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filippo-marconi
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TECNOLOGIA DEL DNA RICOMBINANTE
Ha reso possibile il CLONAGGIO dei GENI permettendo di
ISOLARE
AMPLIFICARE frammenti di DNA
SEQUENZIARE
Perché manipolare i geni?
1) Per facilitare lo studio dell’espressione genica e della regolazione fisiologica;
2) per identificare il prodotto di un gene e/o per ottenerne la sovraespressione;
3) per studiare la relazione fra struttura e funzione delle proteine;
4) per identificare componenti cellulari che interagiscono con particolari sequenze di acidi nucleici o con particolari domini proteici
PROCEDURA di CLONAGGIO
ISOLAMENTO del gene
INSERZIONE del gene in un VETTORE PLASMIDICO
INTRODUZIONE del vettore plasmidico IN CELLULE VIVENTI per propagarlo
Le fasi più delicate sono quelle del taglio e dell’unione di sequenze di DNA in modo preciso….…..tutto ciò si ottiene con l’ausilio di ENZIMI
Cosa serve per un clonaggio
• Gene (DNA di interesse)
• Enzimi di restrizione
• DNA ligasi
• Vettore
• Cellula ospite
OH
OH P
P
OH
OHP
P
DNA LIGASI
Forma legami covalenti fra il gruppo fosfato 5’ di una estremità ed il gruppo ossidrilico 3’ della catena adiacente.
L’enzima comunemente utilizzato è la T4 DNA Ligasi perché stabile e poco costosa.
CARATTERISTICHE DELLA REAZIONE:
Presenza di ATP
10° C o.n. oppure temperatura ambiente, poche ore
OH
POH
P
BamHI
5’-G GATCC-3’3’-CCTAG G-5’
OH
P OH
P
EcoRI
5’-G AATTC-3’3’-CTTAA G-5’
La bassa temperatura è consigliata in quanto, diminuendo l’energia cinetica delle molecole, riduce la possibilità che le estremità appaiate si separino prima di venir stabilizzate dalla ligazione.
DNA LIGASI
OH
OH P
P
OH
OH
P
P
OH
OH P
P
OH
OHP
P
FOSFATASI ALCALINA
OH
POH
P
BamHI
5’-G GATCC-3’3’-CCTAG G-5’
HpaI
5’-GTT AAC-3’3’-CAA TTG-5’
OH
P OH
P
OH
OH
Blunt ends ligationoppure trattamento conTransferasi terminale
OH
OH
Sticky ends ligation
OH
OH P
P
+ dATP
OH
OH+ dTTP
AAA P
P AAA
TTT
TTT
Sticky ends ligation
Vettori di clonaggio
• Plasmidi
• Fagi
• Cosmidi
• Yac
• Bac
PLASMIDI
Per essere un buon vettore di clonaggio, un plasmide deve avere:
Dimensioni contenute
Un sito di origine della replicazione
Un gene per la resistenza a un antibiotico
Siti unici di restrizione (polilinker)
Piccole molecole di DNA batterico extracromosomico, circolare.
In natura conferiscono vantaggi selettivi ai ceppi che li contengono.
Ingegnerizzati per l’uso di laboratorio.
TRASFORMAZIONE delle CELLULE BATTTERICHE:Inserimento del plasmide nella cellula ospite
Cellule competenti
Solo le cellule che hanno incorporato il plasmide formeranno delle colonie.
Curva di crescita di E. coli
INTERVALLO (Lag phase)
I batteri vengono diluiti nella coltura iniziale; la divisione procede lentamente in quanto le cellule si stanno adattando al terreno fresco.
FASE LOGARITMICA
4 - 5 ore
I batteri crescono esponenzialmente.
10 - 11 ore
FASE STAZIONARIA
La densità cellulare rimane costante. La coltura può anche entrare in una fase di declino in cui le cellule si lisano ed il DNA si degrada parzialmente.
