismo denominado ressonância (SCHALKA & REIS, 2011).

Essencialmente, são substâncias com estruturas aromáticas conjugadas com

grupos carbonílicos e, geralmente, possuem um grupo doador de elétrons como, por

exemplo, uma amina ou metoxila na posição orto ou para do anel aromático.

(BALOGH, 2011).

Os filtros químicos são divididos em filtros UVA, que exercem proteção frente

à radiação UVA, filtros UVB, que exercem proteção frente à radiação UVB, e filtros

de amplo espectro, que promovem proteção contra radiação UVA e UVB (Figura 22)

(CABRAL, PEREIRA & PARTATA, 2013).

Muitas formulações contendo filtros químicos não proporcionam proteção

total, principalmente quando são considerados efeitos crônicos como:

fotoenvelhecimento e fotocarcinogênese. Assim, extratos vegetais, principalmente

aqueles ricos em constituintes fenólicos, vêm sendo empregados em formulações

fotoprotetoras associadas aos filtros UV. Uma vez que, comprovada sua capacidade

de absorver radiação solar de alta energia, diminuindo seus efeitos nocivos, além

dos efeitos antioxidantes, os extratos vegetais podem intensificar a proteção final do

produto e/ou neutralizar os radicais livres produzidos na pele após exposição ao sol

(SOUZA et al., 2013).

A eficiência dos filtros é dependente da sua capacidade de absorção da

energia radiante, que é proporcional à sua concentração, ao intervalo de absorção e

ao comprimento de onda onde ocorre absorção máxima (PAOLA & RIBEIRO, 1998;

SCHALKA & REIS, 2011). A eficiência dos filtros orgânicos está diretamente

relacionada à estabilidade fotoquímica, à dispersão e dissolução facilitadas e

permanentes no veículo e à resistência ao enxague. Estes filtros devem ser atóxicos

e não causar irritação ou alergia (BALOGH, 2011). Essa eficiência dos filtros pode

ser verificada através de métodos in vitro e in vivo, como a determinação do fator de

proteção solar (FPS) em relação à radiação UVB e em relação ao fator de proteção

FPUVA (Sociedade Brasileira de Dermatologia, 2013).

42

A determinação do FPS avalia capacidade protetiva dos filtros químicos

contra a radiação UVB do espectro eletromagnético. Como a UVB é o responsável

por causar eritema na pele, um filtro bastante eficaz é aquele que é capaz de

proteger a pele exposta contra a queimadura solar. O valor de FPS consiste na

razão entre a dose mínima de exposição à radiação ultravioleta necessário para

produzir eritema (vermelhidão) na pele protegida pelo protetor solar e a dose de

exposição, para o mesmo efeito, com a pele desprotegida (RIBEIRO, 2004). O valor

de FPS é calculado a partir da equação:

Como alternativa, existem métodos in vitro que se baseiam nas propriedades

absortivas ou refletoras do filtro e que podem ser utilizadas para avaliar o FPS,

durante o desenvolvimento de formulações e para o controle de qualidade de rotina,

lote a lote (RIBEIRO, 2004).

O método proposto por Mansur e colaboradores (MANSUR et al., 1986), o

qual consiste de modificações no método de Sayre e colaboradores (1979 e 1980),

representa uma alternativa eficaz e rápida, além de apresentar uma boa correlação

com os resultados in vivo (BARTH, 2000; GARCIA et al., 1990).

No Brasil, todo protetor solar deve ser registrado pela ANVISA como

cosmético, segundo legislações específicas, necessitando ser testado por métodos

in vivo (Brasil, 2012b).

Com isso é possível inferir, que pela grande presença de compostos fenólicos

nos órgãos vegetativos da Eugenia uniflora, além de sua potente ação antioxidante,

ela demonstra uma possível atividade fotoprotetora, devendo com isso ser

comprovado seu potencial fotoprotetor. Com esse potencial comprovado pode ser

considerada uma matéria prima com grande apelo no uso de cosméticos

fotoprotetores e antienvelhecimento, por ser natural, apresenta menor potencial

irritante, baixa toxicidade e impacto ambiental insignificante.

Equação 1

43

3. OBJETIVOS

3.1. Objetivo Geral

O objetivo desse trabalho foi padronizar e adequar o método

espectrofotométrico de determinação do fator de proteção solar (FPS) de amostras

em soluções diluídas, às condições do Laboratório de Farmacognosia da Faculdade

de Farmácia da Universidade Federal de Juiz de Fora (UFJF). Assim como utilizar o

método padronizado para determinar o FPS de formulações contendo extrato de

Eugenia uniflora L. (Myrtaceae).

3.2. Objetivos Específicos

Estabelecer o perfil químico do extrato hidroalcoólico dos ramos em forma de

galhos de E. uniflora (EEAgEu) e de suas frações em hexano (FHgEu), em

diclorometano (FDgEu), em acetato de etila (FAgEu) e fração residual (FRgEu).

Padronizar o extrato hidroalcoólico de Eugenia uniflora (EEAgEu) e suas

frações em teor total de metabólitos fenólicos.

Verificar o potencial antioxidante do extrato hidroalcoólico de Eugenia uniflora

(EEAgEu) e suas frações.

Obter formulações cosméticas contendo extrato hidroalcoólico de Eugenia

uniflora (EEAgEu).

Estabelecer o fator de proteção solar (FPS) de uma formulação contendo o

extrato hidroalcoólico de Eugenia uniflora (EEAgEu).

44

4. MATERIAL E MÉTODOS

4.1. Material vegetal

4.1.1. Autorizações

Para o desenvolvimento das atividades deste projeto o grupo dispõe de

autorizações de coleta de material SISBIO nº 19245-1/61555311 e 09/2008

14/000.808/2010-Coordenadoria de Recuperação Ambiental, Gerencia de Gestão de

Unidades de Conservação e INEA/ RJ 040/2008 Fundação Instituto Estadual de

Florestas.

Além das autorizações locais de acesso/coleta para atividade de pesquisa,

dispomos também de autorização para atividades com finalidade cientifica,

contemplando acesso ao patrimônio genético SISBIO n 26189-7/ 35277546.

4.1.2. Eugenia uniflora Linnaeus

O material botânico foi coletado no Parque Nacional da Restinga de

Jurubatiba, no município de Quissamã, Rio de Janeiro. Uma amostra testemunho foi

processada, identificada pela profa Dra Tatiana Ungaretti Paleo Konno e depositada

na Coleção Botânica do Núcleo de Ecologia e Desenvolvimento Socioambiental

(NUPEM/UFRJ), vinculado ao Herbário do Instituto de Biologia da UFRJ (RFA),

recebendo o tombo RFA 38755.

4.2. Equipamentos e reagentes

4-hidroxibenzoato de metila

6-propilparabeno

2,2-difenil-1-picrilidrazila (DPPH) – Sigma Aldrich

Acetato de etila P.A / ACS. Vetec / TEDIA

Ácido acético glacial All Chemistry do Brasil

Ácido clorídrico P.A. 37% - Isofar

Ácido gálico Riedel-de Haën

45

Ácido p-cumárico

Ácido sulfúrico P.A. / ACS 97% Vetec

Ácido tânico Sinth

Agitador magnético. (Fisatom) Modelo: 702AC.

Agitador mecânico. (Fisatom). Modelo: 713D.

Agitador vortex (Phoenix Luferco). Modelo: AP-56.

Água ultrapura

Álcool Etílico (etanol) P. A. – Tedia

Álcool Metílico (metanol) P. A. – Cromato produtos químicos (CRQ)

Anisaldeído Fluka

Balança analítica (LINI). Modelo: 205A.

Bomba de vácuo (Marte). Modelo: 131B.

Carbonato de sódio anidro Vetec

Catequina Sigma Aldrich

Centrífuga (Excelsa baby I). Modelo 206.

Cloreto de ferro (III) hexahidratado - Vetec

Cloreto de sódio

Clorofórmio P. A. – Vetec

Cumarina Fluka

DCR 245 silicone D’ Altomare

DCR 5225C formulation AID D’ Altomare

DCR 9011 silicone elastone D’ Altomare

Dicloromentano (cloreto de metileno) P. A. - Impex

Dimetil Sulfóxido (DMSO) P. A. - Tedia

Espectrofotômetro (Schimadzu). Modelo: UV-1800.

