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Tecnología de microarrays
Portafolio de soluciones
Amparo DávilaEspecialista de Producto de Genómica en Iberia
Plataforma abierta a Todas las
técnicas Emergentes
Múlitples
aplicaciones
Trabajamos para cubrir tus necesidades
de manera PERSONALIZADA a precio de
Catálogo
Procesamiento Fácil de
Muestras Difíciles
(parafinadas,
procariotas…)
capaz de detectar eventos
biológicos raros
Soluciones para todo el
flujo de trabajo
Hardware, software,
consumibles
Disponibilidad de distintos formatos
Rango dinámico
extendido
Oligos de 60 nt con la
mejor calidad
Plataforma de trabajo de Agilent Technologies
Aplicaciones
DNA RNA
Splice
VariantsChIP
• Interacciones
proteina/ADN
• transcripción
• Replicación del
• Reparación del
ADN
• Variantes de
splice de genes
específicos
• Efectos
translacionales
posteriores
GX
• Medidas de Alta
sensibilidad de
la transcripción
• of transcription
• Correlación de
los resultados
con los datos
genómicos
mRNA
aCGH/
CNV
• Aberraciones
cromosómicas
• Variaciones del
número de
copia
Copy number
CH3
• Patrones de
metilación
• Efectos
transcripcional
es posteriores
Metilación Factores de
transcripción
mRNA isoforms
RNAi
• Presencia de
microRNAs
• Análisis de
knockouts
• Correlación de los
resultados con los
datos de
transcripción
RNA interference
Sure Select
Enriquecimiento
dirigido
El Mayor Rango
de Aplicaciones
con la Mejor
Respuesta
Glass Substrate
PRODUCCIÓN DE MICROARRAYS
Tecnología de Fabricación In-situ SurePrint Ink-Jet
Los microarrays de oligonucleótidos de catálogo se fabrican base a base, hasta
una longitud de 200mer
Planta de Fabricación In situ de Santa Clara (EE UU)
Precisión de impresión
Tamaño y forma de los puntos
uniforme
Secuencias de hasta 200 mer sin
errores
Diseños Personalizados o de
Catálogo
Control de calidad y monitorización del proceso de impresión
Evolución de la Tecnología Ink-Jet en Arrays de Oligos
Año 200022k / 135mm
Año 200444k / 100mm
Año 2006244k / 55mm
Año 20081000k / 30mm
Formatos de Multiplex: flexibilidad para sus necesidades.
Estos formatos están disponibles para toda la gama de la línea de productos CGH/CNV en arrays
de catálogo y personalizados
Baja densidad
Bajo coste
Genoma Completo/Parcial
Una sonda por gen
Alta densidad
Premium Genoma Completo
Sondas replicadas
Alto rendimiento
Densidad Media
Premium Genoma Parcial
Sondas replicadas
Alto rendimiento
Los microarrays y reactivos de Agilent se fabrican
bajo la normativa ISO 13485
Page 9
Fabricación Sureprint, oligos de 60mer en los productos de catálogo
Flexibilidad en la longitud del Oligo de 25 a 120mer
Flujo de trabajo unificado (desde la preparación de la muestra al análisis de los
datos)
Personalización Flexible del diseño de los microarrays
Acceso pleno al contenido de los microarrays de catálogo (secuencia del oligo,
puntuación de la calidad de la sonda, localización génica, descripción del gen,
accession numbers, etc…)
Actualizaciones frecuentes de las anotaciones y contenido
Información en formatos estándares (MIAME compliant, tdt, BED, GEO etc…)
Link directo con las bases de datos públicas más utilizadas
Acceso fácil y flexible a la información mediante eArray
Características comunes entre las aplicaciones
Características únicas del Nuevo Scanner C
Autofocus Dinámico (Enfoque Específico en Cada Punto del array)
Compatible con los Microarrays más comunes con
formato 1 x 3”
Actualizaciones Disponibles para Usuarios de Scanner B
Carrusel Automático para el procesamiento de 48
Slides
Creación Automática de Archivos TIFF
Escaneado Simultáneo en Dos Colores (Cy3 / Cy5)
Características únicas del Nuevo Scanner C
Rapidez de escaneado: 8 minutos en Escanear un Slide
en 2 colores (5micras)
Resoluciones Seleccionables (2, 3, 5 y 10 micras)
Menos de 20 minutos en Escanear un Slide de 2 micras
