Terapia Gênica - o Que é, o Que Nao e

estudos avanados 24 (70), 2010 31

Introduoesde sua fundao, pelo monge Johann (Gregor) Mendel no sculo XIX, aos dias de hoje, a gentica evoluiu extraordinariamente e conquistou um lugar de destaque entre as cincias. H dez anos foi completado o

sequenciamento do genoma humano (Lander et al., 2001; venter et al., 2001), um feito grandioso que promete acelerar o progresso da biologia e da medicina do sculo XXI.

a medicina moderna acrescenta, a cada dia, descobertas importantes em reas de investigao destinadas ao desenvolvimento de novos paradigmas de tratamento para doenas ainda incurveis. entre elas, a expectativa de curar doenas genticas re-pousa sobre a identificao de genes responsveis por sua patognese e sobre o avan-o das tecnologias de dna recombinante, ou engenharia gentica, que permitem a manipulao do genoma de forma cada vez mais eficiente e segura (Watson et al., 2006). em paralelo, a determinao de fatores genticos de suscetibilidade a certas doenas, seu curso e suas manifestaes clnicas (nCBI, 2009), bem como o enor-me avano na compreenso da biologia celular e molecular de eventos patolgicos fundamentais, tais como processos inflamatrios, distrbios de proliferao e morte celular programada (Coleman & tsongalis, 2009), aumentam a expectativa de que a manipulao do genoma possa vir a ser aplicada a uma ampla gama de doenas.

essa uma rea ainda incipiente da medicina, praticada especialmente nos laboratrios de pesquisa fundamental, e sua aplicao ainda estritamente ex-perimental. J h nessa rea produtos comerciais aprovados para uso mdico (Pearson et al., 2004), mas a expectativa dos cientistas, bem como da indstria farmacutica e de biotecnologia, de que a liberao de protocolos de mani-pulao do genoma para a prtica mdica e o respectivo mercado de biolgicos devero avanar cautelosamente ao longo dos prximos 5-10 anos, ainda assim englobando um nmero restrito de aplicaes.

J em 1990, entretanto, uma equipe mdica norte-americana tinha inse-rido um gene sadio no organismo de uma menina doente e a criana melhorou aps esse tratamento. Comeara uma nova era. a era da terapia gnica (ou tera-pia gentica), ou seja, o procedimento destinado a introduzir em um organismo, com o uso de tcnicas de dna recombinante, genes sadios (nesse contexto denominados genes teraputicos) para substituir, manipular ou suplementar genes inativos ou disfuncionais (Linden, 2008).

terapia gnica: o que ,o que no e o que ser RAfAel linden

d

estudos avanados 24 (70), 201032

Primrdios da terapia gnicaa partir da dcada de 1940, a gentica tomou grande impulso, e desco-

bertas sobre a natureza, composio qumica e as propriedades do material ge-ntico, bem como as primeiras manipulaes do dna de bactrias, comearam a gerar expectativas de novos avanos teraputicos.

em meados da dcada de 1960, comeou a especulao sobre a possibi-lidade de utilizar vrus para transferir genes a seres humanos doentes e curar doenas genticas (Friedmann, 1997). J naquela poca, considerava-se tanto que os prprios genes de certos vrus pudessem fazer efeito quanto que fosse possvel inserir genes humanos sadios em vrus para que esses os transferissem ao paciente. entretanto, foi s no incio da dcada seguinte que Paul Berg con-seguiu de fato manipular uma molcula de dna (Jackson et al., 1972), criando a tecnologia do dna recombinante.

duas tentativas iniciais de aplicar na prtica clnica o conceito de terapia gnica fracassaram, uma delas por se apoiar em uma premissa sobre propriedades de um vrus, a qual, mais tarde, se mostrou falsa (Rogers, 1952; Rogers & Rous, 1951; andrewes, 1966; Friedman, 2001; scaglia & Lee, 2006); outra, embora tecnicamente justificvel e j utilizando metodologias de dna recombinante, foi maculada por grave deslize tico (Mercola & Cline, 1980). Mas, em 1989, um novo teste, feito de acordo com as regras vigentes na poca, restabeleceu expectativas positivas nessa rea de pesquisa.

a paciente tratada em 1989 era uma menina de quatro anos de idade in-capaz de levar uma vida normal, porque sofria de uma doena gentica causada por deficincia da enzima adenosina desaminase (ada), indispensvel para o desenvolvimento do sistema imune. vrias mutaes no gene que codifica a enzima provocam deficincia de ada, o que resulta em degenerao das clulas t do sistema imune (Buckley, 2004) e constitui uma das principais causas de sn-drome de imunodeficincia combinada severa (sCId, do ingls severe combined immunodeficiency). no caso em questo, a doena conhecida pela sigla sCId-ada. Crianas afetadas pelas diversas formas de sCId (ibidem) tm baixssima resistncia a infeces e, se no forem tratadas, morrem em geral antes dos seis meses de idade. so conhecidas como crianas da bolha, por necessitarem de isolamento feito, frequentemente, por meio de compartimentos de plstico transparente. o tratamento usualmente feito por reposio da enzima atravs de injees semanais. naquele caso, depois de um perodo de um ano em que houve relativo sucesso, no segundo ano de tratamento a criana voltou a sofrer infeces frequentes e desenvolveu uma alergia ao preparado da enzima usado para injees. os indcios eram de que a terapia de reposio enzimtica estava falhando. o mdico William French anderson, da universidade do sul da Ca-lifrnia, obteve ento autorizao dos comits de tica para iniciar um teste de terapia gnica (anderson et al., 1990).

a cada um ou dois meses, os pesquisadores retiravam clulas t do sangue


de ashanti, inseriam o gene da ada, induziam a proliferao dessas clulas no laboratrio e, ento, devolviam as clulas tratadas para o sangue da paciente (Culver et al., 1991). depois de sete infuses, houve uma pausa de seis meses, e, a partir da, as infuses recomearam at o tratamento completar dois anos. Por segurana, a menina continuou a receber as injees semanais da enzima. a terapia gnica dessa paciente, bem como a realizada a partir de 1991 em uma segunda paciente de nove anos de idade, teve resultados positivos. Houve me-lhora clnica com uma reduo da quantidade de enzima que era necessrio re-por. observou-se que os nveis da enzima no sangue das pacientes aumentaram progressivamente com a terapia gnica e se mantiveram estveis no intervalo de descanso de seis meses (Blaese et al., 1995; Mullen et al., 1996). Finalmente, doze anos aps terminarem as infuses, poca em que foi feita uma reavaliao dos dois casos, grandes nmeros de clulas t continuaram expressando o gene teraputico no sangue da primeira paciente, cujo tratamento foi mais bem-suce-dido do que o da segunda (Muul et al., 2003).

deve-se assinalar que ainda h questes tcnicas relacionadas a esse es-tudo, que no permitem consider-lo um completo sucesso clnico. Como as crianas continuaram a receber reposio da enzima, embora em doses menores, h dvida sobre o quanto a terapia gnica ter de fato contribudo para que, por exemplo, a primeira paciente esteja hoje, aos 24 anos de idade, saudvel e ativa. no entanto, a partir das observaes feitas ao longo do tratamento dessas duas primeiras pacientes, a terapia gnica para sCId-ada evoluiu e hoje conside-rada um sucesso clnico (aiuti et al., 2009; Kohn & Candotti, 2009). Mesmo incipiente, o estudo iniciado em 1989, que obteve pelo menos alguns resultados positivos observando os requisitos ticos, um marco na histria da terapia g-nica e inspirou o crescimento subsequente dessa rea de investigao cientfica.

Modalidades de terapia gnicaa ideia de usar as tcnicas de dna recombinante para corrigir o genoma

foi inspirada nas doenas causadas por mutao em um nico gene (ditas do-enas monognicas). nesse caso, a ideia substituir ou suplementar a expres-so do gene disfuncional, mediante a insero de uma ou mais cpias do gene teraputico (Porteus et al., 2006; oConnor & Crystal, 2006; Brinkman et al., 2006). o tratamento da sCId-ada representa uma aplicao bem-sucedida dessa ideia.

Mas as doenas monognicas no so o nico alvo da terapia gnica (Figu-ra 1). a medicina moderna luta contra muitas doenas complexas, cujas causas primrias ainda no so conhecidas e para as quais h, na melhor das hipteses, apenas tratamentos paliativos. em certos casos, possvel planejar uma inter-veno por meio de terapia gnica, visando reduzir ou evitar a progresso da doena. a interveno pode ser baseada no conhecimento de determinantes genticos de suscetibilidade ou gravidade, ou na oportunidade de alterar me-canismos fundamentais ou a fisiologia das clulas, dos rgos ou sistemas afeta-


dos pelas doenas (Cardone, 2007; Flotte, 2007). as principais estratgias so aumentar a resistncia celular, estimular sistemas de reparo ou regenerao, ou ainda recompor caractersticas funcionais especficas de determinados sistemas orgnicos, mediante modulao de genes no necessariamente associados cau-sa da doena (Bagley et al., 2008; Lundberg et al., 2008). J no caso de tumores, o principal objetivo a induo de morte celular seletiva em populaes celula-res proliferativas (Bauzon & Hermiston, 2008; Cattaneo et al., 2008; Ribacka et al., 2008).

