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© Segunda Edición

Ministerio de Salud INSTITUTO NACIONAL DE SALUD Jr. Cápac Yupanqui 1400, Jesús María Telf.471-3254 I Fax: 471-7443 Lima, Perú, 1997

Diseño e impresión: Art. Lautrec S.R.Ltda.

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MANUAL DE PROCEDIMIENTOS DE LABORATORIO PARA EL DIAGNOSTICO DE LEISHMANIASIS

COMITE RESPONSABLE Biol. Gloria Sonia Minaya Gómez

COMITÉ EDITOR: Dr. Alfonso Zavaleta Martínez- Vargas Dr. César Cabezas Sánchez Dr. Carlos Carrillo Parodio Dr. Jaime Chang Neyra

MINISTERIO DE SALUD ALTA DIRECCIÓN Dr. Mariano Costa Bauer Ministerio

Dr. Alejandro Aguinaga Recuenco Viceministro INSTITUTO NACIONAL DE SALUD Dr. Carlos Carrillo Parodio Jefe. CENTRO NACIONAL DE LABORATORIOS DE SALUD Dr. César Cabezas Sánchez Director General

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PERFIL DEL AUTOR Blgo. Gloria Sonia Minaya Gómez Bióloga Laboratorio de Leishmaniasis y Enfermedad de Chagas, División de Parasitología, Centro Nacional de Laboratorios de Salud Pública, INS, MINSA. PERFIL DE LOS EDITORES Dr. Alfonso Zavaleta Martínez- Vargas Médico Cirujano, Doctor en Farmacología Director General, Centro Nacional de Control de Calidad, Instituto Nacional de Salud, MINSA Profesor Principal, Sección Farmacología, Departamento Académico de Ciencias Fisiológicas, Facultad de Ciencias y Filosofía, Universidad Peruana Cayetano Heredia Miembro, Instituto de Medicina Tropical "Alexander Von Humbolt", Universidad Peruana Cayetano Heredia. Dr. César Cabezas Sánchez Médico Cirujano, Master en Medicina, Especialista en Enfermedades Infecciosas y Tropicales Director General, Centro Nacional de Laboratorios de Salud Pública, Instituto Nacional de Salud, MINSA. Profesor invitado de Medicina Tropical, Universidad Nacional Mayor de San Marcos y Universidad Peruana Cayetano Heredia. Dr. Carlos Carrillo Paradi Médico Cirujano, Doctor en Medicina Profesor Principal, Departamento Académico de Microbiología, Facultad de Ciencias y Filosofía, Universidad Peruana Cayetano Heredia. Jefe, Instituto Nacional de Salud Dr. Jaime Chang Neyra Médico Cirujano, Master of Science in Community Health in Developing Countries Director Ejecutivo de Certificación y Garantía de la Calidad, Centro Nacional de Control de Calidad, Instituto Nacional de Salud, MINSA, Investigador, Instituto de Medicina Tropical “AIexander Von Humbolt”, Universidad Peruana Cayetano Heredia.

Agradecimientos: El comite Editor del Instituto Nacional de Salud, agradece a los señores doctores Alejandro Uanos Cuentas, Humberto Guerra Allison y César Naquira Velarde, por la colaboración brindada en la revisión crítica efectuada al manuscrito. Al Dr. Antonio Antúnez de Mayolo por su aporte en el aspecto histopatolégico. La edición de este Manual se efectuó en el marco del Convenio de Cooperación suscrito entre el Instituto Nacional de Salud y la Universidad Peruana Cayetano Heredia.

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INDICE

Presentación ......................................................................................................................................................8 Resolución Jefatural ..........................................................................................................................................9 CAPITULO I Introducción ......................................................................................................................................................10 CAPITULO III Introducción a los Métodos de Diagnóstico de Leishmaniasis ....................................................................................................................................................12 CAPITULO III Métodos Parasitológicos de Diagnóstico de Leishmaniasis ..............................................................................15 CAPITULO IV Cultivo de Leishmanias .....................................................................................................................................20 CAPITULO V Inoculación en Hamsters ...................................................................................................................................24 CAPITULO VI Diagnóstico Histopatológico .............................................................................................................................29 CAPITULO VII Intradermo Reacción de Montenegro (Leishmanina) ........................................................................................30 CAPITULO VIII Técnica de Inmunoabsorción Enzimática (ELISA) ...........................................................................................32 CAPITULO IX Inmuno Fluorescencia Indirecta (IFI)................................................................................................................35 CAPITULO X Envío de Muestras y Resultados........................................................................................................................38 CAPITULO XI Referencias Bibliográficas.................................................................................................................................39 CAPITULO XII (Anexos) ............................................................................................................................................................41 Anexo 1 Reactivos de Coloración para la Técnica de frotís ............................................................................................42

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Anexo 2 Reactivos y Medios de Cultivo..........................................................................................................................43 Anexo 3 Reactivos y Soluciones empleadas para las Pruebas Inmunológicas......................................................................................................................................45 Anexo 4 Recomendaciones para el Mantenimiento de animales de laboratorio.....................................................................................................................................................48

