8/8/2019 Tamura 1971

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J O U R N A L O F B A C T E R I O L O G Y , J a n . 1 9 7 1 , p . 3 5 5 - 3 6 0 V o l . 1 0 5 , N o . IC o p y r i g h t C 1 9 7 1 A m e r i c a n S o c i e t y f o r M i c r o b i o l o g y P r i n t e d i n U . S . A .

E l e c t r o n M i c r o s c o p i c O b s e r v a t i o n s o n t h eS t r u c t u r e o f t h e E n v e l o p e s o f Ma t u r eE l e m e n t a r y B o d i e s a n d D e v e l o p m e n t a lR e t i c u l a t e F o r m s o f C h l a m y d i a p s i t t a c i

A . TAMURA, A . MATSUMOTO, G . P . MANIRE, AND N . HIGASHID e p a r t m e n t o f B a c t e r i o l o g y a n d I m m u n o l o g y , S c h o o l o f M e d i c i n e , U n i v e r s i t y o f N o r t h C a r o l i n a ,C h a p e l H i l l , N o r t h C a r o l i n a 2 7 5 1 4 , a n d I n s t i t u t e f o r V i r u s R e s e a r c h , K y o t o U n i v e r s i t y ,K y o t o , J a p a n

R e c e i v e d f o r p u b l i c a t i o n 2 3 S e p t e m b e r 1 9 7 0P u r i f i e d s u s p e n s i o n s o f C h l a m y d i a p s i t t a c i w e r e p r e p a r e d f r o m L c e l l s . T h i ns e c t i o n s o f i n t a c t e l e m e n t a r y b o d i e s a n d i n t a c t d e v e l o p m e n t a l r e t i c u l a t e b o d i e s a n do f t h e i r p u r i f i e d e n v e l o p e s w e r e o b s e r v e d b y e l e c t r o n m i c r o s c o p y . I n b o t h i n t a c to r g a n i s m s a n d p a r t i a l l y p u r i f i e d e n v e l o p e s , t w o m e m b r a n o u s s t r u c t u r e s , e a c h a p -p e a r i n g i n e l e c t r o n m i c r o g r a p h s a s t w o d a r k l y s t a i n e d l a y e r s , w e r e o b s e r v e d . I n t h ee l e m e n t a r y b o d y s e c t i o n s , t h e o u t e r m e m b r a n e w a s r o u n d , a p p a r e n t l y r i g i d , a n d w a sn o t s o l u b l e i n 0 . 5 % s o d i u m d o d e c y l s u l f a t e . T h e i n n e r l a y e r w a s i r r e g u l a r i n s h a p ea n d w a s c o m p l e t e l y r e m o v e d b y d e t e r g e n t t r e a t m e n t . We i n t e r p r e t t h e s e r e s u l t s t oi n d i c a t e t h a t t h e o u t e r r i g i d l a y e r o f t h e e n v e l o p e i s t h e c e l l w a l l a n d t h e i n n e r l a y e ri s t h e c y t o p l a s m i c m e m b r a n e . When t h e f r a g i l e r e t i c u l a t e b o d y e n v e l o p e s w e r e s i m i -l a r l y s t u d i e d , t h e o u t e r c e l l w a l l w a s c l e a r l y v i s i b l e , a n d s o m e e v i d e n c e o f a n i n n e r

m e m b r a n e w a s s e e n . A f t e r t r e a t m e n t w i t h n u c l e a s e s a n d d e t e r g e n t , a l l e v i d e n c e o fi n n e r o r c y t o p l a s m i c m e m b r a n e w a s r e m o v e d , b u t t h e o u t e r c e l l w a l l r e m a i n e d . T h u s ,i t a p p e a r s t h a t t h e c e l l w a l l o f t h i s o r g a n i s m i s c o n t i n u o u s t h r o u g h o u t t h e g r o w t hc y c l e a n d t h a t t h e f r a g i l i t y a n d l a c k o f r i g i d i t y o f t h e r e t i c u l a t e b o d y c e l l i s d u e t oc h a n g e s i n c h e m i c a l c o m p o s i t i o n o r s t r u c t u r e o f t h e c e l l w a l l .I n t h e m u l t i p l i c a t i o n c y c l e o f C h l a m y d i a i ns u s c e p t i b l e c e l l s , t w o d i f f e r e n t c e l l t y p e s a r e i n -v o l v e d ( 1 ) . O n e i s t h e s m a l l , d e n s e - c e n t e r e d i n f e c -t i o u s e l e m e n t a r y b o d y ( E B ) a b o u t 0 . 3 s m i n d i -a m e t e r , a n d t h e o t h e r i s t h e l a r g e , n o n i n f e c t i o u sr e t i c u l a t e b o d y ( RB ) a b o u t 0 . 5 t o 1 . 0 A m i n d i -a m e t e r , t h i s b e i n g t h e r e p r o d u c t i v e f o r m . F o r ac l e a r u n d e r s t a n d i n g o f t h e p a t h w a y o f m u l t i p l i c a -t i o n o f t h e s e m i c r o o r g a n i s m s f r o m d e n s e c e l lt h r o u g h t h e r e t i c u l a t e c e l l a n d a g a i n t o d e n s e c e l l ,i t a p p e a r e d n e c e s s a r y t o s t u d y e a c h c e l l s e p a -r a t e l y a n d t o c o m p a r e t h e i r c h a r a c t e r i s t i c s .I n a s e r i e s o f o u r s t u d i e s o n t h e m e n i n g o p n e u -m o n i t i s ( M P ) o r g a n i s m s , t h e m e t h o d s o f p u r i f i c a -t i o n f o r E B , R B , a n d t h e i r e n v e l o p e s w e r e e s t a b -l i s h e d ( 4 , 1 0 , 1 1 , 1 3 ) . F r o m t h e s e s t u d i e s , i t h a sb e e n d e m o n s t r a t e d t h a t t h e r e a r e d i s t i n c t d i f f e r -e n c e s i n p h y s i c a l a n d c h e m i c a l c h a r a c t e r i s t i c s o f

