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1 - INTRODUÇÃO
A participação da fêmea eqüina no processo de seleção da espécie é de
sabida importância, atingindo seu apogeu entre os criadores árabes, que valorizam
mais as matrizes que o próprio garanhão.
O fato de a égua liberar apenas um ovócito por ciclo estral aliado a um
período de gestação longo, de aproximadamente 330 dias, limita a sua participação
genética no plantel, comparada ao garanhão que pode fecundar várias fêmeas numa
única estação, deixando uma vasta prole.
A transferência de embriões de uma égua doadora para uma receptora, com
o intuito de liberar a primeira da tarefa de gestar o embrião, tem sido a solução mais
utilizada no mundo inteiro, objetivando aumento do número de
descendentes/ano/matriz. É um recurso tecnológico que incrementa o nascimento de
produtos geneticamente superiores. Entretanto, este processo tem sido lento devido
ao fato de as éguas não responderem satisfatoriamente ao estímulo da
superovulação (TAVEIROS et al., 1999). Isto aliado ao alto custo da técnica, devido à
necessidade de manutenção de um grande número de receptoras no haras, aos
valores do material, medicamentos e meios utilizados, bem como custo do
profissional especializado para realização dos procedimentos.
As pesquisas que dêem ao criador opções economicamente mais viáveis
podem contribuir para aumentar a utilização da técnica no Brasil, país que, segundo
SQUIRE et al. (2003), é o terceiro em importância na transferência de embriões
eqüinos no mundo.
A elaboração de protocolos eficazes que determinam a superovulação na
espécie eqüina é de grande importância na evolução desta técnica, uma vez que a
obtenção de vários embriões em uma só coleta diluiria os custos das gestações
resultantes. Infelizmente, não existem produtos hormonais economicamente viáveis
para superovulação em éguas (SQUIRES et al., 2003). A diminuição do número de
receptoras seria de extrema importância, pois, segundo LAGNEAUX e PALMER
(1993), tal manutenção representa um dos maiores custos da transferência de
embriões em eqüinos. A comparação experimental entre os diferentes
medicamentos, materiais, meios de manutenção e lavagem do embrião e do útero,
apontando opções mais econômicas e tecnicamente recomendáveis, juntamente
com o aumento do número de profissionais habilitados para a execução da técnica,
também constituem pontos importante na redução destes custos.
O presente trabalho apresenta os resultados de três diferentes
experimentos, objetivando diminuir a relação receptoras/doadora (experimentos 1 e
2) e comparar 2 dos meios comerciais mais utilizados no Brasil, para os processos
de rasteamento, lavagem, manutenção e inovulação de embriões (experimento 3).
2 - REVISÃO BIBLIOGRÁFICA
CRESCIMENTO FOLICULAR EM EQÜINOS
Os mecanismos que regulam o desenvolvimento folicular até a fase pré-antral
não são completamente entendidos. Existem evidências de que este
desenvolvimento ocorra independentemente das gonadotrofinas. Os mecanismos
autócrinos e parácrinos controlam o início da foliculogênese com envolvimento de
polipeptídeos na proliferação e diferenciação celular. Entre eles, os fatores de
crescimento epidermal (EGF), fibroblástico (FGF), semelhante à insulina (IGF) e
crescimento neural (NGF), o fator transformante beta, que inclui a inibina e a ativina,
e os fatores de crescimento hematopoéticos (citoquinas), regulam esta fase
(FINDLAY, 1994).
O aumento da concentração plasmática de (FSH) é a chave para o
recrutamento dos grupos de folículos que inicia seu desenvolvimento sincronizado
sob forma de uma onda (FORTUNE, 1994). GINTHER (2000) afirma que a
emergência das ondas foliculares em eqüinos e bovinos é estimulada por um pico de
FSH. Na égua, a onda alcança o pico quando os folículos atingem o diâmetro de
13mm, ocorrendo então uma diminuição da concentração de FSH, que não impede
que 2 folículos alcancem o diâmetro de 22 e 19mm, alguns dias após o pico da onda
de FSH. Quando os folículos alcançam este diâmetro, ocorre o desvio, e um folículo
se torna dominante por crescimento contínuo até a ovulação e o outro subordinado,
que irá regredir na maioria das vezes. GASTAL et al. (2000) concluíram que o (LH)
não está envolvido no início do desvio, mas é necessário para o crescimento do
folículo, após o desvio.
Os tipos de ondas foliculares que se desenvolvem em éguas são as ondas
maiores (caracterizadas por um folículo dominante e outros subordinados) e as
ondas menores (folículos maiores não alcançam o diâmetro de um folículo
dominante). Baseado na palpação retal, uma única onda folicular maior era proposta
inicialmente para o ciclo estral eqüino. Esta onda de folículos estaria dissociada ao
redor de 6 dias antes da ovulação em um único folículo pré-ovulatório em
crescimento e vários em regressão. Vários pesquisadores publicaram trabalhos com
o uso de ultra-sonografia após este período e relataram que existem variantes deste
modelo de apenas uma onda. Em algumas raças, usualmente, apenas uma onda
maior primária se desenvolve no fim do diestro e culmina com a ovulação do folículo
dominante no estro. Em outras raças, uma onda maior secundária freqüentemente
se desenvolve no início do diestro ou durante o cio, e o folículo dominante pode ser
anovulatório como no bovino, ou ovulatório. (GINTHER, 2000).
SOUZA et al. (1999), trabalhando com potras da raça Brasileiro de Hipismo
relataram que em 21 intervalos ovulatórios estudados, 14 apresentaram uma única
onda de crescimento folicular (duração média de 19 dias) e 7 apresentaram duas
ondas de desenvolvimento folicular (duração de 21 dias).
FASE ESTROGÊNICA E PROGESTERÔNICA DO CICLO ESTRAL
O principal estrógeno presente no sangue e fluido folicular de éguas não
prenhes é o estradiol, segundo SHORT (1961). É ele o responsável pelo
comportamento das éguas em cio, reproduzindo estes sinais em éguas
ovariectomizadas, quando administrado sistemicamente (GINTHER, 1979). O edema
endometrial que ocorre no estro pode ser percebido pelo ligeiro aumento do tônus e
formato quase tubular do útero (HUGHES et al.,1977). O estradiol induz ainda o
relaxamento e o aumento do diâmetro do canal cervical, bem como um aumento da
secreção uterina, e produção de fluidos com alta capacidade lubrificante pela cérvix
e vagina durante o cio (MCKINNON e VOSS, 1992). O crescimento do ducto
glandular do endométrio uterino, as alterações histológicas do epitélio vaginal
durante o ciclo estral, o crescimento do ducto da glândula mamária durante a
mamogênese, a liberação de hormônio hipofisário, o auxílio no processo de
implantação embrionária e a potencialização dos efeitos da oxitocina e da
prostaglandinas sobre as contrações uterinas, são também resultantes da ação dos
estrógenos, segundo HAFEZ (1982)
PELEHACH et al. (2002), trabalhando com éguas ovariectomizadas e tratadas
com 5 mg de estradiol, reportaram um rápido aumento no edema uterino (6 h após
administração intramuscular), com um máximo alcançado entre 10 a 12h. O mesmo
tratamento aumentou, significativamente, o número de receptores uterinos para
progesterona, embora não tenha alterado os de estrógenos. A associação de 75mg
de progesterona ao tratamento com estradiol aumentou o grau do edema, embora
não tenha alterado o tempo do início e pico do mesmo. Nas éguas que só foram
tratadas com estradiol este edema persistiu por um tempo muito maior que nas do
controle (éguas cíclicas) e com tratamento estradiol + progesterona, sugerindo,
segundo os autores, ocorreu o envolvimento de progesterona na dissipação deste
edema.
O fluxo sangüíneo uterino em éguas cíclicas, segundo BOLLWEIN et al.
(2002), está positivamente associado com a concentração endógena de estrógenos
no plasma e negativamente associado com a de progesterona. BOLLWEIN et al.
(2003) estudaram o fluxo sangüíneo na artéria uterina e na artéria ovariana do
folículo dominante em éguas cíclicas (controle), cíclicas tratadas com estradiol e
cíclicas tratadas com Altrenogest (progestágeno). Em éguas cíclicas, houve um
aumento da circulação sangüínea na artéria uterina, no início do diestro e nos
últimos dias antes da ovulação e uma diminuição do fluxo entre o D1 e D11. Em
éguas cíclicas tratadas com estradiol, o fluxo aumentou no primeiro dia de aplicação
(D0), diminuindo nos outros dias. O mesmo tratamento diminuiu o fluxo sangüíneo
na artéria do folículo dominante durante todo o ciclo. O tratamento com
progestágeno diminuiu o fluxo sangüíneo na artéria uterina e na artéria do folículo
dominante durante todo o ciclo.
A principal fonte de progesterona são as células luteais do corpo lúteo.
Embora a progesterona tenha sido isolada do córtex adrenal e da placenta de vários
animais, a principal fonte fisiológica continua sendo o corpo lúteo. Durante o período
final da prenhez, a placenta pode ser fonte da progesterona em alguns animais
(JONES et all., 1983).
