Enzimología

Posg

rado e

n B

iote

cnolo

gía

, C

BS

, U

AM

-I

Sistemas Multiespecies

Sergio Huerta OchoaUAM-Iztapalapa

Enzimología

Posg

rado e

n B

iote

cnolo

gía

, C

BS

, U

AM

-I

Reacciones bi-substratos

• El modelo de cinética enzimática de Michaelis-

Menten fue derivado para una reacción de un

substrato

• La mayoría de las reacciones enzimáticas tienen

múltiples substratos y productos

• Las reacciones bi-substratos son

aproximadamente el 60% de las reacciones

enzimáticas conocidas

A + B P + Q E

Enzimología

Posg

rado e

n B

iote

cnolo

gía

, C

BS

, U

AM

-I1. Oxidoreductasas Catalizan reacciones redox en las cuales un

sustrato es reducido a expensas de un segundo que

es oxidado

2. Transferasas Catalizan reacciones en las cuales un grupo es

transferido de un sustrato a otro

3. Hidrolasas Catalizan reacciones en las cuales un sustrato es

hidrolizado

4. Liasas Catalizan reacciones en las cuales un grupo es

eliminado de un sustrato para formar un doble

enlace

5. Isomerasas Catalizan reacciones de isomerización

6. Ligasas Catalizan la unión de dos moléculas a expensas de

ATP o de alguna otra “fuente de energía”

Reacciones catalizadas por enzimas

Price N.C. y Dwek R.A., Principles and Problems in Physical Chemistry for Biochemist

Solamente las reacciones de las categorías 4 y 5 pueden ser

consideradas como reacciones realmente de un solo sustrato

Enzimología

Posg

rado e

n B

iote

cnolo

gía

, C

BS

, U

AM

-I

Equilibrio rápido

en sistemas bi y tri-reactantes

1. La aproximación de equilibrio rápido es útil y válida

para los sistemas de enlace aleatorio

2. La mayoría de las enzimas que catalizan secuencias de reacciones

ordenadas se prefiere la aproximación de estado estacionario

E + A + B EAB E + P

B = Sustrato

A = Cosustrato, coenzima o coactivador

Notas:

donde:

E = Enzima

Enzimología

Posg

rado e

n B

iote

cnolo

gía

, C

BS

, U

AM

-I

Reacciones bi-substratos

Una gran proporción de reacciones bi-substrato

son reacciones transferasas o reacciones de

oxidación reducción

R1-C-NH-R

2+ H

2O R

1-C-O- + H

3N+-R

2

Tripsina

O

O

Polipéptido

CH3-C-OH + NAD+ CH

3-CH + NADH

Alcohol

deshidrogenasa

H

O

H H+

Enzimología

Posg

rado e

n B

iote

cnolo

gía

, C

BS

, U

AM

-I

Adición de substrato – liberación de producto

� El orden de la adición de substrato y liberación de

producto en la mayoría de las reacciones enzimáticas

sigue dos mecanismos de reacción

� Reacción secuencial – todos los substratos deben

enlazarse a la enzima antes de que la reacción ocurra

y los productos sean liberados

• Secuencial ordenada

• Secuencial aleatoria

� Reacción Ping-pong – uno o más productos son

liberados antes de que todos los substratos hayan sido

adicionados y una forma estable alterna de la enzima,

F, es producida a la mitad de la reacción

Enzimología

Posg

rado e

n B

iote

cnolo

gía

, C

BS

, U

AM

-I

Reacción secuencialtodos los substratos deben enlazarse a la enzima antes de

que la reacción ocurra y los productos sean liberados

• Secuencial ordenada – la reacción tiene obligatoriamente un orden de

adición de substrato y liberación de producto

• Secuencial aleatoria – la reacción no muestra preferencia por el orden de la

adición de substrato y liberación de producto

A B P Q

EAE EAB-EPQ EQ E

AB

A B P

P

Q

Q

E EAB-EPQ E

EA

EB

EQ

EP

Enzimología

Posg

rado e

n B

iote

cnolo

gía

, C

BS

, U

AM

-I

Sistemas bi-reactantes ordenados

[ ] [ ]

