Tecniche per la valutazione della attività in vitro degli antibiotici:

Antibiogramma

Giovanni DI BONAVENTURA, PhDDipartimento di Scienze Sperimentali e Cliniche

Scuola di Medicina e Scienze della Salute

Università “G. d’Annunzio” di Chieti-Pescara

C.L. Medicina e ChirurgiaUniversità di Chieti-PescaraAnno Accademico 2015-2016

Tests di antibiotico-sensibilitàObiettivi

I tests di sensibilità agli antibiotici permettono la valutazione del profilo di sensibilità di un ceppo microbico, presunta causa della malattia, verso uno o più antibiotici.

I tests vengono eseguiti in vitro, ossia in condizioni standardizzate per garantire la riproducibilità e la accuratezza dei risultati.

I risultati di questi tests debbono essere adeguatamente interpretati per guidare la scelta dell’antibiotico da adottare. A tal fine contribuiscono, ovviamente, anche le informazioni cliniche e l’esperienza professionale.

Obiettivi:

- INDIVIDUALE: predire il successo od il fallimento in vivo della terapia antibiotica mirata.

- EPIDEMIOLOGICO: monitorare la evoluzione della antibiotico-resistenza, per la definizione della terapia empirica, per l’aggiornamento dello spettro di azione clinico della molecola, per l’adozione di adeguate misure di controllo e/o per verificarne l’efficienza.

• La intrinseca variabilità biologica della sensibilità microbica agli antibioticirappresenta la principale limitazione dei tests di sensibilità.

• E’ dunque necessario controllare tutti i fattori tecnici mediante rigorosastandardizzazione di tutte le fasi analitiche e post-analitiche (purezza e concentrazione dell’inoculo batterico, composizione del terreno, reattivi, condizioni di incubazione, metodi di lettura e di interpretazione dei risultati).

• Informazioni dettagliate ed aggiornate al riguardo della esecuzione dei tests di sensibilità e della interpretazione dei risultati vengono fornite dalla CLSI (ClinicalLaboratory Standards Institute), già NCCLS (National Committee for ClinicalLaboratory Standards), e dall’EUCAST (European Committee for AntimicrobialSusceptibility Testing).

Tests di antibiotico-sensibilità Standardizzazione

Tecniche per la determinazione in vitro dellaantibiotico-sensibilita’

Le metodiche che possono essere utilizzate dal Microbiologo Clinico per valutare la sensibilità microbica agli antibiotici sono:

• FENOTIPICHE (basate sulla attività antimicrobica ed utilizzo dei breakpoints)

QUANTITATIVE (determinazione di MIC)

- Microdiluizione in brodo (gold standard)

• Manuale od automatizzato

- Agar diluizione (gold standard)

- Epsilometer test (E-test) (manuale)

QUALITATIVE (classe di sensibilità)

- Kirby-Bauer o diffusione in agar (manuale)

• GENOTIPICHE (basate sulla ricerca di un gene di resistenza o di un suo prodotto)

– mecA, blaZ, vanA, vanB, … PBP2a, …

Verranno trattate soltanto alcune tra le tecniche fenotipiche. Per le altre, si rimanda al C.I. «Medicina di Laboratorio»

Tecniche per la determinazione in vitro dellaantibiotico-sensibilità

Condizione essenziale per l’esecuzione di un antibiogramma accurato ed attendibile è l’impiego di una coltura PURA, ossia derivata da una singola colonia (popolazione clonale).

Una coltura pura di un microrganismo potrà essere ottenuta a seguito di sub-coltura della crescita primaria (ossia quella ottenuta dalla semina del campione clinico) mediante tecnica di semina per isolamento.

Coltura PURA (monomicrobica) Coltura non PURA (polimicrobica)

Tecnica di semina per isolamento

Kirby-BauerEsecuzione

1. Allestimento di una sospensione batterica standardizzata (1 x 108 CFU/ml)da una coltura pura

2. Semina della sospensione alla superficie di un terreno standardizzato

3. Apposizione di dischetti antibiotizzati

4. Incubazione (37°C, 18-24h)

5. Lettura (misurazione degli aloni di inibizione) ed interpretazione (S, I, R) dei risultati

Kirby-BauerPrincipio

A seguito della applicazione del dischetto, la molecola antibioticadiffonde nell’agar in direzione centrifuga, creando un gradientedinamico di concentrazioni antibiotiche. Il microrganismo inizia a dividersi e cresce verso una massa critica. Si formerà un alone di inibizione dovuto alla inibizione della crescitabatterica indotta dall’antibiotico fino a che (“testa” dell’alone) la densità cellulare sarà tale da assorbire la molecola nelle immediate vicinanze, in tal modo mantenendone le concentrazioni a livelli sub-inibenti e, quindi, permissivi per la crescita batterica.