IRVINE e ALEXANDER (1997) afirmaram que o “feedback” negativo da
progesterona é muito efetivo no início do diestro e que, logo após a aplicação de
uma dose de PGF2 alfa (prostaglandina F2 alfa) em éguas neste período, ocorre um
rápido aumento das concentrações circulantes de GnRH, LH e FSH.
Os efeitos da progesterona no comportamento e as características
morfológicas da cérvix e o útero são eficazes após efeitos do estrógeno
(MCKINNON e VOSS,1992). A progesterona age no útero estimulando a secreção
do leite uterino pelas glândulas endometriais (ALLEN, 2001). As glândulas uterinas
aumentam em profundidade, mais especificamente em ramificações e tortuosidades.
A espiralização das glândulas aumenta sua capacidade funcional, depois do
desenvolvimento do ducto reto, sob a influência do estrógeno (JONES et al.,1983).
GRAY et al. (2001), revisando trabalhos sobre desenvolvimento das glândulas
uterinas, descreveram que estas, em éguas neonatas, se apresentam como simples
estruturas tubulares, assim permanecendo até o primeiro diestro da puberdade.
Segundo os autores, as observações nesta espécie sugerem a participação somente
da progesterona no desenvolvimento das glândulas endometriais.
A meia-vida fisiológica de progesterona exógena, aplicada via endovenosa
em éguas ovariectomizadas, varia de 2,5 a 20 minutos (GANJAN et al.,1975). Isto
significa que uma secreção constante é essencial para manter o nível circulatório.
O transporte dos estrógenos (particularmente, o estradiol) e dos progestágenos
(particularmente, a progesterona) no plasma é semelhante. Ambos são fracos, mas
completamente ligados à albumina. Quando os esteróides sexuais atingem a célula
alvo, são liberados das proteínas transportadoras e penetram no interior destas
células nas quais onde atuam. Quando a síntese protéica é induzida, as células alvo
funcionam. Por exemplo, uma célula glandular pode secretar, a mitose pode ser
estimulada em célula epitelial, o estro psíquico pode ser induzido se a célula alvo for
um neurônio particular ou a hipertrofia pode ser induzida em célula do miométrio
(JONES et al., 1983).
PERKINS et al. (1993) demonstraram a secreção pulsátil de progesterona, e
concluíram que, em média, 3,33 pulsos diários de liberação deste hormônio ocorrem
em éguas com 8 dias de ovulação. Em seus trabalhos, a concentração média de
progesterona para este dia foi de 7,26ng/ml. Segundo SHARP (2000), em éguas que
permanecem gestantes, a concentração plasmática de progesterona se mantém
consistentemente acima de 4ng/ml. CAIADO (2000) encontrou níveis séricos médios
de progesterona de 7,0ng/ml em receptoras selecionadas para receberem embriões,
entre os dias 4 e 8 após a ovulação. Já BERGFELT e GINTHER (1996), trabalhando
com éguas e pôneis, verificaram que a concentração de progesterona (ng/ml) foi
próxima de zero no dia da ovulação, atingindo aproximadamente de 3,0 no D2 e
11,0 no D7 em ambos os tipos de fêmeas. No D4, a concentração de progesterona
foi menor nas éguas (em torno de 7,0ng/ml) que em pôneis (em torno de 9,0ng/ml).
CALDAS et al. (1994) não encontraram diferença em relação à concentração de
progesterona entre éguas gestantes e não gestantes nos primeiros dez dias após a
ovulação. SOUZA et al. (1999), trabalhando com potras da raça Brasileiro de
Hipismo, encontraram concentrações médias de progesterona plasmática de
5,6ng/ml no quarto dia após a ovulação, permanecendo elevadas até o décimo
quarto dia, quando retornaram aos valores basais. CARVALHO (2000) cita que, após
a ovulação, as concentrações de progesterona aumentam progressivamente até o
oitavo dia.
A secreção uterina, estimulada pela progesterona, produz o leite uterino
(MCKINNON e VOSS,1992). SHARP (2000) cita que o meio ambiente uterino é
extremamente importante para o desenvolvimento do concepto eqüino e que a
progesterona é essencial para promover um ambiente favorável. Portanto, a cada
fase luteal, a égua se prepara para uma provável prenhez. O conteúdo total de
proteínas da secreção uterina no ciclo estral das éguas decresce rapidamente com o
declínio dos níveis plasmáticos de progesterona (ZAVY et al., 1979). Estes últimos
autores mostraram, mais tarde, que o incremento da proteína uteroferrina no lume
uterino é semelhante entre éguas prenhes e não prenhes entre os dias 12 e até
após o dia 14, porém, há um rápido decréscimo no dia 18 pós ovulação nas não
prenhes. MCDOWELL et al. (1987) trataram éguas com progesterona ou
progesterona associada a estrógenos, concluindo que ambos os tratamentos
aumentaram a concentração de uteroferrina, embora o tratamento com progesterona
sem associação com estrógeno tenha aumentado também a secreção de outras
proteínas uterinas que o tratamento conjugado não incrementou.
WATSON et al. (1992) estudaram a distribuição dos receptores de
progesterona e de estrógeno no endométrio eqüino, relatando que, durante o estro,
as células do estroma apresentam um aumento maior de ambos os receptores, que
as células do miométrio, epitélio luminal e do epitélio glandular. Durante o diestro, a
quantidade de ambos os receptores diminui nas células do estroma e do miométrio.
As células do epitélio luminal não alteraram a quantidade de receptores nas
diferentes fases do ciclo estral. Entre D0 e D14, não houve diferença no número de
ambos os receptores entre éguas gestantes e não gestantes. Este trabalho ratifica o
estudo de TOMANELLI et al. (1991), que chegaram às mesmas conclusões,
trabalhando com receptores solúveis de estrógeno e progesterona do endométrio de
éguas.
TRANSFERÊNCIA DE EMBRIÕES EM EQÜINOS
A primeira transferência de embriões eqüinos (TEE) que logrou sucesso foi
realizada no Japão por OGURI et al. (1972). Nos Estados Unidos da América, as
pesquisas nesta área tiveram um grande impulso quando a American Quarter Horse
Association aprovou a técnica (MCKINNON, 1999). No Brasil, os trabalhos de TEE
tiveram início em 1986, no estado de São Paulo, e foram realizados com sucesso na
raça Mangalarga (FLEURY, 1998a). Na raça Mangalarga Marchador, a técnica foi
reconhecida e aceita pelo seu Conselho Deliberativo Técnico em 1995, sendo, a
partir daí, muito utilizada (CAIADO, 2000).
Nos últimos anos, têm-se utilizado a inseminação artificial e a transferência de
embriões como ferramenta para melhoramento genético de eqüinos, ou para a
simples multiplicação de genótipos (GINTHER, 1992).
A taxa de gestação na transferência de embriões pode ser afetada pelo
método (cirúrgico e não-cirúrgico), pela habilidade técnica do operador, pela
sincronia de ovulação entre doadora e receptora, pela condição reprodutiva de
ambas as fêmeas e pela qualidade e idade do embrião no momento da transferência
(CAIADO, 2000).
A sincronização do cio entre doadoras e receptoras é condição importante
para o sucesso de um programa de transferência de embriões na espécie eqüina
(POOL et al., 1987 e SQUIRES et al., 1998). PASHEN et al. (1993) utilizaram a
aplicação de uma única dose de prostaglandina F2 alfa, durante o diestro de
doadoras e receptoras, para obter a sincronização da luteólise. ALVARENGA et al.
(1998) obtiveram a luteólise por meio da aplicação de microdose de prostaglandina,
no ponto apropriado de acupuntura, localizado no espaço lombo sacral.
HUHTINEN et al. (1996) obtiveram índices de recuperação embrionárias
menores à medida que o tempo decorrido entre a ovulação da doadora e a
inseminação artificial foi aumentado. As éguas foram divididas em quatro grupos,
sendo o primeiro inseminado antes da ovulação e os outros 8-16, 16-24 e 24-32
horas após a ovulação, obtendo, respectivamente, as seguintes taxas de prenhez:
45; 36; 30 e 20%.
ALVARENGA et al. (1993) citaram que as vantagens da utilização da solução
de Ringer com lactato de sódio, durante as lavagens uterinas, visando à
recuperação de embriões de doadoras eqüinas, expressam-se por menor custo
financeiro e maior facilidade de ser encontrado, uma vez que é um produto
rotineiramente usado na clínica hospitalar. Além disso, apresentam índices similares
de recuperação e de qualidade de embriões, quando comparados aos do PBS
(solução salina tamponada com fosfato). FLEURY (1998a) e CARVALHO (2000)
também utilizaram a solução de Ringer com lactato de sódio para lavagens uterinas,
objetivando recuperação embrionária.
A recuperação não cirúrgica de embriões feita por meio de lavagens uterinas
em um sistema fechado, com um tipo especial de sonda (BIVONAR Inc. Gary.