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PRESENTACION

La Leishmaniasis es una enfermedad parasitaria endémica en los valles interandinos y el llano amazónico de nuestro país. El agente causal de la Leishmaniasis es un protozoario parásito del género Leishmania, del cual se han reportado 5 especies en el Perú: L. (V.) braziliensis, L. (v.) peruviana. L. (V.) guyanensis, L. m. amazonensis y L. (V.) lainsoni. De ellas, las especies L. (V.) braziliensis y L. (V.) peruviana tienen reconocida importancia epidemiológica, y son responsables de la mayoría de los casos de Leishmaniasis reportados en el país. Recientemente, se han reportado algunos casos aislados de leishmaniasis cutánea diseminada producidos por L. m. amazonensis. El agente vector de la enfermedad es un pequeño insecto díptero de la subfamilia de phlebotominae, la Lutzomyia. En los valles interandinos se observa la forma cutánea de la enfermedad (Uta) siendo el vector reconocido, la Lutzomyia peruensis. También se han implicado a otras especies como L.u. verrucarum. L.u. tejadai y L.u. ayacuchensis. En la selva amazónica predomina la forma cutáneo mucosa de la enfermedad (Espundia), sin embargo, no se conocen con precisión los vectores involucrados en la transmisión de la enfermedad en esta región geográfica. El estudio básico taxonómico y epidemiológico de la espundia se enfrenta con una mayor complejidad debido a la diversidad de nichos ecológicos, y a la escasez de recursos humanos calificados. A pesar de las ya varias décadas transcurridas de uso, los antimoniales pentavalentes (Glucantime y Pentostan) continúan siendo las drogas de elección las que conjuntamente con el Anfotericin B como droga de segunda elección, constituyen el arsenal terapéutico para el tratamiento de la leishmaniasis. Se hace patente la necesidad de estimular la ejecución de estudios de sensibilidad a los diferentes agentes, y potencializar los métodos que empleando tecnología de punta (biotecnología), permitan el desarrollo de métodos cada vez más sensibles de detección del parásito. El Instituto Nacional de Salud, organismo técnico normativo de la Red Nacional de Laboratorios de Salud, pone este manual a disposición del personal de salud, que en los diferentes niveles de atención se ven en la necesidad de tener que obtener y enviar muestras biológicas para estudio. Con esta obra, se intenta llenar el vacío existente en cuanto a normas para obtención y envío de muestras para diagnóstico de Leishmaniasis, y hace énfasis en el empleo de las técnicas de diagnóstico para el nivel local (frotís e intradermo reacción de Montenegro o leishmanina), e incluye, asimismo, las técnicas empleadas en los laboratorios intermedios y referencial (inoculación en Hamster, histopatología; cultivo, histopatología, IFI y ELISA), y las directivas generales empleadas para el envío de las muestras a dichos laboratorios intermedios y referenciales de la Red, con fines de diagnóstico, confirmación y/o control de calidad.

EL COMITE EDITOR

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CAPITULO I

INTRODUCCION

Las leishmaniasis son enfermedades antropozoonóticas, de amplia distribución, producidas por parásitos del género Leishmania y transmitidas por picaduras de flebotominos.

En nuestro país, constituyen, después de la Malaria, la segunda enfermedad metaxénica de importancia, debido a su incidencia, dispersión e impacto socio-económico. Presentan una variedad de formas clínicas, las cuales son atribuidas a la especificidad del agente etiológico causal y a los aspectos genéticos e inmunológicos del hospedero. En el Perú, se han reportado 5 especies de Leishmania: L. (V) braziliensis, L. (V) peruviana, L.(V) guyanensis, L.m. amazonensis y L.(V) lainsoni; sin embargo, sólo las 2 primeras tienen importancia epidemiológica hasta la fecha.

Existen dos formas clínicas de leishmaniasis: l. Leishmaniasis Tegumentaria y (Foto 1) 2. Leishmaniasis Visceral. En nuestro medio, no se han reportado casos de leishmaniasis visceral de modo que se señalarán sólo las técnicas de diagnóstico para la forma tegumentaria, ya sea cutánea y/o cutáneo-mucosa. En los casos típicos de leishmaniasis cutánea y mucocutánea, el diagnóstico de la enfermedad es establecido generalmente por la clínica. Algunas formas con infección agregada pueden hacer pensar en una piodermitis o un forúnculo, lo cual, se descarta por el carácter indoloro de la lesión cutánea de la leishmaniasis previo a la sobreinfección. Sin embargo, cuando existe una infección agregada, las leishmanias pueden ser difíciles de descubrir; una nueva toma de muestras después del tratamiento anti-infeccioso puede ser necesaria. El diagnóstico etiológico de las leishmaniasis está dado por la determinación de la presencia de los parásitos, directa o indirectamente, en sus formas de amastigote en la lesión y/o promastigote en los cultivos. El hallazgo de las leishmanias, constituye el único criterio confirmatorio. Este manual, está dirigido a personal con responsabilidad en el diagnóstico parasitológico de las leishmaniasis de los Laboratorios de los Establecimientos de Salud del MINSA.

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Foto Nº 1: Paciente con Leishmaniasis cutánea diseminada (LCD). (Foto cortesía Dr. A Guillén)

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CAPITULO II

INTRODUCCION A LOS METODOS DE DIAGNOSTICO DE

LEISHMANIASIS

Los métodos de diagnóstico de Leishmaniasis se agrupan en dos tipos principales.

2.1 METODOS DE DIAGNOSTICO DIRECTO (METODOS PARASITOLOGICOS)

Se basan en la determinación de la presencia de los parásitos en sus formas de amastigote en la lesión (Foto 2), y/o promastigote en los cultivos (Foto 3). Estos métodos constituyen la base fundamental del diagnóstico confirmatorio de la enfermedad o la infección activa. Incluyen: - Frotís - Cultivo - Histopatología - Inoculación en animales.

2.2 METODOS DE DIAGNOSTICO INDIRECTO (METODOS INMUNOLOGICOS)

Se basan en la detección de la enfermedad a través de la respuesta inmune celular (mediada por células) o respuesta inmune humoral, a través de anticuerpos específicos desarrollados como consecuencia de la infección. Incluyen: - Intradermo Reacción de Montenegro (Leishmanina, IDRM) - ELISA / DOT-ELISA - Inmunofluorescencia Indirecta (IFI)

En el Fluxograma N° 1 se muestran los procedimientos de laboratorio en Leishmaniasis, según tipo y procedencia de la muestra. En el Fluxograma N° 2 se detallan las pruebas de laboratorio por niveles en la Red Nacional de Laboratorios de Salud - Leishmaniasis.

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CAPITULO III

METODOS PARASITOLOGICOS DE DIAGNOSTICO DE LEISHMANIASIS

Los métodos parasitológicos permiten la determinación de la presencia de los parásitos en su forma de amastigote en la lesión y constituyen la base fundamental del diagnóstico confirmado de enfermedad o infección activa.

3.1 FROTIS DE LESION:

Consiste en el reconocimiento de las leishmanias en sus formas de amastigotes, las cuales, se encuentran dentro de los macrófagos (Foto 2). Para ello, se recomienda realizar un frotís con material tomado de los bordes (surco dérmico) de las lesiones cutáneas o inyectando intradérmicamente algunas gotas de suero fisiológico en el borde de la lesión y luego aspirándolo. En el caso de lesiones múltiples, la muestra, se tomará de las lesiones más recientes. Para casos de leishmaniasis cutánea se recomienda el frotís de lesión, o exudado de la misma, para el diagnóstico inmediato.