Finalmente, h uma forma peculiar de terapia gnica denominada vacina de dna. nessa, ao invs da utilizao de uma protena ou um vrus completo inativado, como se faz nas vacinas convencionais, o paciente recebe o gene que codifica uma protena tpica do agente agressor. dessa forma, o organismo do paciente passar a fabricar permanentemente a protena exgena, estimulando seu prprio sistema imune. essas vacinas podem ter finalidade preventiva, de forma semelhante s vacinas clssicas, ou curativa, levando o sistema imune a atacar os agentes agressores j instalados no organismo (atkins et al., 2008, sykes, 2008; silva et al., 2009).

Figura 1 Modalidades principais de terapia gnica.

Terapia celular, clulas-tronco e terapia gnica as clulas-tronco so, atualmente, o principal assunto de natureza mdica

na mdia. ao mesmo tempo, criou-se certa confuso entre clulas-tronco, tera-pias celulares e terapias genticas. nas chamadas terapias celulares, empregam-se clulas inteiras para tratar uma doena, com base nas propriedades regenerativas de clulas-tronco ou em outros efeitos, a maior parte dos quais ainda no ex-plicados, das clulas transplantadas. o exemplo clssico, cuja fundamentao bem conhecida, o de leucemias, mas h expectativa de que muitas classes de doenas possam vir a ser tratadas com emprego de terapias celulares nos prxi-mos anos (torrente & Polli, 2008; Gribben, 2008; einstein & Ben-Hur, 2008; Reffelmann et al., 2008).

no presente contexto, importante frisar que terapias celulares no envol-vem necessariamente modificao gentica. J as terapias gnicas so baseadas na introduo ou modificao de genes. Isso pode ser feito diretamente in vivo, sem o auxlio de clulas inteiras do prprio paciente ou de doadores.


ou seja, terapia gnica e terapia celular so dois conceitos distintos. en-tretanto, h mtodos que combinam as duas tcnicas. um exemplo de combi-nao de terapia gnica com terapia celular foi, novamente, o procedimento ex vivo que inaugurou a terapia gnica, e que foi descrito antes. novas tecnologias de terapia gnica para a sCId-ada so baseadas na manipulao gentica de clulas-tronco de medula ssea, em lugar das clulas t empregadas nos primei-ros estudos (aiuti et al., 2009). Portanto, em certas circunstncias, podem-se utilizar clulas como veculo para introduzir o gene teraputico. Mas so a intro-duo do gene e o uso das tecnologias de dna recombinante que caracterizam o tratamento como terapia gnica.

Vetores para terapia gnicaa base da terapia gnica consiste na introduo de genes em clulas. Po-

rm, a entrada de dna puro atravs da membrana plasmtica de clulas eucari-ticas extremamente rara (vellai & vida, 1999). essa dificuldade , naturalmen-te, benfica para o organismo, pois dificulta alteraes esprias do metabolismo celular e at mesmo transformaes semelhantes s que se observam na evoluo das espcies.

Por conseguinte, de modo geral, h necessidade de um carreador que faci-lite a entrada do dna nas clulas vivas. esse veculo denominado vetor. H trs classes principais de vetores atualmente em desenvolvimento: plasmdeos, vetores virais e vetores nanoestruturados.

Plasmdeosos plasmdeos so sequncias de dna relativamente simples, porm efi-

cazes para expresso de genes, nas quais possvel inserir um gene teraputico por tcnicas de dna recombinante (voss, 2007; Clanchy & Williams, 2008; Gill et al., 2009). Mas, para vencer a resistncia das clulas introduo de plasm-deos, preciso fragilizar a membrana celular, o que pode ser obtido por diversos mtodos, como o emprego de choques eltricos ou substncias que fragilizam quimicamente a membrana celular (dass, 2004; Cemazar & sersa, 2007; Favard et al., 2007; Wu & Lu, 2007). outra alternativa consiste em aplicar uma grande quantidade de plasmdeos nas vizinhanas das clulas, de modo que, mesmo com eficincia muito baixa, uma pequena frao que seja capaz de cruzar a membrana j produza efeitos, ou ainda injetar rapidamente um grande volume de soluo contendo plasmdeos (Herweijer & Wolff, 2007).

essas tcnicas so, entretanto, muito limitadas. Por exemplo, improvvel seu uso para introduzir genes em rgos de difcil acesso, como o crebro. as-sim, o emprego de vetores plasmidiais limitado a algumas circunstncias, tais como sua introduo por injeo intramuscular, como no caso das vacinas de dna ou no msculo cardaco, ou ainda em estudos experimentais em animais. outrossim, essa tecnologia pode ter aplicaes importantes, por exemplo, para introduzir o gene sadio em clulas isoladas e combinar terapia gnica com tera-pia celular.


Figura 2 Construo de um vetor viral para terapia gnica. a figura ilustra, como exem-plo, o vrus adenoassociado, cujo material gentico uma fita simples de dna. na parte de cima esquematizado um vrus visto por fora e por dentro, em um corte que mostra a localizao do dna viral. esse dna contm vrios genes necessrios para o ciclo de vida do vrus, isto , sua multiplicao e re-composio no interior das clulas. Mas, para usar como vetor, o dna das re-gies terminais, marcadas com a sigla ItR, o suficiente. o processo consiste em substituir os genes virais pelo gene teraputico, usando as tecnologias de dna recombinante. assim se produz o componente essencial do vetor viral. entretanto, como o dna nu no entra com facilidade nas clulas, preciso recompor um vrus parecido com o ilustrado no canto superior esquerdo des-ta figura e em grandes quantidades, como ilustrado na Figura 3. Reproduzido de Linden (2008), com permisso dos editores.

Vetores viraisem contraposio resistncia da membrana celular entrada espontnea

de dna em uma clula, os vrus so micro-organismos especializados exata-mente em invadir clulas e nelas introduzir material gentico. Contm cido nucleico (dna ou Rna) cercado por uma capa de protena e, em alguns casos, de um envelope adicional de protena e lipdeos e seu ciclo de vida implica libe-rao do cido nucleico viral na clula hospedeira. essa propriedade explorada para introduzir genes teraputicos nas clulas, por meio de tecnologias de dna recombinante.

alguns vetores so derivados de adenovrus. essa famlia inclui quase 50 tipos distintos de vrus que causam, por exemplo, faringites ou conjuntivites. In-feces por adenovrus so muito comuns, e, por isso, a maior parte da popula-o possui anticorpos contra um ou mais tipos dessa famlia de vrus. outros so da famlia dos retrovrus, que inclui o HtLv causador de um tipo de leucemia e


o HIv causador da aids, que pertence subfamlia dos lentivrus, os quais vm sendo muito estudados como fonte de vetores para terapia gnica. ainda outros vetores so derivados de vrus da famlia dos adenovrus-associados, que no so patognicos para seres humanos.

o princpio da produo de vetores de origem viral para terapia gnica (figuras 2 e 3) consiste em remover os genes envolvidos nos mecanismos pato-gnicos e de proliferao viral, mantendo apenas o necessrio para invaso das clulas sem multiplicao, seguida da insero de um gene teraputico no que resta do dna viral (Machida, 2002). a remoo de genes que conferem o car-ter patognico e a multiplicao permite, por exemplo, que um vrus da mesma subfamlia do perigoso HIv possa dar origem a um vetor viral til para terapia gnica.

Figura 3 Produo em massa de vetores virais para terapia gnica. a figura, mais uma vez, usa como exemplo um vetor derivado de vrus adenoassociado. o dna do vetor viral foi construdo conforme mostrado na Figura 2. esse dna introduzido por precipitao ou eletroporao em clulas produtoras, junto com um plasmdeo contendo genes auxiliares, os quais so necessrios para empacotar o dna do vetor dentro da estrutura de vrus semelhantes aos ade-noassociados originais. as clulas produtoras formam grandes quantidades de vetores virais completos, juntamente com contaminantes, que so removidos em uma etapa de purificao, aps a qual conseguem-se trilhes de partculas virais contendo o gene teraputico livre de impurezas. o vetor est, assim, pronto para uso. Reproduzida de Linden (2008), com permisso dos edito-res.

os vetores virais diferem entre si (tabela 1). uns so mais eficientes, ou-tros tm maior capacidade de veicular genes grandes. alguns tm maior propen-so a provocar reaes inflamatrias do que outros. Finalmente, alguns vetores,


como os derivados de retrovrus, tm a propriedade de se integrar ao genoma das clulas. Isso positivo quando se quer uma expresso permanente do gene teraputico, mas pode causar efeitos adversos graves.

tabela 1 Propriedades de diversos tipos de vetores virais e no virais para terapia gnica

fonte: Modificada de nathwani et al. (2005).