Espectrofotômetro (biospectro). Modelo: SP-220.

Eugenol Vetec

Extrato seco padronizado de Gingko biloba Deg

Filtro solar UVA/UVB hidrossolúvel Chemistry do Brasil LTDA

Glicerina

Hexano ACS / P.A. Tedia / Vetec

Lâmpada ultravioleta com cabine escura Camag®

46

Micropipetas (Gilson e Labmate soft)

n-Butanol P.A. Carlo Erba

pHmetro (Mettler Toledo). Modelo: MP 220.

Polietilenoglicol

Quercetinadiidratada 99% HPLC – FlukaBioChemica

Reagente Folin Ciocalteau Haloquímica

Rotaevapores (Buchi). Modelos: B-480.

Rutina Fluka

Sulfato cérico

Ultrassom (Unique): Modelo: 1400.

4.3. Preparação de reagentes

Anisaldeído sulfúrico - Foi misturado 0,5mL de anisaldeído, 10mL de ácido

acético glacial, 85mL de metanol e 5mL de ácido sulfúrico a 97% v/v, sob

resfriamento.

Cloreto férrico 10% em etanol - 10g de Na2CO3 para 100mL de etanol.

NP-PEG - Foi pesado 0,1g de difenilboriloxietilamina (NP) em 10mL de

metanol. A solução de polietilenoglicol foi preparada por meio de dissolução de 0,5g

de polietilenoglicol 4000 (PEG) em 10mL de etanol e armazenada a temperatura

ambiente.

Solução saturada de Na2CO3 - 10g de Na2CO3 para 100mL de água

deionizada.

Sulfato cérico – A solução de sulfato cérico foi preparada a partir de 2 g de

sulfato cérico dissolvido em 55mL de H2SO4 concentrado e completando o volume

de 1000mL de água destilada. Sedo realizado em capela com o auxílio do banho de

gelo.

4.4. Obtenção dos extratos e frações a partir dos ramos em forma de galhos de

E. uniflora

Para o desenvolvimento desta proposta escolheu-se os ramos em forma de

galhos como material de partida, um órgão vegetativo onde caracteristicamente são

47

armazenados metabólitos fenólicos, são comparativamente maiores que em outros

órgãos. Os galhos foram secos em estufa a 40º C e triturados em moinho de facas.

1,288 Kg dos galhos secos e triturados foram submetidos ao processo de

extração, em percolador, primeiramente com mistura hexano: diclorometano

(Hex:DCM) 80:20, sendo o líquido extrator renovado continuamente até exaustão.

Após esta etapa, prosseguiu-se à extração exaustiva da torta resultante, utilizando a

mistura de etanol: água (80:20), renovando-se continuamente o liquido extrator até a

exaustão. Os extratos líquidos foram filtrados através de papel de filtro e os

solventes orgânicos foram retirados, utilizando rotaevaporador. Ao final do processo

de rotaevaporação, obteve-se o extrato bruto Hex:DCM (extrato lipofílico - EHDgEu)

e o concentrado aquoso do extrato hidroalcoólico, o qual foi liofilizado, resultando no

extrato bruto hidroalcoólico seco (EEAgEu).

O extrato bruto hidroalcoólico (EEAgEu) foi fracionado por extração sólido-

líquido, com auxílio de agitação em ultrassom, até exaustão, com solventes em

ordem crescente de polaridade: hexano, diclorometano e acetato de etila. Esse

processo, após evaporação dos solventes sob pressão reduzida, rendeu as frações

em hexano (FHgEu), em diclorometano (FDgEu) e em acetato de etila (FAgEu). A

fração residual (FRgEu), obtida após o processo de purificação do EEAgEu, foi

mantida para os testes químicos (figura 24).

Figura 24. Obtenção dos extratos e frações a partir dos ramos em forma de galhos

E. uniflora.

48

4.5. Análise por Cromatografia em Camada Delgada (CCD) do extrato e das

frações

Foram utilizadas cromatofolhas de sílica gel 60 F254 em alumínio, espessura

0,2 mm da MERCK cortadas na medida de 12 cm de altura, sendo deixados 10 cm

de campo de corrida. As amostras analisadas foram solubilizadas em metanol

(EEAgEu; FHgEu) ou diclorometano (FDgEu; FAgEu; FRgEu), sendo aplicados 5µL

(capilar graduado) de cada amostra, a uma altura de 1 cm da borda inferior da placa,

e cerca de 0,3 cm de distância das bordas laterais. Como perfil de comparação,

foram utilizados diversos padrões (eugenol, estigmasterol, terpeno, cumarina, ácido

cumárico, quercetina, catequina, rutina e ácido tânico), os quais foram analisados de

forma semelhante aos extratos e frações. Os sistemas eluentes utilizados foram:

hexano: acetato de etila (8:2); hexano: clorofórmio (7: 3); hexano: acetato de etila

(1:1); clorofórmio: acetato de etila (9:1); clorofórmio: metanol (9:1); acetato de etila:

metanol (9:1); acetato de etila: metanol (7:3); clorofórmio: metanol (1:1); butanol:

ácido acético: H20 (4: 1: 1); clorofórmio: metanol: água (70: 30: 4); acetato de etila:

ácido acético: ácido fórmico: água (100: 11: 11: 27). Os cromatogramas foram

49

visualizados sob a luz ultravioleta nos comprimentos de onda de 254 e 360nm e,

então, revelados com agentes químicos diversos como: sulfato cérico, anisaldeído

sulfúrico e cloreto férrico 10% em etanol.

Além disso, foi usado cromatofolhas de sílica fase inversa (RP18). Utilizou-se

para o desenvolvimento cromatográfico, os sistemas eluentes acetato de etíla: ácido

acético: ácido fórmico: água (100: 11: 11: 27); clorofórmio: metanol (9:1); acetato de

etíla: metanol (9:1); clorofórmio: metanol: água (70: 30: 4); butanol: ácido acético:

água (4: 1: 1); clorofórmio: acetato de etila (7: 3); metanol: água: ácido fórmico (16:

1: 3); butanol: ácido acético: água (4: 1: 5). Os cromatogramas foram revelados com

difenilboriloxietilamina-polietilenoglicol 4000 (NP-PEG).

4.6. Obtenção do espectro de varredura na região do ultravioleta

Foi preparada uma solução em metanol do EEAgEu a uma concentração de

1mg/mL. Dessa solução, foi retirada uma alíquota de 0,2mL e diluída para 10mL com

metanol. A solução na concentração final de 0,02mg/mL foi submetida à varredura

espectroscópica, na faixa de comprimento de onda de 200nm a 400nm, usando-se

metanol como branco.

4.7. Determinação do teor total de metabólitos fenólicos

A quantificação espectrofotométrica dos metabólitos fenólicos foi realizada

pelo método descrito por Wettasinghe e Shahidi (1999), também Zielinski e

Kozlowska (2000), com pequenas modificações. Para tanto, as amostras EEAgEu,

FHgEu, FDgEu, FAgEu e FRgEu, em triplicata, foram solubilizadas e diluídas em

metanol, a fim de obter-se as concentrações de 50µg/mL; 100µg/mL; 150µg/mL;

200µg/mL; 250µg/mL; 300µg/mL; 400 µg/mL para EEAgEu, FAgEu e FRgEu, já para

FHgEu e FDgEu foram usadas as concentrações de 50µg/mL; 100µg/mL; 200µg/mL;

500µg/mL; 1000µg/mL; 2000µg/mL; 4000 µg/mL. Para a reação colorimétrica foram

adicionados, em tubo cônico plástico, 250µL de cada concentração testada e 250µL

de reagente de Folin-Ciocalteau. Após agitação leve, foram acrescentados 500 µl de

solução de Na2CO3 10% e 4 ml de H2O deionizada. Foram preparadas solução de

compensação, constituída de todos os reagentes exceto a solução de amostra, e um

branco para cada concentração de amostra testada, constituída de 0,25mL de

50

amostra e 4,75mL de água deionizada. Dessa forma, como ocorre uma diluição de

20 vezes da amostra, resultou em concentrações de 2,5µg/mL;5µg/mL; 7,5µg/mL;

10µg/mL; 12,5µg/mL; 15µg/mL; 20µg/mL para EEAgEu, FAgEu e FRgEu e

concentrações de 2,5µg/mL;5µg/mL; 10µg/mL; 25µg/mL; 50µg/mL; 100µg/mL;

200µg/mL para FHgEu e FDgEu.