EB a n d RB c e l l s , e s p e c i a l l y i n t h e i r e n v e l o p e s . I nt h i s c o m m u n i c a t i o n , e l e c t r o n m i c r o s c o p i c s t u d i e so f t h e t h i n s e c t i o n s o f p u r i f i e d e n v e l o p e s o f EBa n d RB o f MP o r g a n i s m s w i l l b e d e s c r i b e d . T h i ss t u d y w a s d e s i g n e d t o d e t e r m i n e w h e t h e r t h e c e l l3 5 5

w a l l o f MP i s c o n t i n u o u s t h r o u g h o u t t h e d e v e l o p -m e n t a l c y c l e .MATERIALS AND METHODS

T h e C a l 1 0 s t r a i n o f t h e MP o r g a n i s m w a s u s e d . T h em e t h o d s f o r p r o p a g a t i o n w e r e e s s e n t i a l l y t h e s a m e a st h o s e d e s c r i b e d p r e v i o u s l y ( 1 0 ) . P u r i f i e d s u s p e n s i o n s o fEB a n d RB o f t h e MP o r g a n i s m w e r e p r e p a r e d e s s e n -t i a l l y a s d e s c r i b e d p r e v i o u s l y ( 1 0 , 1 3 ) . P r e p a r a t i o n o fe n v e l o p e s f r o m b o t h f o r m s f o l l o w e d t h e m e t h o d s d e -s c r i b e d p r e v i o u s l y ( 4 , 1 1 ) .To p r e p a r e t h i n s e c t i o n s f o r e l e c t r o n m i c r o s c o p y , t h es u s p e n s i o n s o f d e n s e o r r e t i c u l a t e c e l l s , t h e i r e n v e l o p e s ,o r L c e l l s i n f e c t e d w i t h MP o r g a n i s m s w e r e c e n t r i f u g e da t a p p r o p r i a t e s p e e d s t o m a k e p e l l e t s . A f t e r c e n t r i f u g a -t i o n , t h e s u p e r n a t a n t f r a c t i o n w a s r e m o v e d c a r e f u l l y ,a n d t h e s e d i m e n t w a s o v e r l a i d w i t h 5 m l o f i c e - c o l d0 . 7 5 % g l u t a r a l d e h y d e - 0 . 1 M p h o s p h a t e b u f f e r ( p H 7 . 4 )w i t h o u t d i s r u p t i o n o f t h e p e l l e t . A f t e r p r e f i x a t i o n f o r 3 0m i n i n a n i c e b a t h , t h e l i q u i d l a y e r w a s r e m o v e d , a n dt h e p e l l e t w a s c u t i n t o s m a l l p i e c e s w i t h a t h i n s p a t u l a ,i m m e r s e d i n 1% O s O 4 - V e r o n a l - a c e t a t e b u f f e r s o l u t i o n( p H 7 . 4 ; r e f e r e n c e 7 ) , a n d f i x e d f o r 1 . 5 h r i n a n i c e b a t h .D u r i n g f i x a t i o n w i t h O S O 4 , t h e l i q u i d l a y e r s w e r e g e n t l ya g i t a t e d . A f t e r p o s t f i x a t i o n w i t h O S O 4 , t h e b l o c k s w e r e

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TAMURA ET A L .d e h y d r a t e d i n a c e t o n e a n d t h e n w e r e e m b e d d e d w i t hV e s t o p a l W ( 9 ) o r e p o x y r e s i n ( 3 ) . S e c t i o n s w e r e c u t o na L K B - u l t r o t o m e a n d t h e n s t a i n e d t o e n h a n c e c o n t r a s tb y a c o m b i n a t i o n o f l e a d h y d r o x i d e ( 6 ) a n d u r a n y l a c e -t a t e ( 1 4 ) . T h e s t a i n e d s e c t i o n s w e r e s a n d w i c h e d w i t hc a r b o n a n d e x a m i n e d i n a JEM 6 C e l e c t r o n m i c r o -s c o p e a t 8 0 k v , w i t h a 3 0 - p m o b j e c t i v e a p e r t u r e .

