Tecniche cromatografiche

Principi teorici

Tipi di cromatografia

Metodi cromatografici

Coefficiente di distribuzione

Il principio su cui si basano tutte le tecniche cromatografiche è il

Coefficiente di distribuzione o partizione = Concentrazione nella fase A

Concentrazione nella fase B

= Kd

• descrive il modo in cui una sostanza si distribuisce tra due fasi immiscibili

• dipende dalla temperatura

B

A

Coefficiente effettivo di distribuzione =

quantità totale in A

quantità totale in B

= Kd ·VA/VB

Separazione di due sostanze

in cromatografia

Coefficiente di distribuzione

Tutti i sistemi cromatografici hanno due fasi:

la fase stazionaria la fase mobile

solida o liquida liquida o gassosa,

che scorre attraverso la fase stazionaria

scelte in modo che i composti da separare abbiano differenti coefficienti di distribuzione

Concentrazione nella fase mobile

Concentrazione nella fase stazionariaKd =

Equilibri tra fasi stazionarie e fasi

mobili in cromatografia

fase stazionaria fase mobile

Cr. di assorbimento, solida liquidacr. ad interazione idrofobica

Cr. ad esclusione molecolare, fase liquida intrappolata o gel cromatografia all’interno di una struttura liquida

porosa

Gas cromatografia liquida gassosa

Cr. a scambio ionico scambiatori di cariche liquida(con elettroliti)

Cr. di affinita’ ligando immobilizzato liquida

Esempio di separazione

cromatografica su colonna

TIPI DI CROMATOGRAFIA

Cromatografia su

colonna strato sottile carta

la fase stazionaria

viene impaccata in

colonne di vetro o di

metallo

la fase stazionaria ricopre

sotto forma di strato sottile

piastre di vetro, plastica o di

metallo

la fase stazionaria

aderisce alle fibre di

cellulosa di un foglio di

carta

Apparato per cromatografia

su colonna

A valle della colonna:

rivelatore,

registratore,

collettore di frazioni

Teoria della cromatografia

Durante una separazione cromatografica avvengono due processi:

• Interazione dell’analita con le fasi stazionaria e mobile (meccanismi, di

adsorbimento, scambio ionico, ecc.)

• Diffusione dell’analita, che si oppone alla buona riuscita della separazione

tR : tempo di ritenzione (VR = tRx Fc)

tM : tempo morto (VM = tMx Fc)

tempo di ritenzione aggiustato: t’R = tR - tM

Fc : velocita’ di flusso

Fattore di capacità k'

Tempo relativo che occorre all’analita per eluire dalla colonna rispetto ad

un analita non trattenuto

Fattore di capacita’

tR - tM t’R

k’ = =

tM tM

t’R MS VS

k’ = = = Kd xtM MM VM

MS = massa dell’analita nella

fase stazionaria

MM = massa dell’analita nella

fase mobile

VS = volume della fase stazionaria

VM= volume della fase mobile

Selettivita’ o fattore di separazione

k’A KdA t’RA

= = =

k’B KdB t’RB

Efficienza della colonna e

risoluzione

Efficienza della colonna

Si puo’ pensare che colonna cromatografica consista di un

numero di zone adiacenti in ognuna della quali c’e’ spazio

sufficiente perche’ un analita si equilibri completamente tra le

due fasi piatto teorico

2

Altezza del piatto H = ——x

Numero di piatti teorici N = L/H = Lx/ 2

16 L2 tR 2

Se x = L N = ——— = 16 ——

w2 w

I valori di N e di H per una

colonna sono espressi in funzione

di un determinato analita

è la deviazione standard della

banda gaussiana

x è la distanza percorsa dall’analita

all’interno della colonna

w è la larghezza della base del picco

= 4

L’efficienza della colonna può esere

misurata dal numero di piatti teorici o da

H

Più piccola è l’altezza del piatto teorico

(più grande è il valore di N) più stretto è il

picco dell’analita

Esempio : un analita eluisce da una colonna sotto forma di un

picco Gaussiano con un tempo di ritenzione di 7 min 45 s e una

larghezza della base del picco di 30 s.