Tempo (h)D
ensi
tà c
ellu
lare
(O
D6
00)
5.0
4.5
4.0
3.5
3.0
2.5
2.0
1.5
1.0
0.5
0
0 5 10 15 20
PURIFICAZIONE del DNA PLASMIDICO
LISI ALCALINA
1. RISOSPENSIONE
E. coli
2. LISI
NaOH / SDS
RNasi
DNA cromosomico
DNA plasmidico
Centrifugazione
3. NEUTRALIZZAZIONE
KAc
Precipitato contenente DNA genomico, proteine, detriti cellulari
Supernatante contenente il DNA plasmidico
DNA cromosomico DNA plasmidico
Bromuro d’etidio Bromuro d’etidio
Svolgimento della doppia elica e diminuzione della densità
idrodinamica
Svolgimento della doppia elica compensato dall’introduzione di
supereliche
...PURIFICAZIONE del DNA PLASMIDICO
ULTRACENTRIFUGAZIONE in gradiente di densita’ di CsCl in presenza di EtBr
Il superavvolgimento indotto nel DNA plasmidico dall’intercalazione del bromuro d’etidio fra le basi ne impedisce progressivamente il legame
rendendo la densità idrodinamica del DNA plasmidico maggiore di quella del DNA cromosomico.
TProdotto di PCR
P
OH
O
Tyr-274
Topoisomerasi
PO
Tyr-274
OH
Riepilogo di un procedimento di clonaggio
Libreria genomica
Quando si clona l’intero genoma di un organismo si dice che si costruisce una libreria (library) genomica
La miscela di frammenti che contiene tutte le sequenze codificanti costituisce la “libreria di cDNA”.
Libreria di cDNA (DNA complementare)
AAAAAAAA
AAAAAAAATTTTT
TTTTT
TTTTT
TTTTT
TTTTT
TTTTT
TTTTT
TTTTT
TTTTT
TTTTT
TTTTT
TTTTT
TTTTT
TTTTT
TTTTT
TTTTT
TTTTT
TTTTT
TTTTT
TTTTT
TTTTT
TTTTT
TTTTT
TTTTT
TTTTT
TTTTT
TTTTT
TTTTT
TTTTT
TTTTT
TTTTT
TTTTT
TTTTT
TTTTT
TTTTT
TTTTT
AAAAA
AAAAA
Caricamento Lavaggio Eluizione
AAAAAAAA
AAAAAAAA
AAAAAAAA
1-Estrazione di mRNA
AAAAAAA 3’ mRNA5’
+ oligo dT
3’ TTTTTTT 5’
AAAAAAA 3’ mRNATTTTTTT 5’
5’
AAAAAAA 3’ mRNATTTTTTT 5’ DNA
5’3’
3’TTTTTTT 5’
Formazione della forcina
TTTTTTT 5’3’AAAAAA
A
3’TTTTTTT 5’
Sintesi del filamento complementareDna polimerasi
3’TTTTTTT 5’AAAAAAA
cDNAA
Rimozione della forcina con la nucleasi S1
+ trascriptasi inversa
Rimozione del mRNA(degradazione alcalina o calore)
2-Sintesi del cDNA (1° metodo)
Sintesi del cDNA (2° metodo)
• genoma di 1.85 x 108 bp • dopo digestione, abbiamo avuto frammenti di circa 20.000 basi che
possiamo clonare nel vettore opportuno. • Se ogni tratto del genoma fosse presente una sola volta, basterebbero
10.000 cloni per rappresentare tutto il genoma.
• Esiste una formula che permette di calcolare il numero dei cloni necessari per avere un alta probabilità che tutti frammenti siano rappresentati:
• n = ln(1-p)/ln(1-f)
• f = 20.000 bp/185.000.000 = circa 10-4 cioè ogni inserto di 20 kb è 1/10.000 del genoma totale.
• La probabilità p può essere scelta come 95%, 99%, 99.9% a seconda della sicurezza che si desidera avere.
• Nei tre casi il numero dei cloni sarà:• 30.000, 4-50.000, 70.000
SCREENING mediante IBRIDIZZAZIONE SU PLACCA
Placche o colonie
Punti di riferimento per l’orientazione della replica al termine dell’esperimento
•• •
•
• •Replica su filtri di nitrocellulosa(conservare le piastre originali)
Denaturazione, neutralizzazione e
legame del DNA al filtro
•
• •
Ibridizzazione con sonda marcata e lavaggio della sonda non legata
32P
32P
•
• •
32P32P 32P
32P
Sonda non legata
Sonda ibridizzata
•
• •Autoradiografia
Autoradiogramma che mostra la posizione delle
sonde ibridizzate
Recupero delle placche positive dalla piastra
originale
SONDE OLIGONUCLEOTIDICHE
Una sonda è un filamento di DNA complementare a quello che si vuole isolare dalla biblioteca.