Vetores nanoestruturadosoutra forma de introduzir dna em clulas est sendo desenvolvida

a partir de preparados obtidos por tcnicas avanadas de nanotecnologia (sanvicens & Marco, 2008). a se incluem polmeros que formam verdadei-ras redes que prendem um gene e soltam sua carga quando penetram nas clulas, bem como vesculas de lipdeos contendo o dna, capazes de fundir com a membrana das clulas, liberando seu contedo no interior destas l-timas.

esses vetores podem ser enriquecidos com molculas que ajudem a espe-cificar em que tipos de clulas o contedo poder penetrar, ou ainda permitam guiar ou transferir seletivamente os vetores de um compartimento para outro, por exemplo, do sangue para o crebro (Pardridge, 2005, 2007, Figura 4). esta ltima tcnica importante, pois facilitar a terapia gnica cerebral sem a neces-sidade de uma neurocirurgia para introduzir o vetor, bastando injees endo-venosas.

Retrovrus Lentivrus Herpesvrus Adenovrus Adeno- associado PlasmdeoNano-estruturados

Provrus RNA RNA RNA DNA DNA DNA DNA ou RNACapacidade ~ 9 kB ~ 10kB > 30 kB ~ 30 kB 4,6 kB ilimitado varivelIntegrao no genoma do receptor

sim sim sim no rarssima no no

Rearranjos do transgene + - - - - - -

Durao da expresso do transgene

longa longa transitria transitrialonga em clulas ps-mit-ticas

transitria transitria

Transduo de clulas ps-mitticas

- + +++ +++ ++ + +

Imunidade preexistente no receptor

no no sim sim sim no no

Efeitos adversos

muta-gnese insercio-nal

muta-gnese insercio-nal

resposta inflamatria

resposta inflamatria

leve resposta inflama-tria

no ?

Transmisso em linhagem germinativa

-/+ + - - -/+ - ?


Figura 4 Modelo de vetor no viral combinado com molcula de endereamento. a fi-gura usa como exemplo um imunolipossomo para transduo gnica cerebral (Pardridge, 2005). Como a parede dos vasos sanguneos cerebrais muito resistente penetrao de frmacos, incluindo o dna, provenientes do san-gue, o vetor composto de uma vescula formada por lipdeos, que contm no seu interior o dna com o gene teraputico. na superfcie da vescula, so inseridos anticorpos contra o receptor de transferrina que reconhecem esse receptor na superfcie de clulas da parede dos vasos sanguneos cerebrais e de neurnios. assim, quando o vetor injetado na circulao, ele adere forte-mente parede dos vasos sanguneos cerebrais, o que facilita sua penetrao no tecido cerebral e, consequentemente, a introduo do gene teraputico nos neurnios. uma tcnica como essa pode ser usada para enderear vetores para o destino adequado, com base na escolha do anticorpo inserido na su-perfcie do vetor, que dever ser seletivo para vasos sanguneos do rgo a ser tratado. Reproduzida de Linden (2008), com permisso dos editores.

ainda em outros casos, clulas modificadas pela introduo de um gene

teraputico podem ser encapsuladas em compartimentos produzidos a partir de polmeros inertes e, depois, introduzidas no organismo. a vantagem dessa tc-nica que as clulas podem produzir e secretar molculas teraputicas enquanto ficam isoladas do sistema imune do paciente (Hauser et al., 2004; Lindvall & Wahlberg, 2008). Portanto, as clulas encapsuladas no precisam ser derivadas do prprio paciente.

Terapia gnica hojeas terapias gnicas so procedimentos novos que ainda se encontram em

fase experimental. o conhecimento bsico vem sendo adquirido em laboratrios de pesquisa fundamental por meio de testes em modelos experimentais e ensaios pr-clnicos. esses estudos validam o potencial de eficcia de uma estratgia tera-


putica, bem como permitem detectar potenciais riscos a seres humanos, anteci-pando modificaes dos vetores e outros componentes da estratgia teraputica que aumentem a segurana para uso humano.

a pesquisa fundamental em terapia gnica intensa e crescente no mundo. a Figura 5 ilustra o crescimento contnuo do volume de publicaes cientficas nessa rea. nos ltimos trs anos, foram publicados, em mdia, cerca de 30 arti-gos cientficos sobre assuntos relacionados a terapia gnica por dia.

Figura 5 Frequncia anual de publicao de artigos cientficos classificados sob o termo significativo terapia gnica, registrados na base de dados do national Center for Biotechnology Information (PubMed), no perodo 1980-2009.

Como em outras reas de investigao de novos mtodos teraputicos, a

aprovao de um produto ou processo de terapia gnica depende da realizao de uma srie de ensaios clnicos, que so classificados por fases. Inicia-se pela chamada fase I, cujo objetivo testar a segurana do procedimento e identificar quaisquer efeitos adversos atribudos ao novo produto ou mtodo. seguem-se ensaios de fase II, III e Iv que, progressivamente e sempre acompanhados de vigilncia quanto a efeitos adversos, destinam-se a testar a eficcia do novo pro-duto ou mtodo em amostras crescentes de pacientes, frequentemente distribu-dos em mltiplos centros de pesquisa.

a realizao desses ensaios clnicos de terapia gnica depende de aprova-o prvia por comits de tica locais e nacionais, como a Comisso nacional de tica em Pesquisa (Conep) no Brasil ou a Food and drug administration


(Fda) nos estados unidos. no caso de terapia gnica, existe ainda no Brasil a Comisso tcnica nacional de Biossegurana (CtnBio) e nos estados unidos um comit especfico do Instituto nacional de sade (nIH, do ingls national Institutes of Health), chamado RaC (do ingls Recombinant dna advisory Committee), que devem autorizar procedimentos envolvendo dna recombi-nante. no entanto, diferentemente dos estados unidos, ainda no existe no Brasil regulamentao especfica sobre terapia gnica, a qual precisa, urgente-mente, ser elaborada tanto para evitar o uso inadequado das terapias quanto para controlar a produo e importao de insumos do exterior. no momento, resta s autoridades sanitrias aplicar normas consagradas no exterior para examinar eventuais pedidos de licena ou fiscalizar ensaios clnicos e eventuais produtos de terapia gnica no pas.

em todo o mundo, at junho de 2010 haviam sido compilados cerca de 1.650 ensaios clnicos em terapia gnica na base de dados da revista Journal of Gene Medicine (http://www.wiley.co.uk/genmed/clinical/). as figuras 6-11 ilustram os principais aspectos do estado atual da pesquisa clnica nessa rea.

Figura 6 distribuio geogrfica dos pases-sede de ensaios clnicos de terapia gnica. Repro-duzida da pgina do Journal of Gene Medicine, com permisso dos editores.

a distribuio dos pases-sede de ensaios clnicos (Figura 6) correspon-de, de modo geral, ao investimento feito na pesquisa fundamental em anos pre-cedentes. dentre os pases componentes do grupo outros, a base de dados do JGM inclui um ensaio sediado no Mxico e nenhum na amrica do sul. de fato, dos 38 ensaios clnicos em andamento em pases da amrica do sul iden-tificados ao final de 2009 na base de dados do Instituto nacional de sade dos eua (www.clinicaltrials.gov), 37 constituem extenses de ensaios sediados em pases do Hemisfrio norte e apenas um, iniciado em 2009, de fato sediado na amrica do sul, especificamente no Brasil (ver adiante).


Figura 7 Fases dos ensaios clnicos registrados na base de dados do Journal of Gene Me-dicine. Reproduzida com permisso dos editores.

a distribuio em fases (Figura 7) reflete claramente o carter experimen-tal da terapia gnica. Para comparao, podem-se citar dados do conjunto dos ensaios clnicos registrados na pgina clinicaltrials.gov. dentre esses ensaios, que incluem predominantemente frmacos e procedimentos clnicos e cirrgicos convencionais, cerca de 45% so de fase II e pouco mais de 30% so de fase III. J, como demonstrado no grfico da Figura 7, a maioria dos ensaios clnicos em terapia gnica ainda no passa da fase I e, at o momento, apenas cerca de 4% progrediram at as fases III e Iv. ainda assim, h sinais de que a progresso da terapia gnica experimental no sentido da prtica mdica est se acelerando (Figura 8).

a segurana ainda a principal barreira ao desenvolvimento da terapia gnica para a prtica mdica. o principal entrave o fato de que os vetores no virais mais seguros disponveis no momento so ainda pouco eficientes ou tm aplicao muito limitada, como o caso dos plasmdeos discutidos antes. a alta eficincia de transduo de vetores virais torna estes ltimos os mais promissores para aplicao. entretanto, alguns tipos, particularmente de vetores adenovirais e retrovirais, os mais utilizados at hoje, produziram efeitos adversos, alguns graves e mesmo fatais, e contriburam fortemente para o bloqueio de muitos estudos na fase I.

naturalmente, 150 anos de pesquisa fundamental em farmacologia ofe-recem uma base slida, sobre a qual questes de segurana de medicamentos convencionais so frequentemente resolvidas nos laboratrios de pesquisa bsica ou em ensaios pr-clnicos consagrados e altamente preditivos. ainda h um longo caminho a percorrer at que essa situao se torne rotina na pesquisa em terapia gnica.


Figura 8 Curvas cumulativas de evoluo dos ensaios clnicos das fases I e de fase III na rea de terapia gnica, construdas a partir dos dados registrados na base de dados do Journal of Gene Medicine. enquanto os ensaios de fase I apresentam crescimento linear, a curva em vermelho sugere uma acelerao na evoluo dos ensaios de fase III a partir de 2004. notar que as escalas verticais para as duas fases so distintas.