Os tubos, então, foram agitados vigorosamente em vórtex por 20 segundos e

deixados de repouso, ao abrigo da luz, à temperatura ambiente, por 25 minutos. Ao

final do período de incubação, os tubos foram centrifugados a 5000 rpm por 7

minutos, sendo o sobrenadante utilizado para fazer a leitura em espectrofotômetro

no comprimento de onda de 760 nm, utilizando o metanol para zerar o equipamento.

Para expressar os resultados, foi construída curva analítica de ácido gálico.

Curvas analíticas em triplicatas, em três dias diferentes, foram submetidas à análise

de covariança. e, comprovando-se a ausência de diferença estatística entre elas, os

dados foram reunidos, obtendo-se a curva analítica resultante. A equação da

regressão do melhor ajuste foi calculada, bem como o valor de correlação (R2). Para

esta análise estatística utilizou-se o programa GraphPad Prism, versão 5 (2007) da

GraphPad Software.

Para a curva analítica foi escolhido o ácido gálico (marca Riedel-de Haën)

sendo um metabólico fenólico simples, na qual uma solução estoque a 1mg/mL, em

triplicata, foi preparada a partir de 10mg da substância pura em balão volumétrico de

10mL, utilizando água deionizada como solvente. Foram pipetadas alíquotas de

10µL; 25µL; 50µL; 75µL; 100µL e 125µL desta solução estoque para microtubos

cônicos de plásticos (ependorff) e o volume completado para 1mL. Dessa forma,

preparou-se as concentrações de partida a. 10µg/mL; 25µg/mL; 50µg/mL; 75µg/mL;

100µg/mL; 125µg/mL. A reação colorimétrica foi realizada em tubos cônicos

plásticos, aos quais foram adicionados 250 µL de cada diluição de ácido gálico, junto

com 4 mL de água deionizada, 250 µL do reagente de Folin Ciocalteu e 500 µL de

carbonato de sódio a 10%. Ao final, obteve-se concentrações em ácido gálico de

0,5µg/mL;1,25µg/mL; 2,5µg/mL; 3,75µg/mL; 5µg/mL; 6,25µg/mL. Também foi feita

uma solução compensação constituída de todos os reagentes, exceto a solução

padrão, de mesmo volume final.

As soluções foram agitadas em vórtex e, após 25 minutos de repouso, ao

abrigo da luz e temperatura ambiente, as absorvâncias espectrofotométricas foram

obtidas em comprimento de onda () de 760nm.

51

Para achar o valor de absorvância real utilizou-se a seguinte equação:

Abs Amostra (real) = Abs A – Abs B – Abs C

Na qual, Abs A é a medida espectrofotométrica da absorbância gerada pela

amostra na presença do reagente de Folin Ciocalteu, Abs B é a medida da absorção

da amostra na ausência do reagente Folin Ciocalteu e Abs C é a leitura

correspondente à absorvância do controle de reagentes sem presença da amostra.

4.8. Avaliação da atividade antioxidante pelo ensaio espectrofotométrico de

redução do radical 2,2-difenil-1-picrilidrazila (DPPH•)

A avaliação da atividade antioxidante pelo método espectrofotométrico, in

vitro, de redução do radical livre estável DPPH• (2,2-difenil-1-picrilidrazila) foi

baseada no método proposto por BLOIS (1958), com algumas modificações. Neste

método, verifica-se a capacidade da amostra em reduzir o radical DPPH por doação

de elétron, o que resulta na descoloração da solução de DPPH (MARTOS et al,

2010).

Uma solução estoque de DPPH• (PM= 394,32) (Sigma Aldrich) foi preparada

na concentração de 0,3mM em etanol, em balão volumétrico de 100mL, e protegida

da luz. A absorvância da solução controle de reação (1mL de DPPH• 0,3mM + 2,5

mL etanol P.A.) é verificada no comprimento de onda de pico máximo de absorção

516 nm, de forma a ajustar-se a concentração da solução estoque de DPPH• para

obter-se valor de absorvância dentro da faixa de 0,6 – 0,8 (solução DPPH• de

trabalho).

As soluções dos extratos e frações testadas também foram preparadas em

balões volumétricos e diluídas em etanol. As amostras foram testadas em

concentrações finais variadas, a fim de se verificar a linearidade.

O teste foi realizado em tubos de ensaio com tampa de rosca, protegidos por

papel alumínio e na penumbra. Para cada tubo teste de amostra (extratos e frações),

em cada concentração testada, adicionou-se 2,5mL de amostra e 1mL da solução

DPPH• de trabalho. Os brancos das amostras correspondem à adição de 1mL de

Equação 2

52

etanol a 2,5mL de cada uma das concentrações testadas para as amostras (extratos

e frações). Como referência para comparação, foi utilizado extrato hidroacoólico

70%, seco, padronizado, de Ginkgo biloba (Deg) preparados em diferentes

concentrações e testados nas mesmas condições que as amostras testes.

Após a adição da solução de DPPH•, as amostras foram incubadas por um

período de 30 minutos para que ocorresse a reação e, após esse tempo, foram

realizadas as leituras das absorvâncias no comprimento de onda de 516nm.

As amostras foram analisadas em triplicata e o percentual da atividade

antioxidante (%AAO) das amostras, em cada uma das concentrações testadas, foi

calculado utilizando a seguinte equação:

% AAO = 100 – [ (Aamostra – Abranco) /Acontrole] X 100

Na qual, Aamostra é a medida espectrofotométrica da absorbância de 2,5mL da

amostra adicionada de 1mL da solução de DPPH•, Acontrole é a medida da absorção

de 2,5mL de etanol com 1mL de DPPH• (controle de reação) e Abranco é a leitura

correspondente à 2,5mL de solução da amostra, em cada concentração, mais 1mL

de etanol.

A eficiência antirradicalar foi estabelecida utilizando a análise de regressão

linear no intervalo de confiança de 95% (p<0,05). Os resultados foram expressos

através do valor da concentração efetiva 50% (CE50). Os valores de CE50 das

amostras foram inicialmente submetidos a análise de variância (ANOVA) e

posteriormente ao teste de Tukey para comparação das concentrações médias de

cada amostra e destas com a amostra de referência. As análises estatísticas foram

realizadas pelo programa GraphPadPrism, versão 5 (2007) da GraphPad Software.

4.9. Determinação do fator de proteção solar espectrofotométrico (FPS

espectrofotométrico) in vitro do extrato

Equação 3

53

A determinação das características de absorção dos agentes de proteção

solar foi realizada com base na análise espectrofotométrica de soluções diluídas das

amostras, segundo proposta de Sayre e colaboradores (1979).

Assim, o extrato bruto hidroalcoólico de E. uniflora (EEAgEu), em triplicata, foi

diluído em etanol para obter-se as concentrações finais de 2,5; 5; 25; 50; 100 e 200

mg/L. Cada uma dessas soluções, em triplicata, foram analisadas em

espectrofotômetro, sob radiação de luz ultravioleta, na faixa de comprimento de onda

de 290 a 320nm, com intervalo de 5nm. O equipamento foi zerado com etanol puro,

antes de cada leitura de absorvância nos diferentes comprimentos de onda.

A determinação da capacidade de absorção de luz ultravioleta, pelas

amostras em solução diluídas, foi realizada empregando-se a fórmula proposta por

Sayre e colaboradores (1979) e modificada por Mansur e colaboradores (1986).

Para o cálculo do valor de FPS utilizou-se a equação desenvolvida por

Mansur e colaboradores (1986):

FPS=FC. 320290 .EE (λ).I (λ).abs (λ)

Na qual, FC é igual a 10 sendo o fator de correção, determinado de acordo

com dois filtros solares de FPS conhecido e de tal forma que um creme contendo 8%

de homossalato desse um FPS de 4. EE (λ) representa o efeito eritemogênico da

radiação de comprimento de onda (λ). I (λ) representa a intensidade do sol no

comprimento de onda (λ). Por fim, abs (λ) representa a leitura espectrofotométrica da

absorvância da solução do filtro solar no comprimento de onda (λ) (MANSUR et al.,

1986).