RESULTSE n v e l o p e s o f E B . E a c h p u r i f i e d EB p a r t i c l e i ss u r r o u n d e d b y a d i s t i n c t e n v e l o p e ( F i g . 1 ) . E l e c -t r o n - d e n s e s t r u c t u r e s c a n b e o b s e r v e d i n t h e n u -c l e o i d , a n d r i b o s o m e s a r e s c a t t e r e d t h r o u g h o u tt h e c y t o p l a s m .A s u s p e n s i o n ( 4 m l ) o f p u r i f i e d EB i n 0 . 0 3 3 Mt r i s ( h y d r o x y m e t h y l ) a m i n o m e t h a n e ( T r i s ) b u f f e r

( p H 7 . 4 ) w a s m i x e d w i t h 4 g o f g l a s s b e a d s ( n o .1 8 ) a n d h o m o g e n i z e d b y u s e o f a M i c k l e a p p a r a -t u s ( 6 0 c y c l e s / s e c ) a t 5 C f o r 5 m i n o r a T o m i n a g at y p e B l - l O O B s o n i c o s c i l l a t o r a t 5 C f o r 2 m i n .A f t e r h o m o g e n i z a t i o n , t h e t r e a t e d s u s p e n s i o n w a sa l l o w e d t o s t a n d f o r a f e w m i n u t e s a n d t h e s u p e r -n a t a n t f l u i d w a s s e p a r a t e d w i t h a c a p i l l a r y p i -p e t t e . T h e g l a s s b e a d s w e r e w a s h e d s i x t i m e s w i t hI m l o f 0 . 0 3 3 M T r i s b u f f e r ( p H 7 . 4 ) . T h e s u p e r -n a t a n t f r a c t i o n a n d t h e w a s h i n g f l u i d w e r ep o o l e d , a n d 5 t o 7 m l o f t h i s h o m o g e n a t e w a sl a y e r e d o n 2 0 - m l d e n s i t y g r a d i e n t c o l u m n s o f 5 t o45% s u c r o s e a n d c e n t r i f u g e d a t 8 , 0 0 0 r e v / m i n f o r3 0 m i n i n t h e SW 2 5 r o t o r o f a S p i n c o c e n t r i f u g e .T h e t u r b i d b a n d o f e n v e l o p e s w h i c h f o r m e d a t t h em i d d l e i n t h e d e n s i t y g r a d i e n t c o l u m n w a s h a r -v e s t e d b y c a p i l l a r y p i p e t t e , d i l u t e d t h r e e - t o f i v e -f o l d w i t h d i s t i l l e d w a t e r , a n d c e n t r i f u g e d a t1 0 , 0 0 0 x g f o r 1 h r . F i g u r e 2 i s a n e l e c t r o n m i -c r o g r a p h o f c r o s s s e c t i o n s o f t h e s e e n v e l o p e s .A l t h o u g h t h e m a t e r i a l s i n s i d e t h e p a r t i c l e s a r ea l m o s t e l i m i n a t e d b y t h i s t r e a t m e n t , t h e e n v e -l o p e s m a i n t a i n t h e i r r i g i d s h a p e . B e n e a t h t h e o u t -e r m o s t l a y e r , o t h e r membrane s t r u c t u r e s a r es e e n . T h e s e a r e i r r e g u l a r i n s h a p e a n d s o m e t i m e sv e r y c l o s e t o t h e o u t e r m o s t m e m b r a n e s . T h ef i n d i n g t h a t t h e EB f o r m s o f t h e MP o r g a n i s ma r e s u r r o u n d e d b y t h e s e t w o s t r u c t u r e s l e d t o t h ec o n c l u s i o n t h a t t h e s e e n v e l o p e s c o r r e s p o n d t o t h ec e l l w a l l s a n d c y t o p l a s m i c m e m b r a n e s w h i c h a r ef o u n d i n b a c t e r i a .

