Upload
mikapin
View
37
Download
1
Embed Size (px)
DESCRIPTION
Allrights© belong to they who deservedhttp://artikelteknikkimia.blogspot.com/2012/03/tes-jurnal-praktikum-mikrobiolgi-jilid.html
Citation preview
TES JURNAL 6
PENGHITUNGAN JUMLAH MIKROBA DENGAN RUANG HITUNG
1. Apakah tujuan percobaan kali ini ?
- Mahasiswa mampu melakukan pengamatan mikroba pada alat hemasitometer dengan
bantuan mikroskop.
- Mahasiswa mampu melakukan perhitungan jumlah mikroba dengan menggunakan ruang
hitung.
2. Apa yang Anda ketahui mengenai perhitungan jumlah bakteri ?
Penghitungan jumlah bakteri hidup terbagi atas dua, yaitu secara (tidak langsung)
Misalnya perhitungan pengurangan jumlah substrat dan secara langsung. Penghitungan
mikroba secara langsung antara lain:
1. Plate Count (hitungan cawan)
Plate count / viable count didasarkan pada asumsi bahwa setiap sel
mikroorganisme hidup dalam suspensi akan tumbuh menjadi satu koloni setelah
ditumbuhkan dalam media pertumbuhan dan lingkungan yang sesuai. Setelah
diinkubasi, jumlah koloni yang tumbuh dihitung dan merupakan perkiraan atau
dugaan dari jumlah mikroorganisme dalam suspensi tersebut.
2. Turbidimetri
Turbidimetri merupakan metode yang cepat untuk menghitung jumlah bakteri
dalam suatu larutan menggunakan spektrofotometer. Bakteri menyerap cahaya
sebanding dengan volume total sel (ditentukan oleh ukuran dan jumlah). Ketika
mikroba bertambah jumlahnya atau semakin besar ukurannya dalam biakan cair,
terjadi peningkatan kekeruhan dalam biakan. Kekeruhan dapat disebut optical
density (absorbsi cahaya, biasanya diukur pada panjang gelombang 520 nm – 700
nm). Untuk mikroba tertentu, kurva standar dapat memperlihatkan jumlah
organisme/ml (ditentukan dengan metode hitungan cawan) hingga pengukuran
optical density (ditentukan dengan spektrofotometer).
3. Hemasitometer
Hemasitometer adalah metode perhitungan secara mikroskopis. Ruang hitung
terdiri dari 9 kotak besar dengan luas 1 mm². Satu kotak besar di tengah, dibagi
menjadi 25 kotak sedang dengan panjang 0,05 mm. Satu kotak sedang dibagi lagi
menjadi 16 kotak kecil. Dengan demikian satu kotak besar tersebut berisi 400 kotak
kecil. Tebal dari ruang hitung ini adalah 0,1 mm. Sel bakteri yang tersuspensi akan
memenuhi volume ruang hitung tersebut sehingga jumlah bakteri per satuan volume
dapat diketahui.
3. Apa yang Anda ketahui mengenai Hemasitometer ?
Hemasitometer adalah suatu alat yang dapat digunakan untuk melakukan perhitungan
sel secara cepat dan dapat digunakan untuk konsentrasi sel yang rendah. Hemasitometer
pada mulanya diperuntukkan untuk menghitung sel darah, yang ditemukan oleh Louis-
Charles Malassez.
Penghitungan konsentrasi sel pada hemasitometer ini bergantung
pada volume dibawah coverslip. Pada chamber terdapat 16 persegi besar yang memiliki
persegi-persegi kecil di dalamnya, di mana sisi persegi kecil besarnya 0,05 mm. Jika di atas
bagian yang diasah tadi diletakkan sebuah kaca penutup, maka akan terbentuk ruangan yang
tingginya 0,1 mm. Sehingga volume dari satu persegi kecil adalah 0,05*0,05*0,1 mm3=25.10-
5 mm3.
Kelebihan perhitungan sel dengan menggunakan hemasitometer adalah dapat
menghitung jumlah sel yang hidup maupun yang mati, tergantung dari pewarna yang
digunakan. Misalnya, bila pewarna trypan blue dicampukan ke dalam larutan sel maka sel
yang hidup tidak akan berwarna dan sel yang mati akan berwarna biru. Kelebihan lainnya
adalah morfologi sel dapat diamati, dapat mengevaluasi homogenitas dan data
mendeteksi kontaminasi.(id.wikipedia.org)
Hemasitometer yang akan digunakan dalam percobaan adalah tipe Neubauer-Improved.