Calcolate:

(i) il numero di piatti teorici della colonna;

(ii) l’altezza dei piatti se la colonna e’ lunga 7 cm

(i) N = 16 x (465/30)^2, quindi N = 3844

(ii) H = L/N = 7.5 x 10^4 / 3844, quindi H = 19.5 m

Risoluzione: capacità di

separare un picco da un altro

2 (tRA tRB) tR

RS = —————— = —— se RS = 1 overlap = 2.3%

wA wB wav se RS = 1.5 overlap = 0.2%

N 1 k’2

RS = —— ——— ———

4 1 + k’av

Fattori che determinano la risoluzione di una colonna cromatografica

wav

valore medio

delle larghezze

di base

Cromatografia di adsorbimento

Si basa sul fatto che alcuni materiali solidi hanno la capacita’ di trattenere le molecole alla loro superficie - sono coinvolte forze di interazione deboli, quali forze di Van der Waals e legami a idrogeno.

I diversi analiti si ripartiscono tra fase mobile e adsorbente in modo diverso a seconda delle relative forze di interazione. Queste dipendono dalla natura chimica dell’ adsorbente, della fase mobile e degli analiti.

La forza di legame di un analita dipende da specifici gruppi funzionali (OH e aromatici aumentano le interazioni)

Un tipico adsorbente e’ la silice, che presenta gruppi silanolo (Si-OH). Altri adsorbenti comunemente usati sono allumina e carbone.

La cromatografia di adsorbimento puo’ essere condotta sia su strato sottile che su colonna (FPLC e HPLC). E’ il metodo piu’ comunemente usato per la separazione di composti non ionici, insolubili in acqua, quali trigliceridi, PTH-aminoacidi, vitamine, vari farmaci.

Cromatografia di adsorbimento:

idrossiapatite

Hydroxyapatite

Hydroxyapatite (Ca5(PO4)3OH)2 is a form of calcium

phosphate which can be used for the separation and

purification of proteins, enzymes, nucleic acids, viruses,

and other macromolecules. Hydroxyapatite

chromatography can be utilized at any stage in

a process from initial capture to final polishing.

Hydroxyapatite has unique separation properties and

unparalleled selectivity and resolution. It often separates

proteins shown to be homogeneous by other

chromatographic and electrophoretic techniques.

Applications of hydroxyapatite chromatography

include separation of monoclonal and polyclonal

antibodies of different classes, antibodies which differ in

light chain composition, antibody fragments, isozymes,

supercoiled DNA from linear duplexes, and single-

stranded from double-stranded DNA.

Il meccanismo di

adsorbimento non e’ ben

chiaro, si pensa coinvolga

ioni Ca e PO4 piu’

interazioni elettrostatiche

e dipolo-dipolo

Cromatografia di adsorbimento:cromatografia per interazione idrofobica (HIC)

E’ un tipo di cromatografia sviluppato per la purificazione di proteine, le separa sulla base della loro idrofobicita’ di superficie.

I sali ad alta concentrazione riescono ad esporre le regioni idrofobiche, sottraendo le molecole d’ acqua ordinate le proteine tendono cosi’ ad interagire fra loro (“salting out”). Nella HIC queste regioni cosi’ esposte tendono ad interagire con una fase stazionaria costituita da gruppi idrofobici.

E’ una cromatografia che e’ vantaggioso applicare ad esempio dopo il frazionamento con ammonio solfato.

L’ eluizione puo’ essere fatta con forza ionica decrescente oppure per ‘spiazzamento’ con detergenti non ionici come ad es. Tween 20, Triton X-100.

