BAB IPENDAHULUAN1.1 Latar BelakangDalam teknik biakan murni tidak saja diperlukan bagaimana memperoleh suatubiakan yang murni, tetapi juga bagaimana memelihara serta mencegah pencemaran dariluar. Media untuk membiakkan bakteri haruslah steril sebelum digunakan. Pencemaranterutama berasal dari udara yang mengandung banyak mikroorganisme. Pemindahanbiakan mikroba yang dibiakkan harus sangat hati-hati dan mematuhi prosedur laboratoriumagar tidak terjadi kontaminasi. Oleh karena itu, diperlukan teknik-teknik dalam pembiakanmikroorganisme yang disebut dengan teknik inokulasi biakan (Dwijoseputro, 1998).Teknik inokulasi merupakan suatu pekerjaan memindahkan bakteri dari mediumyang lama ke medium yang baru dengan tingkat ketelitian yang sangat tinggi. Dengandemikian akan diperoleh biakan mikroorganisme yang dapat digunakan untukpembelajaran mikrobiologi. Pada praktikum ini akan dilakukan teknik inokulasi biakanmikroorganisme pada medium steril untuk mempelajari mikrobiologi dengan satu kulturmurni saja.1.2 PermasalahanPermasalahan yang akan dibahas dalamp raktikum ini adalah bagaimanamempelajari teknik inokulasi biakan mikroorganisme pada medium steril.1.3 TujuanPraktikum ini bertujuan untuk mempelajari teknik inokulasi biakanmikroorganisme pada medium sterilBAB IITINJAUAN PUSTAKA2.1 Pemindahan biakanIdentifikasi biakan mikroorganisme seringkali memerlukan pemindahan ke biakansegar tanpa terjadi pencemaran. Pemindahan mikroorganisme ini dilakukan dengan teknikaseptik untuk mempertahankan kemurnian biakan selama pemindahan berulangkali.Mikroorganisme dapat ditumbuhkan dalam biakan cair atau padat. Kekeruhan dalam kaldumenunjukkan terjadinya pertumbuhan mikroorganisme. Bila mikroorganisme menumpukpada dasar tabung maka akan membentuk sedimen, sedangkan pada permukaan kaldupertumbuhannya terlihat sebagai pelikel (Lay, 1998).Pertumbuhan mikroorganisme dalam kaldu seringkali menggambarkan aktivitas

metabolismenya. Mikroba aerob obligat berkembang biak pada lapisan permukaan karenapada bagian ini kandungan oksigen tinggi. Selain dalam media cair, mikroorganisme jugamemperlihatkan pertumbuhan dengan ciri tertentu dalam biakan padat seperti agar miringatau lempengan agar. Agar miring lazimnya digunakan untuk menyimpan biakan murnisedangkan agar lempengan lazimnya digunakan untuk memurnikan mikroorganisme (Lay,1998).2.2 InokulasiPenanaman bakteri atau biasa disebut juga inokulasi adalah pekerjaan memindahkanbakteri dari medium yang lama ke medium yang baru dengan tingkat ketelitian yang sangattinggi. Untuk melakukan penanaman bakteri (inokulasi) terlebih dahulu diusakan agarsemua alat yang ada dalam hubungannya dengan medium agar tetap steril, hal ini agarmenghindari terjadinya kontaminasi (Dwijoseputro, 1998).Ada beberapa tahap yang harus dilakukan sebelum melakukan teknik penanamanbakteri (inokulasi) yaitu :1. Menyiapkan ruanganRuang tempat penanaman bakteri harus bersih dan keadannya harus steril agar tidakterjadi kesalahan dalam pengamatan atau percobaaan .dalam labotarium pembuataanserum vaksin dan sebagainya. Inokulasi dapat dilakukan dalam sebuah kotak kaca(encast) udara yang lewat dalam kotak tersebut dilewatkan saringan melalui suatu jalanagar tekena sinar ultraviolet (Pelczar, 1986).2. Pemindahan dengan dengan pipetCara ini dilakukan dalam penyelidikan air minum atau pada penyelidikan untuk diambil1 ml contoh yang akan diencerkan oleh air sebanyak 99 ml murni (Pelczar, 1986).3. Pemindahan dengan kawat inokulasiUjung kawat inokulasi sebaliknya dari platina atau nikel .ujungnya boleh lurus jugaboleh berupa kolongan yang diametrnya 1-3mm. Dalam melakukuan penanaman bakterikawat ini terlebih dahulu dipijarkan sedangkan sisanya tungkai cukup dilewatkan nyalaapi saja setelah dingin kembali kawat itu disentuhkan lagi dalam nyala (Pelczar, 1986).

2.3 Teknik InokulasiAda beberapa metode yang digunakan untuk mengisolasi biakan murnimikroorganisme yaitu :2.3.1 Metode goresTeknik ini lebih menguntungkan jika ditinjau dari sudut ekonomi dan waktu, tetapimemerlukan ketrampilan-ketrampilan yang diperoleh dengan latihan. Penggoresan yangsempurna akan menghasilkan koloni yang terpisah. Inokulum digoreskan di permukaanmedia agar nutrien dalam cawaan petri dengan jarum pindah (lup inokulasi). Di antaragaris-garis goresan akan terdapat sel-sel yang cukup terpisah sehingga dapat tumbuhmenjadi koloni (Winarni, 1997).Cara penggarisan dilakukan pada medium pembiakan padat bentuk lempeng. Biladilakukan dengan baik teknik inilah yang paling praktis. Dalam pengerjaannya terkadangberbeda pada masing-masing laboratorium tapi tujuannya sama yaiitu untuk membuatgoresan sebanyak mungkin pada lempeng medium pembiakan (Kus Irianto, 2006)Ada beberapa teknik dalam metode goresan, yakni :a. Goresan Tb. Goresan kuadranc. Goresan Radiand. Goresan Sinambung2.3.2 Metode tebarSetetes inokolum diletakan dalam sebuah medium agar nutrien dalam cawanpetridish dan dengan menggunakan batang kaca yang bengkok dan steril. Inokulasi itudisebarkan dalam medium batang yang sama dapat digunakan dapat menginokulasikanpinggan kedua untuk dapat menjamin penyebaran bakteri yang merata dengan baik. Padabeberapa pinggan akan muncul koloni koloni yang terpisah-pisah (Winarni, 1997).……………………………………………2.3.3 Metode tuangIsolasi menggunakan media cair dengan cara pengenceran. Dasar melakukanpengenceran adalah penurunan jumlah mikroorganisme sehingga pada suatu saat hanyaditemukan satu sel di dalam tabung (Winarni, 1997).