T h e s u s p e n s i o n o f e n v el op es o b t a i n e d a b o v ew a s s u s p e n d e d i n 2 t o 1 0 m l o f 0 . 2 M T r i s b u f f e r( p H 7 . 4 ) c o n t a i n i n g 0 . 0 2 M M g C I 2 a n d t h e n w a ss o n i c a l l y t r e a t e d f o r I m i n t o m a k e a h o m o g e -n e o u s s u s p e n s i o n . T h i s s u s p e n s i o n w a s i n c u b a t e dw i t h 0 . 1 m g e a c h o f r i b o n u c l e a s e a n d d e o x y r i b o -n u c l e a s e p e r m l a t 3 7 C f o r 2 h r . A f t e r i n c u b a t i o n ,I m g o f t r y p s i n p e r m l w a s a d d e d , a n d t h e s u s -p e n s i o n w a s f u r t h e r i n c u b a t e d f o r 2 h r . T h e s u s -p e n s i o n o f c e l l w a l l s w a s t h e n d i l u t e d t h r e e f o l dw i t h 0 . 2 M T r i s b u f f e r ( p H 7 . 4 ) a n d c e n t r i f u g e d a t8 0 0 x g f o r I h r . I n t h e e l e c t r o n m i c r o s c o p i co b s e r v a t i o n o f t h i n s e c t i o n s o f t h e p e l l e t o b t a i n e d ,n o d i f f e r e n c e s f r o m F i g . 2 w e r e o b s e r v e d .A f t e r e n z y m e t r e a t m e n t , t h e p e l l e t o b t a i n e da b o v e w a s s u s p e n d e d i n 4 t o 1 0 m l o f w a t e r , a n da n e q u a l v o l u m e o f 1 % s o d i u m d o d e c y l s u l f a t e( S D S ) w a s a d d e d d r o p w i s e w i t h v i g o r o u ss h a k i n g . T h e s u s p e n s i o n w a s i n c u b a t e d a t 3 7 Cf o r 2 h r a n d w a s t h e n c e n t r i f u g e d a t 1 0 , 0 0 0 x gf o r I h r . F i g u r e 3 s h o w s t h e e l e c t r o n m i c r o g r a p ho f a t h i n s e c t i o n o f t h e e n v e l o p e s o b t a i n e d b y t h i sp r o c e d u r e . SD S t r e a t m e n t d i s s o l v e d t h e i n n e ru n i t m e m b r a n e s o b s e r v e d i n F i g . 2 a n d o n l y t h eo u t e r c e l l w a l l r e m a i n e d . M a i n t e n a n c e o f t h es h a p e o f t h e s e w a l l s a f t e r t r e a t m e n t w i t h SD Si n d i c a t e s t h e r i g i d i t y o f t h e s t r u c t u r e . T h e s e c e l lw a l l s a r e a b o u t 9 . 5 t o 1 0 n m i n t h i c k n e s s , a s c a l -c u l a t e d f r o m e l e c t r o n m i c r o g r a p h s .E n v e l o p e s o f R B . P u r i f i e d RB w e r e p r e p a r e d b yi n f e c t i n g L c e l l s a t a h i g h m u l t i p l i c i t y , a f t e rw h i c h t h e c e l l s w e r e c a r e f u l l y w a s h e d i n p h o s -p h a t e - b u f f e r e d s a l i n e ( P B S ) , r e s u s p e n d e d i n f r e s hm e d i u m , a n d i n c u b a t e d a t 3 7 C o n a r o t a r ys h a k e r f o r 1 8 h r . T h e c e l l s w e r e t h e n c o l l e c t e d b yc e n t r i f u g a t i o n a n d h o m o g e n i z e d i n a T e f l o ng r i n d e r f o r 1 0 m i n i n a n i c e b a t h . T h e h o m o g e -n a t e w a s c e n t r i f u g e d a t 5 0 0 x g f o r 1 0 m i n , a n dt h e s u p e r n a t a n t f l u i d w a s l a y e r e d o v e r 3 0 % s u -c r o s e i n 0 . 0 3 3 M T r i s b u f f e r ( p H 7 . 4 ) a n d c e n t r i -f u g e d a t 5 , 0 0 0 x g f o r I h r . T h e p r e c i p i t a t e w a sr e s u s p e n d e d i n 1 0 % p o t a s s i u m t a r t r a t e s o l u t i o nc o n t a i n i n g 0 . 0 3 3 M T r i s b u f f e r a n d l a y e r e d o n t o po f p o t a s s i u m t a r t r a t e d e n s i t y g r a d i e n t c o l u m n s( 2 0 t o 4 0 % ) a n d c e n t r i f u g e d a t 1 2 , 0 0 0 r e v / m i nf o r 6 0 m i n i n a SW 3 9 S p i n c o r o t o r . T h e RBw e r e h a r v e s t e d f r o m t h e b a n d i n t h e m i d d l e o f t h e

F I G . l . E l e c t r o n m i c r o g r a p h o f a t h i n s e c t i o n o f p u r i f i e d m e n i n g o p n e u m o n i t i s e l e m e n t a r y b o d i e s . A c l e a r l y d e -f i n e d d o u b l e - l a y e r e d c e l l w a l l i s c l e a r l y s e e n , b u t d i s t i n c t i n n e r m e m b r a n e s a r e n o t d i s t i n g u i s h a b l e . E l e c t r o n - d e n s en u c l e o i d s a n d r i b o s o m e s a r e c l e a r l y s h o w n . M a r k e r i n d i c a t e s 2 5 0 nm .F I G . 2 . E l e c t r o n m i c r o g r a p h o f a t h i n s e c t i o n o f p a r t i a l l y p u r i f i e d e n v e l o p e s o f m e n i n g o p n e u m o n i t i s e l e m e n t a r yb o d i e s . T h e o u t e r c e l l w a l l a n d a n i n n e r c y t o p l a s m i c m e m b r a n e a r e c l e a r l y s e e n . M a r k e r i n d i c a t e s 2 5 0 nm.F I G . 3 . E l e c t r o n m i c r o g r a p h o f a t h i n s e c t i o n o f p u r i f i e d e n v e l o p e s o f m e n i n g o p n e u m o n i t i s e l e m e n t a r y b o d i e sa f t e r e x t r a c t i o n w i t h s o d i u m d o d e c y l s u l f a t e . T h e c y t o p l a s m i c m e m b r a n e s s e e n i n F i g . 2 h a v e b e e n c o m p l e t e l y r e -m o v e d . M a r k e r i n d i c a t e s 2 5 0 n m .F I G . 4 . E l e c t r o n m i c r o g r a p h o f t h i n s e c t i o n o f p u r i f i e d m e n i n g o p n e u m o n i t i s r e t i c u l a t e b o d i e s . E a c h c e l l i s s u r -r o u n d e d b y an e n v e l o p e c o n t a i n i n g t w o m e m b r a n e l a y e r s . E l e c t r o n - d e n s e i n t e r c e l l u l a r b r i d g e s a r e s e e n . M a r k e r si n d i c a t e 2 5 0 n m.