3.2 MUESTRA: Tejido, exudado. 3.3 MATERIAL REQUERIDO:

- Láminas portaobjetos limpias y desengrasadas - Hoja de bisturí N° 20 ó 21 - Algodón y gasa estéril. - Solución de colorante Giemsa. - Alcohol 70%. - Alcohol metílico - Solución buffer pH 7.2 - 7.4 - Micropipetas estériles (capilares sanguíneos aguzados en uno de sus extremos). - Aceite de inmersión - Lápiz marcador.

3.4 PROCEDIMIENTO DE OBTENCION DE LA MUESTRA:

1. Lavar la lesión con agua y jabón. 2. Desinfectar con alcohol 70% los bordes de la lesión. 3. Presionar con firmeza los bordes de la lesión hasta que empalidezca; en el borde

interno, hacer una pequeña incisión con hoja de bisturí tratando de levantar la piel; secar la sangre con gasa y raspar el tejido.

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4. Con el material obtenido en la hoja de bisturí, hacer el frotis en una lámina, procurando que este sea delgado y evitando pasar dos veces por el mismo sitio.

5. Rotular la lámina y dejar secar a medio ambiente. 6. Anotar los datos del paciente en la ficha epidemiológica respectiva. El frotís puede realizarse también con líquido tisular obtenido con micropipeta o con material de biopsia (tejido), o con material procedente del raspado de mucosas.

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3.5 PROCESAMIENTO DE LA MUESTRA:

1. Fijar la lámina que contiene el frotís con alcohol metílico durante 3 minutos. Descartar el alcohol y dejar secar a temperatura ambiente.

2. Cubrir la lámina con solución de trabajo Giemsa (una gota de solución Giemsa stock por cada mL de solución buffer pH 7.2 - 7.4) por 30 minutos.

3. Descartar el colorante y lavar ligeramente con agua corriente. 4. Secar al medio ambiente y hacer la lectura con lente de inmersión.

3.6 EQUIPOS:

- Microscopio de Luz.

3.7 REACTIVOS DE COLORACION

Los reactivos son detallados en el Anexo l.

3.8 ENVIO DE MUESTRA:

Sólo si el establecimiento de salud donde se toma la muestra no contara con el material requerido para efectuar la coloración y/o personal capacitado para realizar la lectura.

- Fijar con alcohol metítico durante 3 minutos. Descartar el alcohol y dejar secar a temperatura ambiente.

- Envolver las láminas, debidamente rotuladas, con papel e individualmente; hacer paquetes con un máximo de 10 portaobjetos.

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- Colocar los paquetes en caja de cartón y adicionar las fichas epidemiológicas

respectivas.

- Rotular la cubierta y enviar al Laboratorio de Referencia respectivo.

3.9 LECTURA E INTERPRETACION DE RESULTADOS

Los amastigotes se encuentran dentro de los macrófagos; son formas redondeadas u ovaladas de 1.5 - 5 u de diámetro, en cuyo citoplasma se observa dos estructuras que contienen ADN: a. Núcleo, formación mayor, redondeada y generalmente pegada a la membrana

citoplasmática. b. Un kinetoplasto, formación pequeña redondeada o en forma de bastón que tiñe más

intensamente que el núcleo. La observación de formas de amastigotes de Leishmania en los extendidos indica un resultado positivo, debiendo figurar en el resultado de la muestra: Leishmaniasis (+): observación de amastigotes de Leishmania. (Ver Foto 2).

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CAPITULO IV

CULTIVO DE LEISHMANIAS

Consiste en el aislamiento de formas de promastigotes de Leishmania mediante cultivos "in vitro" en medios bifásicos con base de Agar Sangre, a partir de material obtenido por biopsia o aspirado de lesiones cutáneas o cutáneomucosas. La técnica de cultivo ofrece ventajas sobre los frotís coloreados, aún en la confirmación de un diagnóstico presuntivo, por la fácil observación de gran número de formas de promastigotes móviles, en contraste con la dificultad y el mayor tiempo empleado en la búsqueda de formas de amastigotes.

4.1 CULTIVO DE ASPIRADO

4.1.1 MUESTRA: Linfa 4.1.2 MATERIAL REQUERIDO: (Ver Foto 4)

- jeringa estéril de 1 mL (tuberculina) con aguja N° 25 ó 26 de 1/2 pulgada. - alcohol 70%. - agua oxigenada. - suero fisiológico 0.85 %. - sulfato de estreptomicina - penicilina sódica 1 '000,000 U. - tubos con medio de cultivo Agar Sangre, NNN o Senekjie. - algodón y gasa estéril. - mechero de alcohol.

4.1.3 PROCEDIMIENTO DE OBTENCION DE MUESTRA: (Ver Figura)

El material es obtenido por el método de aspiración de Hendricks y Wright (1979), que incluye los siguientes pasos:

- Lavar la lesión con agua y jabón. - Desinfectar la zona elegida con alcohol 70% y agua oxigenada. - Con una jeringa de tuberculina, la cual, ha sido cargada previamente con 0.2

mL de solución salina estéril más antibióticos, se punza y se inyecta el contenido suavemente dentro del área decolorada de la pápula o dentro del margen no necrotizado de la úlcera.

- En seguida se aspira. La aguja y jeringa son retiradas aplicando ligera presión hacia atrás, al mismo tiempo que se gira suavemente hacia derecha e izquierda. El procedimiento es relativamente indoloro, sin embargo, puede utilizarse un anestésico local (Lidocaína al 2%).

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- Dos a tres gotas del material aspirado son inoculadas en tubos con tapa de rosca que contienen medio de cultivo NNN, Agar Sangre o Senekjie, al cual se le ha añadido 0.1 mL de solución salina que contiene 500 IU de penicilina y 500 ug de estreptomicina / mL para prevenir la contaminación.

- Mantener los tubos de cultivo a 24°C y revisarlos diariamente. Si no se dispusiera de estufa, los cultivos se pueden mantener a temperatura ambiente, siempre que ésta no exceda los 26°C.

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4.1.4 EQUIPOS:

- Microscopio de luz - Estufa

4.1.5 REACTIVOS y MEDIOS DE CULTIVO

Los reactivos y medios de cultivo son detallados en el Anexo 2.

4.2 CULTIVO DE BIOPSIA

4.2.1 MUESTRA: Tejido 4.2.2 MATERIAL REQUERIDO: Además del material requerido para el aspirado:

- Punch* de biopsia de 2 mm (para lesiones en la cara), estéril. - punch de biopsia de 4 mm (para lesiones en el cuerpo) estéril. - bisturí con hoja superscript N° 20 ó 21. - pinzas estériles. - xilocaína 2%. - papel filtro. - homogenizador y/o placas Petri. - tijeras agudas punta curva estériles. - viales.