2.3.4 Metode tusukMetode tusuk yaitu dengan dengan cara meneteskan atau menusukan ujung jarumose yang didalamnya terdapat inokolum, kemudian dimasukkan ke dalam media (Winarni,1997).2.4 Perbedaan Inokulasi Jamur dan BakteriPerbedaan Inokulasi Jamur dan Bakteri adalah :1. Inokulasi jamur menggunakan jarum ose bentuk batang. Hifa yang berbentuk sepertibenang mudah diambil dengan jarum ose batang dan mudah sekali tumbuh di dalamsuatu media.2. Inokulasi bakteri menggunakan jarum ose bentuk bulat. Pada ujung jarum ose yangberbentuk bulat, bakteri akan dapat terambil dalam jumlah yang relatif banyak(Rohimat, 2002).2.5 Macam-Macam MediaAda beberapa macam media yang digunakan untuk inokulasi yaitu :1.Mixed culture: berisi dua atau lebih spesies mikroorganisme2. Plate culture: media padat dalam petridish3. Slant culture : media padat dalam tabung reaksi4. Stap culture : media padat dalam tabung reaksi, tetapi penanamannya dengan carapenusukan.5. Liquid culture : media cair dalam tabung reaksi.6. Shake culture: media cair dalam tabung reaksi yang penanamannya dikocok.(Dwijoseputro, 1998).2.6 Cara menyelidiki Piaraan MurniDalam keadaan sebenarnya ( di alam bebas ) boleh dikatakan tidak ada bakteri yanghidup tersendiri terlepas dari spesies lainnya. Kerapkali bakteri patogen kedapatanbersama-sama bakteri saproba. Untuk menyendirikan suatu spesies ada dikenal beberapacara, yaitu :1. Dengan pengenceranSuatu sampel dari suatu suspensi yang berupa campuran bermacam-macam spesiesdiencerkan dalam suatu tabung tersendiri. Dari enceran inii kemudian diambil sampel 1 mluntuk diencerkan lebih lanjut. Jika dari pengenceran yang ketiga ini diambil 0,1 ml untukdisebarkan pada suatu koloni tumbuh dalam medium tersebut, tetapi mungkin juga kitahanya memperoleh satu koloni saja. Dalam hal yang demikian ini kita memperoleh satu

koloni saja. Dalam hal yang demikian ini kita memperoleh satu koloni murni. Kalau kitabelum yakin, bahwa koloni tunggal yang kita peroleh itu murni, kita dapat mengulangpengenceran dengan menggunakan koloni ini sebagai sampel (Waluyo, 2005).Gambar 1. Teknik Pengenceran2. Dengan PenuanganRobert koch ( 1943-905 ) mempunyai metode yang lain, yaitu dengan mengambilsedikit sampel campuran bakteri yang sudah diencerkan, dan sampel ini kemudiandisebarluaskan di dalam suatu medium dari kaldu dan gelatin encer. Dengan demikiandiperoleh hanyalah suatu piaraan adukan. Setelah medium itu mengental, maka selangbeberapa jam kemudian nampaklah koloni – koloni yang masing – masing dapat dianggapmurni. Denagn mengulang pekerjaan seperti di atas, maka akhirnya akan diperoleh piaraanmurni yang lebih terjamin (Waluyo, 2005).3. Dengan PenggesekanMetode ini sekarang banyak digunakan, karena tidak begitu memakan waktu, hanyasayang, dengan cara ini maka bakteri anaerob tidak dapat rumbuh. Jika ujung kawatinokulasi dibengkokan, kemudian ujung kawat inokulasi itu setelah disentuhkan suatukoloni lalu digesekkan pada permukaan medium padat, maka beberapa waktu kemudian(kurang lebih 12 jam) akan nampaklah koloni-koloni yang letaknya tersebar di permukaanmedium. Jika diadakan pemindahan sampel dari suatu koloni yang letaknya terpencil,maka akan diperoleh suatu piaraan murni (Waluyo, 2005).4. Dengan Mengucilkan Satu Sel ( Single Cell Isolation )Mikropipet adalah alat yang dapat memungut satu bakteri dari sekian banyak,dengan tiada ikut sertanya bakteri lain. Mikropipet ditempatkan pada tangan – tangan suatumikromanipulator. Dengan mikropipet dibuat beberapa tetesan bergantung pada suatu kacapenutup. Pekerjaan ini dilakuan di bawah obyektif mikroskop. Jika tampak suatu tetesanhanya mengandung satu bakteri, maka dengan lain mikropipet, tetesan tersebutdipindahkan ke medium encer dengan maksud supaya bakteri tersebut berkembang biakdulu. Kemudian dari sini dapat diperoleh piaraan murni. Meode ini sangat memerlukankesabaran, lagipula mikromanipulator sangat mahal (Waluyo, 2005).

