TÉCNICAS DE LABORATORIO NEUROMUSCULAR CON APLICABILIDAD CLÍNICA

INMUNOLOGIA

OBJETIVOS

• Familiarizarse con las técnicas utilizadas comúnmente

• Destacar sus utilidades, ventajas e inconvenientes

• Análisis crítico con ejemplos reales de artículos destacados

RESUMEN• Inmunohistoquímica

• Diagnóstica• Investigación

• Screening autoanticuerpos• Confirmación de reactividad

• Técnicas basadas en células• Inmunocitoquímica• Citometría de flujo

• ELISA

• Western-blot

• Cromatografía de capa fina

INMUNOHISTOQUÍMICA DIAGNÓSTICA

Inmunohistoquímica: es un procedimiento que se basa en la utilización de un anticuerpo específico, para la localización e identificación de un antígeno en una muestra tisular.

Inmunohistoquímica

2 tipos de anticuerpos

Antígenos

Anticuerpo 1°

Anticuerpo 2°

Inmunohistoquímica

Inmunofluorescencia directa

Antígenos

Anticuerpo 1°

Utiliza un solo anticuerpo

Inmunofluorescencia indirecta

Antígenos

Anticuerpo 1°

Anticuerpo 2°

Utiliza un 2° anticuerpo conjugado

Inmunohistoquímica

Marcado con fluorocromo Marcado mediante enzimas +

sustrato

Inmunohistoquímica

Inmunohistoquímica

APLICACIONES

• Detectar la presencia/ausencia de una moleculas concretas en un tejido• Detectar moleculas que están y no deberían estar• Detectar moléculas que no están y deberían estar

• Analizar el patrón de tinción • Si las moléculas están donde tienen que estar y en la proporción

adecuada.

DISTROFINA

MHC I

INMUNOHISTOQUÍMICA INVESTIGACIÓN

UTILIDAD

• Enfermedad inmunes y no inmunes• Demostrar la presencia de anomalias estructurales o la alteración

del patrón de tinción de determinadas proteinas relacionadas con la fisiopatología de la enfermedad

• Enfermedades inmunes• Demostrar que el suero/LCR de pacientes reacciona contra un

tejido relevante para la enfermedad estudiada.

EJEMPLOS• PRIMER CASO

EJEMPLOS• SEGUNDO CASO

Ensayos diagnósticos celulares (cell-based assays)

INMUNOCITOQUÍMICA CITOMETRÍA DE FLUJO

Cultivo celular y transfección

• Primarios: provienen de una persona/animal y su crecimiento es limitado.

• Ej: musculares, endoteliales, neuronas…

• Líneas: Células immortalizadas, crecimiento ilimitado, amplia utilización en investigación.

• Ej: HEK, CHO, HeLa….

Tipos de Cultivo

Cultivo de explantes Separación con CD56+

Proliferación de mioblastos Diferenciación a miotubos

Cultivo de biopsias musculares de pacientes

Inmunocitoquímica

Transfección: partículas lipídicas

Célula

Procéso immunocitoquímica

Célula

Contactin-1 CASPR1/Contactin-1

(Contactin1 complex) Neurofascin155

Serum

Commercial Ab

Merged

Serum

Commercial Ab

Merged

Serum

Commercial Ab

Merged

Proyecto de busqueda de nuevos antígenos en CIDP

VENTAJAS ICC• Expresión proteínas en su conformación nativa

• Incluye modificaciones post-traduccionales• Ideal para proteinas de membrana

• Permite el estudio de proteinas humanas sobre líneas celulares humanas

• Permite valorar el patrón de tinción (aspectos cualitativos)

• Sencillo y relativamente barato. Puede utilizarse de la misma manera o con mínimos cambios para muchas proteínas.

DESVENTAJAS

• No es útil para complejos de proteínas o proteínas con interacciones complejas

• Diferencias post-traduccionales respecto a proteina en su tejido de origen (diferente glicosilación, splicing…)

• No cuantitativo

• No mecanizable, consume tiempo.