3 5 6 J . B A C T E R I O L .

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V O L . 1 0 5 , 1 9 7 1 ENVELOPES OF CHLAMYDIA PSITTACI"*.-9A- .S tIR,A : ' f p , t , t #*. A s . ( : ^ js v..5:s-t~~ r 29+y.s 3 5 7I . /A.Ssy_f i 4.. % ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~ ~*I . .E ~ 0

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F I G S . 1 - 4 .

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&sefoI, Tid, .A , _ - | _ v 4 ,. . J.

1(_I . .. . ,-. . 9 ,F I G . 5 . E l e c t r o n m i c r o g r a p h o f t h i n s e c t i o n o f m e n i n g o p n e u m o n i t i s r e t i c u l a t e b o d i e s i n a n i n f e c t e d L c e l l 2 4 h ra f t e r i n f e c t i o n . B o t h t h e o u t e r c e l l w a l l a n d t h e c y t o p l a s m i c m e m b r a n e c a n b e c l e a r l y s e e n i n v a r i o u s a r e a s o f e a c ho r g a n i s m . M a r k e r s i n d i c a t e 2 5 0 n m .F I G . 6 . E l e c t r o n m i c r o g r a p h o f t h i n s e c t i o n o f p a r t i a l l y p u r i f i e d m e n i n g o p n e u m o n i t i s r e t i c u l a t e b o d y e n v e l o p e sb e f o r e s o d i u m d o d e c y l s u l f a t e t r e a t m e n t . E l e c t r o n - d e n s e i n t e r c e l l u l a r b r i d g e s a n d i n t e r n a l m e m b r a n o u s s t r u c t u r e s

a r e s e e n i n s e v e r a l e n v e l o D e s . M a r k e r i n d i c a t e s 2 5 0 n m .F I G . 7 . E l e c t r o n m i c r o g r a p h o f t h i n s e c t i o n o f p u r i f i e d m e n i n g o p n e u m o n i t i s r e t i c u l a t e b o d y e n v e l o p e s a f t e rs o d i u m d o d e c y l s u l f a t e e x t r a c t i o n . No i n t e r n a l m e m b r a n o u s s t r u c t u r e s a r e s e e n , b u t t h e o u t e r c e l l w a l l s r e m a i ni n t a c t . M a r k e r i n d i c a t e s 2 5 0 n m .3 5 8

