TEM - transmisní elektronová mikroskopielipovj/FoM/FoM_4.pdf · 3 MV transmisní elektronový mikroskop –poprvé „spatřen“ atom ! cca 2010 - Titan. Světelná vs. elektronová

TEM - transmisní elektronová mikroskopie

Elektronová mikroskopie

http://www.lbl.gov/MicroWorlds/ALSTool/EMSpec/EMSpec2.html

paprsek elektronů

• komplexní vynález 20. století:– 1897 J.J. Thompson - objev elektronu– 1925 Luis de Broglie - rychle letící částice mají i vlnový charakter– 1926 H. Busch - analogie vychylování paprsku elektronů pomocí

magnetických polí solenoidů a světla skleněnou čočkou

• 1930 M. Knoll + E. Ruska - první elektronový mikroskop (první publikace s obrázky 1932)

• 1938 M. von Ardenne - první skenovací elektronový mikroskop• 1939 firma Siemens - první komerční transmisní elektronový

mikroskop (zaručená rozlišovací schopnost 10 nm)• 1964 firma Cambridge Instruments - první komerční SEM• 1986 Nobelova cena E. Ruska

Elektronová mikroskopie

Knoll a Ruska

cca 1989

3 MV transmisní elektronový mikroskop – poprvé „spatřen“ atom !

cca 2010 - Titan

Světelná vs. elektronová mikroskopie

fluorescentní stínítko,

fotografický film, kamera

lidské oko, fotografický

film, kameraDetektor

vakuumvzduchVnitřní prostředí

magnetyskleněnéČočky

vysokonapěťové

wolframové vlákno(100kV)

wolframová, halogenová

lampaZdroj

2 000 000x2 000xMaximální

zvětšení

0.2nmcca. 200nmMaximální

rozlišení

elektrony

cca. 4nm

viditelné světlo

760nm – 390nm

Použitá

vizualizace

ELEKTRONOVÝ

MIKROSKOPSVĚTELNÝ MIKROSKOPVlastnost

přístroje pro zobrazení struktur neviditelných prostým okem

měděná mřížkapodložní sklíčkoPodložka

těžké kovybarvy rozpustné ve voděBarvení

mikrotom/ultramikrotom

50nm

ruční či mikrotom

20 000nmŘezy

pryskyřicevoskZalévání

např. OsO4např. alkoholFixace

dehydrované vzorky -

mrtvéživé i fixované preparátyVzorek

ELEKTRONOVÝ

MIKROSKOPSVĚTELNÝ MIKROSKOPVlastnost

Světelná vs. elektronová mikroskopie

Nevýhody elektronových mikroskopů

• extrémně drahé + prostorově náročné + drahý provoz a údržba• příprava vzorku velmi náročná - vzorek nutno pokrýt tenkou vrstvou kovu (např. zlata),

aby odrážel a rozptyloval elektrony• vzorek musí být absolutně dehydrovaný - nelze pozorovat živé vzorky• nelze pozorovat barvu, elektronový paprsek je monochromatický• empiricky náročné pro odlišení artefaktů• vzorek nevydrží dlouho, protože je vystaven silné iradiaci (energie elektronového

paprsku je velká)

subatomární částice s elementárním záporným nábojem

lze je urychlit elektrickým napětím U (dodání kinetické energie)

e - náboj elektronu (1,602x10-19 C)

U - urychlovací napětí (V)

m - hmotnost elektronu (9,109x10-31kg)

v - rychlost elektronu

Do vztahu lze za rychlost dosadit z rovnice de Broglieho, která popisuje vztah

mezi vlnovou a korpuskulární povahou hmotných částic:

λ - vlnová délka

h - Planckova konstanta (6,626x10-34 Js)

elektron

e.U=1/2.m.v2

𝝀 =𝒉

𝒎.𝒗

vlnová délka urychleného elektronu je nepřímo

závislá na použitém urychlovacím napětí.

Vlnová délka elektronu v závislosti na

urychlovacím napětí

U [V] lambda[nm] v[m/s]

102 0.123 5.95x106

103 0.040 1.87x107

104 0.0123 5.85x107

105 0.00386 1.65x108

106 0.00122 2.83x108

𝑣 =ℎ

𝑚. 𝜆

𝑒. 𝑈 =ℎ2

2.𝑚. 𝜆2

𝜆 =ℎ

2.𝑚. 𝑒. 𝑈

𝝀 =𝟏, 𝟐𝟐𝟔

𝑼

už známeR = 0,61 x λ/NA

rozlišovací schopnost

zdravé lidské oko při dostatečném osvětlení je schopno ve vzdálenosti 25 cm rozlišit dva body vzdálené od sebe 0,2 mm

optický mikroskop - jeho rozlišovací schopnost se během jeho vývoje posunula až na hodnotu menší než 0,2 μm

vlnová délka elektronu urychleného napětím 100 kV už teoreticky stačí na zobrazení atomu, běžné laboratorní transmisní elektronové mikroskopy v současné době mají rozlišovací schopnost v řádu desetin nm, která postačuje k pozorování např. větších bílkovinných makromolekul