4. Apa saja kelemahan dan kelebihan dari metode perhitungan bakteri secara
langsung ?
Keuntungan metode ini ialah pelaksanaannya cepat dan tidak memerlukan
banyak peralatan. Namun mempunyai kelemahan sebagai berikut:
Sel-sel mikroba yang telah mati tidak dapat dibedakan dari sel yang hidup.
Karena itu keduanya terhitung. Dengan kata lain hasil yang diperoleh ialah
jumlah total sel yang ada di dalam populasi. Pada beberapa macam sel eukariotik,
penambahan zat warna tertentu (misalnya biru metilen sebanyak 0,1 %) pada
sampel yang akan dihitung dapat membedakan sel hidup dari sel mati. Pada sel
khamir misalnya baik sel hidup maupun sel mati akan menyerap biru metilen
namun hanya sel hidup mampu mereduksi zat warna tersebut secara enzimatik
menjadi tidak berwarna; jadi sel-sel mati akan tampak biru.
Sel-sel yang berukuran kecil sukar dilihat di bawah mikroskop, seperti bakteri
karena ketebalan hemasitometer tidak memungkinkan digunakannya lensa
obyektif celup minyak, sehingga kalau tidak teliti tidak terhitung. Hal ini
biasanya diatasi dengan cara mewarnai sel sehingga menjadi lebih mudah dilihat.
Untuk mempertinggi ketelitian, jumlah sel di dalam suspensi harus cukup tinggi,
minimal untuk bakteri 106
selmL . Hal ini disebabkan dalam setiap bidang pandang
yang diamati harus terdapat sejumlah sel yang dapat dihitung
Tidak dapat digunakan untuk menghitung sel mikroba di dalam bahan yang
banyak mengandung debris atau ekstrak makanan, karena hal tersebut akan
mengganggu dalam perhitungan sel.
Kelemahan lain adalah sulitnya menghitung sel yang berukuran sangat kecil
seperti bakteri karena ketebalan hemasitometer tidak memungkinkan digunakannya
lensa obyektif celup minyak. Hal ini biasanya diatasi dengan cara mewarnai sel
sehingga menjadi lebih mudah dilihat. Kadang-kadang sel cenderung bergerombol
sehingga sukar membedakan sel-sel individu. Cara mengatasinya ialah mencerai-
beraikan gerombolan sel-sel tersebut dengan menambahkan bahan anti gumpal
seperti dinatrium etilen diamin tetraasetat dan Tween 80 sebanyak 0,1 %.
5. Bagaiman cara menghitung sel mikroorganisme dengan ruang hitung ?
Karena letak mikroorganisme tidak beraturan maka perlu dilakukan perjanjian supaya
tidak terjadi perhitungan dua kali, yaitu :
Sel-sel pada sisi kanan dan bawah tidak dihitung pada kotak yang sedang
diamati/dihitung.
Sel-sel pada sisi kiri dan atas tetap dihitung pada kotak yang sedang
diamati/dihitung.
6. Bagaiman metode perhitungan untuk percobaan kali ini ?
Prinsip dari perhitungan Petroff-Hauser yaitu melakukan perhitungan dengan
pertolongan kotak-kotak skala, di mana dalam setiap ukuran skala seluas 1 mm2
terdapat 25 buah kotak besar dengan luas 0,04 mm2, dan setiap kotak besar terdiri dari
16 kotak kecil. Alat haemocytometer digunakan di bawah mikroskop, sisinya
mempunyai ukuran 0,05 mm. Sedangkan satu kotak sedang berukuran nilai 0,2 mm.
Dan tebal nya adalah 0,1 mm. Jumlah sel per mL sampel dapat dihitung sebagai
berikut:
Jumlah sel dalam 25 kotak besar = Jumlah sel per kotak besar × 25 kotak
Jumlah sel per mm3 sampel = Jumlah sel dalam 25 kotak besar ×
10 ,02
Jumlah sel per ml sampel = Jumlah sel per mm3 sampel × 103
= Jumlah sel per kotak besar × 25 kotak×
10 .02
×103
Jumlah sel per ml sampel = Jumlah sel per kotak besar × 25 kotak × 50 × 103
Misalnya : didapatkan jumlah mikroba yang mau dihitung 12 sel mikroba, maka jumlah
sel per ml sampel adalah: 12 × 1,25 × 106 = 1,5 × 107.