5. Dengan Inokulasi HewanMetode ini didasarkan atas suatu kenyataan, bahwa tidak semua bakteri dapattumbuh di dalam tubuh seekor hewan. Misal kita ambil dahak dari seseorang yangdisangka menderita tbc. Jika dahak ini disuntikkan ke dalam tubuh tikus putih, makabakteri – bakteri _aprobe yang ikut serta itu tidak akan bertahan, sehingga kemudian kitaperoleh semata – mata hasil tbc saja. Piaraan pneumococcus murni dapat diperoleh denganjalan demikian juga. Bakteri yang ketinggalan dalam tubuh tikus yang sakit atau matiakhirnya dapat dipindahkan ke dalam medium yang sesuai.Inokulasi dapat dilakukan di dalam kulit ( intracutaneous ), dapat di bawah kulit( subcutaneous), dapat di dalam otot ( intramuscular), dapat di rongga tubuh atau lain-laintempat lagi (Waluyo, 2005).2.7 Teknik AseptikSebelum benar-benar dilakukan proses kultur mikroorganisme, pertama kali kitaharus mempertimbangkan bagaimana agar tidak terjadi kontaminasi. Mikroorganisme adadimana-mana. Karena ukurannya yang sangat kecil, mereka mudah lepas dalam udara danpermukaan. Maka dari itu, kita harus mensterilisasikan medium kultur secepatnya setelahpreparasi untuk pemindahan mikroorganisme siap dikontaminasikan, ini biasanya terbunuh.Bagaimanapun, itu sama pentingnya untuk tindakan pencegahan sampai penangananberikutnya mediun kultur harus tetap steril. Demikian materi yang lain yang akan kontakjuga harus tetap terjaga kesterilannya (Cappuccino, 1983).Teknik yang digunakan dalam pencegahan kontaminasi hingga kultur manipulasidan media kultur steril disebut teknik aseptik. Keunggulan itu dibutuhkan keberhasilandalam laboratorium mikrobiologi, dan salah satu cara belajar dengan pendampingmikrobilogi. Kontaminasi udara paling sering menjadi masalah karena udara selalu kontakdengan partikel debu dan umumnya banyak komunitas mikroorganisme didalamnya.Ketika wadah dibuka maka segera ditangani agar tidak terkontaminasi dengan udara sekitar.Transfer aseptik pada kultur dari salah satu medium ke medium yang lain harus lihaidengan loop inokulasi atau jarum harus disterilkan oleh pembakaran pada nyala api. Dalam

pertumbuhan kultur dibutuhkan tempat yang mudah dipindahkan ke permukaan agar datar,dimana pertumbuhan suatu koloni berasal dari pertumbuhan dan pembelahan sel tunggal(Cappuccino, 1983).Gambar 2. Teknik Aseptik2.8 Escherichia coliMenurut Kenneath tahun (2008), Escherichia coli termasuk dalam familiEnterobacteraceae yang termasuk gram negatif dan berbentuk batang yang fermentatif. E.coli hidup dalam jumlah besar di dalam usus manusia, yaitu membantu sistem pencernaanmanusia dan melindunginya dari bakteri patogen. Akan tetapi pada strain baru dari E.colimerupakan patogen berbahaya yang menyebabkan penyakit diare dan sindrom diarelanjutan serta hemolitik uremic (hus). Peranan yang mengguntungkan adalah dapatdijadikan percobaan limbah di air, indikator pada level pencemaran air serta mendeteksipatogen pada feses manusia yang disebabkan oleh Salmonella typhi. (Mikrolibrary, 2008).KlasifikasiKingdom : BakteriaFilum : ProteobacteriaKelas : Gamma ProteobacteriaOrder : EnterobacterialesFamili : EnterobacteriaceaeGenus : EscheriachiaSpesies : E. coliEscherichia coli biasanya hidup di dalam intestinum pada manusia ataupun hewan,memiliki gram negative, dan fakultatif anaerob. Merupakan makhluk prokariot. Padakondisi tertentu bisa menjadi pathogen atau dapat menyebabkan penyakit. Dan bakteri inijuga dapat menyebabkan keracunan makanan, dan yang paling sering adalah dapatmenyebabkan diare serta beberapa penyakit yang sejenis (Anonim, 2008).Escherichia coli memproduksi racun yang berbahaya di lapisan intestinum. Bilaterjadi desakan pada intestinum maka akan menghasilkan racun tersebut untukmenkontaminasi daging dan susu. Escherichia coli merupakan mikroorganisme normalyang berasal dari kotoran hewan atau manusia baik dalam kondisi sehat maupun sakit.Oleh karena itu, dikenal juga dengan istilah koli tinja. Morfologi sel bakteri Escherechia

coli berupa batang pendek (0,5-1,0 X 1,0-3,0 μm), serta motil (sel-selnya peritrikus, yaituflagela secara merata tersebar diseluruh permukaan sel) dan ada juga yang non motil. Ciriciribiokimiawinya adalah banyak sekali terjadi perubahan pada substrat. Keterangan inimemberikan cara-cara dasar untuk membedakannya dengan yang lain. Habitatnya padalingkungan aquatik, tanah, makanan, air seni dan tinja (Pelczar, 1986).BAB IIIMETODOLOGI3.1 Alat dan Bahan3.1.1 AlatAlat yang dipergukan dalam percobaan ini adalah jarum ose, tabung reaksi, lampuspiritus, penangas air, cawan Petri, dan inkubator.3.1.2 BahanBahan yang dipergunakan daalm praktikum ini yaitu kapas lemak dan media agaryanng telah disterilkan.3.2 Cara kerja3.2.1 Metode Gores (Streak Plate Method) pada Media Agar Miring- Ditulis nama spesies mikroorganisme, tanggal serta nama praktikan ditulispada tabung reaksi.- Biakan induk dalam tabung reaksi dan media agar miring yang telahdisterilkan diletakkan pada telapak tangan kiri.- Dipanaskan jarum ose pada nyala api lampu spiritus hingga membara.- Dibuka sumbat kapas pada biakan induk dengan jari manis dan kelingking.- Disumbat kapas pada biakan induk ditutup.- Disumbat kapas media agar miring yang akan diinokulasi mikroorganismedibuka dengan cara yang sama dengan langkah 4. Kemudian ujung jarumose yang sudah mengandung mikroorganisme digeserkan dengan hati-hatidi atas permukaan agar, dimulai dari dasar tabung secara zig-zag menujuke bagian atas tabung.- Disumbat kapas ditutup secepatnya pada media yang telah diinokulasi.dipanaskan ujung jarum ose kembali sampai membara untukmemusnahkan mikroorganisme yang masih menempel.- Disimpan biakan yang baru diinokulasi dalam inkubator. Diamati,digambar dan diberi keterangan pertumbuhan koloni bakteri.HasilTabung Reaksi3.2.2 Metode Gores (Streak Plate Method) pada Media Agar Datar- Ditulis nama spesies mikroorganisme, tanggal serta nama praktikan padacawan petri.- Biakan induk dalam tabung reaksi diletakkan pada telapak tangan kiri.- Dipanaskan jarum ose pada nyala api lampu spiritus hingga membara.- Dibuka sumbat kapas pada biakan induk dengan jari manis dan kelingking.- Disumbat kapas pada biakan induk ditutup.