Onde os valores de EE (λ) x I (λ) são tabelados (Tabela 2):

Tabela 2. Constante EE x I empregada no cálculo por espectrofotometria.

Equação 4

54

Fonte: SAYRE et al., (1979).

4.10. Preparação das formulações

Foi realizado um estudo de pré-formulação buscando realizar a seleção

adequada de excipientes (tabelas 3 e 4), quali e quantitativamente, para o

desenvolvimento de formulações com característica “oil free” (produto praticamente

livre de óleo). Os componentes de característica hidrossolúvel, entre eles os

parabenos (4-hidroxibenzoato de metila e 6-propilparabeno) que tem ação

antimicrobiana, a glicerina (umectante), e o cloreto de sódio (espessante), foram

adicionados sobre os componentes de característica lipossolúvel, entre eles o DCR

245 silicone (veículo volátil), DCR 9011 silicone (estabilizador de formulações) e

DCR 5225 silicone (estabilizador de formulações), sendo os dois últimos variados

para analisar a emulsão final quanto a sua característica sensorial. Sendo a mistura

mantida sobe agitação mecânica, rotação de 300rpm, por 10 minutos, até a

formação de uma emulsão.

Tabela 3. Formulação 1- com silicone 9011.

Silicones Componentes hidrossolúveis

DCR 9011 silicone 10% NaCl 2%

DCR 245 silicone 7% Glicerina 5%

Parabeno (4-hidroxibenzoato de

metila e 6-propilparabeno) 3,3%

Agua qsp 100%

Tabela 4. Formulação 2- com silicone 5225.

Silicones Componentes hidrossolúveis

55

DCR 5225 silicone 10% NaCl 2%

DCR 245 silicone 7% Glicerina 5%

Parabeno (4-hidroxibenzoato de

metila e 6-propilparabeno) 3,3%

Agua qsp 100%

4.10.1. Verificação das características físicas e químicas das formulações

As medidas de pH foram realizadas em pHmetro. Para tanto, as formulações

foram diluídas em água destilada a uma concentração de 10% p/v. O pH foi ajustado

para o valor de 5,5 com adição de 2 gotas de solução de ácido cítrico a 5mg/mL. As

formulações foram centrifugas por 30 minutos em rotação de 3000rpm para verificar

a estabilidade preliminar das formulações.

Foi realizada uma varredura espectroscópica das formulações, na faixa

espectral de 200 a 400nm, usando soluções em metanol, a uma concentração de

0,02mg/mL. Metanol foi usado como branco.

4.10.2. Incorporação do EEAgEu a formulação 1.

Na sequência, o EEAgEu foi incorporado à formulação 1, nas concentrações

de 2,5; 5 e 10 % p/p, de acordo com a figura 25. Sendo realizado todo o

procedimento em triplicata.

Figura 25. Incorporação do EEAgEu à formulação 1.

56

Fonte: Elaborado pelo autor.

O extrato bruto de E. uniflora foi solubilizado com o uso de diluente (DMSO

0,1mL+ água 0,1mL) e depois foi incorporado à formulação 1, através de agitação

manual, com auxílio de espátula.

Preparo das formulações contendo EEAgEu, nas concentrações pré-

determinadas: para cada porcentagem de EEAgEu incorporado (2,5; 5 e 10% p/p),

as massas correspondentes de EEAgEu (25mg, 50mg e 100mg) foram solubilizadas

no diluente (DMSO: água 1:1) e, a seguir, as soluções foram incorporadas,

manualmente com ajuda de espátula, a 1g da formulação 1. Sendo realizado todo o

procedimento em triplicata. Para fins comparativos, foi preparada a incorporação de

um filtro químico sintético (filtro solar UVA/UVB hidrossolúvel), na proporção de

100µL do filtro para 1g da formulação 1. A homogeneização foi manual com auxílio

de uma espátula.

4.11. Determinação do fator de proteção solar espectrofotométrico (FPS

espectrofotométrico) in vitro

A determinação das características de absorção dos agentes de proteção

solar foi realizada com base na análise espectrofotométrica de soluções diluídas das

amostras, segundo proposta de Sayre e colaboradores (1979).

Para a análise espectrofotométrica, cada produto final de incorporação do

extrato na formulação foi diluído em etanol: 0,5g do produto em balão volumétrico de

25mL. A formulação contendo EEAgEu, assim diluído, foi filtrado em papel de filtro,

Pesar 1g da formulação 1

Produto final

57

descartando-se os primeiros 10mL. Uma alíquota de 1mL do filtrado foi, então,

diluído com etanol em balão volumétrico de 10mL. Ou seja, diluição final da

formulação contendo EEAgEu foi de 250 vezes. Essa mesma diluição foi utilizada

para as formulações sem nenhum ativo ou para a formulação contendo filtro químico

sintético (filtro solar UVA/UVB hidrossolúvel).

Essas soluções etanólicas das formulações em concentração final de

0,2mg/mL foram utilizadas para determinação das absorvâncias

espectrofotométricas, na faixa do ultravioleta, nos comprimentos de onda de 290 a

320nm, em intervalos de 5nm. Antes das leituras de absorvância em cada

comprimento de onda, o equipamento foi zerado com etanol. Todo o procedimento,

para cada formulação foi realizado em triplicata. Para o cálculo do valor de FPS

utilizou-se a equação desenvolvida por Mansur e colaboradores (1986) descrita no

item 4.9.

5. RESULTADOS E DISCUSSÃO

5.1. Caracterização Química de Eugenia uniflora L. (Myrtaceae)

58

Obtenção dos extratos e frações a partir dos ramos em forma de galhos de

Eugenia uniflora

O extrato hidroalcoólico dos galhos (EEAgEu), após evaporação do solvente

orgânico sob pressão reduzida, foi liofilizado, resultando no extrato hidroalcoolico

dos galhos de E. uniflora (EEAgEu) que teve um rendimento de 6,3% p/p em relação

a massa de matéria prima seca. A extração sólido-líquido, assistida por ultrassom,

do EEAgEu em solventes de polaridade crescente, resultou em: 1,5% p/p da fração

em hexano (FHgEu), 1,87% p/p a fração em diclorometano (FDgEu), 11,1% p/p da

fração em acetato de etila (FAgEu) e 30,7% p/p da fração residual (FRgEu). Todos

os rendimentos foram calculados em relação a massa de EEAgEU. O extrato

lipofílico dos galhos de E. uniflora (EHDgEu) teve um rendimento de 0,19% p/p, em

relação ao material vegetal seco.

Análise por Cromatografia em Camada Delgada (CCD) do extrato e das frações

A cromatografia é um processo físico e químico de separação dos

componentes de uma mistura de substâncias, no qual o fluxo do solvente promove a

separação dos componentes da mistura em um meio poroso. Esta distribuição se dá

entre duas fases que estão em contato íntimo, onde uma delas permanece

estacionária e a outra se move através da mesma. Através da relação gerada entre

fase estacionária / substância ou mistura de substâncias / fase móvel, consegue-se

uma separação mais efetiva dos componentes da mistura (PESSANHA, 2010).

Sendo assim, utilizou-se a cromatografia em camada delgada para registrar o

perfil químico dos extratos e frações de E. uniflora e, assim, estabelecer os

parâmetros de continuidade dos trabalhos. Para tanto, foram obtidos diversos

cromatogramas das amostras, em placas cromatográficas de gel de sílica, eluídas

em diferentes sistemas eluentes. Os cromatogramas foram analisados sob luz

ultravioleta nos comprimentos de onda de 254/366nm e também com reveladores

químicos diversos. Para fins comparativos, foram usadas substâncias de referências

de diferentes classes de metabólitos secundários (eugenol, estigmasterol, terpeno,

cumarina, ácido cumárico, quercetina, catequina, rutina e ácido tânico).

59

A partir disso, foi verificado que os sistemas eluentes que melhor separaram

foram hexano:acetato de etíla (8:2) para visualização das frações EHDgEu; FHgEu;

FDgEu e acetato de etíla: ácido acético: ácido fórmico: água (100: 11: 11: 27) para

visualização das frações FAgEu; FRgEu; EEAgEu.

