プロダクトブリテン TaqMan® multiplex real-time PCR

TaqMan® マルチプレックス リアルタイム PCR̶ サンプルからより多くのデータを収集

• 遺伝子発現定量及びSNPジェノタイピングのためのマルチプレックスリアルタイムPCRソリューション

• 新しい蛍光色素のABY®とJUN®、 QSY®クエンチャー、マルチプレックスマスターミックスが増幅を最適化

• シングルプレックスと同じ感度で最高4-plexまでの反応を実現。初期サンプル量を削減するとともに最適化プロセスを短縮

少量の貴重なサンプルから最大限の遺伝子情報を引き出すのは容易ではありません。特にトランスレーショナルリサーチに用いる FFPE サンプルや腫瘍生検サンプルでは、これが大きな課題となります。このような臨床研究サンプルにはシングルプレックスqPCRが一般的ですが、通常はマルチプレックスに比べてサンプル当たりのコストが上昇します。また、複数のシングルアッセイを個々にセットアップすると時間がかかり、必要なサンプル量も増えるため、複雑なプロジェクトでは実験コストが激増する可能性もあります。

一方マルチプレックスqPCRは、1本のチューブでサンプルに含まれる複数のターゲットを増幅および定量するため、必要なサンプルや試薬の量を少なく抑えることができます。そこでライフテクノロジーズは、複数の試薬が連携してデータの品質を改善し、最適化の時間をより短縮するよう設計した完全なマルチプレ

FiltersWavelength （nm）

Emission Spectra

Dyes~517 nm ~551 nm ~580 nm ~617 nm ~654 nm

FAM™ VIC® ABY® JUN® MP

ックスqPCRソリューションを開発しました。このソリューションは、次のような製品構成で提供しています。

• QSY®クエンチャーを持つTaqMan® プローブは、マルチプレックスPCRの効率を最大限に高めます。この新しいプローブは、FAM™、VIC®、ABY®、 JUN®と組み合わせることで、1反応で最高4つのターゲットを増幅することができます。これらの蛍光色素は、スペクトルの重複を最小限に抑え、相互に連携して最高の性能を発揮できるよう最適化されています（図1）。またQSY®クエンチャーは、MGBクエンチャーをもつプローブと完全に適合します。

図1. マルチプレックス リアルタイム PCR に用いる FAM™、VIC®、ABY®、JUN®の蛍光スペクトル 灰色のゾーンは、Applied Biosystems® リアルタイムPCRシステムで使用されている各フィルターに適応しています（QuantStudio® 7/12K FlexリアルタイムPCRシステムでは1 ～ 6、QuantStudio® 6 Flex リアルタイムPCRシステム、およびViiA™ 7リアルタイムPCRシステム、7500/7500 Fast リアルタイムPCRシステムでは 1 ～ 5 が使用できます）。MPはMUSTANG PURPLE®を示します。

• 4つのターゲットを競合することなく同時に増幅するために新しく開発されたTaqMan® Multiplex Master Mix。このマスターミックスは、ROX®

の代わりにパッシブリファレンスとして、MUSTANG PURPLE®を含み、これまでROX®の測定に使用していたチャネルでJUN®を測定できるようにしました。

• デザイン済みアッセイ―ABY®-QSY®

プローブを使用したRNaseP用アッセイと、JUN®-QSY®プローブを使用したGAPDH用アッセイ。どちらもプライマー濃度を制限したアッセイおよび非制限アッセイの双方を取り揃えています。

• ABY® 、JUN® 、MUSTANG PURPLE® 用キャリブレーションプレート。96ウェル、96ウェルFast、384ウェルの各フォーマットでご用意しております。

• カスタムアッセイデザインサービス（有料）は、専門のアッセイデザインチームがマルチプレックスアッセイのデザインを代行し、お客様の時間を節約します。

当マルチプレックスソリューションは、 QuantStudio® 6、7 および12K FlexリアルタイムPCRシステム、ViiA™ 7 リアルタイムPCRシステム、7500/7500 Fast リアルタイムPCRシステムでご利用いただけます。