4.2.3 PROCEDIMIENTO DE OBTENCION DE MUESTRA:

- Lavar la lesión con agua y jabón. - Desinfectar el borde de la lesión con alcohol 70% y agua oxigenada. - Anestesiar con 0.5 mL de xilocaína. - Introducir el punch en el borde de la lesión y rotar varias veces con

movimiento suave. - Retirar el punch, y con ayuda de la pinza y la hoja de bisturí, cortar la base

del trocito de tejido removido. - Presionar la lesión con una gasa hasta que deje de sangrar. Luego, cubrir la

herida. - Colocar la biopsia sobre un papel filtro para absorber el exceso de sangre**.

Enseguida, introducir en un vial que contenga solución salina más antibióticos y dejar por 2 horas.

- Triturar la biopsia en un homogenizador, mortero y/o placa estéril que * punch = sacabocado ** Utilizando una pinza, puede presionarse el trocito de tejido sobre una lámina (impronta-frotís).

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contenga 0.5 mL de solución salina más antibióticos. - Con jeringa y/o micropipeta estéril, inocular 2 a 3 gotas del homogenizado

en medios bifásicos (Agar Sangre, NNN, Seneckjie). (Ver Foto 5) 4.3 LECTURA E INTERPRETACION DE RESULTADOS

Utilizando el asa de siembra, tomar una gota del sobrenadante y observar al microscopio de luz con objetivo l0x en búsqueda de promastigotes. Sólo la observación de formas móviles de promastigotes indica positividad de la muestra (Ver Foto 3), debiendo figurar en el resultado: Leishmaniasis (+): observación de promastigotes de Leishmania. Los cultivos que permanecen negativos se descartan a los 30 días. En la Foto N° 8 se muestran los promastigotes de Leishmania en un frotís teñido con Giemsa.

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CAPITULO V

INOCULACION EN HAMSTERS

Con la finalidad de infectar, experimentalmente, al Hamster, 0.2 mL del material obtenido, sea por aspiración o biopsia (homogenizado), es inoculado intradérmicamente con jeringa de l mL y aguja N° 26 en la nariz y la almohadilla plantar de una pata posterior del Hamster (Ver Foto 6). Los animales inoculados deberán permanecer en un ambiente especial. (Ver Anexo 3). . A fin de detectar los signos aparentes de infección, el animal es revisado minuciosamente una vez por semana. La inflamación (enrojecimiento) y la aparición de una pápula en los sitios de inoculación, constituyen signos evidentes de la infección leishmaniásica. (Ver Foto 7). La confirmación diagnóstica se realiza mediante el frotís y/o el aislamiento (método del aspirado) del parásito de los sitios de inoculación. La infección se evidencia usualmente después de un mes de la inoculación, sin embargo, esto varía en función de la especie de Leishmanía infectante involucrada. Si el animal permaneciera negativo, se necropsia a las 52 semanas para realizar el cultivo de muestras de hígado y bazo.

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Foto Nº 2: presencia de amastigotes de Leishmania amazonensis

em frotis.

Foto Nº 3: Promatigotes de Leishmania (V.) braziliensis en medio de cultivo observados bajo microscopio de contraste de fases.

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Foto Nº 4: Materiales para el cultivo.

Foto Nº 5: Siembra (inoculación) en medios de cultivo bifásicos

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Foto Nº 6: Inoculación del hamster dorado

Foto Nº 7: Hamster con lesiones leishmaniásicas

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Foto Nº 8: Promastigotes de Leishmania (V.) braziliensis coloreados con Giemsa.

Foto Nº 9: Prueba positiva de Inmuno Flurescensia Indirecta

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CAPITULO VI

DIAGNOSTICO HISTOPATOLOGICO

6.1 MATERIAL:

- bisturí con hoja nueva. - viales conteniendo formol al 10%. - etiquetas y ficha de envío de muestra.

6.2 PROCEDIMIENTO:

- Las muestras se tomarán del lugar de la lesión (zona ulcerada) que se encuentra en la piel o mucosas.

- Si la lesión cutánea es pequeña (menor de 0.5 cm de diámetro) se extirpará toda ella, dando un margen de por lo menos medio centímetro de borde con tejido sano.

- Si la lesión cutánea es amplia se tomarán muestras de los cuatro cuadrantes, tratando de obtener en cada una de ellas una porción de la lesión y tejido sano adyacente.

- Las muestras se introducen inmediatamente en el vial (frasco) con formol al 10%, se rotula y envía al Laboratorio de Patología del Centro de Referencia Nacional, junto con la ficha llenada adecuadamente.

- En el Laboratorio de Patología se procede al tratamiento de la muestra; su inclusión en parafina, y posterior preparación de cortes de 3 mm de espesor. Los cortes se tiñen con Hematoxilina-Eosina y se observan al microscopio.

6.3 LECTURA E INTERPRETACION DE RESULTADOS

En los cortes la observación de amastigotes dentro de los histiocitos se considera positiva.

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CAPITULO VII

INTRADERMOREACCION DE MONTENEGRO

(Leishmanina)

Es una prueba de hipersensibilidad cutánea que permite evidenciar, a través de la reacción de induración la probable infección por Leishmania, en pacientes con enfermedad activa que tengan más de cuatro (4) semanas de evolución, personas con infección antigua o cicatrizada, e individuos con evolución tórpida de la infección que no pudo ser evidenciada directamente.

7.1 MATERIAL:

- Leishmanina de 30 ug/mL (antígeno elaborado con promastigotes de L.(V.) braziliensis) conservado en refrigeración.

- jeringa estéril de 1 mL con aguja N° 26 de ½ pulgada. - alcohol 70%. - algodón. - regla graduada en mm. - bolígrafo.

7.2 PROCEDIMIENTO:

- Desinfectar con alcohol 70% la región ventral del antebrazo izquierdo. - Inyectar vía intradérmica 0.1 mL de la leishmanina (antígeno) en la

superficie del tercio medio anterior. - Llenar la ficha epidemiológica con los datos del paciente. - Recomendar al paciente la observación de no beber bebidas alcohólicas, ni

fumar, ni frotarse en el área de aplicación.

En los sujetos infectados, esta inyección produce una reacción de hipersensibilidad al antígeno de la Leishmania.

