UFPS

INFORME DE BIOLOGIA MOLECULAR

[

] Luz Andrea Barriga Rodríguez 1610183, Carol Nataly Carrero Becerra 1610423, Sandra Patricia Rueda Díaz 1610425, Lady Johana Moreno Villamizar 1610461

INTRODUCCIÓN

La electroforesis es un método de laboratorio en el que se utiliza una corriente eléctrica controlada con la finalidad de separar biomoleculas según su tamaño y carga eléctrica a través de una matriz gelatinosa. [1]

Fue empleado por primera vez por  en el año 1937, pero su importancia vino a incrementarse cuando en los años cincuenta E. L.Durrum y Arne W.K. Tiselius , impulsaron la electroforesis de zona, nombre que se asignó a la separación de materiales en un campo eléctrico en presencia de algún tipo de soporte; aunque este término se limitó originalmente al análisis de coloides y partículas submicroscopicas , se ha convertido en estos últimos años en una metodología aplicada a sustancias de bajo peso molecular. Desde entonces hay varios tipos de geles donde se realiza electroforesis como electroforesis en geles de gradientes, de agarosa, de poliacrilamida, también se haba de electroforesis capilar, electroforesis bidimensional e isoelectroenfoque. [2]

Electroforesis en gel de poliacrilamida; estos geles se forman por  polimerización de la acrilamida por acción de un agente entrecuzador, es químicamente inerte, de propiedades uniformes, capaz de ser preparado de forma rápida y reproducible.

Forma, además, geles transparentes con estabilidad mecánica, insolubles en agua, relativamente no iónicos y que permiten buena visualización de las bandas durante un tiempo prolongado. Además tiene la ventaja de que variando la concentración de polímeros, se puede modificar de manera controlada en el tamaño del poro, lamentablemente cada vez se emplea menos en diagnostico debido a su neurotoxocidad.[3]

OBJETIVO

Extraer el ADN de Fusarium sp y analizarlo en una gel de poliacrilamida, preparada según las indicaciones establecidas, conociendo la importancia de cada uno de los reactivos utilizados.

METOOLOGIA

Para la extracción del ADN genómico de Fusarium sp o para cualquier otra especie de hongo es necesario seguir la siguiente metodología:

Tomar 0.5 -0.75 del hongo en suspensión.Fig.1

Adicionar 500 microlitros de buffer de estracción y macerar. ver figura 2 y 3

vortex por 1 minuto y centrifugar a 6000 rpm por 10 minutos, trasvasar la face superior a tubos eppendorf nuevos, figura 4 y 5

Incubar a 70 grados centigrados por 15 minutos y adicionar fenol-cloroformo en proporcion 1:1. Figura 6 y 7

Centrifugar a 10.000 rpm por 10 min y reenvasar el sobrenadante Figura 8Adicionar un volumen de isopropanol a 0 grados por 10 minutos y centrifugar nuevamente a 10.000 por 10 minutos

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Fig. 10 Adicion de los 50 microlitros de Tris Edta (TE)

Gel de Poliacrilamida:

La polimerización deriva del tratamiento (Fig. 12) con aps al 10% y temed de edición comercial sobre la solución de acrilamida al 30%. Ubicar los dos vidrios de orillo curvo bien alineados con los separadores de lado y lado; aislarlos para evitar fugas. Poner el vidrio muescado sobre el montaje anterior y se sella el complejo de vidrio. Fig. 11

Fig. 11 Aislamiento del par de vidrios para el gel de poliacrilamida. Servir el gel con pipetas pauster, (Fig. 13) se coloca el peine (Fig. 14) y se espera la polimerización.

Descartar el isopropanol y dejar secar

conservar en 50 microlitros de TE Fig 10

Adicionar el buffer de corrida y correr en electroforesis gel de poliacrilamida

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Fig. 1 Micelio del hongoFusarium sp

Fig. 2 Se añade el buffer de extracción. Fig. 3 Se macera el

hongo.

Fig. 4 se agita en el vortex

Fig. 5 Centrifugación.

Fig. 6 Incubación

Fig. 7 se añade fenol cloroformo.

Fig. 8 Centrifugación

Fig. 9 Adición del fenol cloroformo

Fig. 12 Adición de Aps y temed a la solución de acrilamida, para realizar la polimerización.

Fig. 13 Servicio de la solución previa a la polimerización de la acrilamida por efectos del temed.

Fig. 14 Formación de los pocillos ubicando el peine.Una vez polimerice el gel se colocan los vidrios con los separadores en uno de los lados de la cámara de electroforesis vertical procurando dejar los pozos hacia el interior con el fin de inundarlos con buffer de corrida.

Se fijan los vidrios con los ganchos y al lado opuesto se coloca un vidrio individual para sellar la cámara,

retirando el peine con cuidado se inunda la cámara arriba y abajo con buffer 1x y se eliminan las burbujas.

Cargar las muestras de 10 microlitros por cada pozo y conectar los electrodos a la fuente de 120 voltios.

Para leer se sumerge en 5 volúmenes de colorante.

