Técnicas Inmunológicas

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Reacción Antígeno - Anticuerpo

Dentro de los procedimientos inmunológicos, los más útiles y prácticos son aquellos que se basan en la especificidad de la unión Ag-Ac. La propiedad que tienen las Igs de unirse a un Ag, la especificidad de esta unión y el hecho de que pueda ser visualizable por los fenómenos de precipitación, aglutinación y otros mecanismos indirectos (marcaje con fluoresceína, con radioisótopos o con enzimas, hacen que estos métodos se empleen ampliamiente.

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Técnicas Inmunológicas - Clasificación• Técnicas de Precipitación

• Técnicas de Floculación• Técnicas de Aglutinación• Electroforesis• Técnicas de Fluorescencia y Citometría

de Flujo• Técnicas de Inmunocromatografía• Técnicas Inmunoenzimáticas• Técnicas de Radioimnunoensayo• Técnicas Quimioluminiscentes

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Técnicas de Precipitación

• Para la realización de estas técnicas se requiere que tanto el Ag como el Ac se encuentren en un medio fluído en el que sea posible la precipitación del complejo Ag-Ac

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Técnicas de Precipitación

Los principales son:1.- Reacciones de precipitación sobre

gel• Pruebas de inmunodifusión• Inmunoelectroforesis2.- Reacciones de precipitación en

disolución• Inmunonefelometría• Inmunoturbidimetría

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Inmunodifusión Radial

• Placa de difusión radial de Mancini

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Aplicaciones Clínicas:

• Cuantificación de Ig séricas

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Doble Inmunodifusión en Gel

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Doble Inmunodifusión en Gel

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Doble Inmunodifusión en Gel

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Doble Inmunodifusión en Gel

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Doble Inmunodifusión en Gel

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Patrón de identidad parcial

Patrón de identidad

Doble Inmunodifusión en Gel

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Inmunoelectroforesis

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Inmunoelectroforesis

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Inmunoelectroforesis

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Inmunoelectroforesis en cohete

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Inmunoelectroforesis en cohete

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Inmunoelectroforesis Bidimensional

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Inmunoelectroforesis Bidimensional

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Contrainmunoelectroforesis

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Contrainmunoelectroforesis

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Inmunonefelometría

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InmunonefelometriaAplicaciones clínicas:

• IgA• IgG• Ig M• Cadenas ligeras

totales κ• Cadenas ligeras

totales λ• Fracción

complemento C3• Fracción

complemento C4

• α- 1 antitripsina• Pre – Albúmina• Haptoglobina

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Inmunoturbidimetría

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InmunoturbidimetríaAplicaciones clínicas:

• Proteína C Reactiva

• Factor Reumatoide

• ASL O• Transferrina

sérica

• Ferritina• Dímero D• Microalbuminuri

a

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Técnicas de Floculación

• Reacción de precipitación en la cual se forman los precipitados inmunológicos, que son complejos insolubles formados por la unión de Ac (precipitinas) y Ag (precipitógenos), que se encuentran en solución.

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Floculación

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Floculación

Aplicaciones Clínicas:

• VDRL• RPR

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Técnicas de Aglutinación

• Cuando el antígeno se encuentra unido o formando parte de células, bacterias o partículas, la reacción Ag-Ac se puede detectar por aglutinado celular o bacteriano formado.

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AglutinaciónAglutinación Directa

Aplicaciones Clínicas:• Grupo Sanguíneo• Reacción de Widal - Hudlesson

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Aglutinación Directa

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Aglutinación

Aglutinación Indirecta

Aplicaciones Clínicas• Test de Coombs

Directo• Test de Coombs

Indirecto• PCR en latex

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Aglutinación IndirectaTest de Coombs Directo

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Aglutinación IndirectaTest de Coombs Indirecto

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Aglutinación Indirecta

Prueba de Látex

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Inhibición de la Aglutinación

Aplicaciones Clínicas:• Test de Embarazo

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Inhibición de la Aglutinación

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Inhibición de la Aglutinación

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1.- Prozona(Exceso de Ac frente

al Ag)2.- Zona de

Equivalencia3.- Postzona(Exceso de Ag)

Aglutinación

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HemaglutinaciónAplicaciones Clínicas:• Grupo Sanguíneo • MHA-TP• Waler Rose

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Hemaglutinación

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Hemaglutinación

Electroforesis• Es el fenómeno de migración de

partículas cargadas eléctricamente.

• Una molécula cargada se coloca en un campo eléctrico se moverá hacia uno u otro electrodo.

• Las moléculas cargadas positivamente se desplazaran hacia el cátodo (el polo negativo) y aquellas cargadas positivamente se desplazarán hacia el ánodo (polo positivo)

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Electroforesis de Zona

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Electroforesis de Zona

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Electroforesis de Zona

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Electroforesis de Zona

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Electroforesis de Zona

Técnicas de Fluorescencia y Citometría de Flujo

• Para la realización de estas técnicas el anticuerpo se marca con un fluorocromo detectándose la formación del complejo Ag – Ac por la fluorescencia emitida.