A visualização dos cromatogramas revelados com sulfato cérico, um revelador

de uso geral, possibilita avaliar a complexidade das amostras. A solução de

anisaldeído sulfúrico permite uma melhor visualização dos derivados terpênicos,

bem como também para alguns derivados fenilpropanoídicos, como taninos, por

apresentar maior sensibilidade a essas classes de metabólitos. O uso de solução de

cloreto férrico auxilia na verificação da presença de substâncias fenólicos através da

visualização da cor azul ao ser revelado. Já o reagente de difenilboriloxietildiamina

em polietilenoglicol (NP-PEG) possibilita evidenciar a presença de derivados

cumarínicos e flavonoídicos. Estes últimos se mostram como manchas fluorescentes

de colorações que variam de acordo com a estrutura química das substâncias, onde

a cor laranja sugere flavona e flavonol e a cor amarela sugere glicosídeos de

flavonol e quercetina.

Com base na análise dos cromatogramas (Rf e coloração) e comparando-se

com as amostras referências, foi visualizada a presença de taninos pela coloração

escura na revelação com cloreto férrico nas amostras EHDgEu; FHgEu; FDgEu

(Figura 26 (C)). Foram identificados predominantemente metabólitos secundários de

origem fenólica como os derivados flavonoidicos, visualizados através de manchas

amarelo-alaranjadas dotadas de leve fluorescência após a revelação com NP-PEG

(figura 26 (D) e figura 27). Derivados terpênicos e esteroidais puderam ser

visualizados como manchas roxas/róseas após revelação com anisaldeído nas

amostras EHDgEu; FHgEu; FDgEu (figura 26 (B)). Estes resultados estão em

conformidade com a literatura científica na qual os estudos mostram que em

analises com folhas de E. unflora predominam os derivados fenólicos (FIUZA et al.,

2008; SILVA et al., 2015; FIUZA et al., 2011).

Figura 26: Cromatogramas em CCD. Fase estacionária: sílica GF254. Fase móvel

hexano:acetato de etíla 8:2 para (A), (B) e (C); cloroformio metanol 9:1 para (D).

60

Reveladores utilizados (A): sulfato cérico (B): anisaldeído sulfúrico (C): cloreto férrico

(D): NP/PEG.

(A) (B) (C) (D)

Amostras: Da esquerda para a direita nas cromatoplacas: EHDgEu; FHgEu; FDgEu.

Figura 27: Cromatograma CCD. Fase estacionária: sílica C18 (fase inversa). Fase

móvel: Butanol : ácido acético: água (4: 1: 5). Revelador: NP/PEG.

Amostras: Da esquerda para a direita na cromatoplaca: FAgEu; FRgEu; EEAgEu.

Obtenção do espectro de varredura na região do ultravioleta

61

O espectro de absorção para o extrato hidroalcoólico de E. uniflora (Figura

28) mostra picos de absorvância na região do ultravioleta nos comprimentos de onda

206, 260, 272nm, compatível com a presença de metabólitos fenólicos, já

visualizado no perfil químico em CCD. Dessa forma, espera-se que esse extrato, ao

ser incorporado em formulações apropriadas, possa contribuir para uma boa

proteção solar.

Figura 28. Varredura do extrato de E. uniflora na região do ultravioleta (200 a

400nm).

5.2. Determinação do teor total de metabólitos fenólicos

A determinação espectrofotométrica de derivados fenólicos de uma amostra

pode ser realizada por meio de diversas técnicas, todavia, a que utiliza o reagente

de Folin-Ciocalteau (RFC) está entre as mais extensivamente utilizadas (BONOLI et

al., 2004; ROGINSKY & LISSI, 2005). O RFC consiste de mistura dos ácidos

fosfomolibídico e fosfotunguístico, no qual o molibdênio e o tungstênio encontram-se

no estado de oxidação 6+, porém, em presença substâncias redutoras, como as

substâncias polifenólicas, a média do estado de oxidação dos metais passa para

entre 5 e 6. A coloração azul adquirida com a redução dos metais permite a

determinação da concentração das substâncias redutoras, que não necessariamente

precisam ter natureza fenólica (IKAWA et al., 2003; NACZK & SHAHIDI, 2004). O

ajuste do pH ideal (pH = 9,0) para que ocorra a reação entre os grupos fenólicos e o

RFC é feito com solução de Na2CO3 (TREVISAN et al., 2009). A Figura 29 mostra a

62

desprotonação de hidroxilas fenólicas, em meio alcalino, o que favorece a reação de

óxido-redução entre ânion fenolato e os metais do RFC. Segundo Singleton e

colaboradores (1999), o molibdênio sofre redução e o meio reacional muda de

coloração de verde para azul.

Figura 29. Esquema de desprotonação do ácido gálico em meio alcalino e posterior

reação com molibdênio presente no reagente de Folin Ciocaulteu.

Fonte: OLIVEIRA et.al., 2009.

Para expressar os resultados em relação ao conteúdo de metabólitos

fenólicos no extrato bruto hidroalcoólico dos galhos de E. uniflora (EEAgEu) e suas

frações, em equivalente em ácido gálico (mg EAG/g amostra), foram construídas

curvas analíticas do padrão ácido gálico. Durante três dias, em triplicata, foi

realizado o ensaio pelo método de Folin-Ciocalteau com o padrão de ácido gálico.

Ao fim dos três dias, procedeu-se com a análise de covariância das curvas geradas

(programa GraphPad Prism 5.01.) e, constatando-se que as inclinações e

interceptos mostravam equivalência (p > 0,05), a equação de melhor ajuste foi

estabelecida em y = 0,0803396x + 0,006622298 (com R2 = 0,9942). A sobreposição

das curvas de calibração referentes aos três ensaios com ácido gálico nas

concentrações de 0,5 a 6,25 µg/mL estão demonstradas no Gráfico 1 e a curva

analítica obtida pela média dos resultados pode ser vista no Gráfico 2.

63

Gráfico 1. Curvas analíticas sobrepostas de ácido gálico, obtidas para a

quantificação de substâncias fenólicas por espectrofotometria no ultravioleta-visível

em λ 760 nm.

Gráfico 2. Curva analítica de ácido gálico equivalente aos três dias de ensaio. Os

valores representam a média ± desvio padrão. A equação da reta e o R2 se referem

à resultante dos três dias de ensaio.

Na quantificação do conteúdo de metabólitos fenólicos, o maior resultado

encontrado foi para o EEAgEu (376,1±64,5mgEAG/g do extrato), seguido pela

FRgEu (290,1±68,7mgEAG/g da fração) e FAgEu (268,1±1,2mgEAG/g da fração). A

0,000

0,100

0,200

0,300

0,400

0,500

0,600

0 2 4 6 8

Ab

s (7

60 n

m)

[ ] de ácido gálico µg/mL

1ª curva

2ª curva

3ª curva

Y=0,0803396X+0,00662298

R² = 0,9942

0

0,1

0,2

0,3

0,4

0,5

0,6

0 2 4 6 8

Ab

s (7

60 n

m)

[ ] de ácido gálico µg/mL

curva padrão

Linear (curva padrão)

64

FDgEu foi a que mostrou menor conteúdo de substâncias fenólicas

(23,3±2,9mgEAG/g da fração). Embora com resultado inferior, a FHgEu mostrou um

conteúdo relativamente alto de metabólitos fenólicos (146,1±4,5mgEAG/g da fração),

já que se trata da fração de polaridade muito baixa e não se esperava um conteúdo

tão alto desses metabólitos que, em geral, têm de média a alta polaridade (Tabela

5).

Esses resultados corroboram aqueles encontrados no perfil químico por

análise em CCD, onde foi possível visualizar presença de substâncias fenólicas em

todas as amostras de E. uniflora. Como já era esperado, as frações mais polares e o

extrato bruto foram aqueles onde se verificou o maior teor de metabólicos fenólicos.

Tabela 5: Doseamento de substâncias fenólicas expressos em equivalente em ácido

gálico (EAG mg/g amostra).

Amostra [ ] em EAG mg/g amostra ± DP

EEAgEu 376,1 ± 64,5

FHgEu 146,1 ± 4,5

FDgEu 23,3 ± 2,9

FAgEu 268,1 ± 1,2

FRgEu 290,1 ± 68,7

EAG: equivalente em ácido gálico; DP: desvio padrão.