Rango Dinámico Linear 20 Bits
Estabilización de Láser y tubo fotomultiplicador ajustable
Aumento de 16X en el rango dinámico
La información en eArray
Personalización de proyectos,
experimentos y acceso a la
información
eArray herramienta segura, online
Creación de diseños personalizados en un entorno seguro
Búsqueda de secuencias y anotaciones de los arrays de catálogo
Trabajo en colaboración con la posibilidad de compartir los diseños con otros investigadores
Descarga de los archivos de las anotaciones para análisis de datos e imágenes
Pedido directo de los diseños propios a fábrica
Diseño personalizado de sondas para expresión génica
Trabajar con información génica de organismos que no están disponibles comercialmente
…y gratis
Page 15
eArray Workgroups – Grupos de trabajo
Your WorkGroup
Agilent Domain
Agilent CatalogHD CGH Probe
DatabaseHD ChiP Probe
Database “Superadmin”
Admin Users
Probes, Probe Groups, Microarray Designs
Other WorkGroupCollaboration Space
Probes, Probe Groups, Microarray Designs
EXPRESIÓN GÉNICA
A Complete Solution for Gene Expression
Array Selection & Creation
Sample Labeling
Genome-wide & Custom ArraysHyb & Wash
Scanning and Feature Extraction
Data Analysis
• Purificación de ARN
• Calidad del ARN
• Numerosos diseños de
arrays de catálogo, opciones
de personalización ilimitadas
• Análisis sensible de los
niveles de expresión
• Ensayos simples con
requerimientos bajos de ARN
incial
• Controles y medidas de la
calidad
• Interpretación Biológica
• Validación de los resultados
por qRT-PCR
Sample Prep and QA
qRT-PCR Validation
Portafolio de Microarrays de Expresión Génica Agilent
4x44k Humano RatónRata
Perro
Mono
Pollo
Zebra Fish
C. elegansXenopus
Arabidopsis Arroz Magnaporthe
LevaduraDrosophila
E. Coli
Bovino Oveja
Maiz
Caballo
Tabaco
Mosquito
Porcino
Salmón
Cualquier Array, Cualquier Genoma
con eArray
•El número de genomas completos
secuenciados es cada día mayor
•La solución de Agilent’ a la expresión
génica ofrece arrays personalizados
para un número ilimitado de especies
•Puede subir o diseñar sus sondas para
cualquier secuencia
•Visite eArray y diseñe cualquier
microarray personalizadohttps://earray.chem.agilent.com/earray/
Genome Projects: H. sapiens, H. neanderthalensis, H. influenzae, M. musculus, R. norvegicus, P. troglodytes, M. mulatta, G. gallus, M. eugenii, F. silvestris, C.
lupus familiaris, D. melangaster, S. cerevisiae, S. pombe, N. crassa, A. thaliana, O. sativa, T. aestivum, Z. mays, P. trichocarpa, E. coli, SARS virus, S.
purpuratus, C. elegans, B. rerio, X. laevis, O. latipes, T. rubipres, S. lycopersicum, S. tuberosum, A. mellifera, V. vineifera, O. anatinus, A. pisum, etc.
A vs. B
Flexibilidad Experimental: Uno o dos colores
Un color Doble color
A B
ARN A ARN B
marcajemarcaje
AB
ARN A
marcaje
A
ARN B
marcaje
hibridaciónhibridación
B
hibridación
Medición
relativa
Medición
absoluta
Gene Expression workflow: Absolutely RNA
Purification Kits• High yields of highly pure total RNA
• Fast 30 minute method
• Non-toxic
• DNase included for gDNA removal
• Convenient bench-top storage saves freezer space
Bioanalyzer results of cell RNA purified using the Absolutely RNA Miniprep Kit
A plethora of options:
• Absolutely RNA Miniprep Kit (cells, tissues)
• Absolutely RNA Microprep Kit (cells, 96-well version available)
• Absolutely RNA Nanoprep Kit (smallest samples, down to single cell)
• Absolutely RNA miRNA Kit (for total RNA containing miRNA)
• Absolutely RNA FFPE Kit (with and without deparaffinization reagents)
Bioanalyzer
Quality Controls and Quality Metrics are an
Integral Part of the Agilent Gene Expression
Platform
• Spike-in kits to track labeling efficiency and success
• QC Report with metrics on signal, background, reproducibility,
and spike-ins
• Histogram of signals
• And much, much more!