Kirby-BauerLettura dei risultati

La lettura del risultato consiste nella misurazione del diametro del’alone di inibizione formatosi attorno al dischetto. Considerando il gradient di concentrazione formatosi (tende a diminuire in direzione centrifuga), la sensibilità del ceppobatterico alla molecola saggiata sarà diretta funzione del diametro misurato: S = k · d

Saggi fenotipici – Kirby BauerPros & Cons

- Semplicità di esecuzione, non richiedestrumentazione accessoria

- Fornisce un risultato (classi di sensibilità), facilmenteinterpretabile dal Clinico

- flessibilità, nella selezione delle molecole da saggiare

- Economico (il meno costoso tra i tests di sensibilità)

- Non automatizzabile

- Non consente la crescita di tutti i microrganismi“esigenti”

L’antibiotico (a concentrazioni scalari 2-fold) viene solubilizzatoin brodo di crescita.

A seguito di semina dell’inoculo standardizzato, il sistema vieneincubato a 37°C per 16-20 h, quindi viene letta la MIC.

MIC (Concentrazione Minima Inibente) è una misuraquantitativa dell’attività di un antibiotico verso un determinatobatterio. Definita come la più bassa concentrazione di antibiotico in grado di inibire la crescita batterica visibile.

Si esprime in µg/ml (mg/L).

Microdiluizione in brodo Esecuzione e lettura risultati

128 64 32 16 8 4 2 1 0.5 0.25 + -

L’antibiotico (diluizioni scalri 2-fold) viene incluso in agar. MIC: minima concentrazione di antibiotico in grado di inibire la crescita microbica visibile (colonie).

Agar diluzioneEsecuzione e lettura risultati

Saggi fenotipici – tests di brodo/agar diluizionePros & Cons

- Elevata riproducibilità (“gold standard”)- Quantitativa: genera valori di MICs (anche MBC nelcaso della diulizione in brodo)

- economica (reagenti, strumentazione)

- Consente di verificare la accuratezza di sistemiautomatizzati in caso di risultati discordanti

- Laborioso (tempi)

- Richiede elevato “know-how”

- Tecnica manuale, possibili errori in fasepre-analitica (es. preparazione diluizioni seriali di antibiotico)

• Fino agli anni ‘70 i tests di antibiotico-sensibilità venivano condotti esclusivamentemediante metodiche manuali.

• La possibilità di automatizzare tali tests: i) riduce significativamente i tempi di esecuzione dell’indagine e, quindi, il tempo richiesto per la refertazione deirisultati; ii) minimizza gli errori legati all’operatore; iii) aumenta la sensibilità di lettura.

• Nel 1974 venne per la prima volta introdotto un Sistema automatizzato (Autobac I; Pfizer Diagnostics).

• Attualmente, la maggior parte dei laboratori clinici utilizza un sistemaautomatizzato per la valutazione della attività antimicrobica degli antibiotici.

Sistemi automatizzati

Sistemi automatizzatiEsecuzione

In questo sistema non è possibile testare, per ciascuna molecola, un range di concentrazioni ma soltanto i valori bkp-S e bkp-R.Pertanto, il risultato indicherà soltanto la posizione del valore di MIC rispetto ai bkps (MIC<bkpS; bkpS<MIC<bkpR; MIC>bkpR), ma non il valore esatto di MIC.

Phenotypic tests – Sistemi automatizzatiPros & Cons

- Riduzione del lavoro

- Rapida refertazione dei risultati, tempestivoavvio della terapia antibiotica

- Possibilità di organizzare i risultati in databases, utili per la consultazione retrospettica dei trends di isolamento e di resistenza.