Souza (2013) realizou a avaliação da concentração de substâncias fenólicas

totais para o extrato em etanol 80% das folhas de E. uniflora, encontrando o valor de

206,26 mg EAG/g. Luzia e colaboradores (2010) determinaram um teor de

metabólitos fenólicos de 75,64 mg EAG/g para o extrato em etanol das sementes de

E. uniflora. Já no trabalho de Bagatti (2019), é citado um teor de metabólitos

fenólicos totais, em equivalente de ácido gálico, para o extrato em metanol dos frutos

de E. uniflora, de 4,63 mg EAG/g. A espécie E. uniflora pode ser considerada

promissora na busca por substâncias fenólicas, como taninos, flavonoides e outros

fenólicos, tendo em vista o teor de metabólitos fenólicos registrados na literatura

65

para diferentes partes vegetativas dessa espécie. Assim, os valores encontrados

nesse trabalho para os ramos em forma de galhos de E. uniflora, estão de acordo

com a literatura e, uma vez que se trata de um órgão vegetativo onde

caracteristicamente são armazenados metabólitos fenólicos, são comparativamente

maiores.

Estes resultados demonstrando a diversidade e alto conteúdo de substâncias

fenólicas desses extratos e frações obtidas a partir dos galhos de E. uniflora,

desperta o interesse em relação ao seu potencial antioxidante e de proteção solar.

5.3. Avaliação da atividade antioxidante pelo ensaio espectrofotométrico de

redução do radical 1,1-difenil-2-picrilidrazila (DPPH)

O método DPPH está baseado no descoramento de uma solução composta

por radical estável DPPH• (2,2-difenil-1-picrilidrazila) de cor violeta. É um método

fotocolorimétrico, in vitro, de redução do radical livre, baseado na proposta por

BLOIS (1958) com algumas modificações. O DPPH, quando em solução, possui

coloração violeta com forte absorção em torno de 515 - 517nm e apresenta

paramagnetismo conferido pelo elétron não emparelhado. Assim, ao receber um

elétron, seu elétron passa a ser pareado, tornando-se uma molécula diamagnética e

a absorção característica desaparece (Figura 30). Quando esta solução é colocada

junto de substâncias que podem transferir elétrons, ocorre o descoramento. Logo se

baseia na transferência de elétrons de um composto antioxidante para um oxidante.

(HUANG et al., 2005).

Assim, a atividade antioxidante de uma amostra pode ser expressa em função

da sua capacidade de provocar um decréscimo na absorção (λ 515 - 517nm) de uma

solução de DPPH•, a uma determinada concentração. O método é simples, rápido e

conveniente, sendo útil para a triagem de muitas amostras no intuito de avaliar a

atividade neutralizante de radical livre (BRAND-WILLIAMS et al, 1995; KOLEVA et

al., 2001).

66

Figura 30. Redução do radical livre DPPH.

Fonte: GÜLÇIN, 2012.

A capacidade antioxidante foi estimada através da redução do radical 1,1-

difenil-2-picrilidrazila pelas amostras, em triplicatas e em concentrações variadas

(200 a 2,5 µg/mL), a fim de se verificar a faixa de linearidade. A eficiência

antirradicalar foi estabelecida utilizando a análise de regressão linear no intervalo de

confiança de 95% (p<0,05). Os resultados foram expressos através do valor da

concentração efetiva 50% (CE50), encontrado com a aplicação da equação da reta

originada do gráfico resultante dos valores médios.

As CE50 do extrato hidroalcoólico dos galhos de E. uniflora e suas frações

variaram de 9,08 – 52,81 µg/mL (Tabela 6). Valores de CE50 menores do que 30

µg/mL indicam uma boa atividade antioxidante (RAMOS et al., 2003), portanto é

notável o bom potencial antioxidante da maioria dos extrato e frações obtidas de E.

uniflora.

67

Tabela 6: CE50 do EEAgEu, suas frações e extrato de G. Biloba frente ao radical

DPPH.

Amostra CE50 µg/mL ± DP

EEAgEu 9,08 ± 0,35

FHgEu 48,85B ± 1,46

FDgEu 52,81B ± 1,02

FAgEu 13,69A ± 0,36

FRgEu 12,75A ± 0,36

Extrato seco padronizado de Ginkgo biloba 39,1844 ± 0,18

Os valores referentes à CE50 são a média das três determinações mais o desvio

padrão entre elas. Letras iguais indicam médias equivalentes – ANOVA/Teste de

Tukey p<0,05

As amostras testadas apresentaram alta atividade antioxidante, sendo

EEAgEu o mais efetivo em doar elétrons ao radical estável DPPH•. O maior

potencial antioxidante foi encontrado para o EEAgEu (CE50 = 9,08 µg/mL), seguido

pelas amostras FRgEu (12,75 µg/mL) e FAgEu (13,69 µg/mL), depois a FHgEu

(48,85 µg/mL) e pôr fim a FDgEu (52,81 µg/mL).

A análise dos resultados desse trabalho considera como valores de referência

a CE50 do extrato seco padronizado de Ginkgo biloba (39,18 μg/mL) para comparar a

atividade antioxidante das amostras testadas, uma vez que, a espécie G. biloba é

uma das plantas consideradas com alta atividade antioxidante (MENSOR et al.,

2001).

O interesse na descoberta de antioxidantes naturais tem aumentado, com o

intuito de substituir aqueles sintéticos, os quais têm tido o uso restringido devido à

toxicidade e até mesmo carcinogênese. Muitas plantas medicinais têm sido

pesquisadas e sua atividade antioxidante e de extinção de radicais livres reportadas,

com intuito de seu potencial ser provado para futuros fármacos e formulações

cosméticas possam fazer uso dessas plantas medicinais (RAJBAPOOR, BURKAN &

SENTHILKUMAR, 2010; RAJKUMAR & GUHA, 2010).

Luzia, Bertanha e Jorge (2010) ao avaliarem a atividade antioxidante do

extrato em etanol das sementes de E. uniflora, pelo método DPPH, encontraram

68

CE50 30,72 µg/mL, uma atividade antioxidante pronunciada e compatível com aquele

obtido para o extrato hidroalcoólico e frações de E. uniflora.

No estudo realizado por Reynertson, Basile e Kennelly (2008) foi avaliada a

atividade antioxidante da fração acetato de etila das folhas E. uniflora, pelo método

DPPH, encontrando um valor de CE50 de 19.6 µg/mL. Uma atividade antioxidante

comparável com aquela verificada para a FAgEu cujo CE50 foi de 13,69 µg/mL.

Já Pessanha (2010) avaliou a atividade antioxidante do extrato aquoso e das

frações em acetato de etila e em butanol das sementes de Eugenia uniflora. Os

resultados obtidos demonstraram o alto potencial antioxidante da fração em acetato

de etila, com 84,1% de atividade para uma concentração de 1mg/mL, em relação às

outras amostras utilizadas nesse estudo. Em relação às amostras de galhos de E.

uniflora, pode se verificar que a atividade antioxidante de FAgEu (13,69 µg/mL)

também foi maior em relação as outras frações testadas FHgEu (48,85 µg/mL) e

FDgEu (52,81 µg/mL). Esses resultados podem demonstrar que essa fração

concentra maior número de compostos ativos. Já o valor o CE50 para o EEAgEu

(9,08 µg/mL) foi menor do que de todas as suas frações, ou seja, maior atividade

oxidante, uma possível explicação para isso seria o sinergismo dos constituintes do

extrato.

Comparando-se os resultados no método antioxidante frente ao radical

DPPH, encontrados para as amostras a partir dos ramos em forma de galhos de E.

uniflora, com aqueles descritos na literatura, nota-se que esse órgão vegetativo

possui um potencial antirradicalar maior do que outros órgãos como folhas, frutos e

sementes.

Como foram verificadas em CCD e na quantificação de substâncias fenólicas,

os extratos e frações dos galhos de E. uniflora são muito ricos em substâncias

fenólicas. Assim, as amostras mais polares apresentaram melhor atividade

antioxidante, o que pode estar relacionado com o alto conteúdo de substâncias

fenólicas, uma vez que essas substâncias possuem propriedades redutoras que

desempenham um papel importante na neutralização ou sequestro de radicais livres

e quelação de metais de transição (SOARES, 2002; CHUN et al., 2005).