データを損なうことなく　　　　　　　　マルチプレックスを実行

マルチプレックスは、コストを削減し、貴重なサンプルを有効利用します。しかし、シングルプレックスと同様の感度を維持することも重要です。そこで図2では、遺伝子定量実験におけるシングルプレックスと4-plexの結果を比較しました。

プローブの性能向上

新しいレポーター蛍光色素としてのABY®

およびJUN®と、MUSTANG PURPLE®パッシブリファレンスの導入により、FAM™

およびVIC®と合わせて理想的な4色のマルチプレックスアッセイが可能となりました。FAM™およびVIC®色素はMGBとQSY®

のどちらのクエンチャーも使用できますが、ABY®およびJUN®はクエンチャーが QSY®に限られますのでご注意ください。他社製の色素の組み合わせと比較して、ライフテクノロジーズの色素は大半のアッセイでより早いCt値を示します（図3）。

A B

C D

Amplification plot

△Rn

Cycle

Cycle Cycle

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8

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0.5

△Rn

Amplification plot

Amplification plot Amplification plot

図2. 遺伝子発現定量におけるシングルプレックスとマルチプレックスの比較 （A）EGFRアッセイ、FAM™ラベル、（B） BRCA1 アッセイ、VIC®ラベル、（C） ESR1アッセイ、JUN®ラベル、（D） RNaseP アッセイ、ABY®ラベル。QuantStudio® 7 リアルタイムPCRシステムで、TaqMan® Multiplex Master Mix を使用して増幅しました。コントロールcDNA を10 μL あたり 20,000 pg ～ 2 pg 含む希釈系列を調製し、4つのシングルプレックス（青）と4-plex（赤）で実施した結果、いずれも稀釈倍率に応じた増幅曲線を得ることができました。希釈系列のCt値の平均（線グラフ）と標準偏差（棒グラフ）をそれぞれひとつのグラフに表示し、シングルプレックスと4-plexの結果がほぼ一致していることを確認しました。PCR 効率は、EGFRでシングルプレックスが96.09%に対し4-plexが96.39%、BRCA1でシングルプレックスが93.56%に対し4-plexが94.93%、ESR1でシングルプレックスが97.13%に対し4-plexが95.81%、RNasePでシングルプレックスが96.91%に対し4-plexが98.1%でした。

図 3. ライフテクノロジーズの新しい色素群と他社製の色素群との比較 （A）B2M、（B）HPRT、（C）GAPDH、 （D）RNasePの各遺伝子発現アッセイ用にFAM™、VIC®、ABY®、JUN®のQSY®プローブ（赤）を合成し、他社製の色素の組み合わせ（青）と比較しました。PCR反応液はTaqMan® Multiplex Master Mixで調製し、プライマー900 nM、プローブ250 nM、cDNA10 ng を使用しました。QuantStudio® 7リアルタイムPCRシステムを使用して増幅しました。棒グラフは標準偏差を、三角形とひし形はCt値の平均を示しています。

図 4. TaqMan® Multiplex Master Mix と　　他社製マスター ミックスの比較（A）B2Mアッセイ、FAM™、（B）RNasePアッセイ、VIC®、（C）GAPDHアッセイ、ABY®、（D）HPRTアッセイ、JUN®。いずれのアッセイもクエンチャーには QSY®を使用しました。グラフは標準偏差（棒グラフ）、およびCt値の平均（十字と三角形）を示しています。cDNAを10 μLあたり100 ng～10 pg含む希釈系列を調製し、4-plexで増幅しました。すべての増幅は、各マスターミックスが推奨するサイクル条件に従い、ViiA™ 7リアルタイムPCRシステムで実行しました。赤はTaqMan® Multiplex Master Mix、青は他社製マスターミックスの4-plexを示しています。

最適化済みマルチプレックス　マスターミックス

マルチプレックスPCRでは、厳しい競合環境で各ターゲットを安定的に増幅できるマスターミックスが必要となります。そこでライフテクノロジーズは、PCR反応で各ターゲットに対し最高のマルチプレックス性能を発揮できる新しい組成のマスターミックスを開

発しました。このマスターミックスと他社製のマスター ミックスとを4-plex反応で比較した結果、ライフテクノロジーズ製品は増幅したターゲットのうち3つが他社製品より早くCt値に達するとともに、大半の希釈ポイントで標準偏差がより小さく、優れた性能を発揮しました（図 4）。