[ ] [ ] [ ]

BAA

BA

max

KK

BA

K

A

KK

BA

V

v

⋅++

⋅

=

1

E + A EA + B EAB E + P

Consideración de equilibrio rápido

Enzimología

Posg

rado e

n B

iote

cnolo

gía

, C

BS

, U

AM

-I

[ ] [ ]

[ ] [ ] [ ] [ ]

BABA

BA

max

KK

BA

K

B

K

A

KK

BA

V

v

⋅

⋅

+++

⋅

⋅

=

α

α

1

Sistemas bi-reactantes aleatorios

E + B EB

+

A+

A

EA + B EAB E + P

KB

KA

α KB

α KA

kp

Consideración de equilibrio rápido

Enzimología

Posg

rado e

n B

iote

cnolo

gía

, C

BS

, U

AM

-I

Reacción ping-ponguno o más productos son liberados antes que todos los

substratos sean adicionados y una forma alterna estable

de la enzima, F, es producida la mitad de la reacción

A P B Q

EA-FPE F FB-EQ E

[ ] [ ][ ] [ ] [ ] [ ]BAAKmBKm

BA

V

v

BA⋅++

⋅=

max

Consideración de equilibrio rápido

Enzimología

Posg

rado e

n B

iote

cnolo

gía

, C

BS

, U

AM

-I

Gráficas de velocidades iniciales

Las reacciones secuenciales y ping-pong pueden ser

distinguidas sobre la base de sus gráficas de

Lineweaver-Burk o doble recíproca

Enzimología

Posg

rado e

n B

iote

cnolo

gía

, C

BS

, U

AM

-I

Enzimología

Posg

rado e

n B

iote

cnolo

gía

, C

BS

, U

AM

-I

Enzimología

Posg

rado e

n B

iote

cnolo

gía

, C

BS

, U

AM

-I

Enzimología

Posg

rado e

n B

iote

cnolo

gía

, C

BS

, U

AM

-I

Sistemas tri-reactantes aleatorios

[ ] [ ] [ ]

[ ] [ ] [ ] [ ] [ ] [ ] [ ] [ ] [ ] [ ] [ ] [ ]

CBACBCABACBA

CBA

max

KKK

CBA

KK

CB

KK

CA

KK

BA

K

C

K

B

K

A

KKK

CBA

V

v

⋅⋅⋅

⋅⋅+

⋅

⋅+

⋅

⋅+

⋅

⋅++++

⋅⋅⋅

⋅⋅

=

γβααβγ

γβα

1

Consideración de equilibrio rápido

EABEABC

EAEAC

EB

E EC

E + P + Q + R

+ C

KC

+ C

β KC

+ C

α β KC

EBC+ C

α KC

Enzimología

Posg

rado e

n B

iote

cnolo

gía

, C

BS

, U

AM

-I

Sistemas tri-reactantes ordenados

[ ] [ ] [ ]

[ ] [ ] [ ] [ ] [ ] [ ]

CBABAA

CBA

max

KKK

CBA

KK

BA

K

A

KKK

CBA

V

v

⋅⋅+

⋅++

⋅⋅

=

1

(EABC EPQR)kp

KA KB KC

E EA EAB

KP KQ KR

EQR ER E

Consideración de equilibrio rápido

Sistema Ter Ter ordenado

Enzimología

Posg

rado e

n B

iote

cnolo

gía

, C

BS

, U

AM

-I

Multisitios de enlace de sustrato

Sitios de enlace no cooperativos

[ ] [ ]

[ ]n

S

n

SS

max

K

S

K

S

K

S

V

v

+

+

=

−

1

1

1

[ ][ ]SK

S

V

v

Smax+

=

Si todos los sitios de enlace son equivalentes, n moléculas de enzima de un

sitio sencillo de enlace, producen la misma curva de velocidad de una

molécula de n sitios de enlace

Enzimología

Posg

rado e

n B

iote

cnolo

gía

, C

BS

, U

AM

-I

[S]

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9

v

0.0

0.1

0.2

0.3

0.4

0.5

0.6

0.7

0.8

0.9

1.0

Enzimas alostéricas

Comparación de curvas de velocidad.