hodně zhruba je mezní rozlišovací schopnost polovinou vlnové délky použitého záření

cesta elektronového svazku

celý tubus mikroskopu je evakuováncca 10-5 mbar- prodloužení střední volné

dráhy elektronů- zvýšení životnosti emitoru- snížení prašnosti

• elektronové dělo emituje elektrony

• urychlení elektronů elektrickým polem

• magnetické a elektrické pole použito na kontrolu cesty elektronů

elektronová tryska

K – katoda – hrot emitující elektronyA – extrakční anoda s kruhovým otvoremW– Wehneltův válec - elektroda pro zaostření a kontrolu elektronového paprskuX – křižiště

termoemisní elektronová tryska• katoda emitující elektrony (zdroj, dělo)• anoda s kruhovým otvorem – přitahuje elektrony a urychluje je do tubusu

x

Křižiště v mikroskopu slouží jako technický zdroj elektronů a jeho poloha se mění centrováním katody. Vzhledem k tvaru katody v případě termoemisní trysky, která se do křižiště promítá, má křižiště elipsovitý tvar. Čím je průmět vlákna v křižišti kruhovější, tím je zdroj elektronů bodovější a koherentnější.

• přirozená energetická bariéra brání elektronům v úniku

z materiálu

• zahřátím dodáme dostatečnou energii

• např. pro wolfram je úniková rychlost 1,26 x 106 m/s

• k zahřátí a následné termoemisi dojde při průchodu

elektrického proudu vláknem

• pravděpodobnost úniku elektronů lze zvýšit

vytvarováním vlákna do tvaru písmene V

základní požadavek na zdroj:

• koherentní svazek elektronů

• elektrony ze stejného bodového zdroje

• elektrony se stejnou energií

Nejčastěji wolfram, nikl nebo borid lanthanový

(vysoký bod tání, vyžadováno relativně nízké vakuum)

nebo

autoemisní tryska - studené wolframové vlákno odleptané

do hrotu

elektronová tryska

W

LaB6

parametry jednotlivých elektronových zdrojů

vlastnosti

žhavená

wolframová

katoda

žhavená

LaB6

katoda

autoemisní

tryska

průměr hrotu 200 µm 20 µm 0,1 µm

provozní teplota 2859 K 1850 K okolí

proud svazku 5x10-12 A 8x10-11 A 10-8 A

průměr svazku 9 mm 5 mm <1-2 nm/td>

požadované

vakuum10-5 mm Hg 10-7 mm Hg 10-10 mm Hg

životnost 35 h 250 h 1-2 roky

zdroj elektronů

• elektronové čočky - obdoba optických čoček, zaostření rovnoběžných paprsků do jedné roviny

• mohou operovat elektrostaticky nebo magnetickyo elektrostatické - Wehneltův váleco elektromagnetické - změna směru elektronů, zvětšení, zmenšení -

kondenzorové, objektivové, intermediální, projekční čočky• požadavek na radiální symetrii (jinak produkce aberací)• kondenzorové čočky - přenos elektronového paprsku z křižiště na preparát,

většinou dvěo první vytváří obraz křižiště - změnou její ohniskové vzdálenosti měníme

velikost obrazuo druhá zaostřuje obraz křižiště do roviny preparátu

• objektiv - nejvýkonnější čočka mikroskopu, největší zvětšení, nejkratší ohnisková vzdálenost. Cívka objektivu má velký počet závitů, kterými protéká značný proud. Aby nedošlo k jeho přehřátí, bývá chlazený vodou.

• obraz vyprodukovaný objektivovou čočkou se dále zvětšuje na požadovanou velikost pomocí projektivů a intermediálních čoček

• čočky často sdružovány – quadrupole, hexapole, octapole (např. stigmatory)

elektronové čočky

vady elektromagnetických čoček

obdobné vady jako u optických čočekdůvod, proč není dosaženo teoretického rozlišení (0,02 nm)sférická vada - neschopnost čočky zaostřovat všechny paprsky vycházející z bodového zdroje opět do jednoho bodu - důsledkem této vady je, že zvětšení v krajích obrazu je jiné než v jeho středu (poduškovitost, soudkovitost)osový astigmatismus - způsobený nesymetrií magnetického pole, většinou kvůli nečistotámchromatická vada - vzniká v důsledku rozdílných energií elektronů ve svazkupomalejší elektrony s větší vlnovou délkou jsou v magnetickém poli cívek vychylovány jinak a protínají osu cívky v jiném bodě, než elektrony s vyšší rychlostí

interakce elektronu s hmotou

interakce při průchodu elektronového svazku hmotou preparátu:

Pružný (elastický) rozptyl - když urychlený elektron prolétá elektronovým oblakematomu preparátu, je vychýlen pod úhlem, který je tím větší, čím blíže míjí elektron jádroa čím větší je náboj jádra. Tento úhel může dosáhnout až 180° a elektron může býtzpětně odražen.Část elektronů rozptýlených s dostatečně velkým úhlem je zachycena objektivovouclonou a tím vyřazena z tvorby obrazu na stínítku. V důsledku toho se mění intenzitaelektronového svazku a vzniká kontrast obrazu. Kontrast, který vzniká nedopadnutímelektronu na stínítko, je velmi výrazný a označuje se jako amplitudový kontrast. Kromětoho se na tvorbě obrazu projevuje ještě fázový kontrast, tvořící různé stupně šedi, kterývzniká díky rozdílu drah elektronů, odchýlených pod různým úhlem.