Figura 9 Indicaes teraputicas dos ensaios clnicos registrados na base de dados do Journal of Gene Medicine. Reproduzida com permisso dos editores.

a distribuio dos ensaios clnicos por indicao teraputica (Figura 9) cor-robora um aspecto j mencionado. embora a terapia gnica tenha sido concebida originalmente com o objetivo de tratar doenas monognicas, essas constituem hoje o alvo de menos de 10% dos ensaios clnicos. a predominncia de cncer


pode ser explicada, em parte, pela maior facilidade de aprovao de ensaios clni-cos baseados no uso compassionado de drogas ou terapias experimentais em pa-cientes terminais, mas tambm pelo grande avano no desenho de vrus oncolti-cos (que destroem clulas tumorais) e terapias com genes suicidas (ver adiante).

Figura 10 Classificao dos genes utilizados nos ensaios clnicos registrados no Journal of Gene Medicine. Reproduzida com permisso dos editores.

Figura 11 vetores utilizados nos ensaios clnicos registrados na base de dados do Journal of Gene Medicine. Reproduzida com permisso dos editores.

a variedade de genes utilizados nos ensaios clnicos (Figura 10) reflete o carter ad hoc da terapia gnica. provvel que o avano dessa rea de pesquisa


mdica seja fortemente influenciado pela tendncia ao desenvolvimento de medi-cina personalizada, com base em avanos da gentica, da farmacogenmica e de outros campos de investigao moderna. ainda assim, a prevalncia de antgenos, citocinas, supressores de tumor e genes suicidas corresponde predominncia de cncer como indicao teraputica mais frequente na pesquisa clnica nessa rea.

o tpico de vetores , sem dvida, o mais crtico para o avano da terapia gnica no sentido da aplicao prtica mdica. o grfico da Figura 11 compila dados obtidos em duas dcadas, ao longo das quais o progresso tecnolgico na rea de vetores foi extraordinrio. Por exemplo, em contraposio ao tipo de vetor adenoviral que ensejou a morte de um paciente de um ensaio clnico em 1999 (ver adiante) e quase paralisou a pesquisa em terapia gnica, hoje esto disponveis vetores adenovirais de terceira gerao, radicalmente modificados no sentido de evitar efeitos adversos como o que vitimou aquele paciente. Cresce, contudo, a expectativa de utilizao de vetores virais intrinsecamente mais segu-ros, como os vetores derivados de vrus adenoassociado.

Aplicaes da terapia gnicaPara ilustrar as aplicaes potenciais da terapia gnica, bem como a lgica

subjacente e a sequncia da pesquisa fundamental e pr-clnica que levou aos ensaios clnicos, foram selecionados alguns exemplos ilustrados a seguir.

Doenas monognicasHemofilia: Como cada tipo de hemofilia uma doena monognica, o

procedimento o de introduzir o respectivo gene sadio (fator vIII ou fator IX, dependendo do tipo de hemofilia) em clulas do paciente, para que essas passem a produzir a protena necessria. a terapia deve no apenas fazer o organismo voltar a produzir a protena que falta, mas produzi-la em quantidade suficiente para restabelecer a sade do paciente e por longo prazo, idealmente por toda a vida.

aps extensos ensaios pr-clnicos em camundongos e ces, que demons-traram recuperao de longo prazo da atividade pr-coagulante mediada por fator IX introduzido por terapia gnica experimental, dois estudos de fase I/II foram realizados recentemente por um grupo da universidade da Pensilvnia, com aplicao de um vetor derivado de vrus adenoassociado (raav), conten-do o gene codificante do fator IX em pacientes de hemofilia B (Manno et al., 2003, 2006; Hasbrouck & High, 2008). no houve efeitos adversos srios em nenhum dos pacientes testados.

os resultados indicam potencial eficcia do tratamento, pois um paciente que recebeu uma dose elevada do raav-F9 por infuso heptica apresentou, entre duas e cinco semanas aps o tratamento, nveis teraputicos de fator IX circulante acima de 10% da atividade normal, que suficiente para sustentar a capacidade de coagulao sangunea. entretanto, o efeito teraputico foi tran-sitrio, desaparecendo seis semanas aps o tratamento, acompanhado de au-


mento temporrio e assintomtico de nveis de transaminases (Figura 12). os resultados deste e de outro paciente no mesmo estudo indicaram que os efeitos teraputicos foram abolidos por degenerao das clulas do fgado nas quais foi introduzido o vetor, causada por uma resposta imune contra protenas do vetor viral (Mingozzi & High, 2007).

esse exemplo particularmente importante, porque em nenhum dos en-saios pr-clnicos realizados em animais antes da formulao do estudo clnico, e nem mesmo em novos experimentos realizados aps a obteno dos resultados do ensaio clnico citado, foram observadas nos animais de experimentao res-postas imunitrias que permitissem prever a resposta imune observada nos pa-cientes. o resultado demonstra a necessidade de cautela na transio de estudos pr-clnicos para ensaios clnicos, mesmo na ausncia de efeitos adversos srios, e forneceu dados cruciais para o avano da aplicao clnica de terapia gnica. novos estudos experimentais esto em andamento, visando evitar essa resposta imunitria com o emprego de variantes do vetor e imunossupresso transitria, que guiaro novos ensaios clnicos (Hasbrouck & High, 2008).

Figura 12 atividade de fator IX circulante (vermelho) e nveis de transaminases (azul e verde) ao longo do tempo aps terapia gnica para hemofilia B, em um ensaio clnico realizado com emprego de vetor derivado de vrus adenoassociado con-tendo gene codificante do fator IX. Modificada de Hasbrock & High (2008).

Amaurose congnita de Leber: a partir do final de abril de 2008, foram tambm divulgados os primeiros resultados de ensaios clnicos de fase I/II para tratamento da amaurose congnita de Leber (abreviada LCa, do ingls lebers congenital amaurosis). a LCa uma doena que provoca cegueira progressiva, iniciando-se com perda importante de viso em bebs e progredindo ao longo do tempo para cegueira total. Inicialmente, os fotorreceptores, clulas retinianas sensveis luz e imprescindveis para a viso, so inativados, mas permanecem vivos na retina (den Hollander et al., 2008). Com o passar dos anos, os fotorre-ceptores inativos, predominantemente os bastonetes que funcionam em baixos nveis de luminosidade, degeneram e desaparecem (spuy et al., 2005).


H vrias formas de LCa, algumas de causa gentica j bem conhecida, como a deficincia da RPe65, uma enzima necessria para produzir o derivado de vitamina a essencial para o funcionamento dos fotorreceptores (Poehner et al., 2000; Bereta et al., 2008). os fotorreceptores desses pacientes perdem paulatinamente a funo, mas sua degenerao s costuma acontecer por volta dos 30 anos de idade (Hollander et al., 2008). esse curso da doena oferece uma janela teraputica para insero de cpias normais do gene que codifica a RPe65 na retina de adultos jovens portadores desse tipo de LCa (Figura 13). os testes so ainda preliminares, e, em princpio, somente trs pacientes foram testados em cada um de trs ensaios clnicos de fase I realizados na Inglaterra e nos estados unidos (Bainbridge et al., 2008; Maguire et al., 2008; Cideciyan et al., 2008; Hauswirth et al., 2008).

Figura 13 diagrama de terapia gnica para amaurose congnita de Leber por mutao em RPe65. a figura ilustra ensaios clnicos realizados desde 2007 por equipes do university College em Londres, Inglaterra, e das universidades da Pensilvnia e da Flrida, nos estados unidos. essa retinopatia degenerativa produz inicial-mente inativao funcional de bastonetes com deficincia progressiva de viso escotpica e, mais tarde, degenerao dos fotorreceptores antes dos 30 anos de idade, levando cegueira. os trs grupos de pesquisa testam os efeitos da introduo do gene sadio da RPe65 na retina de adultos jovens portadores da LCa. os estudos esto em andamento e os pesquisadores esto avaliando, alm da segurana do procedimento, a capacidade visual dos pacientes, comparada capacidade visual que apresentavam antes da terapia gnica. em alguns casos, houve melhora dos resultados de exames oftlmicos (ao alto direita), reflexos pupilares e a orientao espacial em ambiente pouco iluminado contendo vrios obstculos (abaixo direita, em um fotograma extrado do filme do Moorfields Hospital, cortesia do Prof. Robin ali, university College, Londres).


os primeiros resultados mostraram que a introduo dos vetores deriva-dos de adenovrus-associado contendo o gene normal na retina dos pacientes no provocou efeitos adversos importantes. Foi observada melhora em exames oftalmolgicos e no desempenho visual de alguns doentes, que recuperaram parcialmente a sensibilidade luz (Hauswirth et al., 2008) e a capacidade de se orientar em ambientes de baixa luminosidade, o que no conseguiam fazer antes da introduo do gene sadio (Bainbridge et al., 2008).

os resultados at agora, entretanto, foram obtidos em poucos pacientes, ainda no foram observados sinais de melhora em certos testes oftalmolgicos cruciais (Hauswirth et al., 2008) e a deficincia de RPe65 responsvel por apenas 6% dos casos de LCa (Hollander et al., 2008). ou seja, a terapia que est em teste no momento, se for bem-sucedida, s poder ser aplicada a uma frao pequena dos doentes. tratamentos para os demais grupos de pacientes tero de ser desenvolvidos caso a caso. ainda assim, trata-se de um avano importante no desenvolvimento de novas terapias para doenas que levam cegueira, e j est em andamento um ensaio clnico fase II para confirmar (ou no), de forma sistemtica, a possvel eficcia do tratamento.