Potenziali svantaggi:- in alcuni casi le condizioni di eluizione possono provocare denaturazione- non e’ predicibile, puo’ applicarsi bene ad alcune proteine ma non ad altre

Cromatografia per interazione idrofobica (HIC)

Cromatografia di partizione

Usa fasi stazionarie e fasi mobili liquide

cromatografia liquido-liquido

cellulosa

legano fino al

amido

50% di acqua

silice

cromatografia liquida a fase legata

In questo caso la maggior parte delle fasi legate utilizza come matrice la silice, derivatizzata con organoclorosilani:

cr. liquida in fase normale cr. liquida in fase inversa

fase stazionaria ad es. fase stazionaria e’ apolare

alchilammina butile, ottile, ottadecile

fase mobile e’ di solito fase mobile puo’ essere un

un solvente organico tampone acquoso, metanolo,

in gradiente acetonitrile. tetraidrofurano,

o misceleordine di eluizione: ordine di eluizionepolarita’ crescente polarita’ decrescente

Cromatografia in fase inversa

fase stazionaria: apolare (introduzione di catene idrofobiche) (C4, C8, C18...) sulla silice mediante derivati alchilici del tricloroesano:

fase mobile: relativamente polare (acqua o tamponi acquosi, metanolo, acetonitrile, miscele di questi solventi).

Principio: gli analiti instaurano interazioni apolari con la fase stazionaria (ricettiva ma passiva) e la separazione cromatografica avviene principalmente sulla base delle caratteristiche della fase mobile. Gli analiti polari eluiscono per primi e quelli non polari per ultimi

Teoria solvofobica: spiega la cromatografia in fase inversa in termini di bilanciamenti tra

variazioni di energia libera ed di entropia, interazioni acqua-acqua instaurate quando

l’analita si lega alla fase stazionaria

Cromatografia in fase inversa

per accoppiamento ionico

La separazione cromatografica di composti polari, come aminoacidi, nucleotidi, ecc.

può essere migliorata con due tipi di approccio:

• Soppressione ionica (variando il pH si neutralizzano composti acidi o basici)

• Accoppiamento ionico (si aggiunge un contro-ione con carica opposta a quello

da separare)

RCOO- + R4N+ [RCOO-N+R4]

RN+H3 + RSO3- [RN+H3

-SO3R]

Es. tetrabutilammonio

Es. sodio eptansolfonato

Le coppie ioniche diventano più lipofiliche e sono meglio trattenute dalla fase stazionaria

o

Si produce una superficie attiva di scambio ionico

Cromatografia chirale

Gli enantiomeri hanno proprieta’ fisiche e chimiche identiche ma vengono riconosciuti in modo differente dai sistemi biologici.

Fino a 15-20 anni fa era impossibile risolvere miscele di enantiomeri, il che costituiva un impedimento notevole allo sviluppo dell’ industria farmaceutica e dell’ uso clinico dei farmaci.

1) trasformazione degli enantiomeri in diastereoisomeri con un agente derivatizzante chirale:

(R + S) + R’ RR’ + SR’miscela di agente miscela dei

enantiomeri derivatizzante diastereoisomeri

2) fase mobile chirale

3) fase stazionaria chiralemeccanismo probabilmente interazione a 3 punti tra fase stazionaria ed enantiomero.

Cromatografia chirale

• Fasi stazionarie di Pirkle : derivati nitrobenzoici di aminoacidi come la

fenilglicina che vengono legati alla silice.

• Ciclodestrine (oligosaccaridi ciclici con struttura a tronco di cono aperta).

• Proteine immobilizzate - si sono rivelate particolarmente adatte per molte

applicazioni la AGP (acidic 1-glycoprotein) e la HSA (human serum

albumin). Entrambe si trovano nel plasma dove legano i farmaci. La 1-

glicoproteina acida tollera concentrazioni di solventi organici relativamente

alte, pH alti e bassi, e alte temperature.

Il meccanismo con cui operano e’ ancora in gran parte sconosciuto.

