Tecnica s Experimental Es

Estudio de respuestas celulares Estudio de respuestas celulares in in vitrovitro eein vivoin vivo

Funcionalidad de las células

Activación

• Proliferación

• Función efectora

• Síntesis de sustancias inmunoreguladoras(citoquinas)

• Expresión de Receptores

Apoptosis

Detección de tipos celulares

• Caracterización fenotípica

• Evaluación número total de linfocitos

• Relaciones LT/LB, LT CD4+/ CD8+

In vivo

• Proliferación

• Apoptosis

• Citotoxicidad

In vitro

• Activación de Linfocitos por Mitógenos o Ag

• Cultivo Mixto Linfocitario (CML)

• Citotoxicidad Mediada por Células (CMC)

• Producción de citoquinas, Acs (para LB)

• Muerte celular - Apoptosis

Activación celular:Medición de citoquinas:

• ELISA, RIA

• ELISPOT

• Inmunofluorescencia

• PCR

• Western Blot

• Métodos biológicos

ڡ Marcación

intracitoplasmàtica

ڡ Beads

ڪ RT – PCR (cualitativa-semicuantitativa)

ڪ RT - Real-time PCR (RT-qPCR) Cuantitativa

Citometría de flujo(Células en suspensión)

Microscopía(cortes de tejidos, células adheridas a un soporte)

Proliferación celular:

• In vitro

• In vivo • Incorporación de Bromo-deoxiuridina

• CFDA-SE

Apoptosis:• Anexina-V / PI

• Tunel

• Hipodiploidía

• Fragmentación de ADN

• Tinción con Bromuro de etidio y Naranja de acridina

• dosaje biológico de TNF-α

• Vías de activación de caspasas

• Incorporación de 3H-Timidina

• Incorporación de Bromo-deoxiuridina

• CFDA-SE

Estudio de la función efectora:

• Citotoxicidad mediada por células

• Reacción mixta linfocitaria

• Ensayos de presentación y procesamiento

• In vitro

•In vivo

• 51Cr

• colorantes

• enzimas

CFDA-SE

Separación de las células

células mononucleares

Sangre periférica

LT (80%)LB (10%)NK (10%)

Ganglios

LT (70%)LB (30%)

Bazo

LT (50%)LB (40%)NK (10%)

Métodos

• Gradiente de Ficoll-Hypaque• Gradiente de Percoll• Pasaje a través de columnas de lana de nylon• Adherencia

• Citotoxicidad mediada por Ac• Técnicas inmunomagnéticas• Citometría de Flujo – Separación de células

enriquecimiento

purificación

Separación de células

Gradiente de Gradiente de FicollFicoll--HypaqueHypaque


Sedimentación con Dextran:

Para enriquecer en PMN

Desplaquetizar

Separar células por adherencia (y diferenciar los monocitos a macrófagos)

Separar células por gradiente de Percoll

A partir de éstas fracciones se puede:

Plasma

Gradiente de Gradiente de PercollPercoll

Centrifugación

eritrocitos

plasma

granulocitos

linfocitos

blastos, monocitos, NK


Permite separar los linfocitos de los monocitos del halo del Ficoll (doble purificación)

• pellet: linfocitos

• Halo de monocitos

Accesibles en costo

Simples

Ventaja: No se necesitan Ac o complemento

Desventaja: Enriquecimiento, no quedan las poblaciones puras

Pasaje a travPasaje a travéés de columnas de lana de nylons de columnas de lana de nylon

Adhesión de LB y macrófagos

LT eluyen

Enriquecimiento de células T por no adherencia al nylon


LBMO

LT

LB

LT

MOLB

LT

TIPO CELULAR MARCADORLT CD3

LT helper CD3 CD4

LT citotóxico CD3 CD8

LBIgM de superficie

CD19CD21

NK CD16

monocitos CD14

SeparaciSeparacióón de las poblaciones n de las poblaciones linfocitariaslinfocitarias

• citometria de Flujo (sorting)

• Perlas inmunomagnéticas

• Citotoxicidad mediada por anticuerpos

Utilizando anticuerpos específicos

Selección Positiva

Selección Negativa


CitotoxicidadCitotoxicidad mediada por mediada por AcAc

Complemento

Y

YY

Y

Y

Y

Y

Y

Y

Y

Depleción de la población


TTéécnicas cnicas inmunomagninmunomagnééticasticas

Ac con microesferasmagnéticas

SELECCIÓN NEGATIVA

SELECCIÓN POSITIVA


Activación de Linfocitos (LT y/o LB)

• Estimulación con Mitógenos

• Estimulación Antigénica

• Cultivo Mixto Linfocitario (CML)