Cncera maioria dos ensaios clnicos de terapia gnica tem sido feita em pacien-

tes de cncer (Figura 9), em geral em estgios avanados. o efeito desejvel de qualquer tratamento para o cncer o de provocar a morte seletiva das clulas tumorais (evan & Littlewood, 1998; Green & evan, 2002). Clulas cancero-sas geralmente multiplicam-se com rapidez, o que explica o crescimento dos tumores. Muitos frmacos so usados no tratamento do cncer justamente por-que atacam seletivamente clulas que se multiplicam com rapidez e, portanto, matam clulas tumorais (Wang et al., 2008; Prochownik, 2008; vazquez et al., 2008).

a necessidade fisiolgica de renovao contnua das clulas do sangue, a partir da proliferao de precursores na medula ssea, implica, entretanto, efei-tos adversos graves da quimioterapia. esses efeitos so difceis de evitar, pois, en-tre outros fatores, os medicamentos so injetados na circulao. Para tratamento de cncer, desejvel atingir, de alguma forma, apenas as clulas tumorais. no caso de tumores slidos, como tumores originados no sistema nervoso central, isso possvel mediante terapia gnica localizada (Rainov & Ren, 2003), e vrias estratgias vm sendo desenvolvidas nesse sentido (tabela 2).

o procedimento apelidado de tcnica de genes suicidas consiste em introduzir nas clulas tumorais um gene que no existe no genoma humano e codifica a enzima timidina cinase, proveniente do genoma do herpesvrus. a presena dessa enzima em uma clula humana mata a clula na presena de uma droga chamada ganciclovir, pois a timidina cinase transforma o ganciclovir em uma toxina. a toxina, por sua vez, s afeta clulas que se multiplicam (Figura 14).


Figura 14 Mecanismo de ao de genes suicidas. o conceito, formulado no final da dcada de 1960 pelo pesquisador norte-americano Frederick Moolten, da universidade de Boston, est representado esquematicamente no desenho, na sequncia das setas a partir do canto superior esquerdo. o exemplo refere-se a glioblastomas, mas tambm se aplica a outros tipos de tumores. Primeiro, o neurocirurgio remove o mximo possvel do tumor, restando clulas tu-morais dispersas entre os neurnios normais do crebro. o gene teraputico (Hsv-tK ou timidina cinase) injetado na regio operada, penetrando nas clulas nas clulas e comandando a produo da enzima. essa enzima fosfo-rila o ganciclovir injetado, transformando-o em uma toxina poderosa que se incorpora ao dna das clulas-alvo, bloqueando a replicao do dna e levan-do, eventualmente, morte da clula proliferante. Reproduzida de Linden (2008), com permisso dos editores

embora a eficcia da tecnologia de gene suicida para tratamento de tu-mores seja ainda controversa, alguns estudos obtiveram resultados animadores. dentre eles, um ensaio clnico de fase I/II realizado na Finlndia, no qual a res-seco de tumores extremamente agressivos do sistema nervoso central, deno-minados glioblastomas, foi seguida por injeo, no leito cirrgico, de um vetor adenoviral contendo o gene da timidina cinase de herpesvrus. o procedimento prosseguiu com injees endovenosas dirias de ganciclovir por 14 dias. a tera-pia gnica resultou em aumento significativo da sobrevida (Figura 15) do grupo de 17 pacientes tratados por terapia gnica, quando comparado a um grupo de 19 pacientes tratados com terapia convencional, ou quando comparado a uma populao controle de 36 pacientes previamente tratados por mtodos conven-cionais na mesma unidade de neurocirurgia, nos dois anos anteriores ao ensaio (Immonen et al., 2004). o vetor utilizado nesse estudo est sendo desenvolvido pela empresa ark therapeutics que, recentemente, relatou resultados positivos


significativos de um estudo multicntrico de fase III com 250 pacientes e, em fevereiro de 2009, obteve na Frana a primeira autorizao para uso compassio-nado do produto, denominado Cerepro.

tabela 2 Genes e estratgias para terapia gnica de tumores do sistema nervoso central

fonte: adaptada de Linden & Lenz (2007).

.

.

Figura 15 extenso da sobrevida de pacientes de glioblastoma tratados por terapia gnica

Estratgia Exemplos FuncionamentoGenes suicidas induo de morte celular programada seletiva das clulas tumorais

HSV-TK (timidina cinase de herpesvrus)

Bloqueio da sntese do DNA quando na presena de uma pr-droga

Vrus oncoltico com replicao condicional

HSV-1 Onyx-015

Replicao somente em clulas em diviso ou tumorais

Induo de apoptose FasL, TRAIL Ativao da apoptoseLigantes de alta afinidade Receptor de transferrina Endereamento especfico de

drogas ao tumorEstratgia corretiva p53, Rb, p16, PTEN Correo dos genes

eliminados nos tumoresTerapia gnica imunitria Interleucinas, interferons,

TNF-Ativao da resposta imune antitumoral

Supresso da angiognese Angiostatina, endostatina Bloqueio do crescimento de novos vasos sanguneos

RNA de interferncia VEGF, EGFR, IGFR Reduo da expresso de oncogenes

Combinao com terapia celular

Clulas-tronco neurais ou mesenquimais como produtoras de vetores virais

Produo continuada e localizada dos vetores virais.


com emprego de gene suicida. um vetor adenoviral codificando o gene da enzima timidina cinase foi injetado no leito cirrgico aps resseco dos tumo-res, seguido de injees endovenosas de ganciclovir por duas semanas. a curva de Kaplan-Meier indica a frao de pacientes sobreviventes ao longo do tempo para pacientes tratados (vermelho) e controles (preto). a interpretao de que a terapia gnica teve efeito sobre uma parte das clulas tumorais restantes aps a cirurgia, as quais no poderiam ser atacadas de outra forma. Modificada de Immonen et al. (2004).

Doena de Parkinsonas doenas neurodegenerativas so uma das classes mais problemticas

para a medicina contempornea. apesar dos avanos ocorridos desde os anos 1990, perodo denominado dcada do crebro (Goldstein, 1994), e do exten-so conjunto de conhecimentos acumulados sobre diversos aspectos da patog-nese, gentica, curso clnico, complicaes e resposta aos diversos tratamentos testados ao longo de anos de investigao, h uma conspcua carncia de opes teraputicas, particularmente nos estgios mais avanados destas doenas (Ra-dunovic et al., 2007; Cacabelos, 2007; Han & Mcdonald, 2008; Jalbert et al., 2008; Gauthier & Poirier, 2008; olanow et al., 2008).

Por sua vez, algumas neurodegeneraes so ilustrativas do potencial de desenvolvimento de terapia gnica para doenas multifatoriais e de alta comple-xidade. a doena de Parkinson (dP) um exemplo dessa categoria.

a dP caracterizada por perda progressiva de neurnios na parte compac-ta da substncia negra do mesencfalo e alteraes funcionais em outros ncleos do tronco cerebral (Figura 16), acompanhada da formao de incluses intrace-lulares denominadas corpos de Lewy. Isso resulta em depleo de dopamina, o neurotransmissor utilizado pelos neurnios que degeneram, no alvo dos prolon-gamentos dos neurnios da substncia negra, que se chama corpo estriado. Com a evoluo da doena, encontra-se adicionalmente o envolvimento de outros sistemas de neurotransmissores. os distrbios motores tpicos da doena, como tremor de repouso, lentido dos movimentos e rigidez muscular, so frequente-mente acompanhados por instabilidade postural, disfuno visceral e distrbios cognitivos (Guttman et al., 2003). os mecanismos que levam morte dos neu-rnios da substncia negra so ainda controversos (dawson & dawson, 2003; dauer & Przedborski, 2003).

o tratamento farmacolgico com L-dopa, um medicamento precursor da sntese de dopamina, eficaz em curto ou mdio prazo, mas tende a se tornar incuo com a perda progressiva dos neurnios, alm de eventualmente provocar distrbios motores adicionais. a progresso da doena exige doses mais elevadas e combinaes de medicamentos, que nem sempre se mostram eficazes (Poewe, 2009). terapias celulares destinadas a repor neurnios dopaminrgicos na subs-tncia negra podero, eventualmente, beneficiar pacientes de dP, mas, at o momento, os ensaios clnicos efetuados com transplantes de tecido nervoso fetal


tiveram efeitos discretos, bem como sugeriram a possibilidade de transmisso da doena para o tecido transplantado (thajeb et al., 1997; Li et al., 2008; Kordo-wer et al., 2008; Mendez et al., 2008; Braak & del tredici, 2008).