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InmunoFluorescencia

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InmunoFluorescencia

Inmunofluorescencia directa

Inmunofluorescencia indirecta

Antígenos

Antígenos

Anticuerpo 1° Anticuer

po 1°

Anticuerpo 2°

Ventajas

Desventajas

Se necesitan pocos pasos

Posibilidad de doble marcación

Menor sensibilidad (nec. mucho Ac 1º)

Es necesario purificar el Ac

El Ac puede perder afinidad

Se necesitan muchos pasos de tinción

Con ag múltiples se necesita que los Ac 1º sean de distintas especies

El mismo anticuerpo conjugado se utilizan para distintas reacciones

Se evita la disminución de afinidad del Ac 1°

Utiliza un solo anticuerpoUtiliza un 2° anticuerpo conjugado

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Citometría de Flujo

SeñalesDe dispersión

De fluorescencia

Citometría de Flujo

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Citometría de Flujo

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Citometría de Flujo

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Citometría de Flujo

Ventajas: - Realiza múltiples marcajes

- Analiza hasta 5000 partículas/segundo

- Analiza intensidad antigénica

- Mayor sensibilidad y objetividad

- Permite almacenar informaciónDesventajas:

- se pierde información sobre

arquitectura de tejidos, interacción y

medio que los rodea.

Citometría de Flujo

Técnicas de Inmunocromatografía• Permite detectar la presencia de Ag

y Ac específicos.

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Inmunocromatografía

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Inmunocromatografía

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Inmunocromatografía

Técnicas Inmunoenzimáticas

• Las técnicas inmunoenzimáticas se basan en el marcaje de Ac o Ag con enzimas para su posterior detección.

Clasificación de las técnicas inmunoenzimáticas:

• Técnicas Homogéneas• Técnicas Heterogéneas

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ELISA

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ELISA

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ELISA

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ELISA

1.- Métodos no Competitivos

1.1.- Placa recubierta de Ag

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1.2.- Placa recubierta con Ag

ELISA

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ELISA

2.- Métodos Competitivos

2.1.- ELISA competitivo para detectar Ag

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ELISA

2.2.- ELISA competitivo para detectar Ac.

Inmunoelectrotransferencia

• Es de gran utilidad en el análisis de mezclas antigénicas y sus interacciones con Ac.

• Esta técnica combina una separación electroforética de los Ag, su transferencia electroforética a un medio de soporte en forma de membrana u hoja y finalmente su inmunodetección mediante el uso de Ac marcados. LLCH

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Inmunoelectrotransferencia (Western Blot)

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Inmunoelectrotransferencia (Western Blot)

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Inmunoelectrotransferencia (Western Blot)

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Inmunoelectrotransferencia (Western Blot)

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Inmunoelectrotransferencia (Western Blot)

Técnicas de Radioimnuensayo

• En estas técnicas al Ac se le une un isotopo radioactivo siendo posible la cuantificación del complejo Ag – Ac a través de la radioactividad emitida.

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RIA

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RIA

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RIA

Técnicas Quimioluminiscentes

• Se caracteriza por generar a partir de sustratos estables productos enzimáticos capaces de emitir fotones al pasar de un estado intermedio inestable y energéticamente superior a uno de energía inferior mas estable.

• Estos fotones se detectan mediante un fotomultiplicador.

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Quimioluminiscencia

Técnicas Quimioluminiscentes

Existen 4 generaciones:• Quimioluminiscencia directa• Quimioluminiscencia indirecta• Electroquimioluminiscencia • Quimioluminiscencia amplificada

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Quimioluminiscencia directa

• En esta técnica el Ac está marcado directamente con la molécula luminiscente, por lo tanto, por cada Ac marcado se emiten una cantidad limitada de fotones.

• Una reacción de oxidación del sustrato libera una molécula luminiscente con la liberación de un número de fotones.

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Quimioluminiscencia indirecta

• El Ac está marcado con una enzima y ésta actúa sobre un sustrato que es el que emite la luz, obteniéndose por cada Ac marcado la producción de muchos fotones.

• En esta técnica la enzima es la que se encuentra marcada con una molécula luminiscente y la amplificación resulta por el cambio en el sustrato. LLCH

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Quimioluminiscencia

Aplicaciones Clínicas• Cortisol (orina y

sangre)• DHEAS• Ac Valproico• Fenobarbital• Carbamazepina• GH• ACTH• Digoxina

• Acs anti – tiroglobulina

• TORCH

Electroquimioluminiscencia

• En este inmunoensayo el Ac utilizado recubre unas partículas imantadas, que tras la formación del complejo Ag-Ac, se fijan por magnetismo a un electrodo. Dicho Ac está conjugado con un marcador (derivado del rutenio) capaz de emitir fotones cuando se aplica una pequeña diferencia de potencial sobre el electrodo.LLCH

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Electroquimioluminiscencia

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Electroquimioluminiscencia

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Electroquimioluminiscencia

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Electroquimioluminiscencia

Aplicaciones Clínicas• Ácido Fólico• Vitamina B12• FSH• LH• Estradiol• Progesterona• Testosterona total• Prolactina

• TSH• T3 Y T4 libre• AFP • CEA• PSA total y libre• Ca 125• Ca 15-3• Ca 19-9

Quimiluminiscencia amplificada

• Es una quimioluminiscencia indirecta, siendo una reacción generadora de señal, que es leída por un luminómetro.

• Aquí también se va a tener una enzima marcada que va a actuar sobre un sustrato que es el que va a emitir luz, pero hay una molécula (catalizador) que acelera la reacción entre la enzima y el sustrato.LLCH

Quimiluminiscencia amplificada

• Se utiliza la peroxidasa de rábano (HRP) es utilizado para el marcaje de la enzima.

• Enzima: Fosfatasa Alcalina • Sustrato: Luminol + Peróxido de

Hidrógeno• Acetanilida: Amplificador (actúa

como catalizador de la reacción aumentando 1000 veces la oxidación del luminol por el HRP)LLCH

Quimiluminiscencia amplificada

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Gracias Totales