- Dipanaskan pinggiran cawan petri untuk proses sterilisasi cawan petri- Dibuka sedikit tutup cawan petri dengan tetap melakukannya di dekat apibunsen.- Digeserkan ujung jarum ose yang sudah mengandung mikroorganismedengan hati-hati di atas permukaan agar, dimulai dari atas permukaansecara zig-zag menuju ke bagian bawah (goresan T dan kuadran).- Ditutup secepatnya pada media cawan petri yang telah diinokulasi.dipanaskan ujung jarum ose kembali sampai membara untukmemusnahkan mikroorganisme yang masih menempel.- Disimpan biakan yang baru diinokulasi dalam inkubator. Diamati,digambar dan diberi keterangan pertumbuhan koloni bakteri.HasilTabung Reaksi3.2.3 Metode taburan (Pour Plate Method)- Dicairkan medium bakteri di atas penagas air dan didinginkan sampaisuhu 50C.- Dituangkan ke dalam cawan petri secara aseptic dan dibiarkan sampaipadat.- Diencerkan susupensi bahan yang mengandung mikroorganisme seencermungkin dan diteteskan secara aseptic.- Diratakan dengan digoyang seperti angka delapan.- Ditutup cawan petri dan diberi label, kemudian diinkubasi dalam keadaanterbalik dalam incubator selama 24-48 jam masa inkubasiMedium BiakanHasilBAB IVHASIL DAN PEMBAHASAN4.1. Hasil Pengamatan4.1.1. Inokulasi dengan Metode Gores (Medium Agar Datar)No. Perlakuan Pengamatan1. Disiapkan media biakan induk darijenis mikroorganisme :Bakteri : Escherichia coli- Diberikan pada 2 sampel medium,menggunakan goresan kuadran dangoresan T- Pada medium biakan induk, kolonibakteri tampak berwarna putih2. Medium NA pada tabung reaksi yangtelah disterilkan, dipanaskan di ataskompor listrik selama 10-15 menit- Medium berwarna beningkekuningan- Pemanasan bertujuan untukmencairkan media sehingga dapatdituangkan untuk media agar datarpada cawan petri3.

Disediakan dua buah cawan petri dansekeliling pinggirnya dipanaskan dekatapi bunsen- berfungsi untuk mensterilisasi cawanpetri dari kontaminanmikroorganisme yang lain4. Dituangkan Medium NA panas kedalam cawan petri steril- berfungsi sebagai tempatmenggoreskan bakteri dan tempatpertumbuhan koloni bakteri5. Didiamkan selama beberapa menitcawan petri yang telah diberi mediumNA panas- berfungsi agar medium NA menjadipadat seperti agar6. Di panaskan jarum ose hinggamembara- berfungsi untuk mensterilisasi jarumsehingga tidak ada mikroorganismelain yang menempel disana.7. Dibuka sumbat kapas tabung reaksiyang berisi isolat biakan induk,kemudian dipanaskan bibir tabung- berfungsi untuk mensterilisasi tabungdan biakan dari mikroorganisme lain8. Dimasukkan jarum ose bulat padamedium biakan induk jarum ose untukinokulasi bakteripengambilan inokulum denganmenggoreskan ujung bulat pada jarum kemedia biakan induk, memungkinkanbakteri dapat terambil banyak9. Dipanaskan mulut tabung reaksi yangberisi isolat biakan induk, kemudiansegera ditutup dengan sumbat kapas- berfungsi untuk mensterilisasi tabungdan biakan dari mikroorganisme lain10. Setiap perlakuan di usahakan dilakukansecara aseptis (di dekat api bunsen)- berfungsi agar saat inokulasi, bahanserta alat gelas yang digunakan tetapsteril11. Digoreskan inokulum di permukaanmedia agar di dalam cawan petri yangtelah disediakan menggunakan metodegores mulai dari sisi samping secaramerata. Metode gores yang dipakai

meode T dan kuadran- Media agar untuk bakteri digunakanmedia NA (Nutrien Agar), fungsipenggunaan medium NA karenakomposisinya yang terdiri dariekstrak daging sapi didalamnya yangmengandung protein, karbohidrat,vitamin, dan sedikit lemak, jugaterdapat adanya faktor pertumbuhanyang tidak mampu disintesismikroorganisme- Agar koloni yang terbentuk tersebarmerata, tampak jelas dan tidakbertumpukan12. Ditutup cawan petri dan dipanaskankembali sekeliling cawan petri dandiisolasi dengan selotip bening- berfungsi untuk mensterilisasi cawanpetri dan biakan darimikroorganisme lain13. Inokulum cawan petri diinkubasi diinkubator pada suhu 370C- sebagai tempat penyimpanan sterilcawan petri dengan menyeting suhuoptimum bakteri untuk tumbuh14. Disimpan inokulum ke dalam inkubatordengan posisi terbalik, diamati dandifoto bentuk koloni yang terbentuksetelah diinkubasi selama 2 x 24 jamdan 4 x 24 jamPosisi cawan petri terbalik untukmenghindari uap air hasil metabolismebakteri akan menetes dari tutup cawanke permukaan media. Hal ini akanmenghasilkan suatu masa pertumbuhanyang menganak sungai danmenghancurkan pembentukan kolonisecara individu. Sehingga untukmenghindari hal ini, maka ketikadiinkubasi, bagian bawah cawan petridiletakkan di atas atau terbalik15. Setelah diinkubasi selama 2x 24 jama. Sampel 1:b. Sample 2:- tidak terbentuk koloni bakteri karenatidak nampak goresan putih menyebar- tidak terbentuk koloni bakteri karenatidak nampak goresan putih menyebar