Figura 16 diagrama das principais conexes e sistemas de neurotransmissores dos circui-tos dos ncleos da base, relevantes para a doena de Parkinson. a degenerao (em vermelho) dos neurnios dopaminrgicos da parte compacta da substncia negra (snc) reduz a ativao de receptores dopaminrgicos (d1 e d2) no cor-po estriado (str). Como resultado, a atividade dos alvos de projeo do corpo estriado desequilibrada, ocorrendo, entre outros efeitos, hiperatividade dos neurnios glutamatrgicos do ncleo subtalmico (stn), que causa distrbios motores. as estratgias dos ensaios de terapia gnica em pacientes de dP es-to indicadas por setas e os respectivos alvos em azul. Modificada de nakano (2000).

estratgias de terapia gnica para tratamento da doena de Parkinson in-cluem a induo da produo local de dopamina no estriado, a oferta de fatores neurotrficos para reduzir a perda progressiva de neurnios dopaminrgicos ou, ainda, a compensao do desequilbrio funcional na rede de comunicao celular dos ncleos da base (Chen et al., 2005).

a produo de dopamina depende essencialmente da atividade de trs enzimas. as tcnicas destinadas a produzir dopamina no corpo estriado deple-tado envolvem, em geral, a induo de uma ou mais destas enzimas por meio de vetores virais (Kang et al., 2001). os modelos experimentais pr-clnicos consistem em leses qumicas da substncia negra em ratos ou em primatas. Fo-


ram testados vrios tipos de vetores virais (Chen et al., 2005 para reviso). Com base nos resultados dos estudos pr-clnicos, foi iniciado um ensaio clnico fase I destinado a testar a segurana e, secundariamente, efeitos benficos de terapia gnica por expresso de uma das enzimas produtoras (a aadC), veiculada por vetor adenoviral-associado injetado no corpo estriado de pacientes que sofrem da dP, em mdia, h 14 anos (http://clinicaltrials.gov/show/nCt00229736). os resultados (Christine et al., 2009) demonstraram melhora do quadro clnico sem efeitos adversos da terapia gnica per se, embora tenham sido detectados riscos no procedimento operatrio.

Por sua vez, estratgias de neuroproteo, destinadas a reduzir ou impe-dir a perda neuronal a longo prazo, tm sido formuladas com base em diversos fatores de crescimento que tm efeito protetor sobre neurnios da substncia negra. dentre os experimentos feitos em animais, um estudo testou os efeitos da injeo, no corpo estriado, de um vetor viral expressando uma construo do gene de neurturina, com resultados positivos (Fjord-Larsen et al., 2005). assim, um ensaio clnico fase I foi iniciado em meados de 2005, visando examinar a se-gurana de um vetor viral adenoassociado expressando o gene de neurturina in-jetado no corpo estriado (http://clinicaltrials.gov/show/nCt00252850). no houve efeitos adversos graves em 12 pacientes tratados com duas doses distintas do vetor, e foram detectados efeitos benficos em alguns parmetros motores (Marks et al., 2008). um estudo multicntrico de fase II encontra-se, agora, em andamento.

a terceira estratgia de terapia gnica para dP baseada no desequilbrio funcional entre vias excitadoras e inibidoras nos ncleos da base, consequente perda da atividade da substncia negra (Figura 16). nessas condie, ocorre de-sinibio da atividade de um ncleo chamado ncleo subtalmico (stn), qual se atribui importante papel nos principais sinais da dP (nakano, 2000; Chen et al., 2005). vrios estudos demonstraram que remoo cirrgica do stn ou estimulao eltrica de alta frequncia tem efeitos benficos sobre alguns desses sinais, justificando o emprego da chamada estimulao cerebral profunda no tratamento de casos avanados de dP (diamond & Jankovic, 2005). o conhe-cimento das propriedades funcionais de circuitos neurais envolvidos na doena levou a um exemplo notvel de interveno gentica destinada a modular a fi-siologia do sistema nervoso, independentemente da causa da doena que, ainda hoje, continua controversa.

Foi desenvolvido um ensaio de terapia gnica que consiste na induo de expresso de enzimas que produzem um neurotransmissor inibidor, visando contrapor-se ao excesso de atividade neural no stn. a expresso dessas enzimas no stn produziu efeitos funcionais benficos em modelo de dP em ratos (Luo et al., 2002). Com base nesses resultados, foi conduzido, no perodo 2003-2005, um ensaio clnico de fase I de terapia gnica empregando um vetor de vrus ade-noassociado recombinante, contendo o gene que codifica uma dessas enzimas,


injetado no stn (http://www.clinicaltrials.gov/ct/show/nCt00195143). Resultados de 11 pacientes acompanhados por at 12 meses indicaram melho-ra significativa de desempenho motor, acompanhada de reduo de atividade metablica em alvos de projeo do stn, compatvel com os resultados dos estudos pr-clnicos. Foi tambm divulgada melhora significativa em escala de atividades cotidianas, que reflete a opinio dos pacientes sobre seu desempenho em tarefas do dia a dia. no foram relatados efeitos adversos que deponham contra a segurana do procedimento (Kaplitt et al., 2007).

os resultados dos ensaios clnicos descritos so, ainda, muito preliminares, foram obtidos em nmeros reduzidos de pacientes e necessitam de confirma-o em ensaios mais amplos, com controles mais rigorosos para efeito placebo e outras variveis. Portanto, ainda cedo para concluir sobre a viabilidade e, particularmente, a eficcia de terapia gnica para doenas neurodegenerativas. entretanto, esses estudos somam-se a outros ensaios clnicos que sugerem que a terapia gnica poder se transformar em alternativa efetiva de tratamento para doenas hoje incurveis.

O balano risco-benefcio da terapia gnicadentre as centenas de ensaios clnicos de terapia gnica j encerrados, a

maioria destinou-se a testar a segurana do procedimento. em certos casos, a identificao precoce de efeitos adversos durante o estudo foi suficiente para encerrar imediatamente o teste, evitando risco de agravamento. Mas, em muitos casos, o procedimento empregado foi considerado seguro, quando muito com efeitos adversos ocasionais, discretos e tolerveis.

dor ou inflamao leves no local da injeo, febre baixa transitria, dor de cabea passageira, sintomas semelhantes gripe e outros efeitos suaves so, em geral, tolerveis em vista do potencial de tratamento de uma doena incurvel. esses so a maior parte dos incidentes que se costuma encontrar nos ensaios clnicos de fase I em terapia gnica, especialmente aps a realizao de extensos testes pr-clnicos em animais, exigidos pelas agncias reguladoras para autori-zao de ensaios clnicos (acesso a agncias reguladoras nos estados unidos e europa e regulamentao nessa rea pode ser obtido, por exemplo, pelo link http://www.genetherapynet.com/legislation.html).

Reaes imunitrias, entretanto, no apenas podem provocar efeitos ad-versos, mas, mesmo que no o faam, podem destruir os vetores ou as clulas infectadas por vetores virais, em que pese o uso de tcnicas sofisticadas de dna recombinante em sua fabricao. esse foi o caso do ensaio para hemofilia do tipo B, j descrito (Mingozzi & High, 2007), mas que no trouxe consequncias sig-nificativas aos pacientes. em outros casos, no entanto, os efeitos adversos podem ser muito severos ou, em raros casos, fatais.

em 1999, um paciente morreu logo aps a injeo de um vetor viral durante um ensaio clnico de terapia gnica, vitimado por uma sndrome de resposta inflamatria sistmica causada pelo vetor adenoviral de primeira ge-


rao (Raper et al., 1998, 2003). em ensaios clnicos mais recentes, realizados na Frana e Inglaterra (Hacein-Bey-abina et al., 2002; Gaspar et al., 2004), de um total de 20 crianas abaixo de um ano de idade submetidas a terapia gnica para sndrome de imunodeficincia combinada severa ligada ao cromossomo X (sCId-XL) (Buckley, 2004), cinco desenvolveram leucemias (Hacein-Bey-abina et al., 2003; Howe et al., 2008). dessas, uma foi a bito e quatro apresentaram remisso completa da leucemia aps quimioterapia. exames feitos aps o apare-cimento das leucemias revelaram que os vetores retrovirais utilizados em ambos os ensaios produziram mutagnese insercional, ou seja, mutaes produzidas pela intromisso do vetor no dna, rompendo a continuidade da sequncia ge-ntica (Cavazzana-Calvo & Fischer, 2007; Howe et al., 2008).

os casos citados constituem os mais graves exemplos efetivamente carac-terizados como efeitos adversos diretos da terapia gnica. ambos tm origem em caractersticas dos vetores virais utilizados. Porm, em ambos os casos, a pesquisa fundamental, aliada observao criteriosa dos eventos associados ao tratamento e ao curso clnico dos efeitos colaterais, contribuiu para avanos no desenho e produo de novos vetores, destinados a evitar tais efeitos adversos.

no caso de vetores adenovirais, em contraposio primeira gerao de vetores empregada no ensaio clnico que resultou no caso fatal de 1999, j es-to disponveis vetores adenovirais de terceira gerao, construdos com deleo completa de genes virais e capazes de transduo gnica muito mais segura em seres humanos (Rty et al., 2008; dormond et al., 2009). Por sua vez, crescen-te a expectativa de evitar mutagnese insercional, como a observada nos ensaios para sCId-XL, por meio do desenho de vetores retrovirais ou lentivirais autoi-nativantes ou dotados de isoladores de cromatina, duas das mais promissoras tcnicas em desenvolvimento atualmente para essa classe de vetores (Yi et al., 2005; Rty et al., 2008).