(a) Respuesta hiperbólica, (b) respuesta sigmoidal

(a)

(b)

Enzima alostérica

Enzimología

Posg

rado e

n B

iote

cnolo

gía

, C

BS

, U

AM

-I

Regulación alostérica y actividad enzimática

NH2

C

O OPO32-

+

CH2

C

+H3N COO

-

H

C

O O-

Carbamoyl phosphate Aspartic acid

aspartate transcarbamoylase

CH2

C

N H

COO-

C

O O-

C

O

NH2 + H2PO

4

-

N-Carbamoyl aspartate

H

• Como sucede en la hemoglobina, algunas enzimas muestran regulación

alostérica. El enlace de pequeñas moléculas regula la actividad catalítica de

estas enzimas mediante la alteración de la afinidad de enlace del substrato

Aspartato transcarbamoilasa (ATCasa)(como un sistema modelo de control alostérico)

• ATCasa cataliza la formación de N-

carbamoilaspartato de carbamoil

fosfato y ácido aspártico

• Esta reacción es la primera única

etapa en la biosíntesis de pirimidinas

Enzimología

Posg

rado e

n B

iote

cnolo

gía

, C

BS

, U

AM

-I

Regulación alostérica y actividad enzimática

Altas concentraciones de

CTP causan una reducción

en la tasa de síntesis de

CTP

Enzimología

Posg

rado e

n B

iote

cnolo

gía

, C

BS

, U

AM

-I

ATCasa es alostéricamente inhibida por CTP y es alostéricamente

activada por ATP

Regulación alostérica y actividad enzimática

CTP

Enzimología

Posg

rado e

n B

iote

cnolo

gía

, C

BS

, U

AM

-I

Regulación alostérica y actividad enzimática

• ATCasa tiene dos estados conformacionales, T y R

• CTP se enlaza al estado T de baja afinidad mientras ATP se enlaza al estado R

de alta afinidad

• El enlazamiento de los substratos induce un cambio conformacional en la

estructura cuaternaria induciendo un cambio de T a R

Enzimología

Posg

rado e

n B

iote

cnolo

gía

, C

BS

, U

AM

-I

El modelo alostérico de Monod, Wyman y Changeux

Considere una proteina que puede asumir dos estados. El estado “tirante”

enlaza al substrato muy pobremente, mientras el estado “relajado” tiene una alta

afinidad por el substrato. El subíndice 0 denota una proteina no enlazada, y

estos dos estados existen en equilibrio, tal que:

R0↔ T

0

Además asuma que el equilibrio de R0y T

0tiende substancialmente hacia la

derecha, tal que en la ausencia de substrato hay mucha más forma “tirante”

que “relajado”.

Si L es la constante de equilibrio,

L = [T0] / [R

0], y L es grande.

Si KRes la constante de disociación de substrato de la forma “relajada”, y K

T

es la constante de disociación de substrato de la forma “tirante”, entonces por

las condiciones señaladas KR<< K

T, y el caso extremo es K

R/ K

T= 0. Esto

significa que no hay afinidad de T0para el substrato.

Enzimología

Posg

rado e

n B

iote

cnolo

gía

, C

BS

, U

AM

-I

El modelo alostérico de Monod, Wyman y Changeux,

(modelo simétrico)

R0↔ T

0

Si substrato es adicionado a este sistema, el equilibrio es perturbado. R0 enlaza el

substrato y no es más cambiado con T0. Ahora la reacción va hacia la izquierda,

más R0 es hecho, y, en turno, más substrato es enlazado por R0, y así sucesivamente.