STRATEGIE DI SINTESI:
E’ nota la sequenza amminoacidica della proteina codificata dal gene
Si sintetizzano chimicamente le sequenze nucleotidiche (degenerate) più appropriate
osi amplifica un frammento del gene di interesse mediante
PCR
E’ nota la sequenza nucleotidica del gene di
interesse
CASO 1: CASO 2:
Si predice la sequenza nucleotidica che dovrebbe codificare per quella proteina
Nello screening di una libreria genica il cDNA può essere utilizzato come sonda per l’isolamento del corrispondente gene.
Altri vettori di clonaggio
• Fagi
• Cosmidi
• Yac (yeast artificial chromosome)
• BAC
• I fagi (o batteriofagi) sono strutture biologiche complesse in grado di fissarsi alla parete batterica e quindi introdurre il loro DNA all'interno del batterio. (trasfezione) . Il fago più usato e conosciuto è il fago lambda.
• Il fago è un fago temperato, ha un peso molecolare di 31.106 Da ed è lungo 48.502 bp
• Il DNA isolato da alcune particelle virali è a doppio strand con due estremità a singolo filamento di 12 nucletotidi complementari fra loro, chiamati siti cos. Questi siti permettono al DNA di circolarizzare dopo l’infezione della cellula ospite.
• 5’ GGGCGGCGACCTCGC---------------------- ACG 3’• GCG---------------------TCGCCCGCCGCTGG• La mappa genetica del fago comprende circa 40 geni che possono essere
suddivisi in tre gruppi funzionali: • la parte sinistra, comprendente i geni da A a J, codifica per proteine strutturali della
testa e della coda.• la parte centrale, contiene geni responsabili per la lisogenia, cioé il processo che
porta all'integrazione del DNA virale ed altri processi ricombinativi. Gran parte di questa regione non é essenziale per la crescita litica e può essere eliminata per la costruzione di vettori.
• la parte destra contiene geni coinvolti nella replicazione del DNA e nel ciclo litico (S, R), geni regolatori (cI, cII, cIII, cro, N, Q) (Fig. 33)
ASSORBIMENTO
CICLO LITICO CICLOLISOGENICO
REPLICAZIONEPRECOCE
(bidirezionale)
REPLICAZIONETARDIVA
(modello circolare)
CON CATAMERO
TAGLI AD OPERAPROTEINA A
INCAPSIDAZIONE
PARTICELLAFAGICA
MATURA
LISI DELLAPARETE BATTERICA
R
A
A
R
COS
DNAE. coli
RICOMBINAZ.
CROMOSOMAE. coli
GAL bio
ATT
ATT ATT
bioGAL RICOMBINAZ.
AR COS J
REPLICAZIONE CONDNA CROMOSOMICO
CICLO LISOGENICOAd alto stato di infezione la cellula contiene alte concentrazioni di cIII:
Hfl è inibitacII stimola la trascrizione di cI e la proteina
IntegrasicI è un repressore dei geni del ciclo litico e
blocca la sintesi di N, O, P e Q legandosi agli operatori OL e OR, bloccando il ciclo litico
CICLO LITICOA basse concentrazioni di cIII:
Hfl non inibita
riduce l’attività o la quantità di cIIblocco della sintesi di cIla sintesi di N, O, P, Q non è più bloccata
Proteine di assembaggio
Proteine di assembaggio
pD
Geni fagici Geni fagici
Ceppo lisogenico di E.coli portatore della mutazione amber BHB2688. L’induzione porta alla produzione di
di code di , di proteina D e delle proteine di assemblaggio,ma non di proteina E. Non si formano i precursori delle teste.
Ceppo lisogenico di E.coli portatore della mutazione amber BHB2690. L’induzione porta alla produzione di
di code di , dei precursori delle teste e delle proteine di assemblaggio,ma non di proteina D.
L’impaccamento è impedito a causa della mancnaza di proteina D
LISI E MISCELAZIONE DEGLI ESTRATTI + AGGIUNTA DI ATP + DNA CONCATAMENRIZZATO
Proteine di assembaggio
pD+ + +
COS COS COS COS
PARTICELLA FAGICA MATURA
IMPACCAMENTO IN VITRO
• La regione tra i geni J e N del genoma di non è essenziale per la crescita litica. In linea di principio, un vettore privo di questa regione potrebbe contenere circa 14.500 bp di DNA estraneo
• Nella testa del fago può trovare posto fino al 105% della lunghezza del suo DNA e, inoltre, esistono nei bracci di altre regioni non essenziali che possono essere rimosse.
• Considerando tutto questo si ottiene un valore massimo di circa 22 Kb di DNA estraneo inseribile.