a terapia gnica para sCId-XL, por sua vez, foi curativa em 19 das 20 crianas tratadas, que apresentaram melhora significativa do seu sistema imune menos de trs meses aps o tratamento, bem como recuperao persistente de sua resistncia a infeces (tabela 3; Fisher & Cavazzana-Calvo, 2008; aiuti & Roncarolo, 2009). Por seu turno, o tratamento em adolescentes no foi efi-caz, sugerindo uma janela teraputica limitada para interveno nessa doena. adicionam-se aos casos bem-sucedidos 30 pacientes tratados da sCId-ada, a forma de imunodeficincia que corresponde primeira paciente tratada por terapia gnica em 1989 (tabela 4; aiuti & Roncarolo, 2009).

as agncias reguladoras envolvidas na autorizao e no controle de ensaios clnicos em terapia gnica agiram rapidamente em ambos os casos de efeitos adversos aqui relatados. em 1999, o ensaio que resultou na morte do paciente foi suspenso definitivamente, apesar da ausncia de efeitos adversos graves nos outros 17 pacientes tratados no mesmo estudo. no caso dos ensaios para sCId-XL, os procedimentos teraputicos j estavam encerrados, mas as autorizaes


para outros ensaios semelhantes foram suspensas at a avaliao criteriosa dos dados e, posteriormente, voltaram a ser concedidas. em que pese o reconhe-cimento de que o procedimento de terapia gnica foi responsvel pelos efeitos adversos, os comits reguladores concluram que nenhum desses eventos, assim como outros efeitos adversos relatados ocasionalmente, justifica a abolio de ensaios clnicos em terapia gnica. na verdade, a anlise dos efeitos adversos tem contribudo para orientar o desenvolvimento biotecnolgico na rea e, ao mesmo tempo, aperfeioar a regulamentao e os critrios para autorizao de ensaios clnicos.

tabela 3 ensaios clnicos de terapia gnica para sCId-XL

fonte: adaptada de aiuti & Roncarolo (2009).

tabela 4 ensaios clnicos de terapia gnica para sCId-ada

* os estudos (1) e (2) diferem no pr-tratamento medicamentoso dos pacientes antes da exe-cuo da terapia gnica.

** o efeito adverso foi atribudo a uma anormalidade citogentica independente da terapia g-nica.

fonte: adaptada de aiuti & Roncarolo (2009).

o balano de efeitos adversos e benefcios em ensaios clnicos de terapia gnica indica que o curso do desenvolvimento dessa, assim como de outras te-rapias avanadas, tais como os tratamentos com clulas-tronco, ser tanto mais seguro quanto mais bem fundamentado pela pesquisa bsica e sujeito a regula-mentao adequada para restringir a autorizao de ensaios clnicos condio de mxima segurana possvel na poca dos ensaios, porm sem tolher o avano da pesquisa mdica.

Ensaio No de pacientes Tempo de observao

Eficcia Toxicidade

Hospital Necker, Paris

10 (idade < 1 ano) 10 anos sim Leucemia (4 pcs), 3 remisso completa aps quimioterapia

Great Ormond St Hospital, Londres

10 (idade < 1 ano) 7 anos sim Leucemia (1pc), remisso completa aps quimioterapia

Multicntrico, FR, ING, USA

5 (idade = 10-20 anos) 3 anos no no

Ensaio No de pacientes Tempo de observao

Eficcia Toxicidade

HSR-TIGET 15 8 anos sim noGOSH 5 5,5 anos sim noCHLA/NIH (1)* 4 8 anos no noCHLA/NIH (2)* 6 2 anos sim pancitopenia** (1 pc)


Terapia gnica e biotecnologiaempresrios da rea de biotecnologia enxergam no sequenciamento do

genoma humano oportunidades comerciais crescentes. o interesse reside, natu-ralmente, no fato de que a descoberta dos genes e, especialmente de mutaes responsveis, no todo ou em parte, por uma doena, pode levar ao desenvolvi-mento de testes diagnsticos ou medicamentos comercializveis.

entre outras aes, empresas comearam a investir no patenteamento de genes ou mesmo de sequncias de fragmentos de dna que ainda no tinham sequer sido associadas a genes propriamente ditos. Mais de trs milhes de pa-tentes relacionadas ao genoma foram solicitadas at hoje nos estados unidos. a legislao norte-americana em geral permite o patenteamento de genes, des-de que isolados (e no apenas descritos como sequncias de nucleotdeos) e acompanhados de evidncia de utilidade, por exemplo, para desenvolvimento de testes diagnsticos. entretanto, o patenteamento de genes controverso. Por exemplo, as normas internas para avaliao da utilidade de descobertas relativas a genes, em vigor desde 2001 pelo escritrio de Patentes dos estados unidos (uspto), foram e ainda so objeto de severas crticas, das quais o uspto se de-fende com base nas leis de patentes vigentes nos estados unidos. J o Instituto nacional da Propriedade Industrial (Inpi), rgo brasileiro que concede paten-tes com validade nacional, informa em sua pgina que o patenteamento de genes naturais no permitido no Brasil.

Fora do mbito da controvrsia sobre patenteamento de genes, os veto-res para terapia gnica, virais ou no virais, contendo genes teraputicos, bem como suas aplicaes especficas, so produtos de desenvolvimento tecnol-gico e, como tal, constituem objeto legtimo de patenteamento e eventual comercializao (Bobrow & thomas, 2002). Centenas de patentes desse tipo tm sido solicitadas ao uspto e a seus similares europeus e asiticos. dezenas de empresas vm investindo em terapia gnica, a partir de tecnologias paten-teadas de produo de vetores ou como parceiras de instituies de pesquisa (tabela 5).

em todo o mundo, as primeiras etapas de desenvolvimento de tecnolo-gias para terapia gnica e muitos testes pr-clnicos esto ao alcance de grupos de pesquisa, institutos e universidades pblicas, bem como entidades privadas financiadas com recursos pblicos. entretanto, a transferncia da pesquisa de laboratrio para o ensaio clnico geralmente demanda recursos que esto muito alm da capacidade de financiamento pblico. Companhias de biotecnologia investem na realizao desses ensaios em razo da existncia de patentes que possam ser, eventualmente, exploradas comercialmente, assim como em todas as demais reas de tecnologia. at o momento, apenas um produto especifica-mente classificado como terapia gnica foi comercializado, mas outros quatro produtos encontram-se em fase adiantada no caminho da comercializao (ta-bela 6).


tabela 5 empresas no exterior inseridas na rea de terapia gnica

fonte: dados do International scientific Products exchange, 2009. disponvel em: .

tabela 6 Produtos de terapia gnica em estgio avanado de desenvolvimento

1. Advanced Cell & Gene Therapy, LLC

2. Advanced Cell Technology 3. Advanced Vision Therapies, 4. AlphaVax Human Vaccines,

InC. 5. Altogen Biosystems 6. Amaxa GmbH 7. Amsterdam Molecular

Therapeutics 8. Applied Tissue Technologies

LLC 9. Ark Therapeutics Ltd.

10. Athersys, Inc. 11. AuRx Inc12. Austrianova FSG {FSG

AUSTRIANOVA GmbH} 13. Avaris AB 14. Avigen Inc.15. Bavairian Nordic A/S 16. BetaStem Therapeutics Inc17. BioCardia Inc 18. Bioheart, Inc. 19. BioProtein I Technologies 20. Biovex Limited 21. Cardion AG 22. Cell Genesys Inc 23. Cellectis SA 24. Cellerant Therapeutics Inc. 25. CellGenix Technologie

Transfer GmbH 26. Cellprep S. A. 27. Ceregene Inc.

28. Collateral Therapeutics, Inc.29. Copernicus Therapeutics Inc 30. Corgentec Inc. 31. Cyclacel Limited 32. CyThera Inc. 33. Cyto Pulse Sciences, Inc 34. CytoGenix Inc 35. DeveloGen AG 36. Enzo Biochem, Inc. 37. Epeius Biotechnologies

Corporation 38. Expression Genetics Inc 39. geneRx+ 40. Genetix Pharmaceuticals Inc 41. GenVec. Inc. 42. IC-Vec Ltd 43. Ichor Medical Systems, Inc. 44. Immuno-Designed Molecules

(IDM), SA 45. Insert Therapeutics Inc. 46. Intercytex Limited 47. Introgen Therapeutics, Inc. 48. Intronn, Inc. 49. Invivogen 50. Ixion Biotechnology 51. MaxCyte, Inc. 52. MediGene, Inc. 53. Mirus Corporation 54. Innovata pic 55. Molecular Medicine, LLC 56. Mologen Holding AG 57. Nature Technology

Corporation

58. Nephros Therapeutics, Inc. 59. Neurotech SA 60. Nucleonics Inc. 61. Oncosis 62. Onyx Pharmaceuticals, Inc. 63. OrphagenicX 64. Oxford BioMedica 65. PharmaFrontiers Corp. 66. Polygenetics Inc. 67. PrimeGen Biotech LLC. 68. Progenitor Cell Therapy, LLc 69. Proneuron Biotechnologies,

Inc. 70. Regulon Inc. 71. Reneuron 72. REPLICor Inc. 73. Ribozyme Pharmaceuticals

Inc. (RPI) 74. Sertoli Technologies Inc. 75. Stem Cell Sciences 76. StemCells Incorporated 77. Supratek Pharma Inc. 78. Targeted Genetics

Corporation79. TheraCyte, Inc. 80. Theratechnologies 81. TheraVitae Co., Ltd. 82. Tosk lnc 83. Transgene S.A 84. Valentis, Inc. 85. VIA Pharmaceuticals, Inc. 86. Vical Incorporated 87. VirRx, Inc.