- Scarsa flessibilità: possibilità di saggiare pannelli“standardizzati” (commercializzati) di antibiotici

- Difficoltà di analisi per microrganismi a lentacrescita

- Risultato non sempre “dettagliato”: frequentevalutazione della attività mediante l’utilizzo deisoli valori di concentrazione corrispondenti aibreakpoints

Tests di antibiotico-sensibilità

KB BD ETest Sistema automatizzato

Semplicità +++ + +++ +++

Risultati S/I/R MIC MIC MIC

Accuratezza + +++ ++ ++

Flessibilità +++ +++ +++ +

Tempi + +++ + +

Automazione + + + +++

Costo/test + + +++ +++

Interpretazione dei risultati: breakpoints

• I risultati ottenuti in vitro (endpoints) - diametri degli aloni di inibizione (Kirby-Bauer), valori di MIC (brodo/agar diluizione, E-test) - debbono essere interpretati mediante valutazione comparativa con “valori soglia” o breakpoints.

• I breakpoints vengono stabiliti, per ciascuna combinazione “specie-antibiotico”, da ComitatiNazionali od Internazionali quali CLSI ed EUCAST.

• Attraverso il confronto con i breakpoints, l’endpoint può essere tradotto in una delle cosiddette “categorie terapeutiche”:

– S (sensibilità)

– I (sensibilità intermedia)

– R (resistenza)

• I breakpoints sono fissati in funzione di un complesso insieme di parametri:

– microbiologici (es. distribuzione dei valori di MIC o degli aloni di inibizione dei ceppi selvaggi, cioè privi di meccanismi di resistenza acquisiti; cut-off epidemiologici, introdotti da EUCAST);

– farmacologici (es. dosaggio terapeutico del farmaco, concentrazioni sieriche ottenibili);

– clinici (es. studi di efficacia clinica per stabilire la correlazione tra risultati in vitro ed outcome clinico).

S I R

bkp1 bkp2

EUCAST breakpoints

Brodo-diluizioneAgar-diluzione

Kirby-Bauer

Microdiluizione in brodo / E-testInterpretazione dei risultati

Categorie terapeutiche: definizioni

Per un dato antibiotico, in accordo con le linee guida CLSI/EUCAST, un ceppo batterico verrà refertatoquale sensibile, intermedio o resistente:

SensibileIl ceppo viene inibito nella crescita od ucciso da concentrazioni di antibiotico raggiungibili in vivo(sieriche, tessutali)*. Un’infezione sostenuta da un ceppo batterico isolato può essere trattata appropriatamente con il dosaggio usuale dell’antibiotico testato e raccomandato per il tipo di infezione clinica. Indica una elevata probabilità di successo terapeutico.

Intermedio (a sensibilità intermedia)Il ceppo mostra una MIC borderline rispetto ai livelli raggiungibili in vivo (sierici e tessutali) di antibiotico* la cui efficacia potrebbe dunque essere minore di quella registrata per gli isolati sensibili. Tuttavia, questa categoria suggerisce l’efficacia clinica nei siti corporei dove gli antibiotici sono fisiologicamente concentrati (chinolonici e -lattamici nelle urine) o quando l’antibiotico può essere utilizzato a concentrazioni più alte di quelle normali in assenza di significativi effetti collaterali (-lattamici). Rappresenta una “buffer zone” (zona cuscinetto) che dovrebbe evitare/ridurre rilevanti errori interpretativi (falsa sensibilità) a seguito di errori di natura tecnica, soprattutto nel caso di molecole con un ristretto margine di farmacotossicità. Indica un effetto terapeutico incerto.

ResistenteIl ceppo non viene inibito/ucciso dalle concentrazioni sistemiche raggiunte in vivo (sieriche, tessutali) dall’antibiotico*. Questa categoria predice una elevata probabilità di fallimento terapeutico.

* a seguito di somministrazione di una dose terapeutica «usuale»

E’ necessario considerare la attività battericida di un antibiotico, SOPRATTUTTO in questi casi particolari:

• infezioni gravi: osteomieliti, endocarditi, meningiti, polmoniti• focolaio di infezione situato in distretti anatomici difficilmente accessibili

all’antibiotico

Concentrazione Minima Battericida (MBC): la più bassa concentrazione di antibiotico in grado di uccidere almeno il 99.9% (1 germe su 1.000 elude l’azione antibiotica) dellecellule formanti la popolazione iniziale.

Interpretazione critica dell’antibiogramma:Attività battericida