Page 26
Informes de Control de Calidad con el Software
Feature Extration 10.0 + kit Spike in
Rango Dinámico Extendido para aumentar la
sensibilidad de los transcriptos de baja expresións
Solo la plataforma de Agilen es capaz de representar el rango de expresión génica con
una distribución normal a lo largo de 5 órdenes de magnitud
Los resultados de Agilent proveen mayor reproducibilidad a lo largo de todo el rango
dinámico. Sin compresión de los datos
Sensibilidad necesaria en la representación de la expresión génica de los transcritos
muy y poco abundantes
Amplio rango dinámico y su importancia:
• 5 órdenes de magnitud a lo
largo del rango dinamico
supone la posibilidad de
tección de transcritos muy
abundantes y poco
abundantes
MCF-7
GO analysis for each Expression range
Metabolismo
Biosíntesis
Regulación de la transcripción
Transducción de la señal
Validación de los datos
•Refleco real de la expresión génica de los genes
TaqMan Log Ratio
Mic
roa
rray L
og
Ra
tio
10 ng Input: n = 740, r = 0.93, m = 0.92
50 ng Input: n = 760, r = 0.94, m = 0.94
Agilent Array Correlation to Taqman
November 2006
Page 32
Firma de Expresión Génica en Cáncer de Mama
Laura J. Van’t Veer, PhD
COO and Co-founder, Agendia
Head, Family Cancer Center
Netherlands Cancer Institute RECENTLY APPROVED
• Identificación de la expresión génica en
cáncer de mama que identifica el
comportamiento biológico de un tumor
• Probados 70 genes para el perfil
pronóstico
• 295 muestras de cáncer de mama
• Superó todas las variables clínicas
que predicen la supervivencia de la
paciente
• Se clasificaron los microarrays para
personalizar la terapia a aplicar
• Punto de partida al desarrollo de
fármacos personalizados
Introducing the
New SurePrint G3 Exon Microarrays
Whole transcript coverage
Gene-level and exon-level analysis
Continued confidence in results
Why is Exon Analysis Important?One gene One transcript One protein Old school thinking
Multiple transcripts
Multiple proteins
Current understanding
• Gene-level analysis provides a simplified view of expressed genes
• Exon arrays are required to understand the complexity of the transcriptome
From Wikimedia Commons: http://commons.wikimedia.org/wiki/File:DNA_alternative_splicing.gif
Gene-level versus Exon-level Detection
Considerations for an exon array:
• Most assays use oligo-dT primed labeling
• Exon arrays require whole-transcript assays (random primers)
3’ based
Exon-coverage
LIQA WT
Workflow diagram for the LIQA WT Labeling Kit:
– Start with 50 ng total RNA
– Create dsDNA containing T7 promoter:
– AffinityScript, RT with high efficiency
–Oligo-dT and random primed
– Create labeled cRNA (anti-sense)
–T7 RNA polymerase
–Cy3-CTP (Cy5-CTP)
–Linear amplification IVT
– Purify cRNA labeled product ready for hyb
For research use only. Not for use in
diagnostic procedures
AffinityScript
AffinityScript
Linear amplification to avoid introducing
unnecessary biases
Single-tube reaction, no cDNA clean-up
step for fast and easy processing
Now including Primer WT mix, instead of Tt
Features & Benefits: LIQA labeling kits
Feature Benefit
10 ng input Preserve precious material! Work with small samples!