, . , ( * . . . 4 t - . . ." . . 4% % .. . . . ,4 h At.- 1 % , I Mk. , . ,.W

1 4. , v l , .. .. 0 4 4.. ,

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ENVELOPES OF CHLAMYDIA PSITTACIc o l u m n , w a s h e d b y r e p e a t e d c e n t r i f u g a t i o n , a n dr e s u s p e n d e d i n P B S .I n t h i n s e c t i o n s o f p u r i f i e d R B , t h e RB a r eo f t e n i r r e g u l a r i n s h a p e , o r a r e r o u n d o r o v a l , a n da r e c o m p o s e d o f r a t h e r h o m o g e n e o u s , amor-p h o u s , o r r e t i c u l a t e m a t e r i a l o f m o d e r a t e d e n s i t y( F i g . 4 ) . E l e c t r o n - d e n s e c o n n e c t i o n s b e t w e e n t w op a r t i c l e s a r e o f t e n s e e n , w h i c h may b e a n o r g a -n e l l e a c t i n g a s a d i v i s i o n c e n t r u m d e s c r i b e d p r e -v i o u s l y b y o n e o f t h e a u t h o r s ( 1 ) . T h e p u r i f i e dRB s h o w n i n F i g . 4 a r e s u r r o u n d e d b y a n e n v e -l o p e , b u t t h e i n n e r o r c y t o p l a s m i c m e m b r a n e i sn o t c l e a r l y e v i d e n t . H o w e v e r , w h e n t h i n s e c t i o n sw e r e m a d e o f i n f e c t e d L c e l l s a t 2 0 t o 2 6 h r a f t e ri n f e c t i o n , i t w a s c l e a r l y d e m o n s t r a t e d t h a t t h eRB i n t h e v e s i c l e s w e r e s u r r o u n d e d b y t w o s t r u c -t u r e s a s s e e n i n EB ( F i g . 5 ) .P u r i f i e d RB e n v e l o p e s w e r e p r e p a r e d b y r e s u s -p e n d i n g RB i n 0 . 1 M T r i s b u f f e r ( p H 8 . 5 ) f o l -l o w e d b y i n c u b a t i o n w i t h t r y p s i n ( 2 0 0 , g / m l ) a t3 7 C f o r 3 0 m i n a n d t h e n a t 2 t o 4 C o v e r n i g h t .A f t e r c e n t r i f u g a t i o n a t 8 0 0 x g f o r 1 0 m i n , t h er e s u l t i n g s u p e r n a t a n t f l u i d w a s c e n t r i f u g e d a t8 , 0 0 0 x g f o r 3 0 m i n , a n d t h e t h i n s e c t i o n s w e r ep r e p a r e d f r o m t h e p e l l e t . F i g u r e 6 s h o w s a n e l e c -t r o n m i c r o g r a p h o f a t h i n s e c t i o n o f t h i s m a t e r i a l .RB e n v e l o p e s f o r m u n e v e n o u t l i n e s . E l e c t r o n -d e n s e b r i d g e s w h i c h w e r e o b s e r v e d i n F i g . 4 r e -m a i n a f t e r t r y p s i n t r e a t m e n t . M e m b r a n o u s s t r u c -t u r e s c a n b e o b s e r v e d o n t h e i n s i d e o f s o m e e n v e -l o p e s , b u t t h e y a p p e a r t o b e p a r t i a l l y b r o k e n o rs h r u n k e n . I n s p i t e o f many e f f o r t s , RB e n v e l o p e ss h o w i n g t w o c l e a r l y d e f i n e d l a y e r s s u c h a s w e r es e e n w i t h EB e n v e l o p e s w e r e n o t f o u n d .P e l l e t s o f e n v e l o p e s o f RB c e l l s a f t e r t r y p s i nt r e a t m e n t w e r e s u s p e n d e d i n 0 . 1 M T r i s b u f f e r( p H 7 . 4 ) c o n t a i n i n g 0 . 0 1 M M g C l 2 , a n d 0 . 1v o l u m e o f r i b o n u c l e a s e a n d d e o x y r i b o n u c l e a s es o l u t i o n ( 1 0 0 g g / m l e a c h , f i n a l c o n c e n t r a t i o n )w a s a d d e d t o t h e s u s p e n s i o n . A f t e r i n cu b a t i o n a t3 7 C f o r 2 h r , t h e m i x t u r e w a s a g a i n c e n t r i f u g e da t 8 , 0 0 0 x g f o r 3 0 m i n , a n d t h e p e l l e t w a s s u s -p e n d e d i n d i s t i l l e d w a t e r . T h i s s u s p e n s i o n w a sm i x e d w i t h a n e q u a l v o l u m e o f 0 . 5 % SD S a n di n c u b a t e d a t 3 7 C f o r 2 h r . T h e s u s p e n s i o n w a st h e n c e n t r i f u g e d a t 8 0 0 x g f o r 1 0 m i n , a n d t h es u p e r n a t a n t f l u i d w a s f u r t h e r c e n t r i f u g e d a t 8 , 0 0 0x g f o r 3 0 m i n . F i g u r e 7 s h o w s a n e l e c t r o n m i -c r o g r a p h o f a t h i n s e c t i o n o f t h e p e l l e t o b t a i n e d .A l l i n n e r m e m b r a n e s a n d t h e e l e c t r o n - d e n s eb r i d g e s o b s e r v e d i n F i g . 6 a r e c o m p l e t e l y e l i m i -n a t e d b y t h i s t r e a t m e n t . T h e o u t e r l a y e r s o f t h ee n v e l o p e s w e r e n o t s o l u b l e i n d e t e r g e n t b u t a p -p e a r t o b e c o m e s t r e t c h e d o u t a n d t o f o r m l a y e r s ,i n d i c a t i n g a l a c k o f r i g i d i t y .

DISCUSSIONT h e e x i s t e n c e o f c e l l w a l l s s i m i l a r i n many r e -s p e c t s t o t h o s e o f b a c t e r i a w a s s u g g e s t e d b y t h e

i n h i b i t i o n o f C h i a m y d i a b y p e n i c i l l i n ( 5 , 1 2 , 1 5 )a n d w a s d e m o n s t r a t e d d i r e c t l y b y t h e i s o l a t i o na n d p a r t i a l c h e m i c a l a n a l y s i s o f t h e e n v e l o p e s o ft h e s e o r g a n i s m s ( 2 , 4 , 8 ) . T h i s s i m i l a r i t y t o b a c -t e r i a s u g g e s t e d t h a t t h e e n v e l o p e s h o u l d c o n s i s t o fa c e l l w a l l a n d c y t o p l a s m i c m e m b r a n e , b u t s u c hs t r u c t u r e s h a v e n o t b e e n p r e v i o u s l y d e m o n -s t r a t e d .We h a v e a l r e a d y r e p o r t e d t h a t e n v e l o p e s i s o -l a t e d f r o m b o t h EB a n d RB o f MP d i f f e r e d s i g -n i f i c a n t l y i n s u c h c h a r a c t e r i s t i c s a s r i g i d i t y , r e -s i s t a n c e t o s o n i c t r e a t m e n t , l i p i d c o n t e n t , a n da m i n o a c i d c o n t e n t ( 4 , 1 1 ) . From t h e s e d a t a , w es p e c u l a t e d t h a t t w o p o s s i b i l i t i e s e x i s t : ( i ) t h e e x -t r a c e l l u l a r EB a r e s u r r o u n d e d b y a c e l l w a l l a n dc y t o p l a s m i c m e m b r a n e , b u t t h e d e v e l o p m e n t a lRB h a v e o n l y a c y t o p l a s m i c m e m b r a n e a n d m u l -t i p l y l i k e m y c o p l a s m a ; o r ( i i ) b o t h EB a n d RBh a v e b o t h c e l l w a l l a n d c y t o p l a s m i c m e m b r a n e ,b u t t h e c e l l w a l l o f t h e RB i s s i g n i f i c a n t l y a l t e r e da s i t b e g i n s t o u n d e r g o g r o w t h a n d b i n a r y f i s s i o n .