Pruebas Funcionales Pruebas Funcionales in in vitrovitro

Evaluación de la Proliferación Celular

• Incorporación de 3H-Timidina

• Incorporación de Bromo-deoxiuridina

• CFDA-SE

• IL-2 (método indirecto)

Proliferación celular


Proliferación in vitro de celulas mononuclearesActivación Policlonal Células respondedorasFitohemaglutinina (PHA) LT

Concanavalina A (Con A) LT

Mitógeno de Fitolaca (PWM) LT y LB

Ésteres de forbol (PMA) LT y LB

Proteína A S. aureus LB

ionomicina LT + LB

antiCD3 + antiCD28 LT

Activación antígeno específica: se utilizan antígenos o mezclas de antígenos respecto a los cuales se quiere ver la proliferación.

• Previa sensibilización con el Ag (presencia de célulasespecíficas)• Cultivos más prolongados(5 a 6 días)• Necesitan las CPA

Ensayo y controles Estimulación con mitógeno para evaluar proliferación de LT y LB.

Células sin estimularCélulas estimuladas con mitógeno

Proliferación linfocitaria antígeno específica.

Células sin estimularCélulas estimuladas con antígeno.Células estimuladas con mitógeno.

¿Hubo proliferación?



Cultivo en presencia de antígeno o mitógeno

Los linfocitos proliferan

3H-timidina

la timidina se incorpora al ADN celular

El ADN se transfiere a una membrana

Se miden las cuentas por minuto (3H) en cada muestra en un contador de centelleo

Incorporación de 3H-Timidina


010203040506070

0 2 4 6 8

Dias después del Inicio del Cultivo

cpm

x 1

0-3

Cinética de proliferación

Curvas dosis respuesta

Incorporación de 3H-Timidina

Células estimuladas

Células sin estimular: basal

Curva dosis respuesta

0 100 200 300 400 500 600 700 800 900 1000 11000

25

50

75células de dadorinmunizadocélulas de dador control(no inmunizado)

Dosis de antígeno (μg/ml)

CPM

(x10

-3)

BrdU es incorporado en el ADN de aquellas células que se encuentran en la fase S del ciclo celular.

(clélulas proximas a dividirse)

5-bromo-2-deoxyuridina Brdu es un homologo sintético de la timidina


Incorporación de 5-Bromodesoxiuridina (BrdU)

La incorporación de BrdU a las células se puede detectar utilizando un anticuerpo monoclonal anti-BrdU marcado con:

- Una enzima (ej peroxidasa) ELISA

- Un Fluorocromo (FITC) Citometría de Flujo

Cultivo en presencia de

antígeno Los linfocitos específicos proliferan

La BrdU se incorpora al ADN celular

Lisis y desnaturalización

Fijación del DNA a la placa

Anti-BrdU-HRP Revelado



Marcación de células con CFSE: El 5,6 ester succinimidil diacetato carboxifluoresceina

Atraviesa fácilmente las membranas celulares. No Fluorescente

Atraviesa las membranas

celulares con más dificultad. Fluorescente

Reacciona con las proteínas formando uniones covalentes

estables


Células marcadas con CFSE

Inyección a un animal:

- Proliferación in vivo

- Citotoxicidad in vivo

- Homing

- Proliferación in vitro

- Estudio de variaciones en la población según el número de divisiones experimentadas: • Expresión de citoquinas

• Diferenciación celular (ej: marcadores de células de memoria)



Linfocitos Linfocitos

CFDA-SE

inyección endovenosa a un

animal

o

Estimulación in vitro

Proliferación

A medida que proliferan el CFSE se va diluyendo, generación a

generación.

Disminuye la intensidad de Fluoresencia detectada

Células marcadas antes de estimular

Aumenta el número de divisiones celulares

Disminuye la intensidad de fluorescencia


autofluorescencia Células marcadas antes de estimular

Células proliferando


Aumenta el número de divisiones celulares

Disminuye la intensidad de fluorescencia

Cultivo Mixto Cultivo Mixto LinfocitarioLinfocitario (CML)(CML)

Ag: CMH alogeneicode CPA y LB

Célula respondedora

Células estimuladoras

Proliferación por reconocimientoprincipalmente del CMH II

5 a 7 días

UNIDIRECCIONAL: células estimuladoras tratadas con mitomicina C o irradiadas

BIDIRECCIONAL


Medición de citoquinas: • ELISA

• ELISPOT

• Inmunofluorescencia

• PCR

• Western Blot

• Métodos biológicos

ڡ Marcación intracitoplasmàtica

ڡ Beads

ڪ RT – PCR (cualitativa-semicuantitativa)

ڪ RT - Real-time PCR (RT-qPCR) Cuantitativa

Citometría de flujo(Células en suspensión)

Microscopía(cortes de tejidos, células adheridas a un soporte)

Activación celular: producción de citoquinas

Medición de citoquinas por ELISA

ELISA de captura

• En sobrenadantes de cultivo

• Suero

• Diferentes fluídos biológicos

Curva de calibración (citoquina estándar)

muestras

Medición de citoquinas por ELISPOT

• Se detecta la producción de citoquinas a nivel de uan célula individual

• Se requiere al igual que en el ELISA de captura dos anticuerposdiferentes que reconozcan epitopes diferentes en la citoquina.