Esto es un efecto positivo homotrópico.

Enzimología

Posg

rado e

n B

iote

cnolo

gía

, C

BS

, U

AM

-I

El modelo alostérico de Monod, Wyman y Changeux;

enlace coperativo

c = KR / KT ; L = [T0] / [R0]; n = número de sitios de enlace de substrato;

Y = [sitios de enlace de substrate ocupados] / [número total de sitios de enlace de

substrato].

Este comportamiento de enlace de substrato es coperativo. El llenado de los sitios de enlace altera

La afinidad aparente global por el substrato. Todos los sitios de enlace, sin embargo, son equivalentes.

Enzimología

Posg

rado e

n B

iote

cnolo

gía

, C

BS

, U

AM

-I

El modelo alostérico de Monod, Wyman y Changeux;

efecto positivo heterotrópico

• Si cada subunidad tiene un sitio alostérico y un sitio de enlace de substrato, y

A (activador) está presente, entonces la reacción R0↔ T

0va hacia la izquierda,

y hay más sitios de enlace de substrato disponibles.

• Este incremento de afinidad aparente por el substrato (a una concentración

fija de activador). Globalmente, sin embargo, la coperatividad del enlace del

substrato decrece, porque hay más sitios de enlace de substrato disponible. El

activador tiene el mismo efecto que una constante de equilibrio L más baja.

Enzimología

Posg

rado e

n B

iote

cnolo

gía

, C

BS

, U

AM

-I

El modelo alostérico de Monod, Wyman, y Changeux;

efecto negativo heterotrópico

• En la presencia de inhibidor, el equilibrio R0↔ T

0va hacia la derecha.

Esto reduce el número de sitios de enlace de substrato disponible, y baja la

afinidad aparente por el substrato.

• En la presencia de una concentración fija de inhibidor, una titulación del

substrato podría mostrar un incremento en la coperatividad del enlace.

Enzimología

Posg

rado e

n B

iote

cnolo

gía

, C

BS

, U

AM

-I

El modelo alostérico de Monod, Wyman y Changeux;

efecto heterotrópico

Enzimología

Posg

rado e

n B

iote

cnolo

gía

, C

BS

, U

AM

-I

Enzimas alostéricas

Sitios de enlace cooperativos(Modelo de interacción simple: Adair Pauling)

E + S ES E + P

+

S

+

S

SE + S SES SE + P

ES + P

P + E

KS

α KS

KS

kp

kpkp

α KS

Ejemplo: Enzima con dos sitios de enlace

Enzimología

Posg

rado e

n B

iote

cnolo

gía

, C

BS

, U

AM

-I

[ ] [ ] [ ] [ ]

[ ] [ ] [ ] [ ]423

4

32

3

2

2

423

4

32

3

2

2

4641

33

SSSS

SSSS

max

cKba

S

bKa

S

aK

S

K

S

cKba

S

bKa

S

aK

S

K

S

V

v

++++

+++

=

Consideración de equilibrio rápido

Vmax = 4 kcat

[E]tdonde:

Ejemplo: Enzima con cuatro sitios de enlace

Enzimas alostéricas

Sitios de enlace cooperativos(Modelo de interacción simple: Adair Pauling)

Enzimología

Posg

rado e

n B

iote

cnolo

gía

, C

BS

, U

AM

-I

Enzimas alostéricas

[ ][ ]nn

SK

S

V

v

+

=

5.0max

Si la cooperatividad de los sitios en el enlace del sustrato

es muy marcada

Ecuación simplificada para enzimas alostéricas

(Ecuación de Hill)

n = número de sitios de enlace de sustrato por molécula de enzima

K0.5 = Constante que involucra los factores de interacción y a la constante

de disociación intrínseca

Donde: