Embed Size (px)
Citation preview
Tujuan SDS Elektroforesis
memisahkan dan melihat profile dari molekul protein dengan menggunakan perbedaan tegangan listrik. Sebetulnya gel elektrophoresis bisa juga diaplikasikan pada DNA dan RNA. Namun khusus untuk protein, sedikit dilakukan modifikasi dengan menggunakan detergent seperti SDS. Oleh karena itu maka tehnik ini disebut SDS-page elektrophoresis
Protein
Protein (asal kata protos dari bahasa Yunani yang berarti "yang paling utama") adalah senyawa organik kompleks berbobot molekul tinggi yang merupakan polimer dari monomer-monomer asam amino yang dihubungkan satu sama lain dengan ikatan peptida. Molekul protein mengandungkarbon, hidrogen, oksigen, nitrogen dan kadang kala sulfur serta fosfor. Protein berperan penting dalam struktur dan fungsi semua sel makhluk hidup dan virus.Kebanyakan protein merupakan enzim atau subunit enzim. Jenis protein lain berperan dalam fungsi struktural atau mekanis, seperti misalnya protein yang membentuk batang dan sendi sitoskeleton. Protein terlibat dalam sistem kekebalan (imun) sebagai antibodi, sistem kendali dalam bentukhormon, sebagai komponen penyimpanan (dalam biji) dan juga dalam transportasi hara. Sebagai salah satu sumber gizi, protein berperan sebagai sumber asam amino bagi organisme yang tidak mampu membentuk asam amino tersebut (heterotrof).Protein merupakan salah satu dari biomolekul raksasa, selain polisakarida, lipid, dan polinukleotida, yang merupakan penyusun utama makhluk hidup. Selain itu, protein merupakan salah satu molekulyang paling banyak diteliti dalam biokimia. Protein ditemukan oleh Jöns Jakob Berzelius pada tahun1838.
Struktur Protein
Di dalam sel, protein berada dalam bentuk 3 dimensional. Struktur primer protein merupakan sekuen sederhana dari asam amino. Asam amino ini dapat membentuk struktur umum seperti alpha heliks, akibat ikatan hidrogen. Struktur protein juga dapat lebih lanjut terpengaruhi oleh interaksi elektrostatik dan hidrofobik, sekaligus juga gaya yang lebih kuat seperti ikatan kovalen disulfide, ini dikenal dengan sebutan struktur tersier protein
Elektroforesis
Elektroforesis adalah teknik pemisahan komponen/molekul bermuatan berdasarkan perbedaan tingkat migrasinya dalam sebuah medan listrik (Westermeier, 2004). Kecepatan molekul yang bergerak pada medan listrik tergantung pada muatan, bentuk dan ukuran. Dengan demikian elektroforesis dapat digunakan untuk separasi makromolekul (seperti protein dan asam nukleat). Posisi molekul yang terseparasi pada gel dapat dideteksi dengan pewarnaan atau autoradiografi, atau pun dilakukan kuantifikasi dengan densitometer
Prinsip Kerja
SDS-PAGE atau kepanjangannya Sodium dodecyl sulfate – PolyAcrylamide Gel Electrophoresis, merupakan metode pemisahan protein beradasarkan bobot molekul (molecular weight/MW).SDS memecah area hidrofobik dan menyelimuti protein dengan muatan negatif. SDS meruapakan deterjen yang mengikat daerah hidrofobik dalam rasio konstan sekitar 1,4 g SDS per gram protein.Hasil akhirnya memiliki dua makna penting:1) semua protein hanya mengandung struktur primer2) semua protein memiliki muatan negatif yang berarti semua akan bermigrasi ke arah kutub positif ketika ditempatkan dalam medan listrik.Sebelum protein dimasukkan pada gel, diberikan suatu reduktor, mercaptoethanol berfungsi membantu dalam denaturasi protein dengan mengurangi ikatan disulfida.
Proses Kerja ElektroforesisGel yang telah siap kemudian diletakkan secara horizontal diatas kotak elektroforis yang telah berisi larutan penyangga elektroda. Proses ini dilakukan di dalam lemari pendingin dengan suhu 40C. Kedua sisi gel diberi spons yang telah dibasahi dengan larutan penyangga elektroda sebagai jembatan antara larutan penyangga elektroda dengan gel. Setelah itu gel ditutup dengan plastik dan di atas gel tersebut diberi gel yang dingin. Proses elekrofororsis dijalankan dengan memberi daya listrik pada gel. Pemberian daya listrik disesuaikan dengan sampel yang akan digunakan, misalnya sebesar 50-70 A, 50-60 A atau 45-55 A selama kurang lebih 3 jam. Setelah terlihat bahwa biru brom fenol mencapai titik yang berjarak ± 3 cm dari ujung gel, maka proses elekrofororsis dihentikan. Bagian gel yang tidak terpakai dipotong, sedangkan potongan gel yang menjadi tempat migrasi enzim diiris tipis secara horizontal dengan menggunakan gergaji yang berkawat tipis. Gel diiris menjadi beberapa lembar gel yang kemudian setiap lembar gel yang diletakkan dalam wadah plastik, untuk selanjutnya diwarnai sesuia enzim yang akan dianalisis.
2 Jenis Elektroforesis
Elektroforesis Horizontal : Elektroforesis yang menggunakan agar rus, gel party dengan konsentrasi 0.8%. Semakin tinggi persentase agar rus, maka semkain kecilpori – pori yang terbentuk, dan sebaliknya
Elektroforesis Vertikal : menggunakan gel alimati,tapi kalau sudah jadi akan menjadi gel poly aklimati elektroforesis.
Alat Dan Bahan
Cara Kerja
Ektraksi enzim Pembuatan gel Penempatan sample
Proses elektroforesis
Visisulasisasi enzim
Metode analisis Selesai
faktor mempengaruhi kecepatan migrasi dari molekul protein
Ukuran molekul protein
Medium penyangga
Kekuatan
voltase
Bufer
(penyangga)
Konsentrasi gel