7.3 LECTURA E INTERPRETACION DE RESULTADO

Hacer la lectura a las 48 horas; el máximo permisible es 72 horas de inyectado el antígeno. En las personas que muestran reacción positiva al antígeno (leishmanina), se observa, generalmente, una zona rojiza e indurada en el sitio de inoculación.

En la lectura: a. Para delimitar el área de la reacción, utilizar un bolígrafo y trazar sobre la piel, desde

uno de los extremos hacia el punto de inoculación, avanzando hasta encontrar resistencia. Repetir siguiendo los cuatro cuadrantes.

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b. Medir el diámetro de la pápula con una regla graduada en mm.

Si uno de los diámetros de la induración en el sitio de inoculación es de 5 mm o mayor se considera la IDRM positiva.

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CAPITULO VIII

TECNICA DE INMUNOABSORCION

ENZIMATICA (ELISA)

Es una prueba sensible, que nos permite detectar y cuantificar antígenos o anticuerpos en fluídos biológicos. El antígeno a usarse es fijado (absorbido) a una superficie sólida apropiada (placa de poliestireno), el cual, será reconocido por el anticuerpo primario en el suero a evaluarse. Para visualizar la reacción del complejo antígeno-anticuerpo, se requiere adicionar un sustrato no cromático, el peróxido de hidrógeno, el cual, por acción de la enzima peroxidasa, es transformado en un producto coloreado y soluble. La enzima a usarse debe ser estable, presentar alta actividad específica y ser de fácil unión covalente al antígeno o al anticuerpo.

8.1 MUESTRA: Suero

8.2 MATERIAL REQUERIDO:

- antígeno: proteínas totales de promastigotes de Leishmania (V.) braziliensis, conservado en refrigeración (para preparación ver Anexo 3).

- sueros: • sueros control positivos, con título de anticuerpos conocido. • sueros control negativos. • sueros de muestras problema.

- conjugados: inmunoglobulinas de carnero o cabra anti-IgG y anti-IgM humanas fracción Fab marcadas con la enzima peroxidasa.

- buffer fosfato-salino (PBS) 0.01 M, pH 7.2 - Tween 20 al 0.05 % - buffer carbonato-bicarbonato 0.06 M, pH 9.6 - HCl 2N o H2SO4 2N - KOH 0.1 N - sustrato soluble: ortophenilendiamina y peróxido de hidrógeno. - suero albúmina bovina (BSA) al 1 % o leche en polvo descremada al 5% - micropipeta multicanal. - micropipetas. - placas de microtitulación de poliestireno. - cámara húmeda (papel humedecido dentro de un envase plástico cerrado). - punteras para 20, 100 Y 200 uL.

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8.3 EQUIPOS:

- refrigerador. - estufa. - Lector ELISA para microplacas. - Impresora para lector ELISA.

8.4 PROCEDIMIENTO:

- Diluir el antígeno en el buffer carbonato-bicarbonato 0.06 M, pH 9.6 - Sensibilizar las placas colocando 100 ul del antígeno en cada pocito de la placa. - Colocar las placas en cámara húmeda e incubar a 37°C por 2 horas o en

refrigeración (4°C) por 18 horas. - Lavar 3 veces con PBS Tween 20 al 0.05 % por 10 minutos cada vez. - Adicionar 200 ul de solución de BSA al 1 % o leche en polvo descremada al 5%

(diluido en tampón carbonato-bicarbonato 0.06 M; pH 9.6) en cada pocito e incubar en cámara húmeda a 37°C por una hora. Esto evitará reacciones inespecíficas.

- Lavar 3 veces con PBS Tween 20 al 0.05 % por 10 minutos cada vez. Diluir los sueros al doble a partir de 1/10 en PBS- Tween 20 al 0.05% -leche al 1 %; colocar 100 ul en cada pocito e incubar en cámara húmeda a 37°C por dos horas.

- Lavar 3 veces con PBS Tween 20 al 0.05 % por 10 minutos cada vez. Adicionar 100 ul del conjugado marcado con la enzima peroxidasa e incubar en cámara húmeda a 37°C por una hora. Previamente, diluir el conjugado según su título en buffer PBS- Tween 20 al 0.05% - leche al 1%.

- Lavar 3 veces con PBS Tween 20 al 0.05 % por 10 minutos cada vez. - Colocar rápidamente 100 ul de la solución cromógena OPD recientemente

preparada e incubar, en oscuridad (lejos de la luz), por 30 minutos a temperatura ambiente.

- Detener la reacción adicionando 100 ul de HCl 2N o H2SO4 2N en cada pocito. - Realizar la lectura visual o en Lector de ELISA utilizando filtro de 492 nm.

8.5 LECTURA E INTERPRETACION DE RESULTADOS.

La formación del complejo antígeno-anticuerpo específico da lugar a un producto coloreado y soluble, el cual, puede ser interpretado de manera cualitativa o cuantitativa. a. Cualitativa: Mediante una simple observación visual se puede evaluar la intensidad

del color del producto soluble obtenido, en comparación con los colores obtenidos en los sueros controles positivos y negativos.

Cuando se utiliza el OPD como sustancia cromógena, el producto soluble se toma de color naranja o pardo oscuro, indicando una reacción positiva.

b. Cuantitativa: Se obtiene por medición de las densidades ópticas (grados de absorvancia) de los productos solubles mediante un lector de ELISA (espectrofotómetro). En este caso, el blanco debe dar una lectura inferior a 0.100 Y los sueros negativos, lecturas hasta de 0.200.

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8.6 FACTORES DE ERROR

Las reacciones inespecíficas, resultados falsos positivos y falsos negativos pueden ser causados por: - Reacciones cruzadas con otros tripanosomideos. - Bloqueo inadecuado de las placas. - Antígenos y conjugados mal titulados. - Solución cromógena preparada con anterioridad. - Factor reumatoide. - Placas de microtitulación inadecuadas.

8.7 OBSERVACIONES:

- Las concentraciones óptimas de los antígenos y los conjugados deberán ser determinados por titulación en bloque.

- Las muestras de sueros deberán ser trabajadas por duplicado y diluidas en serie a partir de 1/20.

- En la realización de cada prueba se utilizarán los sueros controles positivos de título conocido, y los sueros negativos, diluidos en serie. Esto permitirá determinar los títulos de las muestras en estudio.

- El volumen de los componentes, asi como los tiempos de incubación de las distintas etapas de la técnica de ELISA, puede variar de acuerdo a la estandarización que realize cada laboratorio.