69

Correlação do teor de metabólitos fenólicos com a atividade antioxidante

pelo método DPPH

Em geral, a atividade antioxidante de produtos naturais está fortemente

relacionada com o a composição fenólica das amostras, especialmente, sendo

promovida pelos flavonoides e polifenóis. Deste modo, foi aplicado um teste

estatístico para verificar a correlação entre a composição em metabólitos fenólicos

das amostras de E. uniflora com a atividade antioxidante estimada pelo método do

DPPH. O teste escolhido nesse caso foi o de Pearson, assumindo uma distribuição

Gauseana normal para os dados e um intervalo de confiança de 95% (p<0,05).

O coeficiente de correlação de Pearson foi significativo para todas as

amostras, o que demonstra que a atividade antioxidante está muito fortemente

relacionada com a composição fenólica dessas, Pearson>0,9 para todas as

amostras (Tabela 7). Isto indica que as substâncias fenólicas contribuem de forma

significativa para a capacidade antioxidante do extrato e das frações.

Tabela 7. Análise estatística pela Correlação (Pearson) entre o teor de substâncias

fenólicas e a atividade antioxidante obtida pelo método DPPH de confiança de 95%

(p>0,05). GraphPad Prism 5.01.

Amostra Coeficiente de correlação de Pearson

EEAgEu 0,9786

FHgEu 0,9901

FDgEu 0,9855

FAgEu 0,9328

FRgEu 0,9577

Junior e colaboradores (2014) trabalhando com extratos e frações de folhas

de Eugenia copacabanensis, encontraram uma correlação de Pearson forte entre a

quantidade de substâncias fenólicas e a atividade antioxidante pelo método DPPH

(R2 = 0,72), onde o teor de substâncias fenólicas foi igual a 970,32 ± 2,72 mgEAG/g

e a CE50 de 3,66 ± 0,02 μg/mL. Os autores sugeriram que esses resultados

70

demonstram a contribuição destas substâncias para o pronunciado potencial

antioxidante de extratos e frações de folhas e galhos de Eugenia copacabanensis.

Em relação aos resultados para o EEAgEu foi demonstrado uma correlação

de Pearson entre a quantidade de substâncias fenólicas e a atividade antioxidante

pelo método DPPH muito forte (R de Pearson > 0,9). Com isso, pode-se inferir que

as amostras de E. uniflora tem um grande potencial antioxidante, em função do alto

e variado conteúdo de metabólitos fenólicos e que, portanto, desperta o interesse

quanto ao seu efeito fotoprotetor e antienvelhecimento.

5.4. Determinação do fator de proteção solar espectrofotométrico (FPS

espectrofotométrico) in vitro do extrato

O resultado da determinação do FPS, in vitro está apresentado na tabela 8.

De acordo com a legislação brasileira, RDC nº 30 de 01 de junho de 2012 (Brasil,

2012b), apenas FPS maior ou igual a 6 pode ser considerado como produtos

cosméticos com atividade fotoprotetora UVB, sendo que para sua comprovação

deve ser realizado métodos in vivo obrigatoriamente.

Como resultado de pesquisa científica preliminar, podemos ver que o EEAgEu

diluído em etanol, na concentração de 200mg/L, teve atividade fotoprotetora

satisfatória, com valor de FPS espectrofotométrico igual a 7 (Tabela 8), ou seja, dentro do

especificado pela ANVISA.

Tabela 8. Resultados de FPS das soluções em etanol de EEAgEu, por leitura

em espectrofotômetro.

Amostras FPS Desvio padrão

2,5mg/L de EEAgEu 0,297 0,004

5mg/L de EEAgEu 0,316 0,029

25mgL de EEAgEu 0,951 0,056

50mg/L de EEAgEu 1,739 0,061

100mg/L de EEAgEu 3,344 0,018

200mg/L de EEAgEu 7,003 0,372

71

ARAÚJO, FONTINELES e CHAVES (2015) analisaram diversas espécies

procurando um potencial fotoprotetor dos extratos etanólicos na concentração de

100mg/L, onde encontraram para Handroanthus ochraceus, Handroanthus

serratifolius e Tabebuia aurea o fator de proteção solar (FPS) 3, 5 e 9,

respectivamente. Demonstrando que apenas a espécie Tabebuia aurea apresentou

o potencial de proteção solar, onde sua atividade se mostrou similar a solução de

EEAgEu na concentração de 200mg /L.

5.5. Obtenção das formulações

Desde a década de 1950, os compostos orgânicos derivados do silício,

constituídos por cadeias onde alternam átomos de silício e oxigênio ligados a

radicais orgânicos, têm ampliado sua gama e suas aplicações. De maneira geral, os

diversos tipos de silicone se caracterizam por serem emolientes de alta estabilidade

térmica (resistente a variações de temperatura de -40 a 316ºC) e química (não

reagem com outros produtos químicos), de baixa tensão superficial, bom perfil

reológico a baixas temperaturas e repelência à água. Além de proporcionarem

lubrificação, facilidade de espalhamento, sedosidade ao toque e brilho, sem

possuírem efeito comedogênico. Além disso, são resistentes à ação de bactérias e

fungos e não agridem o meio ambiente. A gama de silicones oferecida para a área

cosmética é ampla e, dependendo da aplicação e da necessidade, pode-se utilizar

uma combinação dessas matérias-primas para otimizar resultados, facilitando o

desenvolvimento de formulações cosméticas devido a sua multifuncionalidade

(STARCH, 2008; GOIATO, COELHO & SANTOS, 2009).

Portanto, para as formulações desenvolvidas nesse estudo, usou-se silicones

como veículo, pretendendo-se alcançar características como aspecto visual e textura

adequados, facilidade de aplicação e redução da pegajosidade (SOMASUNDARAN

et al, 2006).

Os excipientes usados foram escolhidos de acordo com características

necessárias para que a formulação apresentasse perfil físico e químico adequado.

Os excipientes foram incorporados por agitação até a total mistura entre as fases,

fazendo com que a formulação se tornasse emulsionada, estável e adequada para

os testes qualitativos com a formulação de forma preliminar.

72

5.5.1. Verificação das características físicas e químicas das formulações

O pH das formulações foi verificado com o uso de pHmetro. As formulações

mostraram pH no valor de 7, o qual foi corrigido, com adição de ácido cítrico, para o

valor de 5,5, valor necessário para formulações cosméticas que são usadas na pele

para que não haja agressão a sua estrutura. A correção do pH das formulações foi

feita para que se aproximasse e, portanto, fosse compatível com a faixa de pH do

manto ácido da pele que é de 4,1 e 5,8 (SEGGER et al., 2007). O processo de

centrifugação (30 minutos em rotação de 3000rpm) das formulações não resultou na

separação de fases, o que demonstra uma emulsão preliminar adequada.

O espectro de absorção das formulações 1 e 2 em estudo (figura 31) mostrou

picos máximos em 282nm (traço em azul da figura 31) para a da formulação 1 e

200nm (traço em vermelho da figura 31) para a formulação 2, demonstrando que

essas formulações não têm grande absorção na região de 290 a 320nm, equivalente

a radiação ultravioleta UVB.

Figura 31. Varredura na região do ultravioleta (200 a 400nm) das formulações 1 e 2.

Foi escolhida como a formulação para incorporação dos extratos a formulação

1, pois a partir das análises realizadas na varredura das duas formulações

preparadas, os picos espectrofotométricos não se encontraram dentro da faixa de

ação dos filtros UVB, não apresentando atividade fotoprotetora, com isso o critério

de escolha foi em relação a característica sensorial, no qual a formulação 1 teve

maior atração no aspecto de espalhabilidade.

Após a incorporação do extrato a formulação 1 e o filtro solar UVA/UVB

hidrossolúvel de comparação, não foi apresentado separação das fases em um curto

-0,1

0

0,1

0,2

0,3

0,4

200 250 300 350 400 450

formulação 1 formulação 2

73

período de análise e não demonstrou alterações na sua viscosidade, verificando que

as formulações apresentam boa estabilidade física, além de uma boa

espalhabilidade, como pode ser visto na figura 32 e 33.