16. Setelah diinkubasi selama 4x 24 jama. Sampel 1:b. Sampel 2:- belum terbentuk koloni bakteridengan jumlah lebih banyak karenabelum terdapat goresan yangnampak jelas- belum terbentuk koloni bakteridengan jumlah lebih banyak karenabelum terdapat goresan yangnampak jelas4.1.2 Inokulasi dengan Metode Gores (Medium Agar Miring)No. Perlakuan Pengamatan1. Disiapkan media biakan induk darijenis mikroorganisme :Bakteri : Escherichia coli- Masing-masing biakan induk berada ditabung reaksi yang berisi media agarmiring yang berwarna kuning- Pada medium biakan induk kolonibakteri tampak berwarna putih- Diberikan pada 3 sampel media2.Disediakan tiga buah tabung reaksisteril berisi medium agar padat- Medium agar miring berwarnakekuningan- berfungsi sebagai tempatmenggoreskan bakteri maupun jamurdan tempat pertumbuhan kolonibakteri maupun jamur3. Di panaskan jarum ose hinggamembara- berfungsi untuk mensterilisasi jarumsebelum digunakan darimikroorganisme lain4. Dibuka sumbat kapas tabung reaksiyang berisi isolat biakan induk,kemudian dipanaskan bibir tabung- berfungsi untuk mensterilisasi tabungdan biakan dari mikroorganisme lain5. Dimasukkan jarum ose bulat padamedium biakan induk untuk inokulasibakteri- pengambilan inokulum denganmenggoreskan ujung bulat pada jarumke media biakan induk,memungkinkan bakteri dapat terambil

banyak6. Dipanaskan mulut tabung reaksi yangberisi isolat biakan induk, kemudiansegera ditutup dengan sumbat kapas- berfungsi untuk mensterilisasi tabungdan biakan dari mikroorganisme lain7. Setiap perlakuan di usahakan dilakuansecara aseptis (di dekat api bunsen)- berfungsi agar saat inokulasi, bahanserta alat gelas yang digunakan tetapsteril5. Digoreskan inokulum di permukaanmedia agar di dalam tabung reksi yangtelah disediakan menggunakan metodegores mulai dari sisi samping arah zig– zag secara merata- Media agar untuk bakteri digunakanmedia NA (Nutrien Agar), fungsipenggunaan medium NA karenakomposisinya yang terdiri dari ekstrakdaging sapi di dalamnya yangmengandung protein, karbohidrat,vitamin, dan sedikit lemak, jugaterdapat adanya faktor pertumbuhanyang tidak mampu disintesismikroorganisme- Digunakan arah zig – zag agarmemungkinkan koloni yang terbentuktersebar merata, tampak jelas dan tidakbertumpukan6. Dipanas di sekeliling mulut tabungdan segera ditutup dengan sumbatkapas- berfungsi untuk mensterilisasi tabungreaksi dan biakan dari mikroorganismelain7. Disimpan inokulum ke dalaminkubator pada suhu 370C , diamatidan difoto bentuk koloni yangterbentuk setelah diinkubasi selama 2x24 jam dan 4 x 24 jam- sebagai tempat penyimpanan sterilcawan petri dengan menyeting suhuoptimun bakteri untuk tumbuh8. Setelah diinkubasi selama 1x 24 jama. Sampel 1:b. Sampel 2:c. Sampel 3:

- Terbentuk koloni bakteri denganjumlah yang tidak dapat dihitung,terdapat goresan putih menyebar yangnampak jelas.- Koloni terbentuk dengan goresan putihzig-zag agak menyebar- Koloni terbentuk dengan goresan putihzig-zag agak menyebar9. Setelah diinkubasi selama 4x 24 jama. Sampel 1:b. Sampel 2:- Terbentuk koloni bakteri dengan jumlahlebih banyak dan sebagian dapatdihitung, terdapat goresan putihmenyebar yang nampak jelas- Koloni terbentuk dengan goresan putihzig-zag agak menyebarc. Sampel 3:- Koloni terbentuk dengan goresan putihzig-zag agak menyebar4.2. PembahasanPada percobaan ini dilakukan inokulasi bakteri Escherichia coli pada medium agardatar dan medium agar miring.4.2.1. Inokulasi dengan Metode Gores (Medium Agar Datar)Pada penggunaan metode gores dengan medium agar datar, mula –mula disiapkanmedia biakan induk dari jenis mikroorganisme bakteri Escherichia coli.Escherichia coli, atau biasa disingkat E. coli, adalah salah satu jenis spesies utamabakteri gram negatif. E. coli banyak digunakan dalam teknologi rekayasa genetika. Biasadigunakan sebagai vektor untuk menyisipkan gen-gen tertentu yang diinginkan untukdikembangkan. E. coli dipilih karena pertumbuhannya sangat cepat dan mudah dalampenanganannya.Biakan induk berada di tabung reaksi yang berisi media agar miring berwarnakuning. Pada medium biakan induk, koloni bakteri tampak berwarna putih. Disediakansebuah cawan petri steril berisi medium agar padat (medium agar yang sebelumnya telahdipanaskan, dituagkan pada cawan petri steril, kemudian didiamkan untuk proespendingina). Medium agar datar ini berwarna kekuningan, berfungsi sebagai tempatmenggoreskan bakteri dan tempat pertumbuhan koloni bakteri. Selanjutnya dipanaskan