T h e r e s u l t s r e p o r t e d i n t h i s p a p e r c l e a r l y i n d i -c a t e t h a t t h e s e c o n d o f t h e s e a l t e r n a t i v e s i s t r u e .T h e EB e n v e l o p e s w e r e f o u n d t o b e c o m p o s e d o fa c e l l w a l l , n o t s o l u b l e i n 0 . 5 % S D S , a n d a d e t e r -g e n t - s o l u b l e c y t o p l a s m i c m e m b r a n e . T h e RBe n v e l o p e a l s o a p p e a r e d t o b e c o m p o s e d o f t w od i s t i n c t m o r p h o l o g i c a l c o m p o n e n t s , a l t h o u g hb o t h w e r e f r a g i l e . T h e o u t e r l a y e r w a s i n s o l u b l ei n d e t e r g e n t , r e s e m b l e d t h e c e l l w a l l o f EB i nm o r p h o l o g y , a n d i s o b v i o u s l y a c o n t i n u a t i o n o ft h e c e l l w a l l f o u n d i n E B . A p r o b a b l e e x p l a n a t i o no f t h e c h a n g e f r o m a r i g i d n o n p e r m e a b l e c e l l w a l lo f EB t o a f r a g i l e , f l e x i b l e , p e r m e a b l e w a l l i n t h ed i v i d i n g f o r m o f t h e o r g a n i s m i s p r o v i d e d b y t h er e p o r t o f M a t s u m o t o a n d M a n i r e ( B a c t e r i o l .P r o c . , p . 1 0 9 , 1 9 6 9 ) o n t h e i s o l a t i o n o f a f o r -m a m i d e - i n s o l u b l e s u b u n i t f r o m t h e EB c e l l w a l l ,w i t h t h e s e s t r u c t u r e b e i n g a b s e n t i n t h e RB e n v e -l o p e s . A f u l l r e p o r t o n t h i s s t u d y w i l l b e p r e s e n t e di n a n o t h e r p a p e r .T h e s e s t u d i e s g i v e f u r t h e r e v i d e n c e f o r t h eu n i q u e n a t u r e o f t h e C h l a m y d i a . T h e EB i s e s s e n -t i a l l y a n e x t r a c e l l u l a r f o r m o f t h e o r g a n i s m w i t ha c e l l w a l l w h i c h i s r e s i s t a n t t o s u c h a n e n v i r o n -m e n t . A f t e r i n f e c t i o n a n d b e f o r e d i v i s i o n , t h e r eo c c u r s c o n v e r s i o n t o a n i n t r a c e l l u l a r f o r m w h i c hi n p e r m e a b i l i t y i s e s p e c i a l l y a d a p t e d f o r p a r a -s i t i s m w i t h i n t h e p r o t e c t i o n o f t h e h o s t c e l l .

ACKNOWLEDGMENTSWe a r e g r a t e f u l t o E i i c h i F u j i w a r a f o r t e c h n i c a l c o o p e r a t i o n o n t h ee l e c t r o n m i c r o s c o p y a n d a l s o t o M i t s u e M. I k e m u r a f o r e x c e p t i o n a l l y

s k i l l e d t e c h n i c a l a s s i s t a n c e .T h i s i n v e s t i g a t i o n w a s s u p p o r t e d b y P u b l i c H e a l t h S e r v i c e g r a n t A l -0 08 6 8 f r o m t h e N a t i o n a l I n s t i t u t e o f A l l e r g y a n d I n f e c t i o u s D i s e a s e s a n db y N a t i o n a l S c i e n c e F o u n d a t i o n g r a n t G B - 7 5 8 7 .

LITERATURE CITED1 . H i g a s h i , N . 1 9 6 5 . E l e c t r o n m i c r o s c o p i c s t u d i e s o n t h e m o d e o f r e p r o -

3 5 9O L . 1 0 5 , 1 9 7 1

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TAMURA ET A L .d u c t i o n o f t r a c h o m a v i r u s a n d p s i t t a c o s i s v i r u s i n c e l l c u l t u r e . E x p .M o l . P a t h o l . 4 : 2 4 - 3 9 .