Cromatografia a scambio

ionico

Si basa sull’attrazione tra

particelle di carica opposta.

(Ion Exchange Chromatography)

pI

4 6 8 10

pH

Ca

rica

ne

tta

de

lla p

rote

ina

++

+

- --

-

Sulla base della carica netta (+ o -)

nelle fasi precoci di purificazione,

ma non solo

La risoluzione dipende:

- dalla “capacità della resina

(porosità)

- dal pH dell’eluente

- dal pI delle proteine da separare

Requisiti strumentali da semplici a

sofisticati (per caduta, FPLC e sue

evoluzioni)

Equilibri di scambio ionico

RSO3-…Na+ + +NH3R’ RSO3

-…+NH3R’ + Na+

Scambiatore cationico

Scambiatore anionico

Scambiatore Contro-ione Molecola

carica da

scambiare

Ione

molecolare

legato

Ione

scambiato

(R)4N+….Cl- + -OOCR’ (R)4N

+…. -OOCR’ + Cl-

Principi della cromatografia a

scambio ionico

Capacità totale di

scambio =

Numero di

milliequivalenti di ioni

scambiabili disponibili

per grammo di resina

secca

Effetto Donnan: repulsione tra

le cariche dello stesso segno

che si trovano all’interno della

matrice, variazioni di pH

diverse rispetto al volume vuoto

Cromatografia a scambio ionico (IEC),

alcuni tipi di matrici e scambiatori

Scambiatori forti =

Totalmente ionizzati

a tutti i valori di pH a

cui si opera

Cromatografia a esclusione

molecolare (permeazione)

La separazione delle molecole avviene in base alle loro dimensioni e alla loro forma

Setacci molecolari

Se l’analita è grande

è completamente

escluso (Kd=0)

Se l’analita può accedere

Completamente ai pori del

gel Kd=1

Vs= (Kd’-Kd”)Vi

Applicazioni della gel filtrazione

• Purificazione di proteine

• Determinazione della massa molecolare relativa (logMr vs Ve)

• Concentrazione di soluzioni

• Dissalazione

• Studi proteina-ligando

Cromatografia di affinità

K+1

K-1

M + L ML

Ligando legato

alla matrice

Sfrutta interazioni

specifiche,

la separazione non avviene

per differenza nelle

proprietà fisiche delle

macromolecole

Il braccio spaziatore tra

ligando e matrice deve

avere una lunghezza di 6-10

atomi di C. Alcuni bracci

sono di natura idrofobica e

altri di natura idrofila. Si

usano 1,6-diaminoesano,

acido 6-aminoesanoico e

1,4-bis(2,3-

epossipropossi)butano

Matrici per cr. affinità

deve contenere gruppi reattivi numerosi e adatti a legare

covalentemente il ligando e deve risultare stabile nelle condizioni in

cui avviene tale attacco;

deve essere stabile nelle condizioni di interazione della

macromolecola e nella successiva eluizione;

non deve interagire, se non debolmente, con altre

macromolecole, per evitare un adsorbimento aspecifico;

deve possedere buone capacità di flusso.

In pratica si usano particelle uniformi, sferiche e rigide, solitamente

costituite da derivati del destrano (Sephacryl S), dell'agarosio

(Sepharose 4B e 6B, Bio-Gel A), gel di poliacrilammide (Bio-Gel P) e

cellulosa.

Applicazioni della

cromatografia di affinità

• Cromatografia con lectine: glicoproteine

• Cromatografia di immunoaffinità: i ligandi sono anticorpi monoclonali

• Cromatografia con chelati di metalli: Cu++, Zn++, Hg++, Cd++,Co++, Ni++, Mn++

la reazione di legame è con i gruppi imidazolici di istidine, tiolici di cisteine,

indolici di triptofani

• Cromatografia con ligandi colorati: coloranti triazinici, Cibacron Blue