jarum ose hingga membara, berfungsi untuk mensterilisasi jarum sebelum digunakan darimikroorganisme lain. Sumbat kapas tabung reaksi yang berisi isolat biakan induk dibuka,kemudian dipanaskan bibir tabung, berfungsi untuk mensterilisasi tabung dan biakan darimikroorganisme lain. Kemudian dimasukkan jarum ose pada medium biakan induk dimanayang digunakan adalah jarum ose bentuk bulat, pengambilan inokulum denganmenggoreskan ujung bulat pada jarum ke media biakan induk, memungkinkan bakteridapat terambil banyak. Dipanaskan mulut tabung reaksi yang berisi isolat biakan induk,berfungsi untuk mensterilisasi tabung dan biakan dari mikroorganisme udara lain. Setelahitu tabung reaksi segera ditutup dengan sumbat kapas. Digunakan sumbat kapas disinikarena sifatnya yang dapat menyerap uap air, yang terjadi ketika masa inkubasi. Setiapperlakuan diusahakan dilakukan secara aseptis (di dekat api bunsen) berfungsi agar saatinokulasi, tidak ada mikroorganisme kontam. Sebelum inokulasi juga terlebih dahulu harusdiusahakan agar semua alat-alat yang digunakan dan medium benar-benar steril. Hal iniuntuk menghindari kontaminasi yaitu masuknya mikroorganisme yang tidak diinginkan.Gambar 3. Metode Inokulasi pada Cawan PetriSelanjutnya digoreskan inokulum di permukaan media agar di dalam cawan petriyang telah disediakan dengan menggunakan metode gores mulai dari sisi samping secaramerata.Media agar untuk bakteri digunakan media NA (Nutrien Agar), fungsi penggunaanmedium NA karena komposisinya yang terdiri dari ekstrak daging sapi didalamnya yangmengandung protein, karbohidrat, vitamin, dan sedikit lemak, juga terdapat adanya faktorpertumbuhan yang tidak mampu disintesis mikroorganisme. Ditutup cawan petri, dipanasdi sekeliling cawan petri dan diisolasi dengan selotip bening. Perlakuan ini berfungsiuntuk mensterilisasi cawan petri dari mikroorganisme lain. Disimpan inokulum ke dalaminkubator dengan posisi terbalik, diamati dan difoto bentuk koloni yang terbentuk setelah

diinkubasi selama 2x 24 jam dan 4 x 24 jam. Posisi cawan petri diletakkan terbalik karenaselama inkubasi terbentuk air yang mengembun di dalam cawan petri. Air akan menetesdari tutup cawan ke permukaan. Hal ini akan menghasilkan suatu masa pertumbuhan yangmenganak sungai dan menghancurkan pembentukan koloni secara individu. Untukmenghindari hal ini, maka ketika diinkubasi, bagian bawah cawan petri diletakkan di atasatau terbalik .Penggoresan inokulum pada media agar dilakukan untuk dua sampel. Sampelpertama menggunakan goresan kuadran dan sampel ke 2 goresan T.Gambar 4. Metode Gores pada Cawan PetriDari hasil pengamatan 2 x 24 jam dapat dilihat tidak terbentuknya koloni bakteridengan tidak adanya goresan putih meyebar zig-zag pada permukaan medium NA, dengankata lain bakteri belum tumbuh pada jangka waktu ini.Setelah diinkubasi selama 4x 24 jam koloni Escherichia coli masih juga belumterbentuk, belum terlihat adanya streak putih zig-zag menyebar.Berikut gambar perbandingan antara koloni bakteri Escherichia coli yang terbentukdari sumber referensi dibandingkan dengan hasil pengamatan :-Terbentuk koloni (Anonim, 2008) -Hasil pengamatan 96 jam (tidak terbentuk koloni)Goresan Kuadran Goresan TDari hasil pengamatan, pada kedua perlakuan dengan waktu yang berbeda, tidakditemukan koloni yang terbentuk. Tidak terbentuk koloni bakteri bisa disebabkan adanyabahan kontaminan yang masuk saat inokulasi, penggunaan jarum ose belum benar – benarsteril / belum tersterilisasi secara keseluruhan.Metode gores yang dilakukan pada percobaan ini dengan menggunakan cawan petri.Cawan petri ini berfungsi berfungsi sebagai tempat madium agar datar untuk penanamanmikroorganisme dan tempat isolasi. Keuntungan penggunaan cawan petri adalah untukmemperoleh biakan dengan jumlah yang banyak dan lebih mudah untuk melihat morfologibiakan.Medium yang digunakan adalah Nutrient Agar yang sebelumnya dipanaskan agarbisa membentuk medium. Agar lalu didinginkan dalam tabung reaksi hingga memadat danberwarna kuning muda sehinnga membentuk agar tegak. Medium agar tegak adalah

medium yang dibuat dalam tabung reaksi yang diletakkan tegak pada waktu pendinginan.Keuntungan dari media agar tegak ini adalah luas permukaan besar sehingga memudahkanuntuk identifikasi sedangkan kerugiannya adalah peluang kontaminasi yang besar karenaluas permukaan yang lebar.4.2.2. Inokulasi dengan Metode Gores (Medium Agar Miring)Untuk penggunaan metode gores dengan medium agar miring, mula-mula disiapkanmedia biakan induk dari jenis mikroorganisme bakteri Escherichia coli. Biakan indukberada di tabung reaksi yang berisi media agar miring yang berwarna kuning. Padamedium biakan induk, koloni tampak berupa sebaran/suspensi putih pada permukaan atasmedia. Disediakan tiga buah tabung reaksi steril berisi medium agar padat. Medium agarmiring berwarna kekuningan berfungsi sebagai tempat menggoreskan jamur dan tempatpertumbuhan koloni jamur. Jarum ose dipanaskan hingga membara berfungsi untukmensterilisasi jarum sebelum digunakan dari mikroorganisme lain. Sumbat kapas tabungreaksi yang berisi isolat biakan induk dibuka, kemudian bibir tabung dipanaskan berfungsiuntuk mensterilisasi tabung dan biakan dari mikroorganisme lain.Setelah itu, jarum ose dimasukkan pada medium biakan induk. Jarum ose bentukbulat untuk inokulasi bakteri. Pengambilan inokulum dengan menggoreskan ujung bulatjarum ke media biakan induk, memungkinkan bakteri dapat terambil banyak. Muluttabung reaksi yang berisi isolat biakan induk dipanaskan kembali, berfungsi untukmensterilisasi tabung dan biakan dari mikroorganisme lain. Kemudian segera ditutupdengan sumbat kapas Sumbat kapas lemak bertujuan agar keadaan mikroorganisme didalam tabung reaksi tetap steril, apabila ada kontaminan yang akan masuk, maka dapatterserap dengan sumbat kapas tanpa dapat mempengaruhi mikroorganisme yang akandibiakkan.Gambar 5. Teknik Inokulasi pada Media MiringSetiap perlakuan diusahakan dilakukan secara aseptis (di dekat api bunsen)berfungsi agar saat inokulasi, bahan serta alat gelas yang digunakan tetap steril. Inokulum