Produto Composio Indicao Empresa StatusGendicine rAd-p53 Tumores de

cabea e pescoo

SiBiono GenTech, China

Aprovado e no mercado na China

(2003)Rexin-G tumor matrix

(collagen)-targeted, retroV-dnG1-Cyclin

Tumores slidos

Epeius Biotech, EUA

Uso compassionado no Japo (2007),

aprovado nas Filipinas

Collategene Plasmid-HGF Isquemia crtica de membros

AnGes MG/Daiichi Sankyo,

Japo

Sob reviso no Japo, anlise de protocolo especial

(SPA) nos EUAAdvexin rAd5CMV-p53 Tumores de

cabea e pescoo

Introgen, EUA Sob reviso, ensaio fase II em

andamentoCerepro rAd5-TK Glioblastoma Ark

Technologies, ING/Finlndia

Aprovado para uso individualizado na Frana e Finlndia

(2009)


o interesse do setor industrial na terapia gnica pode ser ilustrado por da-dos provenientes de organizaes especializadas em prospeco tecnolgica. a anlise da evoluo do nmero de produtos destinados terapia gnica, em fase de desenvolvimento por parte de empresas, revela um aspecto importante. en-quanto a produo cientfica na rea cresce continuamente (Figura 5), a curva de crescimento do investimento industrial apresentou uma clara reduo entre 2003 e 2007 (Figura 17), provavelmente influenciada pelos efeitos adversos dos ensaios de terapia gnica para sCId-XL, que foram amplamente divulgados e, naturalmente, devem ter despertado preocupao por parte dos investidores. ainda assim, o nmero de produtos industriais nas fases II e III continuou crescendo no perodo (Figura 18) e a recuperao do crescimento do setor previsvel. no meio empresarial, h uma expectativa crescente de sucessos a um prazo compatvel com os investimentos tanto na pesquisa acadmica quanto no setor privado (Phacilitate, 2009). um estudo estratgico de 2008 previu um mercado mundial de cerca de us$ 500 milhes de dlares em 2015 para produtos de terapia gnica (Global Industry analysts Gene therapy: a global strategic business report, 2008).

Figura 17 evoluo do nmero de produtos para terapia gnica em desenvolvimento em empresas de biotecnologia no perodo 1995-2009. Modificada de .


Figura 18 evoluo do nmero de produtos para terapia gnica, nas distintas fases de ensaios pr-clnicos ou clnicos, em desenvolvimento em empresas de biotec-nologia no perodo 1995-2008. Modificada de .

Terapia gnica no Brasilapesar da histria e do reconhecimento internacional da gentica brasilei-

ra, ainda h poucos grupos de pesquisa dedicados a estudos sobre terapia gnica, incluindo vacinas de dna. at recentemente havia pouco investimento pblico nessa rea de investigao e nenhum interesse por parte do setor privado. o quadro, no entanto, est comeando a mudar com algumas iniciativas, ainda que modestas, em ambos os setores.

A Rede de Terapia Gnicaa partir de 2005, comeou a ser organizada no Brasil uma Rede de terapia

Gnica. essa rede, coordenada pelo autor, congregou inicialmente 14 grupos de pesquisa de trs estados (Rio de Janeiro, so Paulo e Rio Grande do sul), dedicados pesquisa na rea de terapia gnica e vacinas de dna. os estudos envolvem desenvolvimento de vetores virais, pesquisa bsica e testes pr-clnicos nas reas de cncer, doenas genticas, doenas neurodegenerativas e vacinas de dna para dengue, doena de Chagas, infeces por estreptococos e cncer.

um primeiro ensaio clnico de terapia gnica para revascularizao mio-crdica com emprego de vetores plasmidiais contendo o gene do veGF (Vas-


cular endothelial Growth factor), promovido conjuntamente pelo Instituto de Cardiologia do Rio Grande do sul, pela Fundao de amparo Pesquisa do Rio Grande do sul e pela Rede de terapia Gnica, por meio do Programa dos Institutos do Milnio do MCt/CnPq, iniciou-se em fevereiro de 2009 em Por-to alegre (http://clinicaltrials.gov/ct2/show/nCt00744315). trata-se do primeiro ensaio clnico de terapia gnica sediado na amrica do sul, em meio a dezenas de ensaios clnicos promovidos por empresas multinacionais ou insti-tuies de pesquisa estrangeiras que contam com participao de pesquisadores sul-americanos (tabela 7).

tabela 7 Patrocinadores de ensaios clnicos de terapia gnica com participao de ins-tituies na amrica do sul. algarismos entre parnteses indicam o nmero de ensaios daquele patrocinador

fonte: nIH-usa (Clinicatrials.gov), dez. 2009.

Terapia gnica e biotecnologia no BrasilConsistente com a incipiente presena da pesquisa em terapia gnica,

reduzido o interesse do setor privado nessa rea no pas. Recentemente, no entanto, foi instalada uma empresa sediada na Fundao Parque de alta tecno-logia de Petrpolis, no estado do Rio de Janeiro, que, entre outros servios de natureza biotecnolgica, est comeando a oferecer suporte para ensaios de terapia gnica no pas.

o vetor para o ensaio clnico de revascularizao miocrdica, iniciado em Porto alegre, foi produzido por essa empresa de servios, um evento pioneiro no pas e prenncio de novas parcerias entre o setor privado e instituies aca-dmicas nessa rea de investigao cientfica.

Por sua vez, a conscincia do papel crucial dos mecanismos de proteo propriedade intelectual nessa rea vem criando hbitos em pesquisadores an-tes desacostumados com a preocupao em patentear produtos e processos de interesse biotecnolgico. assim, a atuao da Rede de terapia Gnica tambm estimulou o primeiro depsito internacional de patente em terapia gnica sensu

Actelion (5)Bristol Myers Squibb (2)Eli Lilly (1)Genentech (3)Glaxo Smith Kline (7)Hoffman-La Roche (3)Hoosier Oncology Group (1)MedImmune LLC (1)National Cancer Institute USA (1)Office of Rare Diseases (1)Sanofi-Aventis (9)Shire Human Genetic Therapies Inc (1)St Judes Childrens Research Hospital (2)Instituto de Cardiologia do RGS + Fapergs + CNPq-Instituto do Milnio Rede de Terapia Gnica (1)


stricto efetuado por uma instituio brasileira, consequente pesquisa no labo-ratrio do autor (World Intellectual Property organization Wo2009/121157 PCt/BR2009/000093).

Conclusoainda estamos no limiar da histria da terapia gnica e tudo o que se fez

at hoje so os primeiros passos de uma longa e tortuosa caminhada (Flotte, 2007). Mas j h alguns sucessos pontuais que demonstram a viabilidade de in-corporao da terapia gnica prtica mdica. os principais avanos, at o mo-mento, encontram-se nas reas de hemofilia, alguns tipos de cncer, sndromes de imunodeficincia combinada severa e certas retinopatias.

tem havido grande progresso no planejamento e na construo de novos vetores mais seguros e eficientes (Rty et al., 2008). em particular, as respostas imunitrias dos pacientes esto sendo estudadas em profundidade, novos mode-los de estudo em animais vm sendo desenvolvidos e a pesquisa est avanando no sentido de aumentar a segurana dos ensaios clnicos.

os problemas no so triviais. Basta lembrar que, depois de todo o pro-gresso da medicina at os dias de hoje, apesar do sucesso que se obteve em no-vos tratamentos e na preveno de tantas doenas nos ltimos 150 anos, ainda lutamos contra doenas incurveis, que desafiam a imaginao e a competncia cientfica e tecnolgica de todo o mundo cientfico.

H, no entanto, razes para otimismo e a expectativa de sucesso das tec-nologias de terapia gnica vem aumentando paulatinamente. um sinal da via-bilidade de aplicao de terapia gnica em futuro prximo o investimento crescente que empresas de biotecnologia esto fazendo no desenvolvimento e na submisso de pedidos de liberao de produtos biolgicos relativos terapia gnica.

o Brasil prepara-se para participar do advento da terapia gnica na prtica mdica. o contingente de cientistas, tcnicos, mdicos e empresrios envolvi-dos nesse campo no pas ainda minsculo, comparado aos pases do Primeiro Mundo. Mas a deciso de investir nessa rea, tanto do ponto de vista financeiro quanto do ponto de vista cientfico e educacional, seguramente ter retorno significativo para a medicina brasileira do sculo XXI.

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