Lower cost Run more samples or reserve money for downstream applications
Linear amplification
labeling
Accurately represent the prevalence of RNA transcripts during
labeling, avoid introducing unnecessary biases
Fewer tubes,
reagents blended
Easier to use assay, decreased pipetting, no need to pipette the
viscous PEG
No cDNA clean-up Process samples quickly and simply using single-tube chemistry
~ 5 logs dynamic
range
Detect the low expressors (and the high ones, too!)
More accurately represent range of gene expression in the sample
High reproducibility,
accuracyFeel confident in the results
Compatible with all
eukaryote designs
and formats
Use the same kit and assay for all study designs
For research use only. Not for use in
diagnostic procedures
miRNA Arrays
Figures not drawn to scale
• Regulación clave en el desarrollo
• ~22nts RNA de cadena simple
• Regulan la traducción del mARN
• Se encuentran en animales, plantas y virus (> 5000)
• >700 identificados en humanos (Sanger miRBase 10.1)
• Se calcula que regulan >30% de los genes humanos
• Patrón de expresión específico de cada tejido
• Tumores con distintos patrones de expresión de miRNA
• Futuro en el diagnóstico y pronóstico de cánceres y
enfermedades
microRNAs (miRNA)
Objetivos en el análisis de miRNAs
• Pequeños – difíciles de marcar con alta eficiencia
• Alta homología de secuencia – dificultad en el diseño de las sondas
• Existen otros RNAs mayores con alta homología en la muestra
• Expresión con alto rango dinamico
• Base de datos crece y se actualiza frecuentemente
11-Apr-11
Slide 43
Sanger miRBase 10.0
miRNA Sequence #NT
hsa-let-7a ugagguaguagguuguauaguu 22
hsa-let-7b ugagguaguagguugugugguu 22
hsa-let-7c ugagguaguagguuguaugguu 22
hsa-let-7d agagguaguagguugcauaguu 22
hsa-let-7e ugagguaggagguuguauaguu 22
hsa-let-7f ugagguaguagauuguauaguu 22
hsa-let-7g ugagguaguaguuuguacaguu 22
hsa-let-7i ugagguaguaguuugugcuguu 22
The Agilent miRNA Microarray Profiling SystemLas sondas de miRNA se diseñan específicamente y se prueban empíricamente
•Rojo: Secuencia de miRNA target marcada
•Negro: secuencia de la sonda
•Marrón: linker de sujeción de la sonda a la superficie del vidrio
•Azul: secuencia en horquilla que aumentea la especificidad de la sonda de miRNA
Agilent Confidential
11-Apr-11
Slide 44
Diseño específico
de cada sonda
Agilent miRNA Profiling System/Workflow
ARN total(100 ng)
Marcaje directo con Cyanine 3-pCp
Sin necesidad de purificación de los
miRNA
Hibridación sobre el array
miRNA profile
ARN marcado
Análisis de los datos con
GeneSpring GX
Formatos multiplex: 8x
• Protocolo sencillo – resultados en menos de 2 días
• Altamente específico a la secuencia y el tamaño
• Varias secuencias de sondas y replicados por
miRNA
• Protocolos para muestras FFPE
• Bases de datos actualizadas: Más de 9000 miRNA
y más de 100 Especies
y = 38.152 – 1.029x
R = -0.988
26 27 28qPCR (Mean Ct)
9
10
11
12
Arr
ay (
log
2(M
ean
To
tal
Gen
e S
ign
al)
miR-15ay = 37.109 – 0.942x
R = -0.987
qPCR (Mean Ct)
Arr
ay (
log
2(M
ean
To
tal
Gen
e S
ign
al)
26 27 28 29 30
miR-34a
9
10
11
12
Comparación de los resultados de microarrays de
miRNA qRT-PCR
Tissues = Placenta, Brain, Breast,
Liver, Heart, Testes, Ovary,
Thymus, Skeletal Muscle
GeneSpring GX 10: La Solución para el Análisis de Expresión Génica,
miRNA, splice variant, QPCR
•GeneSpring GX is a tool specifically
designed for biologists that need powerful
statistical methods to analyze gene
expression data
•GeneSpring GX allows the user to
understand the results of the statistical
analyses in a biological context
•GeneSpring GX provides the user with
guidance through a complete analysis,
providing results, fast
•GeneSpring Workgroup allows users to
collaborate on the same data, leveraging
expertise across the organization
aCGH / CNV
Tecnología de Cariotipado Molecular (aCGH)
Theisen, A. Microarray-based comparative genomic hybridization (aCGH). Nature Education 1(1), (2008)
http://www.nature.com/scitable/topicpage/Microarray-based-Comparative-Genomic-Hybridization-aCGH-45432
Ejemplo de visualización en células HT29:
reordenamientos complejos
Delección homocigótica
Deleccción heterocigótica
Duplicación
•Precisa en el análisis de número de copias
•Puntos de rotura bien definidos gracias a
una buena cobertura personalizable con
sondas de alta calidad
•Capaz de mostrar aberraciones complejas
•Detección de mosaicismos a partir de 30%
Diseño de Arrays: Agilent Ofrece una extensa base de datos de
oligos para diseñar arrays personalizados… GRATUITA
Contenido personalizado para incorporar
información específica de proyectos,
validación de protocolos
La base de datos contiene 28.7 millones de oligos validados para experimentos de CGH.