digoreskan di permukaan media agar miring di dalam tabung reksi yang telah disediakanmenggunakan metode gores mulai dari sisi samping arah zig-zag. Arah zig-zag digunakansupaya memungkinkan koloni yang terbentuk tersebar merata dan tampak jelas serta tidakbertumpuk dari koloni yang akan terbentuk. Dipanas di sekeliling mulut tabung dansegera ditutup dengan sumbat kapas berfungsi untuk mensterilisasi tabung reaksi danbiakan dari mikroorganisme lain. Inokulum disimpan ke dalam inkubator agar mediumdapat tumbuh pada wadah yang steril dengan menyeting suhu 370C sebagai suhu optimunbakteri untuk tumbuh, kemudian diamati dan difoto bentuk koloni yang terbentuk setelahdiinkubasi selama 2x 24 jam dan 4 x 24 jam. Berikut gambar perbandingan antara kolonibakteri Escherichia coli yang terbentuk dari sumber lain dengan hasil pengamatan-Terbentuk koloni (Anonim, 2008) -Hasil pengamatan 96 jam (terbentuk koloni)Dari hasil pengamatan dapat dilihat mulai terbentuknya satu koloni bakteri danterdapat goresan yang nampak samar. Pada suatu percobaan pada umumnya bentuk koloniyang terbentuk di medium agar miring adalah berwarna putih (dilihat dari tiga sampel yangdiamati).Medium yang digunakan adalah larutan Nutrient Agar yang sebelumnyadipanaskan agar bisa membentuk medium miring yang didinginkan hingga memadatdengan memiringkan tabung reaksi sehinnga membentuk agar miring dan berwarna kuningmuda. Medium agar miring adalah medium yang dibuat dalam tabung reaksi yangdiletakkan miring pada waktu pendinginan.Keuntungan media agar miring ini yaitu luas permukaan yang kecil sehinggapeluang kontaminasi rendah dan dapat memperluas bidang untuk digunakan strain murni(indukan murni). Sedangkan kerugiannya hanya memuat sedikit mikroorganisme.Media agar untuk bakteri digunakan media NA (Nutrien Agar) karenakomposisinya yang terdiri dari ekstrak daging sapi di dalamnya yang mengandung protein,karbohidrat, vitamin, dan sedikit lemak, juga terdapat adanya faktor pertumbuhan yangtidak mampu disintesis mikroorganisme. Medium NA berfungsi untuk membiakkan

berbagai macam mikroorganisme serta kultur bakteri. Medium NA dibuat atau disediakanuntuk medium bagi bakteri. Sedangkan medium NA yang instant merupakan media nonsintetik karena menggunakan bahan yang terdapat di alam biasanya tidak diketahuikandungannya secara rinci. Struktur protein besar dan relatif insolubel yang mana hanyasebagian kecil bakteri saja yang dapat langsung menggunakannnya, tetapi enzim yangdisebut pepton dapat mengurai protein menjadi rantai yang lebih kecil yang disebut pepton.Bagian kecil dan solubel ini dapat dicerna oleh sebagian besar bakteri. Medium inimemiliki komposisi kimia tertentu antara lain OXOID CMD003 Nutrient Agar, typcalformula (g/l) yaitu :Lab-lemco powder 1.0, Yeast extract 2.0 (yang berfungsi sebagaifermentor), Pepton 5.0 (sebagai sumber protein), Sodium Chlorida 5.0 (sebagai sumberunsure S dan sumber garam mineral), Agar 15.0 (sebagai pemadat), Akuades1000 ml, Ekstrak daging sapi : 3 gr, NaCl : 8 gr.Pada praktikum ini kita mempelajari bagaimana melakukan teknik inokulasi biakanmikroorganisme pada medium steril. Sehingga setelah melakukan serangkaian acarapraktikum ini dapat didefinisikan bahwa teknik inokulasi adalah pekerjaan memindahkanbakteri dari medium lama ke medium baru dengan tingkat ketelitian sangat tinggi dandituntut sekali bekerja secara aseptik yaitu bebas dari pengaruh kontaminanmikroorganisme pengganggu yang lain. Teknik aseptik dilakukan dengan penyediaan alatalatkerja yang steril dan bekerja di dekat api bunsen agar terhindar dari kontaminan udara.Pada waktu inokulasi, jarum yang digunakan untuk memindahkan mikroba harusdipijarkan di atas api segera sebelum dan sesudah melakukan pemindahan. Pemanasan inimenghancurkan semua bentuk kehidupan yang ada pada permukaan jarum atau alatpemindahan. Setelah diinokulasi, biakan bakteri disimpan atau diinkubasi dalamlingkungan yang sesuai untuk pertumbuhan. Kumpulan dari sel-sel anakan akan tampakdengan mata telanjang sebagai suatu kekeruhan dalam media cair atau populasi yangterpisah yang disebut koloni pada media padat.4.2.4 Esherichia coli