Indiana. USA) apropriada para utilização em éguas, adaptada a uma extensão de
silicone, unida a um filtro para coleta de embrião (75 micras), tem sido utilizado por
vários pesquisadores, demonstrando sua eficiência (ALVARENGA et al., 1993;
RIERA e MCDONOUGH, 1993; ALLEN, 1994; FLEURY, 1998a). SQUIRES et al.
(2003) afirmaram que esta técnica permanece praticamente inalterada nas duas
últimas décadas.
Segundo BETTERIDGE (1997), o tempo de transporte ovidutal na égua é
mais demorado que em outros mamíferos, em torno de 5 ou 6 dias, e que, por isto,
os embriões entram no útero nos estádios finais de mórula ou no início de
blastocisto. BATTUT et al. (1997) mostraram que esse tempo é ainda mais longo,
demorando em torno de 6,0 a 6,5 dias.
IULIANO et al. (1985) obtiveram índices de recuperação embrionária similares
estatisticamente, quando a coleta foi realizada no dia 7 (75,5%) ou 8 (81,9%), após a
ovulação da doadora. Já SQUIRES et al. (1998) afirmaram que os melhores índices
de recuperação embrionária ocorrem quando as lavagens são feitas no sétimo ou
oitavo dia, após a ovulação da doadora, mas aconselham a lavagem no sexto dia
após, a ovulação, quando se pretende congelamento do embrião. WILSON et al.
(1991) não obtiveram nenhum embrião, quando realizaram coletas não-cirúrgicas de
potrancas de 2 anos, no quinto dia após a ovulação (120h), inseminadas com doses
apropriadas de espermatozóides viáveis. Foram obtidos 51 embriões viáveis e 19
inviáveis em 120 lavagens em potras da mesma faixa etária, quando a recuperação
embrionária ocorreu no sexto dia após a ovulação (144h). FLEURY (1998a) obteve
índices de 49,3; 58 e 54,5%, quando realizou a recuperação embrionária,
respectivamente, nos dias 7, 8 e 9, após a ovulação.
SQUIRES et al. (2003) afirmaram que quase todos os embriões
recuperados em programas de transferência em eqüinos são transferidos por meio
de técnica não cirúrgica, utilizando um inovulador apropriado ou pipeta de
inseminação eqüina envolvida por proteção plástica. Por esta técnica, o embrião é
depositado no corpo ou corno uterino pela cérvix.
MCKINNON e SQUIRES (1988) classificaram os embriões eqüinos em 5
graus de qualidade, de acordo com a compactação dos blastômeros, número de
blastômeros danificados ou extrusados, forma do embrião, integridade da blastocele
e da zona pelúcida, do estágio de desenvolvimento comparado a idade do embrião,
em :
1-Excelente. É um embrião ideal, esférico, com células de tamanho, cor e textura
uniformes.
2-Bom. Apresenta pequenas imperfeições, como poucos blastômeros extrusados,
formato irregular ou separação trofoblástica.
3-Regular. Embrião definido sem apresentar lesões severas no que diz respeito ao
número de blastômeros extrusados, células degeneradas ou colapso de blastocele.
4-Ruim. Apresenta problemas severos como colapso da blastocele, numerosos
blastômeros extrusados e células degeneradas, mas com uma massa embrionária
de aparência viável.
5-Mortos ou oócitos não fecundados. Degeneração embrionária total ou oócito não
fecundado.
SQUIRES et al. (2003) concluíram que a qualidade dos embriões é o fator
que tem o maior efeito sobre a taxa de prenhez por transferência em éguas. Citando
trabalhos anteriormente feitos em seus laboratórios, afirmaram que embriões do
grau ≥ 3 apresentam baixa taxa de prenhez. Acrescentam que embriões com
tamanho menor que o esperado pela idade e os que possuem anormalidades
morfológicas também apresentam baixa taxa de prenhez.
SELEÇÃO DE RECEPTORAS NO MOMENTO DA INOVULAÇÃO
Os vários trabalhos consultados na literatura, como SCHECHTER e
THRELFALL (1987); SCHMIDT et al. (1995); SQUIRES et al. (1998); MCKINNON
(1999); CARNEVALE et al. (2000); SQUIRES et al. (2003), indicam que para a
seleção de receptoras, com transferência de embriões, devem ser levadas em conta
o estado geral da receptora, o histórico reprodutivo, o grau de sincronia e o exame
completo da genitália no momento da seleção. Nenhum deles fez referência às
características encontradas, durante o cio e ovulação, como fator importante na
possível determinação desta seleção. Quanto ao grau de sincronia, tais autores
utilizaram receptoras ovuladas 1 dia antes até 3 dias após a sua respectiva doadora,
exceto CARNEVALE et al. (2000), que utilizaram receptoras entre 5 a 9 dias do ciclo
estral. Já CAIADO (2000) utilizou receptoras entre 4 a 8 dias do ciclo estral.
SQUIRES et al. (1998) e SQUIRES et al. (2003) preconizam que receptoras
de embriões eqüinos devem ser examinadas nos dias 4 ou 5, após ovulação, por
meio de ultra-sonografia, para verificar a presença de corpo lúteo, ausência de
fluidos ou dobras endometriais e, além disto, o trato genital deve ser examinado via
retal para observação do tônus uterino e cervical. As éguas que apresentam tônus
uterino e cervical considerados excelentes possuem taxa de prenhez maior que as
receptoras com tônus considerado marginalmente aceitável, segundo os mesmos
autores. CARNEVALE et al. (2000) demonstraram que os fatores mais importantes
na seleção de receptoras, visando à transferência de embriões em eqüinos, são o
tônus do útero e a cérvix. McCUE et al. (1999) analisaram a concentração de
progesterona de receptoras, no dia 5 após a ovulação e concluíram que as
consideradas aptas para receberem embriões apresentavam uma taxa de
progesterona significativamente maior que as rejeitadas. CARNEVALE et al. (2000)
também afirmaram que as receptoras eqüinas classificadas com tônus uterino
excelente ou bom, no momento da transferência de embriões, no dia 5 após a
ovulação, apresentaram uma taxa de gestação significativamente maior que as que
foram classificadas com tônus marginalmente aceitável.
TÔNUS UTERINO
A progesterona é o único fator produzido pelo corpo lúteo necessário para o
desenvolvimento da turgidez uterina na égua, segundo BONAFOS et al. (1994).
Estes pesquisadores monitoraram o tônus uterino em éguas prenhes e não-prenhes,
classificando-os de 1 (flácido) a 6 (túrgido). O trabalho foi conduzido do D0 ao D20
(D0= dia da ovulação) e a classificação se baseou na palpação do útero. Afirmaram
que o pico máximo do tônus, encontrado em éguas não prenhes, ocorreu entre 6 a
13 dias, e que, a partir do D13, o tônus de éguas gestantes é maior que das não
gestantes. A aplicação exógena de progesterona nestas últimas causa turgidez
uterina semelhante à de éguas gestantes, com aproximadamente 30 dias.
MCKINNON et al. (1988) trataram éguas ovariectomizadas com estradiol e
progesterona, mostrando que o aumento do tônus uterino, no início da prenhez e na
pseudo-prenhez, não é somente atribuído à progesterona, uma vez que a adição de
pequenas quantidades de estradiol (1mg) em éguas tratadas com progesterona (100
mg/dia de P4) resultou num tônus maior que o resultado do tratamento somente com
progesterona ou com progesterona na mesma dose acrescida de 5mg de estradiol.
O primeiro tratamento comentado (100mg P4 + 1mg estradiol) foi o que mais imitou
o tônus do início da prenhez. O grau de tônus uterino foi classificado de 1 (mínimo) a
4 (máximo, tônus do início da prenhez). ZAVY et al. (1979) afirmaram que o estradiol
do concepto, juntamente com a progesterona luteal, são os responsáveis pelo
aumento da turgidez do útero durante a fase de motilidade uterina.
GASTAL et al. (1998) relataram que os métodos utilizados, em diferentes
experimentos, para classificar o grau de contração uterina na égua, tiveram como
base o implante de eletrodos e a medida extraluminal do grau de estiramento
uterino. As variações na pressão têm sido estudadas com aparelhos intra-uterinos e
a atividade uterina com uso de ultra-som. Os mesmos autores utilizaram o toque
digital do útero, via palpação retal, na classificação do tônus uterino de éguas, num
escore de um a quatro, submetidas à aplicação de prostaglandina E2.
USO DE PROGESTERONA E PROGESTÁGENOS EM ÉGUAS
WEBEL (1975) foi o primeiro pesquisador a reportar o uso de um
progestágeno sintético via oral, (Altrenogest) para o controle do estro e da ovulação
em égua. Desde então, tem havido numerosas citações do seu uso para este fim
(NEELY, 1988; ALLEN et al., 1980 e SQUIRES et al., 1983). MCKINNON e VOSS
(1992) descreveram que este parece ser o único progestágeno oral realmente
efetivo em éguas. SQUIRES et al. (1983) demonstraram que o Altrenogest foi
ineficaz na indução do estro e da ovulação em éguas em anestro, fora da estação de
monta. Por outro lado, se a égua era tratada por duas semanas a partir da metade
para o final da fase transicional, um grande número delas exibiu cio e ovulação
quando comparadas com as éguas-controle não-tratadas. Os mesmos autores
também avaliaram o Altrenogest na manutenção da gestação em éguas
ovariectomizadas, nas doses de 0,022 e 0,044mg/kg, demonstrando a prevenção de
aborto em 87,5% das éguas, em ambas as doses. O crescimento folicular, a partir de
um dado momento, é inibido durante o tratamento com progestágenos, o que leva a
pressupor que o conteúdo de LH na hipófise esteja aumentado, resultando numa
secreção maior de gonadotrofina, após a cessação do tratamento.