7. Apa tujuan dilakukannya scrub pada NA miring yang berisi biakan dan tujuan
penggunaan air steril ?
Hal ini dimaksudkan agar spora Aspergillus niger dapat lepas dan tersuspensi dalam air
steril.
Penggunaaan air steril untuk membuat suspensi spora dimaksudkan agar tidak terdapat
mikrooba lain yang terlarut dalam suspensi. Tersuspensinya spora dalam air steril
ditandai dengan berubahnya warna air steril dari jernih menjadi keruh.
8. Apa tujuan dilakukannya pembersihan hemasitometer menggunakan alkohol
Sebelum dilakukan pengamatan, terlebih dahulu harus dibersihkan hemasitometer dan
cover glass dengan menggunakan alkohol. Hal ini dimaksudkan agar hemasitometer
bersih dari debu dan kuman yang dapat mengganggu perhitungan.
9. Mengapa setelah membilas, hemasitometer tidak boleh dilap dengan menggunakan
tisu biasa ?
Setelah dibilas dengan alkohol, hemasitometer dikeringkan dengan menggunakan tisu
lensa. Pada saat pengeringan, tisu lensa tidak boleh digosok-gosokkan pada permukaan
Jumlah sel per mL sampel = Jumlah sel per kotak besar × 1,25 × 106
hemasitometer. Hal ini bertujuan agar garis-garis yang terdapat pada hemasitometer tidak
hilang.
10. Setelah dilakukan 2 hal di atas, apa lagi yang harus dilakukan sebelum pengamatan
?
Permukaan lensa objektif dan lensa okuler pada mikroskop harus dibersihkan terlebih
dahulu dengan menggunakan tisu lensa. Hal ini bertujuan untuk membersihkan debu dan
kotoran yang dapat mengganggu proses penghitungan mikroba.
11. Berpakah besar pengamatan yang digunakan untuk pengamatan pada
hemasitometer ?
400 kali
12. Apa sebenarnya tujuan dilakukan pengenceran ?
Pengenceran ini dilakukan untuk memenuhi syarat penghitungan statistik, yaitu jumlah
mikroba yang dihitung tidak boleh lebih dari 100 dengan demikian, kesalahan
penghitungan dapat diminimalkan.
13. Langkah Kerja !
a. Dituangkan air steril sebanyak 5 mL pada media agar miring yang telah ditumbuhi
koloni Aspergilus niger hingga seluruh bagian media agar miring yang ditumbuhi koloni
terbasahi.
b. Digaruk (scrubbing) koloni Aspergilus niger pada media agar miring yang telah
terbasahi dengan menggunakan kawat ose hingga air steril dalam tabung terlihat keruh.
c. Dibersihkan permukaan ruang hitung (hemasitometer) dengan secarik kertas lensa yang
telah dibasahi dengan setetes air suling. Dibersihkan juga kaca tutup ruang hitung sampai
tidak lagi tertinggal sisa-sisa minyak pada permukaannya.
d. Diambil suspensi Aspergilus niger secukupnya dengan menggunakan pipet tetes dan
diletakkan pada tepi kaca tutup, maka dengan sendirinya tetesan tersebut akan mengalir
ke bawah kaca tutup dan mengisi ruang hitung.
e. Ditutup ruang hitung dengan kaca penutup dan diletakkan di atas pentas mikroskop
dengan hati-hati
f. Diamati jumlah sel kapang dengan obyektif 400 kali.
g. Dilakukan perhitungan jumlah sel kapang dalam 5 persegi besar (80 persegi kecil)
sebanyak dua kali (duplo), yaitu pada bagian atas dan bawah hemasitometer. Jika jumlah
sel kapang dalam 1 persegi kecil > 10 sel dan dalam 1 persegi besar > 100 sel, maka
suspensi kapang perlu diencerkan.
h. Pengenceran 1:10 dilakukan dengan cara 1 mL suspensi Aspergilus niger diambil dengan
menggunakan pipet ukur 1 mL dan diletakkan pada labu takar 10 mL. Kemudian,
ditambahkan air steril hingga batas labu takar dan digoyang hingga suspensi kapang
homogen.
i. Langkah 4 sampai 7 diulangi.
j. Dihitung jumlah rata-rata sel kapang dari dua kali perhitungan tersebut.