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CAPITULO IX

INMUNOFLUORESCENCIA INDIRECTA (IFI)

Es una prueba que permite detectar la presencia de anticuerpo anti-Leishmania en suero de pacientes. Se utiliza como antígeno, promastogite de Leishmania, el cual es fijado con acetona fría a la lámina portaobjeto, sobre el que se colocarán diferentes diluciones de los sueros a evaluar. La reacción Antígeno-Anticuerpo es visualizada por la adición de una Inmunoglobulina anti-humana marcada con isotiocianato de fluoresceína, dando lugar a una reacción fosforescente color verde manzana, a través de un microscopio de inmunofluorescencia con iluminación UV apropiada.

9.1 MUESTRA: Suero 9.2 MATERIAL REQUERIDO:

- antígeno: promastigotes de Leishmania - sueros:

• sueros control positivos con título conocido de anticuerpos. • sueros control negativos. • sueros de muestras problema.

- conjugado: inmunoglobulina anti-IgG y anti-IgM marcadas con isotiocianato de fluoresceína.

- buffer fosfato salino (PBS) pH 7.2 - buffer fosfato salino (PBS) pH 7.2 - Tween 80 all % - azul de Evans. - glicerina bufferada, pH 8.5 - placas de microtitulación de poliestireno. - laminillas cubreobjetos 22 x 22 mm. - papel filtro. - cámara húmeda (placa petri conteniendo papel húmedo).

9.3 PREPARACION DE ANTIGENO:

- Cultivar formas promastigotes de Leishmania en medio bifásico de agar sangre. - A los 8 días de crecimiento, remover la parte líquida del medio y centrifugar a

2500 rpm/10 minutos. - Descartar el sobrenadante y lavar el sedimento, dos veces, por centrifugación a

2500 rpm por 10 minutos con PBS. - Descartar el sobrenadante y resuspender en PBS-formalina al 2 % durante 24

horas. - Descartar el sobrenadante y lavar el sedimento, dos veces, por centrifugación a

36

2500 rpm por 10 minutos con PBS. - Descartar el sobrenadante y diluir el sedimento de la centrifugación final en PBS

hasta obtener de 25 a 30 parásitos por campo microscópico (objetivo de 40 X). . - Depositar 10 uL de la solución obtenida en cada campo en que están divididas las

láminas de microscopía; absorber el exceso y dejar secar a temperatura ambiente. - Colocar las láminas en cajas portaláminas y guardarlas a -70°C ó a -20°C, hasta su

uso. .

9.4 PROCEDIMIENTO

- Retirar las láminas del congelador y dejar secar al medio ambiente. - En una placa de microtitulación, diluir al doble los sueros en PBS-Tween 80 al1 %

a partir de la dilución de 1/20. - Colocar 20 uL de cada dilución del suero, sobre las áreas de la lámina que contiene

fijado el antígeno. Para evitar la confusión con los sueros, es conveniente hacer un diagrama de ubicación de los sueros controles asi como de las muestras a ser evaluadas.

- Colocar las láminas en cámara húmeda e incubar en estufa a 37°C por 30 minutos. - Retirar de la estufa y lavar 3 veces como sigue:

Primer lavado: con ayuda de una pizeta que contiene PBS lavar la lámina evitando que el chorro caiga directamente sobre las muestras. Segundo lavado: colocar las láminas en recipientes (coplin) y cubrirlas con PBS por 10 minutos, luego descartar el PBS. Tercer lavado: proceder como en el segundo lavado.

- Utilizando papel filtro retirar cuidadosamente el exceso de PBS. - Colocar, sobre cada área que contiene el antígeno, 20 ul del conjugado marcado

con isotiocianato de fluoresceína e incubar en cámara húmeda a 37°C por 30 minutos. Previamente, diluir el conjugado según su título en buffer PBS- Tween 80 al 1 % - azul de Evans al 0.2 %.

- Lavar como se indica en primer, segundo y tercer lavado. - Secar la lámina, cuidadosamente con papel filtro, colocar glicerina bufferada y

cubrir con laminilla cubreobjeto. - Hacer la lectura en microscopio de inmunofluorescencia (objetivo de 40 X).

9.5 LECTURA E INTERPRETACION DE RESULTADOS (Ver Foto 9)

Reacción Positiva: - La formación del complejo antígeno-anticuerpo específico da lugar a una reacción

fluorescente de color verde manzana. - Como título del suero se considerará la mayor dilución que presente fluorescencia

nítida en toda la superficie del parásito.

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Reacción Negativa: - En las reacciones negativas no hay fluorescencia del parásito. - Habitualmente, el umbral de reactividad para anticueros IgG es una dilución de

1/40.

9.6 FACTORES DE ERROR

Las reacciones inespecíficas, resultados falsos positivos y falsos negativos pueden ser causados por: - Reacciones cruzadas con otros tripanosomideos. - Conjugados de título inadecuado. - Mezcla de distintos sueros. - Conjugados y sueros controles mal conservados. - Iluminación deficiente del microscopio.

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CAPITULO X

ENVIO DE MUESTRAS Y RESULTADOS

10.1 ENVIO DE LAMINAS

En el caso de leishmaniasis, deberá hacerse un mínimo de 2 láminas por muestra, una de las cuales remitirán, con el diagnóstico y ficha clínicoepidemiológica respectiva al Laboratorio de Referencia correspondiente para su control de calidad.

10.2 ENVIO DE MATERIAL CULTIVADO:

La muestra, una vez tomada conforme se ha descrito, puede enviarse al Laboratorio Regional de Referencia en Lima. El tubo conteniendo la muestra debe ser colocado en forma vertical, envuelto en algodón dentro de una cajita de cartón, en cuyo exterior se colocará una flechita indicando la posición en que se debe mantener la caja. Incluir ficha con datos clínicos y epidemiológicos del paciente. No refrigerar.

10.3 INFORME DE RESULTADOS

El resultado del diagnóstico será remitido al Programa de Metaxénicas para el tratamiento correspondiente. El siguiente fluxograma indica las rutas a seguir para informar los resultados:

39

CAPITULO XI

REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS

1. Brucker G. (1982). Las Leishmaniasis en América Latina. Fondation Rhone-Poulenc Sante. 30 pags.

2. Chavez F, Silva S, Zeledon R. (1982). Comparación de dos medios de cultivo para el

aislamiento de cepas de Leishmania. J Parasitol 68: 346-347. 3. Evans DA. (1978). Kinetoplastida. In: Methods of cultivating parasites in vitro.