HUGHES et al., (1980) estudaram o efeito da aplicação diária de
progesterona oleosa, via intramuscular, em éguas ovariectomizadas, e
demonstraram que, para atingir níveis plasmáticos de 4ng/ml, as doses de 50 e
100mg/dia não foram suficientes, sendo estes níveis consistentemente atingidos
com doses de 200 mg/dia (ver Figura 1). Os mesmos autores descreveram que os
níveis séricos de progesterona abaixo de 1ng/ml caracterizam o período do estro.
Figura 1-Concentrações plasmáticas de progesterona, após a administração
intramuscular (setas) de progesterona oleosa, em doses de 50, 100 e 200 mg em éguas ovariectomizadas. As linhas verticais indicam a variação da concentração em duas éguas (HUGHES it al., 1980).
ALEXANDER et al. (1991) determinaram o efeito do tratamento com
progesterona na suscetibilidade de infecção uterina, concluindo que a progesterona
pode ser nociva à saúde do útero, particularmente em éguas velhas. No entanto,
nos estudos de WEBEL (1975); ALLEN et al. (1980) e SQUIRES et al. (1983),
baseados em achados clínicos, não foi observado que o tratamento progesterônico
por 12 a 15 dias tenha alterado a fertilidade reprodutiva em éguas
ginecologicamente sadias.
NEELY et al. (1983) relataram que a terapêutica com progesterona e
progestágenos em égua é utilizada na fase de transição do anestro estacional para a
Prog
este
rona
s pla
smát
icas
ng/
ml
Injeção Tempo
estação de monta, no controle dos folículos ovarianos, na supressão do cio, na
suplementação da progesterona endógena para manutenção da gestação e como
auxiliar no tratamento da involução uterina e retenção de placenta.
REGULAÇÃO DO ESTRO EM ÉGUAS NA FASE DE TRANSIÇÃO REPRODUTIVA
Segundo SILVIA et al. (1986), ocorre um desbalanceamento hormonal
durante o período de transição para a estação de monta, com uma alta secreção de
FSH e baixa secreção de LH. Durante o inverno, as reservas hipofisárias de LH e
reservas hipotalâmicas de GnRH ficam extremamente baixas. As concentrações de
GnRH no hipotálamo são prontamente repostas após o solstício de inverno,
enquanto as reservas hipofisárias de LH aumentam de forma mais lenta. Este
cenário hormonal resulta em desenvolvimento folicular sem ovulação, segundo estes
autores. WEBEL (1975) afirmou que o objetivo de qualquer tratamento hormonal,
durante o período de transição, é o de acelerar a primeira ovulação da estação e,
conseqüentemente, suprimir os longos e erráticos períodos de cio.
Baseado no sucesso do Altrenogest para a regulação do estro em éguas
transicionais, foi conduzido um experimento, sob condições controladas, envolvendo
441 éguas adultas em 17 locais diferentes, por WEBEL e SQUIRES (1982). O
Altrenogest foi administrado na dose recomendada de 0,044mg/kg por 14 dias,
durante os meses de janeiro a maio, que representa o período de transição do
anestro invernal para a estação fisiológica de cobertura, no hemisfério norte. Durante
o tratamento, o estro foi suspenso em 262 de 278 éguas (94%). As éguas que foram
tratadas antes de 15 de março não exibiram cio ou ovularam antes do controle. No
entanto, o tratamento com Altrenogest no final da fase transicional (após 15 de
março) resultou no acurtamento do estro pós-tratamento do intervalo de concepção,
das éguas tratadas versus éguas-controle. Tais dados sugerem que Altrenogest
ajuda na normalização do ciclo estral no final da fase transicional. Outros
pesquisadores descreveram o uso de progesterona injetável no controle do estro em
éguas em fase de transição (LOY et al., 1981).
SINCRONIZAÇÃO RECEPTORA/DOADORA
POOL et al. (1987) utilizaram 22 mg/dia de Altrenogest (progestágeno), em
éguas destinadas a serem receptoras de embriões e não sincronizadas com as suas
respectivas doadoras, com início do tratamento no dia da ovulação da doadora.
Preconizaram a realização deste tratamento em éguas no início de diestro. Já
PARRY-WEEKS e HOLTAN (1987) obtiveram taxa de prenhez de 77% (10/13)
durante a transferência não cirúrgica de embriões em receptoras eqüinas tratadas
com 0,044mg/kg/dia de altrenogest. Com este tratamento, as receptoras ovuladas 3
dias antes ou 2 dias após a doadora foram usadas no experimento, possibilitando
esta taxa, com embriões oriundos de doadoras com 7 dias de ovulação.
HINRICHS e KENNEY (1987) trataram 2 grupos de éguas ovariectomizadas,
destinadas a serem receptoras de embriões, com 300mg de progesterona em óleo,
via intramuscular. No primeiro grupo, o tratamento foi iniciado 2 dias após a ovulação
da doadora e, no segundo, 4 dias antes da ovulação da sua respectiva doadora. A
taxa de prenhez aos dezoito dias, confirmada por exame ultra-sonográfico, foi muito
maior no primeiro (6/8) que no segundo grupo (1/12). De acordo com os
pesquisadores, estes resultados confirmam a necessidade de uma sincronização
entre a ovulação da doadora e o início da aplicação de progesterona.
INIBIÇÃO OU POSTERGAÇÃO DO CIO
MCKINNON et al. (1988), mostraram que é possível a postergação da
ovulação por meio da administração oral de Altrenogest. ALMEIDA (1990)
trabalhando com éguas no cio do potro, conseguiu o bloqueio do cio e da ovulação
em 100% das éguas tratadas diariamente com 0,044mg/kg/dia deste produto.
SQUIRES et al. (1983) comprovaram que é possível suprimir o estro por tempo
prolongado, usando o mesmo progestágeno.
LOY e SWAN (1966) trabalharam com progesterona oleosa, aplicada via
intra-muscular diariamente, relatando que na dose de 100mg ou mais, o cio e a
ovulação foram inibidos. HOLTAN et al. (1977) utilizando o mesmo produto,
obtiveram resultados semelhantes.
MANUTENÇÃO DA GESTAÇÃO
Uma baixa concentração de progesterona, no início da prenhez, tem sido
considerado um dos sinais associados à perda embrionária (DOUGLAS et al. 1985;
GINTHER 1985). O valor de 2,5ng/ml no dia 12 do ciclo estral foi usado como um
valor crítico, abaixo do qual as éguas foram consideradas com disfunção luteal
(DOUGLAS et al., 1985 e SQUIRES et al., 1885). HINRICHS e KENNEY (1985)
demonstraram que éguas ovariectomizadas, tratadas com 300mg de progesterona,
mantiveram a gestação, após a transferência de embrião. PARRY-WEEKS e
HOLTON (1987) obtiveram o mesmo sucesso com éguas ovariectomizadas, usando
Altrenogest, na dose de 0,044mg/Kg.
TAMPÕES BIOLÓGICOS
Os primeiros tampões biológicos estudados foram as misturas de sais
inorgânicos, tamponados com grandes quantidades de fosfato e bicarbonato de
sódio (GONÇALVES et al., 2001). A dificuldade maior na utilização de soluções
tamponadas por bicarbonato é a necessidade do uso de atmosfera de CO2 para
manter o pH constante (MOUSSA et al., 2003a). GOOD et al. (1966), desenvolveram
o Hepes, tampão orgânico para pesquisas biológicas, que mantém o pH de maneira
mais eficiente e mais constante que o da utilização única de bicarbonato. Além disto,
apresenta máxima solubilidade em água, dificuldade em atravessar a membrana
celular, não forma complexo com substâncias biológicas, tem baixa toxicidade e não
age como inibidor em reações bioquímicas.
TAMPÕES BIOLÓGICOS DE USO NA TEE
No início da década de 1970-1980, os meios tamponados com bicarbonato
eram os mais usados para manutenção de embriões. Estes meios foram mais tarde
substituídos por outros, contendo tampão fosfato, uma vez que a necessidade de
incubação com CO2, exigida nos meios com tampão bicarbonato, inviabilizava a
técnica em nível de campo (NELSON e NELSON, 2001).