• Los “spots” formados son permanentes y pueden ser contados visualmente, microscópicamente o electrónicamente

• Es 20-200 veces más sensible que un ELISA de captura: la concentración de citoquina secretada en el microentorno de la célula es mucho mayor que en un sobrenadante de cultivo.

• Si se usa en paralelo con un ELISA se puede determinar la cantidad promedio de citoquina producida por célula.

• Acoplado a métodos de pruificación de poblaciones celulares, se puede determinar la frecuencia de células productoras de citoquinas en las diferentes subpoblaciones

Se sensibilizan placas de microtitulación con fondo de nitrocelulosa horneada con el anticuerpo anti-citoquina de interés

Se cultivan las células productoras de citoquinas en presencia de estímulos. Las citoquinas secretadas se unen a los anticuerpos unidos a la placa.

Se lisan las células.

Se incuba con otro anticuerpo anti-citoquina de interés biotinilado.

Se incuba con la enzima unida a avidina

Se revela con el sustrato de la enzima que genera un precipitado (spot), cada spot indicaría el sitio que ubicaba una célula productora de citoquinas (Unidad productora de citoquinas)

Medición de citoquinas por ELISPOT

ELISPOT

Determinación de la producción de citoquinas por PCRSe determina la presencia o cantidad del mRNA de la citoquina estudiada

Técnica experimental:

- Aislamiento de RNA celular

- Obtención de cDNA

- PCR: clásica o cuantitativa

- Análisis de resultados

- electroforesis en gel de agarosa

- análisis cuantitativo

Tipo de muestras:

• células en cultivo

• tejido (biopsias, etc.)

• células mononucleares de SP (PBMCs)

Aislamiento de RNA celular

Extracción de RNA por el método de trizol(isotiocianato de guanidinio y fenol)

1- Homogeinización en trizol

2- Agregado de cloroformo, centrifugación

3- separación de fase acuosa

4- agregado de isopropanol, centrifugación

5- lavado con etanol, secado

6- suspensión en agua lobre de RNAsas (55-60ºC, 15 min)

cloroformo

Disociación total de complejos nucleoproteína

Método rápido

Mantiene integridad del RNA

Prevenir contaminación con RNAsas

Determinación de citoquinas por RT-PCR semicuantitativa

cDNA

Transcripciónreversa

Transcriptasa reversa

Primers (oligo-dT, primersdiseñados al azar, primersespecíficos para un gen)

dNTPs

dNTPs, TAQpol, primers, MgCl2

citoquina

citoquina

Expresión relativa(densitometría)

A B A B

Determinación de citoquinas por RT-PCR cuantitativa (real time PCR)

SYBR Green es un fluorocromo que se intercala en el DNA doble cadena

Permite monitoreo contínuo de la fluorescencia durante la PCR

Estimamos el número de copias iniciales del cDNA

Al final de la PCR se hace un ciclo de aumento contínuo de la temperatura y determinación constante de fluorescenciaInformación cualitativa del producto de PCR

curva de melting

Análisis de resultados RT-qPCR

Comparación entre detección contínua de DNA y PCR convencional

Análisis de resultados: puesta a punto y problemas

Cuantificación

Fluorescencia

Real time PCR usando sondas TaqMan

Sondas de hidrólisis

Emiten fluorescencia cuando la actividad exonucleasa 5´-3´ de la TaqPol hidroliza la sonda

El reporter se separa del quencher

La sonda está fosforilada en 3´, no puede ser extendida por TaqPol

Se mide fluorescencia al final de la extensión

Las sondas se van consumiendo, y la fluorescencia aumentando

No hay curva de meltingNo se distingue entre cDNA y DNA genómico hay que correr un gel de agarosa

El número de ciclos necesarios para alcanzar un nivel de fluorescencia es proporcional a la cantidad de cDNA de inicial

Se grafica, número de ciclos versis logde la cantidad de DNA inicial y se obtiene una linea recta.

Puede obtenerse una curva de calibración utilizando cantidades conocidas de cDNA.

Análisis de resultados: Cuantificación

Documents

Tecnica s Experimental Es