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取扱店

〒108-0023　東京都港区芝浦 4-2-8TEL.03 (6832) 9300 　FAX. 03 (6832) 9580

本社： 〒564-0052　大阪府吹田市広芝町 10-28TEL.06 (6389) 1201 　FAX. 06 (6389) 1206

大阪：

ライフテクノロジーズジャパン株式会社

www.lifetechnologies.com

研究用にのみ使用できます。診断目的およびその手続き上での使用は出来ません。記載の社名および製品名は、弊社または各社の商標または登録商標です。標準販売条件はこちらをご覧ください。 www.lifetechnologies.com/TC For Research Use Only. Not for use in diagnostic procedures. © 2014 Thermo Fisher Scientific Inc. All rights reserved. All trademarks are the property of Thermo Fisher Scientific and its subsidiaries unless otherwise specified. TaqMan is a registered trademark of Roche Molecular Systems, Inc., used under permission and license. SDR085-A1408OB

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Ordering Information製品名 製品番号TaqMan® QSY® プローブ

TaqMan® QSY® Probe, 6,000 pmol 4482777

TaqMan® QSY® Probe, 20,000 pmol 4482778

TaqMan® QSY® Probe, 50,000 pmol 4482779

QSY®プローブのご注文はこちらから： www.lifetechnologies.com/taqman-orderコントロール キット

TaqMan® GAPDH Assay, JUN®-QSY® 20X 4485712

TaqMan® GAPDH Assay, JUN®-QSY® PL 20X 4485713

TaqMan® RNaseP Assay, ABY®-QSY® 20X 4485714

TaqMan® RNaseP Assay, ABY®-QSY® PL 20X 4485715マルチプレックス マスターミックス

TaqMan® Multiplex Master Mix, 1 mL 4461881

TaqMan® Multiplex Master Mix, 5 mL 4461882

TaqMan® Multiplex Master Mix, 2 x 5 mL 4461884

TaqMan® Multiplex Master Mix, 5 x 5 mL 4484262

TaqMan® Multiplex Master Mix, 10 x 5 mL 4484263

TaqMan® Multiplex Master Mix, 50 mL 4486295キャリブレーション プレート

MUSTANG PURPLE® Dye Spectral Calibration Plate, 96-well 4461599JUN® Dye Spectral Calibration Plate for Multiplex qPCR, 96-well A24737ABY® Dye Spectral Calibration Plate for Multiplex qPCR, 96-well A24738MUSTANG PURPLE® Dye Spectral Calibration Plate for Multiplex qPCR, Fast 96-well 4457328MUSTANG PURPLE® Dye Spectral Calibration Plate for Multiplex qPCR, 384-well 4457334JUN® Dye Spectral Calibration Plate for Multiplex qPCR, 384-well A24733ABY® Dye Spectral Calibration Plate for Multiplex qPCR, Fast 96-well A24734JUN® Dye Spectral Calibration Plate for Multiplex qPCR, Fast 96-well A24735ABY® Dye Spectral Calibration Plate for Multiplex qPCR, 384-well A24736

ユーザーマニュアルや参考文献など、製品の詳しい資料については、

www.lifetechnologies.com/multiplexqpcr をご参照ください。

アッセイ開発を最短化

マルチプレックスPCRアッセイを開発するには、正確にアッセイを設計し、増幅反応を最適化するための長い時間が必要です。しかしライフテクノロジーズのソリューションでは、すべての試薬が同時に使用されることを想定して開発されているため、成功率が高まるとともに開発時間を短縮で

きます。また、新たにお客様の開発および最適化プロセスをサポートするユーザーガイド：TaqMan® Multiplex Optimization Guideを作成しました。さらにライフテクノロジーズのカスタムアッセイデザインサービスを利用すれば、専門チームにアッセイの設計を委託し、手間を最小限に抑えることができます。

参考資料

1. ユーザーガイド：TaqMan® Multiplex Optimization Guide

2. アプリケーションノート：TaqMan® マルチプレックスqPCR

両参考資料とも、以下のURLよりダウンロードいただけます。

www.lifetechnologies.com/multiplexqpcr