CITOMETRIA DE FLUJO

VENTAJAS• En general las mismas que la ICC más

• Cuantificable

• Mecanizable

DESVENTAJAS• Similares a la ICC, más

• No permite análisis cualitativo (localización de la tinción…)

• Discrimina peor reactividad inespecífica

ELISA

ELISA

ELISA: es un inmunoensayo para la cuantificación de un antígeno o anticuerpo mediante la inmovilización en una superficie sólida de un anticuerpo o antígeno, respectivamente.

ELISA

Tipo Sandwich

Indirecta

Detección de anticuerpos anti-gangliósidos en suero

ELISA

ELISA

ELISA

Dilución punto final (cuando deja de ser positivo)

Analisis resultados• Dos formas

• Determinación pacientes positivos en función de una señal umbral

• Mejor especificidad

• Comparación de grupos

VENTAJAS• Versátil. Válido para muchos tipos de ensayo

• Gangliosidos• Proteinas• Acidos nucleicos

• Sencillo y barato. Permite muchas determinaciones en poco tiempo

• Muy bueno para moléculas sencillas, no dependientes de conformación, pero válido para moléculas dependientes de conformación

• Mayor sensibilidad que otras pruebas diagnósticas• Permite titular lo sueros

INCONVENIENTES• Resultados variables, muy dependiente de condiciones

externas de temperatura, tiempos de incubación, el estado de la molécula analizada…

• Más reactividad inespecífica, especialmente con sueros.• Falsos positivos

• No válido para moléculas muy dependientes de conformación, por ejemplo, con muchos dominios transmembrana

• Necesidad de proteinas recombinantes. Proteinas purificadas o ELISA de tejidos, muy sucios.

WESTERN BLOT

Control 1

250

150

100

75

50

37

2Marcador

WB para Disferlina

Western blot

Dysferlin

Β- actin

WB para distrofina

ROD (Dys 2) Carboxi (Dys 3)

1 2 3 1 2 3

1. Control

2. Paciente 1

3. Paciente 2

Dys 1 Dys 2 Dys 3

250KDa

Distrofina

Western blot

CROMATOGRAFÍA DE CAPA FINA

Características de los gangliósidos

Glicoesfingolípidos:ceramida

+uno o más azúcares (hexosas)

Selección de algunos de los gangliósidos relevantes en las

neuropatías (neuropatía motora multifocal y los

síndromes de neurona motora inferior). 

TLC de gangliósidos

lámina de aluminio con gel de sílice

TLC de gangliósidos

Técnicas de determinación Cromatografía en capa fina

No permite la cuantificaciónMayor especificidad en la determinación

Placa Cromatografía silica gelsolución de gangliósidosstandard revelada con resorcinolincubación con el suero del pacienteanti-IgG/IgM humana marcada con peroxidasarevelado por quimioluminiscencia

Técnicas de determinación Cromatografía en capa fina, patrones de reactividad

Interpretación de los resultados

DISIALOSIL

EJERCICIO 1INMUNOHISTOQUÍMICA

EJERCICIO 2INMUNOCITOQUÍMICA

NEURONAS DRG – CIDP ATAXICA

EJERCICIO 3ELISA

EJERCICIO 4WESTERN-BLOT

1 2 3 4 5 6 7 8 9

carril Name DYSF ACTINA DYSF/ACT 100% expresión

1 control 59,06 163,56 0,36109073 100

2 paciente 1 1,17 115,78 0,01010537 2,798568721

3 paciente 2 27,1 95,23 0,28457419 78,80960772

4 paciente 3 38,6 138,89 0,27791778 76,96618955

5 paciente 4 14,94 149,3 0,10006698 27,71241978

6 paciente 5 37,03 136,96 0,27037091 74,8761704

7 paciente 6 26,36 116,77 0,22574291 62,51695042

8 paciente 7 1,97 151,08 0,01303945 3,611128221

9 paciente 8 47,45 159,14 0,29816514 82,5734675

237KDa

42KDa

Western blot

Dysferlin

Β- actin

EJERCICIO 5TLC

AMAN

CANOMAD