A solução tamponada por fosfato, modificada por Dulbeco (DPBS), foi
utilizada por vários pesquisadores na transferência de embriões em eqüinos e
bovinos. MCKINNON (1999) relatou seu uso na coleta de embriões eqüinos,
acrescida de 1% de soro fetal bovino, no momento da lavagem uterina, visando à
recuperação embrionária. O mesmo autor descreve a utilização do DPBS com 10%
de soro fetal bovino (SFB), para o rasteamento e inovulação do embrião. SQUIRES
(1995) e EAST et al. (1999) também aconselham o uso de DPBS para os mesmos
objetivos, acrescentando que, se o embrião for inovulado em tempo inferior a uma
hora, poderá permanecer à temperatura ambiente em DPBS + 10% SFB. Havendo
necessidade de um tempo maior de armazenamento, os autores recomendam a
utilização de Ham’s F10 em atmosfera de CO2. CARNEY et al. (1991), ALVARENGA
et al. (1993), CAIADO (2000), CARVALHO (2000) e PASHEN et al. (1993) também
utilizaram, com sucesso, o DPBS com SFB ou BSA (soro albumina bovina) em
diferentes etapas da TEE. FLEURY (1998b) obteve uma taxa de gestação de 73,3%
quando utilizou embriões transportados em temperatura ambiente (23 a 35ºC), por
um período máximo de 60 minutos, envoltos em meio DPBS.
HAFEZ, (1995) descreveu que o uso de macromoléculas, como a extraída do
soro de bezerros, em adição ao meio, tem função de impedir a aderência do embrião
ao vidro ou plástico, utilizados durante o processo de manipulação. Segundo
NELSON e NELSON (2001), somente no início da década de 1990-2000, surgiram
as primeiras pesquisas que se preocuparam em retirar BSA ou soro dos meios, com
o objetivo de evitar a transmissão de doenças. Isto somado ao aumento das
pesquisas sobre produção in vitro de embriões, e aumentou o interesse para
encontrar alternativas ao uso do DPBS. Entretanto, GONÇALVES et al. (2001)
afirmaram que o uso de soro heterólogo diminui, consideravelmente, o risco de
transmissão de doenças.
NELSON e NELSON (2001) apontaram o Hepes como um sistema tampão
eficiente e estável em atmosfera de oxigênio.
CARNEVALE, et al. (1987) compararam a taxa de prenhez aos 14 dias, de
éguas inovuladas com embriões resfriados a 5oC, em Ham’s F10 com atmosfera
CO2 (5% CO2, 5% O2 e 90% N2) ou tampão Hepes, e relataram uma taxa de
prenhez maior (70% versus 20%) quando o meio utilizado foi o Ham’s F10 em
atmosfera de CO2. FLEURY et al. (2002) utilizaram o meio Ham’s F-10, com tampão
Hepes, na transferência não cirúrgica de embriões eqüinos, a fresco e resfriados por
até 18 horas, com diferentes diâmetros. Concluíram que o meio é satisfatório para
todos os casos empregados, com taxa de prenhez em torno de 75%.
Os meios que utilizam tampão Hepes ou Zwitteriônico têm sido os mais
utilizados em substituição ao DPBS, na indústria de transferência de embriões em
bovinos nos Estados Unidos da América (NELSON e NELSON, 2001). O tampão
Zwitteriônico apresenta um íon tamponante, metabolicamente inerte, que não
atravessa a barreira celular, estabiliza a zona pelúcida e previne uma possível
inibição do desenvolvimento que pode ser causado pelo tampão fosfato
(SESHAGIRI et al.,1991).
BARROS et al. (2000) compararam os resultados, na transferência e
armazenamento de embriões bovinos de 2 meios, contendo diferentes tampões:
fosfato e Zwitteriônico, em ambiente tropical. Concluíram que não existiu diferença
significativa na taxa de prenhez em vacas que inovuladas com embriões a fresco,
mantidos em um ou outro meio. Porém, afirmaram que somente o tampão
Zwitteriônico pode ser utilizado para embriões destinados ao congelamento.
A composição química de meios freqüentemente usados na transferência de
embriões em animais domésticos foi descrita por HAFEZ (1982) e se encontra no
apêndice deste trabalho.
USO DE TAMPÕES BIOLÓGICOS EM OUTRAS BIOTÉCNICAS DE REPRODUÇÃO ANIMAL
Diversos trabalhos, na área de biotécnicas da reprodução, têm usado e
comparado o efeito do tampão Zwitteriônico com outros comumente utilizados.
WALKER et al. (1989) estudaram a substituição de bicarbonato por Hepes (ácido N-
2-hidroxietilpiperazina-N’-2-etanosulfônico), em quantidades crescentes de 0; 6,25;
12,5; 18,75 e 25mM, no meio de cultivo de embriões ovinos. Comprovaram um efeito
adicional na capacidade tamponante, porém com aumento de danos aos
blastocistos, em concentrações superiores a 12,5mM. MOUSSA et al. (2002)
compararam a taxa de prenhez e o número de células mortas, em embriões eqüinos
resfriados por 24 horas, em meio contendo tampão bicarbonato ou Zwitteriônico.
Concluíram que não existiu diferença significativa entre os meios, nem na taxa de
prenhez após transferência nem no número de células mortas, após o tempo de
cultivo. MOUSSA et al. (2003a) estudaram a viabilidade e o índice de apoptose, em
embriões eqüinos estocados sob meios tamponados com bicarbonato e
Zwitteriônico, concluindo que não existiu diferença significativa no índice de
apoptose e de células mortas, nos 2 diferentes meios.
DONNISON et al. (1996) analisaram o desenvolvimento embrionário e o
incremento do metabolismo de blastocistos bovinos cultivados por 24 ou 48 horas,
sob temperatura de 25oC, em dois diferentes meios contendo tampões fosfato ou
Zwitteriônico. Seus resultados apontam uma maior viabilidade embrionária e um
aumento na taxa metabólica (incremento na produção de CO2), em embriões
mantidos em meio com tampão Zwitteriônico. MOUSSA et al. (2003b) também
compararam três meios distintos, objetivando resfriamento de embriões eqüinos,
com dois diferentes tampões: bicarbonato (Ham’s F10) e Zwitteriônico (Emcare e
ViGro holding plus). Tais autores descreveram que os meios com tampão
Zwitteriônico não apresentaram diferença estatística, quando comparados ao meio
com tampão bicarbonato, na taxa de prenhez e na quantidade de células mortas,
após período de resfriamento. Também demonstraram que embriões maiores que
400µm, podem ter uma maior viabilidade, após 24 horas de resfriamento, que os
menores de 400µm, por apresentarem, significativamente, um número menor de
células mortas.
RUBIO POMAR et al. (2004) relataram que embriões de suínos,
armazenados por 24 horas em meio com tampão Zwitteriônico (Emcare),
apresentaram, significativamente, menores danos que os armazenados em meios
com tampão fosfato (DPBS e TCM 199). No mesmo experimento, os embriões
maiores (5 dias versus 4 dias) e os que foram incubados a temperaturas mais altas
(36oC versus 18 e 25oC) também apresentaram, significativamente, maiores danos e
maior quantidade de embriões degenerados, em ambos meios.
COUTINHO da SILVA et al. (2002) utilizaram o Emcare no “flushing” de
folículos de éguas doadoras de ovócitos, nos 10 minutos finais de cultivo e como
meio de transferência dos ovócitos. Tornaram-se prenhes 15 das 17 receptoras
destes ovócitos.
KEEFER et al. (2002) utilizaram, com sucesso, o Emcare no momento de
desnudar e enuclear os ovócitos destinados à produção de cabras clonadas por
transferência nuclear, usando células somáticas adultas.
3 - REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
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4-TRABALHOS
4.1 SELEÇÃO DE ÉGUAS RECEPTORAS DA RAÇA MANGALARGA MARCHADOR POR MEIO DA AVALIAÇÃO DAS CARACTERÍSTICAS DOS SEUS ÓRGÃOS GENITAIS NO DIA DA OVULAÇÃO.
4.2 TRATAMENTO DE ÉGUAS DA RAÇA MANGALARGA MARCHADOR COM PROGESTERONA (P4) OU ALTRENOGEST VISANDO À SUA UTILIZAÇÃO COMO RECEPTORAS DE EMBRIÕES NO SEGUNDO DIA APÓS A OVULAÇÃO.
4.3-COMPARAÇÃO ENTRE 2 MEIOS, COM DIFERENTES TAMPÕES (FOSFATO E
ZWITTERIÔNICO), USADOS ROTINEIRAMENTE NA TRANSFERÊNCIA DE
EMBRIÕES EM ÉGUAS DA RAÇA MANGALARGA MARCHADOR.