• Esiste anche un limite inferiore, pari al 75% del genoma di l, pari a circa 37 Kb, al di sotto il DNA non viene impaccato e il non è vitale.
• Esistono due tipi di vettori • * I vettori d'inserzione • * I vettori di sostituzione
DNA VIRALE come VETTORE DI CLONAGGIO
Regione non essenziale (circa
20 Kb)
Eliminazione del DNA non essenziale
DNA da clonare
DNA ricombinante
Teste e code del
virus
Assemblaggio in vitro delle
particelle virali
Il DNA virale entra nelle cellule, viene replicato e dirige la sintesi delle proteine virali. La lisi delle cellule rilascia le nuove particelle virali assemblate Recupero delle particelle virali e
isolamento del DNA clonato
Infezione dei batteri
DNA virale
Un vettore comunemente utilizzato è il batteriofago , lungo 49 Kb.
IMPACCHETTAMENTO del DNA VIRALE
Il DNA virale a doppia elica entra nelle cellule batteriche durante l’infezione come molecola lineare
Estremità coesive Estremità
coesive All’interno della cellula,
le estremità si appaiano originando una molecola di DNA
circolare
Sito cos
Concatameri di copie di DNA virale
Cicli ripetuti di replicazione con il
meccanismo del cerchio rotante
Il DNA codifica per le proteine della testa e della coda del virus
Il DNA viene inserito nelle teste del virus e tagliato a livello del sito cos
Sono aggiunte le
code Particella virale infettiva.I virus sono rilasciati per lisi delle cellule e possono infettare altre cellule batteriche.
5’•
COSMIDI
Sono PLASMIDI, ma contengono, oltre alle caratteristiche essenziali di un plasmide, anche un
SITO COS
La presenza di questo elemento è determinante per consentire
l’inserimento della molecola di DNA ricombinante nella testa del
virus che, a sua volta, la inietta in una cellula batterica per
infezione.
c) cosmidi
Sono plasmidi che utilizzano la capacità del batteriofago lambda di impacchettare lunghi frammenti di DNA lineare all’interno del capside, di aderire alla superficie delle cellule batteriche e di iniettare il loro contenuto all’interno del batterio.
Rispetto al batteriofago lambda, può contenere un inserto di DNA di dimensioni maggiori (45 kb).
Il cosmide circolarizza e si comporta come un grande plasmide replicando il proprio genoma.
d) Vettori BAC
Bacterial Artificial Chromosome
Plasmidi di dimensioni enormi, consentono l’inserimento di frammenti di DNA umano fino a 300 Kb.
Il DNA viene inserito nei batteri mediante processo di elettroporazione: uno shock elettrico provoca la formazione transitoria di pori sulla membrana batterica attraverso i quali passa il DNA.
Ospiti per i vettori
• Le caratteristiche di un ospite di clonaggo sono:• crescita rapida• capacità di crescere in terreni di coltura poco
costosi• non patogencità• capacità di essere trasformato• stabilità della coltura.
Curva di crescita di E. coli
INTERVALLO (Lag phase)
I batteri vengono diluiti nella coltura iniziale; la divisione procede lentamente in quanto le cellule si stanno adattando al terreno fresco.
FASE LOGARITMICA
4 - 5 ore
I batteri crescono esponenzialmente.
10 - 11 ore
FASE STAZIONARIA
La densità cellulare rimane costante. La coltura può anche entrare in una fase di declino in cui le cellule si lisano ed il DNA si degrada parzialmente.
Tempo (h)D
ensi
tà c
ellu
lare
(O
D6
00)
5.0
4.5
4.0
3.5
3.0
2.5
2.0
1.5
1.0
0.5
0
0 5 10 15 20
DNA stampo a singola elica
3’-GGCTAAC
3’-GGCTAAC5’ 3’
Ibridazione conIl primer
+ [35S]dATP+dCTP,dGTP,dTT (dNTP) +Sequenasi
ddATP, dNTP ddCTP, dNTP ddGTP, dNTP ddTTP, dNTP
-CCG ddA -ddC-C ddC
-CC ddG-CCGATT ddG
-CCGA ddT-CCGAT ddT
Sequenza: 5’-CCGATTG
A C G T
-CCGATT ddG-CCGAT ddT-CCGA ddT-CCG ddA-CC ddG-C ddC-ddC
GT
T
AGCC
Schema di sequenziamento a terminazione di catena
Direzione dilettura