RESULTADOS

Debido a los inconvenientes presentados en el desarrollo de la práctica de laboratorio, no se pudo realizar la electroforesis en gel de poliacrilamida, sino que se realizó en gel de agarosa.

En la Figura 15 se ve la migración de las bandas de ADN genómico de Fusarium sp. hacia el polo positivo ya que el ADN presenta una carga negativa, además se observa como todas las bandas migran con la misma velocidad debido a que presentan el mismo peso.

Fig. 15 Electroforesis en gel de agarosa.

DISCUSIONES

A pesar de que se llevó a cabo, un procedimiento conforme a lo requerido en la guía para la práctica, el gel de poliacrilamida presento muchos inconvenientes para su polimerización, por lo que se tomó como segunda opción la preparación del gel de agarosa, por cuanto este presenta unas características muy importantes como:

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El gel es vertido fácilmente, no desnaturalizan las muestras, y las muestras pueden también ser recuperadas. [5]

La electroforesis es una técnica muy sensible y puede ser afectada por muchos errores experimentales, como pudo ser posible en esta práctica, En geles vertidos a 25 ºC ocurre mayor variabilidad de los Rf si se comparan con los vertidos a bajas temperaturas. La eficiencia de polimerización incrementa comparativamente a 0 ºC por lo que sus propiedades físicas son superiores (para SDS-PAGE) a las de geles polimerizados a 25 ºC, posiblemente por una disminución del promedio de  la longitud de cadena de estos últimos. También es preciso decir que puede existir la presencia de impurezas en los reactivos utilizados para la preparación del gel, sin embargo esto depende de la calidad de los reactivos desde su fabricación. Por ejemplo las principales impurezas son ácido acrílico residual (que puede retardar la movilidad electroforética de algunas Proteínas), poliacrilamida lineal e iones. [4]

El aumento de la concentración de la agarosa de un gel reduce la velocidad de la migración y permite la separación de moléculas más pequeñas de la DNA. Cuanto más alto es el voltaje, más rápidamente la DNA emigra. Pero el voltaje es limitado por el hecho de que calienta y hace en última instancia el gel derretir. Los altos voltajes también disminuyen la resolución (sobre cerca de 5 a 8 V/cm). [5]

Una observación en los resultados de la migración de las bandas del ADN genómico de Fusarium sp, nos garantiza que no hubo una contaminación en el ADN de este hongo, pues estas bandas debido a que deben presentar el mismo peso y tamaño emigraron a la misma velocidad.

CONCLUSIONES

El empleo de reactivos de alta calidad y agua desionizada es un prerrequisito para hacer geles reproducibles y de alta resolución, en particular esto es muy importante para la acrilamida, ya que es el constituyente más abundante del gel. [4]

El factor más importante es la longitud de la molécula de ADN, moléculas más pequeñas viajan más lejos. [5]

La técnica de electroforesis con gel de agarosa resulto ser muy eficaz al momento de observar las bandas de Fusarium sp, que migraron. No hubo ningún inconveniente al preparar el gel de agarosa por lo que también se puede decir que es más fácil de preparar que el gel de poliacrilamida, aunque no hay que dejar de tener encuanta las grandes ventajas que nos brinda el gel de poliacrilamida que son:

Tamiz molecular: tamaño de poro variable

Químicamente inerte frente a moléculas biológicas

Transparente, facilidad para ser densitometrado

Estable en amplio intervalo de pH, fuerza iónica y temperatura

Resistente a agentes desnaturalizante

Fuerza electroendosmótica reducida

Mecánicamente estable Fácil de almacenar Amplia versatilidad para la

detección de compuestos analizados [6].

BIBLIOGRAFIA

[1] UNIVERSIDAD JAVERIANA. Electroforesis. [En línea]. Colombia. [Citado en 2011- 05- 22]. Disponible en internet:http://javeriana.edu.co/Facultades/Ciencias/neurobioquimica/libros/celular/electroforesis.html

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[2] Dra. Gabriela Hernández Mora. Práctica 3 Métodos de caracterización de proteínas: Electroforesis en gel de poliacrilamida. [Citado en 2011-05- 22]. Disponible en internet: http://www.medvet.una.ac.cr/carrera/mva505_Practica3.pdf

[3] B. Lomonte. Capítulo 13: Electroforesis en Gel de Poliacrilamida. [En línea] Inmunología General: Manual de Laboratorio. [Citado en 2011-05-22]. Disponible en internet: http://www.icp.ucr.ac.cr/nuevo/pdf/electroforesis.pdf

[4] Dra. Hilda Marilín García Pérez. Máster en Ciencias Bioquímicas. Investigadora Agregada. [Citado en 22-05-2011]. Disponible en internet:http://bvs.sld.cu/revistas/uni/vol1_2_00/uni07200.htm

[5]Molecular station. [Citado en 22-05-2011] Disponible en internet:http://www.molecularstation.com/es/agarose-gel-electrophoresis/

[6] [Citado en 22-05-2011] Disponible en internet: http://www.qb.fcen.uba.ar/virologia/Claudia/Cursos/T%E9cnicas%20Electrofor%E9ticas/03%20PAGE_Curso.pdf

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Bibliografía

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