SELEÇÃO DE ÉGUAS RECEPTORAS DA RAÇA MANGALARGA MARCHADOR POR MEIO DA AVALIAÇÃO DAS CARACTERÍSTICAS DOS SEUS ÓRGÃOS
GENITAIS NO DIA DA OVULAÇÃO
RESUMO
Durante a estação de monta de 2001 e 2002, 193 éguas da raça Mangalarga
Marchador, receptoras de embriões, foram avaliadas por palpação retal, para exame
das características dos órgãos genitais no dia da ovulação (D0). As éguas
consideradas indesejadas - tônus uterino classificado como 1, 3 ou 4; presença de
folículos com diâmetro maior que 20mm e/ou fechamento cervical), totalizando 58
(30,05%) - apresentaram significativamente o tônus do útero como a maior causa de
depreciação. Estas éguas, em sua maioria (44 ou 75,86%), foram descartadas da
transferência ao exame no D5 (P<0,05). As que foram selecionadas, para serem
inovuladas na mesma data, apresentaram um índice de prenhez de 50%. Das que
apresentaram condições desejáveis dos órgãos genitais, no dia da ovulação - tônus
uterino classificado como 2, ausência de folículos com diâmetro maior que 20mm e
abertura cervical - totalizando 135 (69,95%) receptoras, a maior parte delas (88 ou
86,27%) foi selecionada para inovulação no D5 (P<0,05), apresentando uma taxa de
prenhez de (79,03%), estatisticamente significativa.
Estes resultados permitem inferir que as receptoras que ovulam com
condições indesejáveis da genitália, podem ser descartadas da transferência de
embriões naquele ciclo.
Palavras-chave: eqüino, Mangalarga Marchador, transferência de embriões, seleção
de receptoras.
ABSTRACT
During the reproductive season of 2001 and 2002, 193 mares of the Mangalarga
Marchador breeding were evaluated with the objective of choosing the ones destined
to be inovulated. The evaluation was performed through the examination of the
characteristics of genital organs on the day of ovulation (D0). 58 mares (30.05%)
were considered not appropriate (uterine tonus classified as 1, 3, or 4, the presence
of follicle with diameter greater than 20mm, and/or closed cervix). The uterine tonus
was the cause considered statistically superior for declassification. Between these
mares, 44 (75.86%) were taken off the transference program during the exam on D5
(P<0.05). The ones selected to be inovulated in the same day presented a pregnancy
rate of 50%. 135 recipients (69.95%) presented genital organs considered
appropriate conditions in the day of ovulation (uterine tonus classified as 2, absence
of follicle with diameter greater than 20mm, and open cervix). 88 of them (86.27%)
were selected for inovulation on D5 and presented a pregnancy rate of 79.03%, what
was considered statistically significant (P<0.05). These results allow us to infer that
recipients ovulating with genital organs in undesirable conditions may be taken off
the program during that estrous cycle.
Keywords: equine, Mangalarga Marchador, embryo transfer, selection of recipients.
INTRODUÇÃO
Na rotina de exame ginecológico da fêmea eqüina, visando à transferência de
embriões, é comum que os veterinários façam apenas o controle do
desenvolvimento folicular, por meio de palpação retal, com anotações minuciosas do
tamanho e consistência dos folículos, ficando este exame restrito aos ovários, na
grande maioria das vezes. O exame completo da genitália, estendendo-se ao útero e
à cérvix, poderia trazer mais informações no momento da transferência de embriões.
Tal exame restrito aos ovários tem por base o fato de que no início dos trabalhos de
transferência de embriões na espécie eqüina, a seleção de receptoras levava em
conta, principalmente, o grau de sincronia entre doadoras e receptoras, utilizando-se
somente receptoras que tivessem ovulado dois dias antes ou um dia após a doadora
(ALLEN,1994 e SQUIRES et al., 1992). Os trabalhos consultados na literatura mais
atualizada, como Squires et al. (1998); MCKINON (1999); Squires et al. (2003);
CARNEVALE et al. (2000), indicam que para a seleção de receptoras, objetivando
transferência de embriões, devem ser levadas em conta o estado geral da receptora,
o histórico reprodutivo, o grau de sincronia e o exame completo da genitália no
momento da seleção. Entretanto, nenhum desses autores fez referência às
características encontradas durante o cio e a ovulação, como importantes na
possível determinação desta seleção. Quanto ao grau de sincronia, utilizaram
receptoras ovuladas um dia antes até três dias após sua respectiva doadora, exceto
CARNEVALE et al (2000), que foram utilizadas receptoras ovuladas entre 5 a 9 dias
antes da inovulação. Já CAIADO (2000) usou receptoras ovuladas entre 4 a 8 dias
antes da transferência e JASKO (2002) usou receptoras com intervalo de 4 a 9 dias.
SQUIRES et al. (2003) e SQUIRES et al. (1998) preconizam que receptoras
de embriões eqüinos devem ser examinadas nos dias 4 ou 5 após a ovulação, por
meio de ultra-sonografia para verificar a presença de corpo lúteo, a ausência de
fluidos ou as dobras endometriais e que, além disto, o trato genital deve ser
examinado via retal para observação do tônus uterino e cervical. SCHMIDT et al.
(1995) afirmaram que éguas que apresentarem, neste exame, fluidos uterinos,
folículos anovulatórios e anormalidades no corpo lúteo, tornam-se desqualificadas
como receptoras. As éguas que apresentaram tônus uterino e cervical considerados
excelente apresentaram taxa de prenhez maior que as receptoras com tônus
considerado marginalmente aceitável, segundo os mesmos autores. CARNEVALE et
al. (2000) demonstraram que os fatores mais importantes, na seleção de receptoras
visando à transferência de embriões em eqüinos, são o tônus do útero e a cérvix.
McCUE et al. (1999) analisaram a concentração de progesterona de receptoras, no
dia 5 após a ovulação e concluíram que as consideradas aptas para receberem
embriões apresentavam uma taxa de progesterona significativamente maior que as
rejeitadas. CARNEVALE et al. (2000) também afirmaram que as receptoras eqüinas
classificadas com tônus uterino excelente ou bom, no momento da transferência de
embriões no dia 5 após a ovulação, apresentaram uma taxa de gestação
significativamente maior que as que foram classificadas com tônus marginalmente
aceitável.
A progesterona é o único fator, produzido pelo corpo lúteo, necessário para o
desenvolvimento da turgidez uterina em égua no início da gestação, segundo
BONAFOS et al. (1994). Estes pesquisadores monitoraram o tônus uterino em éguas
prenhes e não prenhes, classificando-os de 1 (flácido) a 6 (túrgido). O trabalho foi
conduzido do D0 ao D20 (D0= dia da ovulação) e a classificação se baseou em
toque digital do útero, via palpação retal. Afirmaram que o pico máximo do tônus,
encontrado em éguas não prenhes, ocorreu entre 6 a 13 dias, e que, a partir do D13,
o tônus de éguas gestantes é maior que o das não-gestantes. A aplicação exógena
de progesterona nestas últimas causa turgidez uterina semelhante à de éguas
gestantes, com aproximadamente 30 dias. MCKINNON et al. (1988) trataram éguas
ovariectomizadas com estradiol e progesterona, mostrando que o aumento do tônus
uterino no início da prenhez e na pseudo-prenhez não é somente atribuído à
progesterona, uma vez que a adição de pequenas quantidades de estradiol (1mg),
em éguas tratadas com progesterona (100mg/dia de P4), resultou num tônus maior
que o do tratamento somente com progesterona ou com progesterona na mesma
dose acrescida de 5mg de estradiol. O primeiro tratamento relatado (100mg P4 +
1mg estradiol) foi o que mais imitou o tônus do início da prenhez. O grau de tônus
uterino foi classificado de 1 (mínimo) a 4 (máximo, tônus do início da prenhez).
ZAVY et al. (1979) afirmaram que o estradiol do concepto juntamente com a
progesterona luteal são os responsáveis pelo aumento da turgidez do útero, durante
a fase de motilidade uterina.
Os métodos utilizados, em diferentes experimentos, para classificar o grau de
contração uterina na égua, tiveram como base o implante de eletrodos e a medida
extraluminal do grau de estiramento uterino. As variações na pressão tem sido
estudadas com aparelhos intra-uterinos, e a atividade uterina, com uso de ultra-som
(GASTAL et al. 1998). Os mesmos autores utilizaram o toque digital, via palpação
retal, na classificação do tônus uterino de éguas, num escore de 1 a 4, submetidas à
aplicação de prostaglandina E2.
O principal estrógeno presente no sangue e o fluido folicular de éguas não
prenhes é o estradiol, segundo SHORT (1961). É ele o responsável pelo
comportamento das éguas em cio, reproduzindo estes sinais em éguas
ovariectomizadas, quando administrado sistemicamente (GINTHER, 1979). A
secreção folicular de estrógenos aumenta o pico até 1 ou 2 dias antes da ovulação
(HUGHES et al., 1972) O edema endometrial que ocorre no estro pode ser
percebido pelo ligeiro aumento do tônus e pelo formato quase tubular do útero
(HUGHES et al.,1977). O crescimento do ducto glandular do endométrio uterino, as
alterações histológicas do epitélio vaginal durante o ciclo estral, o crescimento do
ducto da glândula mamária durante a mamogênese, a liberação de hormônio
hipofisário, o auxílio no processo de implantação embrionária, e a potencialização
dos efeitos da oxitocina e prostaglandinas sobre as contrações uterinas, são também
resultantes da ação dos estrógenos, segundo HAFEZ (1982).