Secuencias a disposición del usuario
Base de datos
Secuenciasde oligos
eArray: interfaz web
Agilent desarrolla sus arrays de
catálogo para satisfacer las
necesidades de proyectos más
comunes
Cri-du-Chat SyndromeNA14117, 46,XY,del(5)(qter>p14:).ish del(5) (D5S23-)
http://fs6.depauw.edu/~cfornari/DISGEN/CriDuChat%20Website/images/cri-du-chat_diagram.gif
Genome View (Agilent Genomic Workbench)
Settings: ADM-2, threshold 10, min 3 probes
Cri-du-Chat SyndromeNA14117, 46,XY,del(5)(qter>p14:).ish del(5) (D5S23-)
http://fs6.depauw.edu/~cfornari/DISGEN/CriDuChat%20Website/images/cri-du-chat_diagram.gif
Settings: ADM-2, threshold 10, min 3 probes
Chromosome View Gene View
Agilent Restricted
De-paraffinization
De-crosslinking + ProteinaseK
DNA purification (Qiagen)
2 hr Restriction Digestion 10 min Heat Fragmentation
Random primers + 3’ Denaturation
2 hr Klenow Labeling 30 min ULS™ Labeling
Microcon clean-up Column clean-up
40 hr Hybridization
Wash
Scan
FFPE Workflow Comparison
ENZYMATIC NON-ENZYMATIC
Elección del kit de marcaje
Características Marcaje enzimático Marcaje ULS
Compatibilidad con la
muestra
Células, Tejido conjelado,
Sangre
Células, Tejido conjelado,
Sangre, ADN y FFPE
Muestra requerida (1x) 500 ng 1500 ng
Tiempo de porcesado
de una muestra4 1/2 hours 1 hour
Coste
Mismo coste para 1x, 2x,
and 4x; Mitad de precio
para 8x
Menor precio que el marcaje
enzimático;
Se reduce en arrays
multiformato
Slide 58
Fresh frozen Archived paraffin
Chr 8 in Prostate Tumor FFPE samples
Paraffin (P) and Frozen (F) prostate tumor samples; normal M/F as a control
CGH v2.0 protocol, direct labeling, 20rpm, no wash 3
La plataforma de Agilent para el mayor estudio del
mundo de Análisis de Número de Copia
Braggio et al. Valores mayores de DLR en la plataforma SNP6.0 platform
reduce la resolución de detección de aberraciones, mientras SNP6.0 array
no puede detectar una ganancia focal de PAX5 que sí se identificaba con 8 y
31 sondas de las plataformas Agilent
En esta comparativa, los arrays
Agilent 1M sobrepasaron a
Affymetrix SNP6. Incluso con la
mitad de sondas, los arrays de
Agilent fueron mejores para la
detección de CNA, para cubrir
genes/exones y mostraba
menos variación de la señal,
menos DLR.
Mayor desnsidad de sondas no se
traduce en mayor resolución
Usuarios que utilizan la plataforma Agilent
rutinariamente para el diagnóstico en Citogenética
Novedades en estudios
citogenéticos
…Ya disponible!