London Academic Press, Taylor AER, Baker JR Editors. pags.: 55-58. 4. Evans, DA. (1989). Handbook on isolation, characterization and cryopreservation of

Leishmania. Geneva: World Health Organization. 5. Ferreira AW. (1984). Diagnóstico inmunológico. In: Diagnóstico de Malaria. Serie de

Normas Técnicas N° 85 WHO pp: 65-74, 86-96 6. Guimaraes MCS, Giovannini VL, Camargo ME. (1974). Antigenic standarization for

mucocutaneous leishmaniasis inmunofluorescence test. Rev 1nst Med Trop Sao Pau/o 16: 145-148.

7. Guimaraes MCS, Celeste BJ, de Castilho EA, Mineo JR, Diniz JMP. (1981).

Inmunoenzimatic Assay (ELISA) in Mucocutaneous Leishmaniasis, Kala-azar, and Chagas disease: An Epimastigote Trypanosoma cruzi Antigen able to distinguish between anti-Trypanosoma and anti-Leishmania antibodies. Am J Trop Med Hyg 30 (5): 942-947.

8. Hendricks L, Wright N. (1979). Diagnosis of cutaneous leishmaniasis by in vitro

cultivation of saline aspirates in Schneider's Drosophila medium. Am J Trop Med Hyg 28: 962-964.

9. Herrer A, Christensen HA, Beumer R. (1973). Reservoir host of cutaneous

leishmaniasis among Panamian forest mammals. Am J Trop Med Hyg 22: 585-591. 10. Walton B, Shaw JJ, Lainson R. (1977). Observations over in vitro cultivation of

Leishmania braziliensis. J Parasitol 63: 1118-1119. 11. World Health Organization. (1984). The leishmaniases. Geneva, Switzerland. WHO

Tech Report Ser 701. 12. World Heath Organization. (1990). Control of the leishmaniases. Geneva, Switzerland.

40

Who Tech report Ser 793. 13. Arana M, Evans DA, Zolessi A, Llanos-Cuentas, Arévalo J. (1990). Biochemical

characterization of Leishmania (Viannia) braziliensis and Leishmania (Viannia) peruviana by isoenzyme electrophoresis. Trans Roy Soc Trop Med Hyg 84: 526-529.

14. Kreutzer RD, Souraty N, Semko ME. (1987). Biochemical identities and differences

among Leishmania species and subspecies. Am J Trop med Hyg 36: 22-32. 15. Romero G, Arana M, López M, Montoya I, Bohl R, Campos M, Arévalo J, Llanos A.

(1987). Characterization of Leishmania species from Perú. Trans R Soc Trop Med Hyg 81: 14-24.

41

CAPITULO XII (ANEXOS)

42

ANEXO 1

REACTIVOS DE COLORACION PARA LA TECNICA DE FROTIS

1. Solución Giemsa Stock:

- Colorante Giemsa en polvo, certificado……………………………………0.75 g - Alcohol metílico puro……………………………..………………..............65 mL - Glicerina pura……………………………………..…………………….….35 mL

Agítese bien en un frasco con perlas de vidrio, de 6 a 10 veces al día, hasta que todo quede completamente mezclado. Manténgase siempre bien tapado. Use aproximadamente al tercer día o tan pronto como los ensayos diarios con sangre normal demuestren que es satisfactorio. Fíltrese antes del uso.

2. Solución de Trabajo Giemsa:

- Solución Giemsa Stock………………………………………………….1.0 gota - Buffer fosfato pH 7.2-7.4………………………………………………..1.0 mL

3. Solución Buffer Fosfato pH 7.2 - 7.4 :

- Na2HPO4……………………………………………………………………6.0 g - KH2PO4…………………………………………………………..…………5.0 g

Mezclar las sales, pesar l g de la mezcla y distribuir en pequeños tubos o viales. El contenido de cada uno de estos tubos se disuelve en un litro de agua destilada. Este buffer tendrá un pH de 7.2 a 7.4

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ANEXO 2

REACTIVOS Y MEDIOS DE CULTIVO

1. Solución fisiológica 0.85%

- ClNa……………………………………………………………………..0.85 g - Agua destilada………………………………………………………… .100 mL

Diluir y autoclavar.

2. Solución stock de antibióticos

- Sulfato de estreptomicina…………………………………………………..0.5 g - Penicilina sódica…………………………………………………………...0.5 g - Agua destilada……………………………………………………………..10 mL

Pesar los reactivos, diluir y filtrar con membrana Millipore N° 0.22 um. Usar 1 mL de la solución para 100 mL de solución salina.

3. Medio de cultivo AGAR SANGRE (Walton et al., 1977)

- Agar sangre Difco código B45......................................................................4 g - Agua destilada…………………………………………………………..100 mL - Solución stock de antibióticos……………………………………………..1 mL - Sangre desfibrinada de conejo……………..……………………………..15 mL

La sangre obtenida por punción cardiaca, es vertida en un matraz o balón estéril, el cual, contiene perlas de vidrio. Para desfibrinar la sangre, agitar suavemente con movimientos rotatorios, durante 10 minutos. Separar 15 mL en una probeta estéril. Preparación:

- Diluir el agar y autoclavar a 121°C por 20 minutos. - Dejar enfriar a temperatura ambiente; cuando alcance los 56°C aproxi-

madamente, agregar los 15 mL de sangre desfibrinada y 1 mL de la solución stock de antibióticos.

- Homogenizar y repartir aproximadamente 1 mL del medio en tubos de cultivo de 13 x 100 con tapa de rosca.

- Colocar los tubos en plano inclinado y dejar al medio ambiente por 2 horas. - Controlar en estufa de 37°C por 24 horas. - Conservar los tubos en refrigeración (4°C) hasta el momento de su uso.

4. Medio de cultivo NNN

- Bacto agar………………………………………………………………….1.4 g - Cloruro de sodio…………………………………………………………...0.6 g - Agua destilada……………………………………………………………..90 mL - Sangre desfibrinada de conejo…………………….……………………..13.5 mL

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- Solución stock de antibióticos……………………………………………..1 mL

5. Medio de cultivo SENEKJIE

- Bacto beef………………………………………………………….……….0.3 g - Bacto agar…………………………………………………………………….2 g - Bacto peptona………………………………………………………………...2 g - Cloruro de sodio…………………………………………………….……...0.5 g - Agua destilada……………………………………………………….…..100 mL - Sangre desfibrinada de conejo……………………………..……………..15 mL - Solución stock de antibióticos……………………………………………..1 mL

Preparación :

- Diluir el bacto beef en el agua destilada, calentar a 55°C por 20 minutos y luego aumentar la temperatura a 80°C por 5 minutos.