SOUZA et al. (1999) verificaram que a produção de progesterona em potras
da raça Brasileiro de Hipismo se manteve baixa no dia da ovulação (abaixo de
0,5ng\ml) e aumentou para 5,6ng/ml no quarto dia, permanecendo elevadas até os
dias 14-16, quando atingiu níveis basais. Já BERGFELT e GINTHER (1996),
trabalhando com éguas e pôneis fêmeas, verificaram que a concentração de
progesterona (ng/ml) foi próxima de zero no dia da ovulação, atingindo
aproximadamente 3,0 no D2 e 11,0 no D7, em ambos os tipos de fêmeas.
PELEHACH et al. (2002), trabalhando com éguas ovariectomizadas e tratadas
com 5mg de estradiol, reportaram um rápido aumento no edema uterino (6 horas
após administração intramuscular), com um máximo alcançado entre 10 a 12 horas.
A associação de 75mg de progesterona ao tratamento com estradiol aumentou o
grau do edema, embora não tenha alterado o tempo do início e do pico do mesmo.
Nas éguas apenas tratadas com estradiol, este edema persistiu por um tempo muito
maior que nas do controle (éguas cíclicas) e com tratamento estradiol +
progesterona, segundo os autores, ocorreu o envolvimento da progesterona na
dissipação do edema.
O fluxo sangüíneo uterino foi estudado, em éguas cíclicas, por BOLLWEIN et
al. (2002), chegando-se à conclusão que este está positivamente associado com a
concentração endógena de estrógenos no plasma e, negativamente, associado com
a de progesterona.
Como muitos eventos do diestro dependem diretamente dos fenômenos
ocorridos no estro, a comparação das características do final da primeira fase do
ciclo estral com as do início da segunda poderia facilitar a seleção de receptoras no
momento da inovulação.
Este trabalho teve como objetivos:
1-Estabelecer critérios, objetivando possível seleção de receptoras de
embriões, no momento da ovulação.
2- Relacionar as características do sistema genital de receptoras no dia da
ovulação com as do dia da transferência.
3- Verificar a porcentagem de receptoras que ovulam com as características
dos órgãos reprodutivos consideradas ideais ou não.
MATERIAL E MÉTODOS
LOCAL DO EXPERIMENTO E ANIMAIS
O experimento foi desenvolvido em um criatório de eqüinos no município de
Guarapari-ES, nas estações de monta de 2001 e 2002. 193 éguas da raça
Mangalarga Marchador, receptoras de embriões, com idade variando de 3 a 12 anos
e condição corporal compatível com a atividade reprodutiva foram utilizadas.
Estas éguas foram mantidas em regime de campo, com pastagem de
gramínea, água e sal mineral ad libidum, sendo suplementadas diariamente com
volumoso e concentrado em bretes com cochos individuais. A sincronização do cio
foi obtida com a aplicação de uma dose de prostaglandina F2alfa no meio do diestro
(CAIADO, 2000 e CARVALHO,2000).
METODOLOGIA
Uma vez ao dia, no próprio brete de suplementação alimentar, as éguas
foram submetidas a exame do trato reprodutivo. Os dados coletados, a saber
tamanho e consistência dos folículos, ovulação, tônus uterino e cervical, foram
cuidadosamente anotados (MCKINNON, 1999).
O sistema de rufiação utilizado foi coletivo e realizado mediante utilização de
um rufião eqüino com a genitália intacta, fértil e com boa libido, conduzido próximo
das fêmeas a serem rufiadas, diariamente, permitindo-se um contato estreito entre
eles, porém separados por uma cerca de réguas que impedia as coberturas e a
recepção de coices, de ambas as partes. Caso houvesse necessidade de uma
rufiação individual, o rufião era conduzido por meio de um cabresto à presença da
fêmea, amarrada a um mourão. A manifestação ou não de cio nas éguas foi
cuidadosamente anotada.
Nos exames de palpação retal, realizados visando à seleção de receptoras
para transferência, observaram-se a presença ou ausência de corpos lúteos, o
número, o tamanho e a consistência dos folículos, o tônus uterino e cervical. A ultra-
sonografia complementava os exames, com avaliação morfológica dos corpos lúteos
e eventuais folículos, a presença de líquidos, tumores, cistos e edema uterinos, bem
como de abertura ou fechamento cervical.
O tônus uterino foi classificado de um a quatro de acordo com GASTAL et al.
(1998) e McKINNON et al. (1988), com modificações, seguindo os seguintes
parâmetros:
• Tônus 1- Mínimo tônus verificado do anestro até o início da atividade cíclica.
O formato e consistência do útero não são bem definidos no exame de
palpação retal (HUGHES et al., 1977).
• Tônus 2- O tônus proporcionado pela fase estrogênica do ciclo estral (estro),
com útero de consistência macia e formato quase tubular (HUGHES et al.,
1977). A contratilidade contrações do útero ainda não é perceptível ao toque.
• Tônus 3- O tônus da fase progesterônica do ciclo estral (diestro). O útero
apresenta formato tubular bem definido, com aumento do tônus e
consistência (HUGHES et al., 1977). A contratilidade uterina é perceptível.
• Tônus 4- Máximo tônus do início da prenhez, após o décimo terceiro dia. A
contratilidade uterina é ainda mais perceptível. O útero mantém formato
tubular e consistência mais firme.
De acordo com a tonicidade, a cérvix foi classificada como aberta ou
fechada. A abertura cervical foi constatada pela sua flacidez e mudança de formato
ao toque, resultantes de uma baixa tonicidade, ocasionada pela ação de estrógenos
(HUGHES et al. 1977). O fechamento resultante da ação de progesterona no diestro
e gestação, ocasionou uma alta tonicidade (HUGHES et al. 1977), por meio do
formato tubular e consistência firme.
Quando da detecção da ovulação, as receptoras foram classificadas em 2
grupos:
• Grupo A (n=58). Consideradas, neste experimento, como possuidoras de
condições não desejáveis nesta fase do ciclo estral. São as éguas que
ovularam e mantiveram folículos maiores que 20mm de diâmetro em um ou
ambos ovários; ovários polifoliculares; tônus uterino 1, 3 ou 4, bem como
cérvix fechada.
• Grupo B (n=135). Éguas consideradas, neste experimento, como possuidoras
de condições desejáveis do sistema genital, nesta fase do ciclo estral. Foram
as éguas que ovularam um ou 2 folículos não permanecendo outros com
diâmetro maior que 20mm no momento da ovulação do único ou do segundo
folículo, com tônus entre 2 e 3 e abertura cervical.
No momento da transferência (D5), as receptoras foram examinadas por
meio de palpação retal e ultra-sonografia, observando-se o tônus uterino e cervical,
a morfologia dos corpos lúteos e a presença de edema, cistos, fluidos ou ar uterinos
(CARNEVALE et al., 2000), sendo classificadas como excelentes, boas,
marginalmente aceitáveis ou rejeitadas, de acordo com as seguintes características:
1-Excelentes. Receptoras que apresentaram pelo menos um corpo lúteo
ecogenicamente bem definido, tônus uterino de 3 ou 4, cérvix firmemente fechada e
ausência de cistos, dobras e tumores uterinos.
2-Boas. Apresentaram corpos lúteos e tônus uterino nas mesmas condições das
anteriores, porém, com um pouco de dobra endometrial com cérvix menos
firmemente fechada que nas do grupo anterior.
3-Marginalmente aceitáveis. O corpo lúteo estava presente, porém era pequeno
(diâmetro menor que 15mm) ou de imagem ecogenicidade ruim. O útero
apresentava tônus entre 2 e 3 com ou sem presença de pequenos cistos
endometriais e a cérvix com um fechamento frágil.
4-Rejeitadas. Não apresentavam corpo lúteo ecogenicamente definido, com tônus
uterino de 2 para menos, presença de patologias uterinas e edema endometrial
pronunciado, bem como abertura cervical.
Somente as receptoras consideradas como excelentes ou boas foram
inovuladas neste experimento, utilizando-se a técnica não cirúrgica (Pashen, 1985
citado por RIERA et al., 1993 com modificações), com embriões pré-classificados
como excelentes ou bons de acordo com MCKINNON e SQUIRES (1988).
Posteriormente, as características da genitália dessas éguas no dia da
ovulação foram comparadas com as mesmas no quinto dia após a ovulação (D5),
visando a estabelecer uma relação.
EXAMES DE ULTRA-SONOGRAFIA
Os exames de ultra-sonografia foram realizados por meio de um aparelho de
ultra-som Scaner-200 Vet (Pie Medical) acoplado a um transdutor transretal linear de
7,5MHz, para a confirmação da ovulação, avaliação das características dos órgãos
reprodutivos das receptoras no dia da inovulação e para o diagnóstico de gestação.