Escherichia coli adalah bakteri yang hidup dalam saluran usus manusia dan hewanberdarah panas tetapi tidak pada ikan. Beberapa penelitian terdahulu menemukan bahwa92,9 % Escherichia coli yang mencemari bahan makanan berasal dari tinja manusia.Sehingga keberadaannya pada bahan makanan atau ikan segar menunjukkan adanyaancaman kesehatan pada konsumen (manusia), sebab dapat diartikan bahwa bahanmakanan atau ikan telah tercemar oleh tinja manusia. Oleh karenanya maka, Escherichiacoli dipakai sebagai indikator cemaran yang berbahaya bagi manusia (Buckle, dkk. 1990).Klasifikasi :Superdomain:PhylogeneticaFilum:ProteobacteriaKelas:GammaProteobacteriaOrdo:EnterobacterialesFamili:EnterobacteriaceaeGenus:EscherichiaSpesies: E. coli(Wikipedia, 2008)Escherichia coli merupakan mikroorganisme normal yang berasal dari kotoranhewan atau manusia baik dalam kondisi sehat maupun sakit. Oleh karena itu, dikenal jugadengan istilah koli tinja. Morfologi sel bakteri Escherechia coli berupa batang pendek (0,5-1,0 X 1,0-3,0 μm), serta motil (sel-selnya peritrikus, yaitu flagela secara merata tersebardiseluruh permukaan sel) dan ada juga yang non motil. Ciri-ciri biokimiawinya adalahbanyak sekali terjadi perubahan pada substrat. Keterangan ini memberikan cara-cara dasaruntuk membedakannya dengan yang lain. Habitatnya pada lingkungan aquatik, tanah,makanan, air seni dan tinja (Pelczar, 1986).Pada jurnal imiah analisa bakteri kloriform jenis E.coli pada air minum dilakukantes pelengkap menggunakan metode medium agar miring NA dengan jarum inokulasisecara aseptik. Diinkubasi pada suhu 370C selama 1 x 24 jam. Bila hasilnya positifterbentuk asam dan gas pada kaldu laktosa, maka sampel positif mengandung bakteriEscherichia coli. Berdasarkan media agar miring NA, dibuat pewarnaan Gram dimanabakteri Escherichia coli menunjukkan Gram negatif berbentuk batang pendek. Untuk

membedakan bakteri golongan koli dari bakteri golongan coli fekal (berasal dari tinjahewan berdarah panas), pekerjaan dibuat Duplo, dimana satu seri diinkubasi pada suhu370C (untuk golongan koli ) dan satu seri diinkubasi pada suhu 420C (untuk golongan kolifekal). Bakteri golongan koli tidak dapat tumbuh dengan baik pada suhu 420C, sedangkangolongan koli fekal dapat tumbuh dengan baik pada suhu 420C (Widiyanti et al, 2004).BAB VKESIMPULANBerdasarkan praktikum yang telah dilakukan maka dapat diperoleh kesimpulanbahwa teknik inokulasi merupakan teknik pemindahan bakteri ke dalam media denganperlakuan khusus untuk mempertahankan kemurnian biakan bakteri. Teknik inokulasidapat dilakukan dengan metode gores pada agar datar (streak plate method) dan metodegores pada agar miring (streak plate method). Proses inokulasi harus benar-benar aseptikatau steril supaya tidak terjadi kontaminasi oleh mikroorganisme lain. Pada hasilpengamatan metode gores agar miring terlihat adanya garis zig-zag putih menyebar yangmenandakan koloni bakteri E.coli biakan tumbuh. Sedangkan pada metode gores agar datartidak ditemukan garis zig-zag putih yang menandakan belum tumbuhnya koloni bakteriE.coli dan hal ini dapat dikarenakan oleh beberapa faktor penentu.DAFTAR PUSTAKAAnonim, 2008. www.google.com.images diakses pada tanggal 10 Nopember 2008 pukul13.40 WIBAnonim, 2008. www.wikipedia.com diakses pada tanggal 10 Nopember 2008 pukul 13.40WIBBuckle,K.A., J.A. Davey, M.J. Eyles, A.D. Hocking, K.G. Newton, and E.J. Stuttard.1989. Foodborne Microorganisms of Public Health Significance. 4ed.. AIFST(NSW Branch).Australia.Cappuccino, J.G and N.Sherman. 1983. Microbiology: a Laboratory Manual. Adison-Wesley Publishing company: CaliforniaDwidjoseputro, D. 1998. Dasar-Dasar Mikrobiologi. Djambatan : Malang.Pelczar, M.1986. Dasar-Dasar Mikrobiologi I. Erlangga : Jakarta.Rohimat, I. 2002. Teknik Inokulasi Mycorrhizae arbuscular pada Bibit Jambu Mente.Buletin Teknik Pertanian Vol.7 Nomor 2. Hal : 80-83.Waluyo, L. 2005. Mikrobiologi Umum. MM Press: Malang.

Winarni, D. 1997. Diktat Teknik Fermentasi. Program Studi D3 Teknik Kimia FTI-ITS :Surabaya.Widiyanti, Ni Luh Putu Manik, Ni Putu Ristianti. Analisis Kualitatif Bakteri KoliformPada Depo Air Minum Isi Ulang Di Kota Singaraja Bali. Jurnal EkologiKesehatan Vol 3 No 1, April 2004 : 64 - 73LAMPIRANDiskusi:1. Mengapa pada saat dilakukan inokulasi bakteri pada media agar miring dimulaidari dasar tabung menuju ke bagian atas tabung secara zig-zag?2. Mengapa biakan yang baru diinokulasi harus disimpan dalam inkubator dalam suhutertentu?Jawaban:1. Supaya pertumbuhan bakteri tersebar pada seluruh bagian permukaan media dandilakukan secara zig-zag supaya pertumbuhan bakteri semakin banyak karenapenggoresan juga semakin banyak dan terjadi degradasi, pada akhir goresan akansemakin jarang dan tampak bentukan koloninya.2. Supaya biakan bakteri dapat tumbuh secara optimal sesuai dengan suhu yangdibutuhkan. Karena tiap jenis bakteri membutuhkan suhu yang berbeda-beda dalampertumbuhannya, ada yang 1800C ada pula yang kurang dari 1000C.