2 . J e n k i n , H . M. 1 9 6 0 . P r e p a r a t i o n a n d p r o p e r t i e s o f c e l l w a l l s o f t h ea g e n t o f m e n i n g o p n e u m o n i t i s . J . B a c t e r i o l . 8 0 : 6 3 9 - 6 4 7 .

3 . L u f t , J . H . 1 9 6 1 . I m p r o v e m e n t i n epoxy r e s i n e m b e d d i n g m e t h o d s . J .B i o p h y s . B i o c h e m . C y t o l . 9 : 4 0 9 - 4 1 4 .4 . M a ni r e , G . P . , a n d A . T a m u r a . 1 9 6 7 . P r e p a r a t i o n a n d c h e m i c a l com-p o s i t i o n o f t h e c e l l w a l l s o f mature i n f e c t i o u s d e n s e f o r m s o f m e n i n -

g o p n e u m o n i t i s o r g a n i s m s . J . B a c t e r i o l . 9 4 : 1 1 7 8 - 1 1 8 3 .5 . M a t s u m o t o , A . , a n d G . P . M a n i r e . 1 9 7 0 . E l e c t r o n m i c r o s c o p i c o b s e r -v a t i o n s o n t h e e f f e c t s o f p e n i c i l l i n o n t h e m o r p h o l o g y o f C h i a m y d i a

p s i t t a c i . J . B a c t e r i o l . 1 0 1 : 2 7 8 - 2 8 5 .6 . M i l l o n i g , G . 1 9 6 1 . A m o d i f i e d p r o c e d u r e f o r l e a d s t a i n i n g o f t h i n s e c -t i o n s . J . B i o p h y s . B i o c h e m . C y t o l . 1 1 : 7 3 6 - 7 3 9 .7 . P a l a d e , G . E . 1 9 5 2 . S t u d y o f f i x a t i o n f o r e l e c t r o n m i c r o s c o p y . J . E x p .

M e d . 9 5 : 2 8 5 - 2 9 8 .8 . P e r k i n s , H . R . , a n d A . C . A ll i s on . 1 9 6 3. C e l l w a ll c o n s t i t u e n t s o f r i c k -e t t s i a a n d p s i t t a c o s i s l y m p h o g r a n u l o m a o r g a n i s m s . J . G e n . M i c r o -b i o l . 3 0 : 4 6 9 - 4 8 0 .

9 . R y t e r , A . , a n d E . K e l l e n b e r g e r . 1 9 5 8 . L ' i n c l u s i o n a u p o l y e s t e r pourl ' u l t r a m i c r o t o m i e . J . U l t r a s t r u c t . R e s . 2 : 2 0 0 - 2 1 4 .1 0 . T a m u r a , A . , a n d N . H i g a s h i . 1 9 6 3 . P u r i f i c a t i o n a n d c h e m i c a l c o mp o -s i t i o n o f m e n i n g o p n e u m o n i t i s v i r u s . V i r o l o g y 2 0 : 5 9 6 - 6 0 4 .1 1 . T a m u r a , A . , a n d G . P . M a n i r e . 1 9 6 7 . P r e p a r a t i o n a n d c h e m i c a l co m -p o s i t i o n o f t h e c e l l m e m b r a n e s o f d e v e l o p m e n t a l r e t i c u l a t e f o r m s o f

m e n i n g o p n e u m o n i t i s o r g a n i s m s . J . B a c t e r i o l . 9 4 : 1 1 8 4 1 1 8 8 .1 2 . T a m u r a , A . , a n d G . P . M a n i r e . 1 9 6 8 . E f f e c t o f p e n i c i l l i n o n t h e m u l t i -p l i c a t i o n o f m e n i n g o p n e u m o n i t i s o r g a n i s m s ( C h i a m y d i a p s i t t a c i ) . J .B a c t e r i o l . 9 6 : 8 7 5 - 8 8 0 .1 3 . T a m u r a , A . , A . M a t s u m o t o , a n d N . H i g a s h i . 1 9 6 7 . P u r i f i c a t i o n a n d

c h e m i c a l c o m p o s i t i o n o f r e t i c u l a t e b o d i e s o f t h e m e n i n g o p n e u -m o n i t i s o r g a n i s m s . J . B a c t e r i o l . 9 3 : 2 0 0 3 - 2 0 0 8 .1 4 . W a t s o n , M . L . 1 9 5 8 . S t a i n i n g o f t i s s u e s e c t i o n s f o r e l e c t r o n m i c r o s -

copy w i t h h e a v y m e t a l s . J . B i o p h y s . B i o c h e m . C y t o l . 4 : 4 7 5 4 7 8 .1 5 . W e i s s , E . 1 9 5 0 . T h e e f f e c t o f a n t i b i o t i c s o n a g e n t s o f t h e p s i t t a c o s i s -

l y m p h o g r a n u l o m a groups. 1 . T h e e f f e c t o f p e n i c i l l i n . J . I n f e c t . D i s .8 7 : 2 4 9 - 2 6 3 .

3 6 0 J . BACTERIOL.