Figura 32. Filtro solar UVA/UVB hidrossolúvel incorporado à formulação 1 a 10%v/p.

Figura 33. EEAgEu incorporado a formulação 1 nas concentrações de: (A) 2,5%;

(B) 5% e (C) 10%p/p.

(A) (B) (C)

5.6. Determinação do fator de proteção solar espectrofotométrico (FPS

espectrofotométrico) in vitro

Os resultados preliminares com as soluções do EEAgEu, onde encontrou-se

para uma solução a 200mg/L valor de FPS maior que 6, em consonância com outros

resultados da literatura para extratos vegetais(SÁ-NETA et al., 2015; ARAÚJO,

FONTINELES e CHAVES, 2015), serviram como parâmetro para a incorporação de

tal extrato à formulação 1, nas concentrações de 25mg de EEAgEu/g da formulação,

50mg de EEAgEu/ g de formulação e 100mg de EEAgEu/g de formulação, ou seja,

concentrações finais 2,5; 5 e 10 % p/p do EEAgEu. Para fins comparativos, um filtro

74

solar hidrossolúvel foi incorporado à formulação 1, na concentração de 10% (v/p),

concentração preconizada para essa substância.

Os produtos contendo EEAgEu em diferentes concentrações, bem como o

produto de referência, foram diluídos em etanol à concentração de 0,2mg/mL, sendo

obtidos os valores de absorvância na faixa de 290 a 320nm e o fator de proteção

solar (FPS espectrofotométrico) foi calculado usando a equação desenvolvida por Mansur

e colaboradores (1986):

FPS=FC. 320290 .EE (λ).I (λ).abs (λ)

Os valores encontrados estão mostrados na tabela 9, onde pode-se constatar

que o melhor resultado, dentro do estabelecido pela ANVISA (gráfico 3), foi para o

produto contendo 10% de EEAgEu (FPS = 6), tendo, inclusive, melhor resultado do

que o produto de referência contendo 10% de um filtro solar UVA/UVB hidrossolúvel,

cujo valor de FPS foi 4.

Tabela 9. Resultados de FPS das formulações com EEAgEu, por leitura em

espectrofotômetro.

Amostras FPS Desvio padrão

Filtro solar UVA/UVB hidrossolúvel 10% + formulação 1 4,50 0,04

2,5% ou 25mg de EEAgEu/1g da formulação 1 1,11 0,03

5% ou 50mg de EEAgEu/1g da formulação 1 2,46 0,02

10% ou 100mg de EEAgEu/1g da formulação 1 6,31 0,3

Equação 4

75

Gráfico 3. Resultados de FPS das formulações com EEAgEu comparados com o

valor mínimo de atividade fotoprotetora UVB de 6.

Reis e colaboradores (2015) realizaram uma análise similar, determinando o

fator de proteção solar espectrofotométrico para o extrato hidroalcoólico (70%) das

cascas do caule de Ximenia americana L. incorporado a 10% em uma emulsão

lanette®, encontrando um valor de FPS igual a 6,13. Os autores consideraram uma

atividade fotoprotetora promissora e, portanto, fortalece os resultados encontrados

para a formulação 1 contendo 10% de EEAgEu, demonstrando que o extrato dos

galhos de E. uniflora tem potencial como um possível ativo fotoprotetor.

Já Mansur e colaboradores (2016) determinaram o FPS para o extrato

etanólico das folhas de Bauhinia microstachya incorporado puro e em associação

com outros filtros químicos. O melhor resultado observado foi para a associação do

extrato com os filtros (benzofenona - 3 , metoxicinamato de octila e octocrileno) solar

gerando um FPS igual a 17,8. Para o extrato etanólico de B. microstachya foi

verificado um valor de FPS igual a 0,7. Assim, os autores concluíram que B.

microstachya apesar de não ter demonstrado atividade fotoprotetora in vitro, contem

compostos fenólicos que podem atuar prevenindo danos induzidos por UV por

outros mecanismos, por exemplo, capturando e inativando os ERO, o que foi

comprovado por testes in vivo (GREUL et al., 2002). Esse resultado indica que a

presença de substâncias fenólicas por se só, que podem atuar na prevenção contra

os danos caudados pelos raios UV, além de agir como um filtro orgânico.

Os resultados encontrados para o EEAgEu mostraram que este é rico em

metabólitos fenólicos, tanto em teor como em diversidade, os quais estão

0

1

2

3

4

5

6

7

Filtro solar UVA/UVB hidrossolúvel 10%+

formulação 1

2,5% de EEAgEu/1g de formulação 1

5% de EEAgEu/1g de formulação 1

10% de EEAgEu/1g de formulação 1

76

correlacionados de forma muito forte (R de Pearson = 0,9786) com a atividade

neutralizadora do radical livre DPPH, além de ter mostrado uma atividade

fotoprotetora considerada promissora dentro dos parâmetros da legislação vigente e

em consonância com outros extratos vegetais descritos na literatura.

77

6. CONSIDERAÇÕES FINAIS E CONCLUSÃO

O extrato hidroalcoólico dos ramos em forma de caule de Eugenia uniflora e

suas frações a partir da cromatografia verificou-se a presença de esteroides;

terpenos; taninos; flavonoides e metabólitos fenólicos sendo que a presença de

metabólitos fenólicos pode ser visualizada em todas as frações, mesmo aquelas de

baixa polaridade. A quantificação de substâncias fenólicas pelo método

espectrofotométrico com reagente de Folin-Ciocalteu está em acordo com o perfil de

CCD, uma vez que foi verificada uma grande concentração de mgEAG/g no extrato

hidroalcoólico seguido pelas frações FRgEu e FAgEu, seguido por FHgEu e FDgEu.

O EEAgEu foi onde encontrou-se maior teor de substâncias fenólicas

(206,26±64,5mgEAG/g), sendo assim esperado que nele seria encontrado a maior

atividade fotoprotetora.

Para analise espectrofotométrica da atividade antioxidante, o extrato e as

frações apresentaram um valor de EC50 relativamente baixo, sendo que o EEAgEu

teve o menor valor (CE50 = 9,08±0,35µg/mL) e nas frações os melhores resultados

foram para FRgEu e FAgEu, onde quanto menor o valor de EC50 maior é sua

atividade antioxidante.

A partir dessas duas últimas analises é possível correlacionar a atividade

antioxidante com a presença de substâncias fenólicas. Isto indica que os derivados

fenólicos contribuem de forma importante para a capacidade antioxidante do extrato

e das frações.

Na determinação do fator de proteção solar espectrofotométrico (FPS) in

vitro, o extrato de E. uniflora na concentração de 200 mg/L teve atividade

fotoprotetora satisfatória e acima do limite mínimo exigido pela ANVISA. Nas

formulações testadas foi encontrado valor de FPS superior a 6 apenas na

concentração de 100mg (10%) de EEAgEu/1g de formulação 1, demonstrando uma

atividade fotoprotetora promissora em relação aos raios solares do tipo UVB.

Portanto, o extrato hidroalcoólico a partir dos ramos na forma de galhos de

Eugenia uniflora L. (EEAgEu) mostrou-se rico em metabólitos fenólicos, com grande

potencial antioxidante e considerável absorção na região do ultravioleta (picos de

absorção em 206, 260 e 272nm) e, ainda, quando incorporado a uma formulação a

base de silicone, na concentração de 10% p/p, mostrou considerável atividade

fotoprotetora (FPS = 6). Esses resultados nos despertam interesse em ralação a

78

uma possível ação sinérgica desse extrato com filtros químicos, podendo intensificar

a proteção final do produto e/ou neutralizar as espécies reativas produzidas na pele

em função da exposição ao sol. Assim, conclui-se que, apesar de serem necessários

maiores estudos in vitro para análise do fator de proteção FPUVA e in vivo, através

dos métodos preconizados pela ANVISA (FDA, Department of Health and Human

Services, Sunscreen drug products for over-the-counter human use. Final

Monograph: Proposed Rule, 21 CFR Part 352 et al, 1999; COLIPA/JCIA/CTFA-SA.

International Sun Protection Factor (SPF) Test Method, 2006), além de ser testado

sua toxidade na pele, o EEAgEu poderia ser um componente interessante para

formulações farmacêuticas/cosméticas fotoprotetoras e antienvelhecimento.

79

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