- Dejar enfriar. Cuando la temperatura baje a 56°C aproximadamente, agregar la peptona, el agar y el cloruro de sodio.

- Ajustar el pH a 7.2 (utilizar NaOH o HCI 1N). - Esterilizar en autoclave a 121°C por 20 minutos. - Dejar enfriar. Cuando la temperatura baje a 56°C aproximadamente, agregar la

sangre desfibrinada y la solución stock de antibióticos. Homogenizar y repartir aproximadamente 1 mL del medio en tubos de cultivo 13 x 100 con tapa de rosca.

- Colocar los tubos en plano inclinado y dejarlos al medio ambiente durante 2 horas.

- Controlar en estufa a 37°C por 24 horas. - Guardar en refrigeración hasta el momento de usar.

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ANEXO 3

REACTIVOS y SOLUCIONES EMPLEADAS PARA LAS PRUEBAS INMUNOLOGICAS

3.1 PREPARACION DE ANTIGENO PARA PRUEBA DE ELISA

- Cultivar formas de promastigotes de Leishmania en medio bifásico de Agar Sangre, hasta alcanzar la fase estacionaria de crecimiento. Remover la parte líquida del medio y sedimentar los parásitos por centrifugación. Decantar el sobrenadante, resuspender en PBS 7.2 y lavar por centrifugación a 6000 rpm por 10 minutos cada vez.

- Remover el sobrenadante y resuspender en PBS estéril a una concentración final de 10 millones de parásitos/uL.

- A fin de lisar las células (parásitos) someter a 6 ciclos consecutivos de frío (-70°C) Y calor (50°C).

- Centrifugar a 6000 rpm/10 minutos. - Retirar cuidadosamente el sobrenadante (antígeno) y congelarIo a -70°C o en

nitrogéno líquido. - Determinar la concentración de proteínas del antígeno mediante el método

espectrofotométrico de Warburg-Christian.

3.2 BUFFER FOSFATO SALINO (PBS) pH 7.2 - TWEEN 20 al 0.05%

NaCl……………………………………………….................................................8.183 g Na2HPO4 anhidro………………………………………………………………….1.051 g NaH2PO4 anhidro…………………………………………………………………..0.313 g Agua destilada c.c.p……………………...……………………………………….1000 mL

Pesar y diluir en el volumen de agua indicado; ajustar el pH a 7.2 utilizando NaOH 1 M. Agregar, 0.5 mL de Tween 20 a 1000 mL del PBS.

3.3 BUFFER CARBONATO BICARBONATO 0.06 M pH 9.6

Solución A Na2CO3 .................................................... ………………………………….6.359 g Agua destilada c.s.p................................. ………………………………….1000 mL

Solución B NaHCO3...................................................………………………………….5.040 g Agua destilada c.s.p.................................………………………………….1000 mL Agregar a la solución A una cantidad suficiente de la solución B agitando constantemente hasta obtener el pH deseado.

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3.4 BUFFER CARBONATO BICARBONATO 0.06 M pO 9.6 – BSA (SUERO ALBUMINA BOVINA) AL 1%

Albúmina Sérica Bovina (BSA fracción V)………………………………….1.0 g Buffer carbonato-bicarbonato .................. ………………………………….100 mL

3.5 BUFFER FOSFATO ACIDO CITRICO

Solución A Na2HPO4 .................................................. ………………….........................11.9 g Agua destilada c.s.p. ................................ ………………………………….1000 mL Solución B Acido cítrico.............................................………………………………….7.0 g Agua destilada c.s.p. ................................………………………………….1000 mL

3.6 SOLUCION CROMOGENA

OFD (ortofenilendiamina-HCl) ...............………………………………….10 mg Buffer fosfato - ácido cítrico....................………………………………….25 mL H2O2 30 volúmenes..................................…….............................................10 uL

3.7 BUFFER DE EXTRACCION

Urea................................................................................................................48.0 g PBS pH 7.2 ....................................................................................................100 mL

3.8 BUFFER FOSFATO SALINO Ph 7.2 – TWEEN 80 EL 1%

PBS 0.01 M. pH 7.2................................. ………………………………….99 mL Tween 80 ................................................. ………………………………….1 mL

3.9 SOLUCION DE AZUL DE EVANS

Solución stock Azul de Evans...........................................…………………………………10 mg PBS - Tween 80........................................…………………………………100 mL Solución de trabajo Solución stock ......................................... …………………………………2 partes PBS - Tween 80....................................... …………………………………8 partes

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3.10 BUFFER CARBONATO-BICARBONATO 0.5 M, pH 8.5

Solución A Na2 CO3................................................... ………………………………….5.3 g Agua destilada c.s.p. ............................... ….................................................100 mL Solución B NaHCO3 .................................................. ………………………………….4.2 g Agua destilada c.s.p. ............................... ………………………………….100 mL Mezclar 0.4 mL de la solución A con 10 mL de la solución B y verificar que el pH corresponda a 8.5. Si no es así, utilizar las soluciones A o B hasta lograr el pH requerido.

3.11 GLlCERINA BUFFERADA (Para montaje de láminas)

Mezclar nueve partes de glicerina bidestilada con una parte del buffer carbonato-bicarbonato 0.5 M, pH 8.5.v

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ANEXO 4

RECOMENDACIONES PARA EL MANTENIMIENTO DE ANIMALES DE LABORATORIO

1. Los animales (hámsters) que son inoculados, deberán ser mantenidos en un ambiente

especial (bioterio), separados de los animales limpios (no inoculados). 2. Los Hamsters, no más de 2 por jaula, contarán con un personal dedicado

exclusivamente a su cuidado, limpieza y mantenimiento. 3. Se rotularán las jaulas con la señal de PELIGRO: ANIMALES INOCULADOS Y no

se permitirá el ingreso a personal no autorizado. 4. 4. El cuarto de animales deberá estar, en lo posible, alejado de los laboratorios y de los

lugares de constante tránsito.

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Esta publicación se término de imprimir en diciembre de 1997 en los

Talleres Gráficos de Art. Lautrec S.R.Ltda. Av. Paseo de la República 731 - Lima 13

TellFax: 4237616