For research use only. Not for
use in diagnostic procedures.
UPD: Disomía uniparental
•Ambos cromosomas del mismo par o segmentos de un par de cromosomas se
heredan de uno de los padres y ninguno del otro progenitor
• Disomía uniparental resulta en un fenotipo anormal cuando los cromosomas de que
se trata estan ”imprinted”, como en los que los genes de eso cromosomas son activos
de forma monoalélica (solo está activo el cromosoma del padre o el de la madre)
Medida de los SNPs mediante enzimas de
restricción
Genotipado de SNPs usando restricción
enzimática (Alu/Rsa)
Se mide el número de copias de un solo
alelo en cada SNP relativo a una
referencia conocida
Regiones de LOH se localizan buscando
en regiones con una pérdida
significativa de señales en
heterocigosis
Not approved for use in diagnostic
procedures
Cómo funcionaAG CT
Homozygous:
ZERO UNCUT COPIES
(2 cut copies) =
low signal
AGCT
AGCT
AGCT
AG CT
CG CTCG CT
CG CT AG CT
AG CT
CG CT CG CT
CG CT
CG
CT
CG
CT
CG
CT
AG CT
Homozygous:
TWO UNCUT COPIES
(0 cut copy) =
high signal
Heterozygous:
ONE UNCUT COPY
(1 cut copy) =
intermediate signal
Enzymatic
labeling
Hybridization
Wash
Scan
AGCT
AGCT
AGCT
CG CT CG CT
CG CT
Restriction
digestion
(AluI & RsaI)
Workflow
FE 10.10
AGW 6.5
Not approved for use in diagnostic
procedures
Homozygous CC Heterozygous CA Homozygous AA
Distribución de las sondas de
SNP corregidas contra la
referencia
Non-human primate FISH
Número de alelos no
cortados
Deteccióno de una
región LOH
… las señal de las sondas SNP se corrigen frente a una referencia
0 1 2
19
20
0
0.5 1
1.5 2
2.5 3
Ge
no
mic
po
sitio
n
Copy Number
LO
H c
alls
fo
r N
A1
27
40
Carencia
estadísticamente
significativa de
heterocigosidad
13.5Mb
(42 SNPs)
Cómo funciona
Not approved for use in diagnostic
procedures
UPD en el cromosoma 15
2x400K
CGH+SNPDLRSD 0.15
4x180K
CGH-onlyDLRSD 0.14
No. uncu
t alle
les
Log
2ra
tio
Log
2ra
tio
LOH: 79 Mb
Not approved for use in diagnostic
procedures
Detección de consanguinedad en el cromosoma 11
No. uncu
t alle
les
Log
2ra
tio
Log
2ra
tio
Not approved for use in diagnostic
procedures
LOH: 5.1 Mb
2x400K
CGH+SNPDLRSD 0.17
4x180K
CGH-onlyDLRSD 0.15
ISCA
Arrays contenido ISCA de catálogo
ChIP on chip
&
Metilación
Agilent ChIP-on-chip: Major Applications
• Identificación de la unión de factores de transcripción al ADN
• Caracterización de la transcripcion, replicación y eventos de reparación del ADN
• Mapeo de las modificaciones de histonas
• Mapeo de nucleosomas
• Mapeo de las metilaciones del ADN
ChIP on chip: Pirincipio y resultados
CHIPinput 67 probes in 25kb region
Bin
din
g r
ati
o
Mammalian Development
Cell 125, 301-313, April 21, 2006.
Richard Young, Professor of
Biology, MIT
June 2007
Page 84June 2007Page 84
DNA methylation
Page 85
DNA methylation
Regulación génica
– Desarrollo embrionario
– Imprinting genómico
– Silenciación génica - cancer
Metilación de la C5 de la citosina en el dinucleótido CG dinucleotide
– DNA methyltransferasas
– Mantenimiento post-replication (DNMT 1)
– de novo (DNMT3A & DNMT3B)
Islas CpG
– Regiones con alto contenido en CG, 1% del genoma y relacionadas a la regulación de la actividad de los promotores
Estabilidad cromosómica