Nepružný rozptyl - vedou k němu srážky primárních elektronů s elektrony na orbitalechatomů preparátu. Protože se jedná o srážku dvou částic o stejné hmotnosti, mohou při níurychlené primární elektrony utrpět relativně velkou ztrátu energie, ale nedojde k jejichodchýlení z původní dráhy. Projdou do zobrazovacího systému mikroskopu, a protožezměna energie a rychlosti přispěje ke změně jejich vlnové délky, mají vliv na ostrostobrazu tím, že zhoršují chromatickou vadu objektivu. Jejich nepříznivý vliv roste stloušťkou preparátu a s klesajícím urychlovacím napětím

Jana Nebesářová


Vick Guo, http://www.phys.sinica.edu.tw/index.php?eng=T


Vick Guo, http://www.phys.sinica.edu.tw/index.php?eng=T

• biologické preparáty jsou tvořeny lehkými prvky, které nedostatečně rozptylují

primární elektrony

• pryskyřice použitá při zalévání má přibližně stejné prvkové složení jako vlastní

preparát (a tedy i podobné rozptylové vlastnosti)

není tedy velký rozdíl v kontrastu mezi vzorkem a zalévacím médiem

nutné vzorek barvit – sole těžkých kovů - Os, Pb, U, W

kontrast se dá zvýšit objektivovou clonou malého průměru, snížením urychlovacího

napětí či zvětšením tloušťky řezů (za cenu snížení rozlišovací schopnosti)


detekce – pozorování a záznam

praktickým výstupem z transmisního elektronového mikroskopu je trvalý záznam pozorovaného obrazu

fluorescenční stínítko, speciální fotografický materiál nebo elektroncitlivá kamera

stínítko pokryté nejčastěji ZnS – emituje světlo po dopadu elektronů (cca 450 nm, kvůli nečistotám často posunuté k zelené oblasti), rozlišení stínítka dáno velikostí zrn ZnS (cca 50 nm)

CCD kamera – přeměna elektronového signálu na světelný, má mnoho výhod, ale nižší rozlišení než fotografický záznam

• pro TEM jsou důležité elasticky rozptýlené elektrony - vzorky pro TEM musí být maximálně 100 nanometrů tlusté (ideální vzorky několik desítek nanometrů), dehydrované

• příprava vzorku může být značně komplexní procedura (záleží na povaze vzorku a požadovanou úroveň výsledků)

• nanotuby, jemný prášek - jen nanést na síťku• kovový materiál - tenká folie nebo zkusit okraj vzorku• biologické vzorky - nutná fixace pro zachování buněčné ultrastruktury (stabilizace)

o chemické nebo fyzikální metody (negativní barvení (např. uranyl acetátem) nebo zalitím do pryskyřice (a následné tenké řezy))

příprava vzorku

příprava ultratenkých řezů - ultramikrotom

příprava krájecího nože – skleněný nebo diamantový

pryskyřičný bloček se vzorkem

nůž

hladina vody

diamantový nůž

50 Ångstromů (5nm) tlustý - cca 30 uhlíkových atomů

ultratenký řez

barvení:

adheze vzorku – 2-5 min

1. oplach – 20 sec až 1 min

2. oplach – 20 sec až 1 min

3. barvení – 20 sec

barvení bakterií – negativní barvení, ředěné STA

Achromobater xylosoxidans

Pavel Ulbrich, VŠCHT Praha

Escherichia coli - conjugation


Campylobacter


produkce PHA Pseudomonas


Staphylococcus aureus

Rhodobacter capsulatus


Escherichia coli


další projekty:

p12 M-PMV proteinfibrinová vlákna


polymery

ultratenký řez eukar. buňkou


artefakty




nanovlákna


SiO2

nanočástice


bakterie v silikagelu


kolagen


Kryo-elektronová mikroskopie

Nobelova cena za chemii 2017

forma TEM- nativní stav vzorku (žádné barvení)- kryo-fixace (ultrarychlé zmrazení)automatizovaná 3D rekonstrukce obrazu

aplikace- nanočástice- farmaceutický průmysl- 3D visualizace biologických vzorků (ribosomy, viry, proteiny, lipidové částice apod.)

Kryo-elektronová mikroskopie

Documents

TEM - transmisní elektronová mikroskopielipovj/FoM/FoM_4.pdf · 3 MV transmisní elektronový mikroskop –poprvé „spatřen“ atom ! cca 2010 - Titan. Světelná vs. elektronová