COLETAS DE SANGUE E ARMAZENAMENTO DAS AMOSTRAS
As amostras de sangue foram coletadas de 10 éguas escolhidas ao acaso,
metade delas consideradas, no momento da ovulação, não possuidoras de boas
características do sistema genital feminino para aquela fase do ciclo estral. Nas
outras 5, as amostras foram coletadas dentro do grupo considerado possuidor de
boas características. A coleta se realizou por meio de punção na veia jugular,entre
10 e 12 horas da manhã, diariamente no período de D0 ao D5, e a seguir de 2 em 2
dias até o D13. Imediatamente após a coleta de sangue, com auxílio de um tubo
heparinizado (VacutainerR), as amostras foram centrifugadas a 2500giros/minuto,
sendo o plasma obtido acondicionado em tubo de polipropileno e imediatamente
congelado a –18ºC até a análise hormonal (CAIADO, 2000).
ANÁLISE HORMONAL
As concentrações séricas de progesterona foram obtidas por RIA
(radioimunoensaio), com utilização de kits comerciais (Coat-A-Count,DPC, Los
Angeles,CA), seguindo as recomendações do fabricante, com todas as amostras
analisadas duplamente, apresentando um coeficiente de variação menor que 5%.
ANÁLISE ESTATÍSTICA
Utilizou-se o teste Qui-quadrado (P<0,05), considerando a hipótese de
nulidade 50% de freqüência entre os grupos de receptoras classificadas como
desejáveis (Grupo A) e indesejáveis (Grupo B), segundo características dos órgãos
genitais avaliadas no dia da ovulação. A hipótese alternativa pressupõe que, no dia
da ovulação, uma maioria significativa de receptoras apresentou características
desejáveis no sistema genital, para aquela fase do ciclo estral. De forma similar,
dentro de cada Grupo (A e B), foram testados os números de receptoras com órgãos
genitais classificados como excelente ou bom, ou, marginalmente, aceitável ou
rejeitado, no dia da inovulação.
Os problemas observados nas receptoras classificadas como indesejáveis, no
dia da ovulação, foram: presença de tônus uterino 1, 3 e 4, persistência de folículos
e cérvix fechada. Analisou-se a freqüência nessas classes de problemas segundo o
teste Qui-quadro (P<0,05), considerando a hipótese de nulidade igual freqüência
entre as classes. A hipótese alternativa pressupõe a identificação de um problema
significativamente majoritário, ou seja, que ocorre com maior freqüência. Da mesma
forma, dentro de cada Grupo (A e B), foi testada a freqüência com que ocorre cada
problema identificado nos órgãos genitais das receptoras no dia da inovulação.
Para análise das concentrações plasmáticas de progesterona, utilizou-se o
delineamento estatístico inteiramente casualizado. Os tratamentos constituíram-se
na formação de 2 grupos de receptoras classificadas quanto às características do
sistema genital no dia da ovulação (Grupo A – indesejáveis e Grupo B - desejáveis)
e 5 repetições (=receptoras). Os resultados foram submetidos à análise da variância
da regressão para os teores de progesterona no período de D0 ao D13. Por meio de
derivações, calculou-se o ponto de máximo das equações de cada repetição e os
resultados foram submetidos à análise da variância (Teste F, GL=2, P<0,05).
RESULTADOS E DISCUSSÃO
As éguas da raça Mangalarga Machador, utilizadas como receptoras de
embriões, podem ser classificadas como aptas à inovulação, segundo as
características dos seus órgãos genitais. Neste experimento, a avaliação de 193
éguas receptoras no dia da ovulação, por meio de palpação retal, revelou que 58
(30,05%) apresentavam órgãos genitais com características indesejáveis, enquanto
135 éguas (69,95%) apresentavam características desejáveis (P< 0,05). Estes dados
encontram-se na Tabela 1.
Tabela 1. Classificação de éguas da raça Mangalarga Machador, receptoras de embriões, quanto às características dos seus órgãos genitais no dia ovulação em comparação com o dia da inovulação (n = 193 éguas)
Classificação dos órgãos genitais das receptoras no dia da inovulação Número de casos (%)
Classificação dos órgãos genitais de
éguas receptoras no dia da ovulação
Número de casos (%) Excelentes ou bons
Marginalmente aceitáveis ou rejeitados
Valor qui-quadrado
(χ²)
Grupo A - indesejáveis1 58
(30,05%)
14
(24,14%)
44
(75,86%)
15,52*
Grupo B - desejáveis2 135
(69,95%)
88
(65,19%)
47
(34,81%)
12,45*
Total (%) = 193
(100%)
102
(51,65%)
91
(47,15%)
0,63ns
Valor de qui-quadrado (χ²) 30,72* 1-Características não-desejáveis dos órgãos genitais na ovulação: a) tônus uterino classificado como 1, 3 e 4; b) presença de folículos com diâmetro maior que 20mm ou/e c) cérvix fechada. 2- Características desejáveis: a) tônus uterino 2; b) ausência de folículos com diâmetro maior que 20mm e c) cérvix aberta. *Teste qui-quadrado entre tipos de problemas, significativo (GL=1, P<0,05). ns- não-signifcativo.
No dia da inovulação, as éguas foram novamente avaliadas, desta vez por
meio de palpação retal e ultra-sonografia, observando-se que das 58 éguas
classificadas anteriormente como Grupo A (indesejáveis), somente 14 (24, 14%)
delas foram consideradas em excelentes ou boas condições do sistema genital,
nessa ocasião. Todavia, 44 (75,86%) éguas do Grupo A permaneceram na condição
de indesejáveis (P< 0,05), sendo classificadas como marginalmente aceitáveis ou
rejeitadas e, por isso, foram descartadas do processo de inovulação.
Observou-se que, das 193 éguas examinadas no dia da ovulação, 135
(69,95%) foram classificadas como pertencentes ao Grupo B, cujas características
do sistema genital foram consideradas desejáveis. No dia da inovulação, estas
éguas foram reavaliadas, sendo que 88 (65,19%) foram classificadas como
excelentes ou boas e 47 éguas (34,81%) como marginalmente aceitáveis ou
rejeitadas (descartadas), havendo diferença entre elas (P< 0,05).
Na avaliação das características do sistema genital, por meio do exame de
palpação retal no dia da ovulação, os seguintes resultados foram observados, para
as receptoras pertencentes ao Grupo A (indesejáveis): a) tônus uterino 1, 3 ou 4
(86,21%), b) persistência de folículos com diâmetro >20 mm (20,97%) e c) cérvix
fechada (18,97%) (Figura 1). Observou-se uma porcentagem maior e significativa
(P< 0,05) de problemas relacionados ao tônus uterino, em comparação aos
problemas de fechamento cervical e presença de folículos com diâmetro maior que
20mm.
86,21%
20,97% 18,97%
0102030405060708090
100
Problemas Identificados
Freq
uênc
ia (%
)
Tônus uterino 1, 3 e 4Persistência de folículos Cérvix fechada
Número de casos = 50 12 11 χ² = 36,95*
Tipos de Problemas
* Teste qui-quadrado entre tipos de problemas, significativo (GL=2, P<0,05). ns – não-signifcativo.
Figura 1. Porcentagem de ocorrência de características indesejáveis no sistema genital de éguas da raça Mangalarga Machador, receptoras de embriões, avaliados por palpação retal no dia da ovulação (n = 193 éguas).
Tais resultados indicam que os problemas relacionados ao tônus uterino na
época da ovulação são o sinal clínico mais importante na classificação de éguas
receptoras no Grupo A (indesejáveis). Como nesta fase do ciclo estral o estradiol é o
principal hormônio ovariano produzido, também é o principal responsável pelo
aparecimento de edema e tônus uterino característicos (HUGHES et al., 1977).
Somente se houver algum distúrbio fisiológico que afete as ações desse hormônio, o
tônus ficará comprometido, contribuindo para a classificação da receptora neste
grupo. Os animais que apresentaram tônus uterino classificado como 1,
característico da fase de anestro, no dia da ovulação, demonstraram que o
endométrio não respondeu aos estrógenos ovarianos, com a conseqüente produção
de edema e tônus característicos desta fase (tônus 2). As éguas que apresentaram
tônus classificado como 3 ou 4, característicos da fase do diestro ou gestação, no
dia da ovulação, também demonstram alterações fisiológicas ou patológicas, sendo
por isto de baixa freqüência (22%).
Com referência à persistência de folículos (20,97%), no momento da
ovulação, cabe ressaltar que essa é uma condição fisiologicamente de pouca
freqüência, pois os folículos subordinados tendem a regredir logo após o
aparecimento do folículo dominante e ovulação (GASTAL, 2000; GINTHER, 2000),
sendo pouco freqüente encontrar folículos de diâmero maior que 10mm no período
de 4 a 9 dias após a ovulação (ARTHUR, 1979). Isto justifica sua baixa freqüência
na classificação.
Quanto ao fechamento cervical (18,97%) no dia da ovulação, trata-se de um
evento fisiológico pouco comum, pois normalmente a cérvix encontra-se com pouca
tonicidade, permitindo sua abertura nessa época, por ação do estradiol (HUGHES et
al., 1977; ARTHUR, 1979). Neste experimento, 3 das 11 fêmeas que apresentaram
cérvix fechada, no dia da ovulação, foi diagnosticado piometrite e, nas outras 5,
portadoras de genitália infantil. As éguas com piometrite podem prolongar a fase
progesterônica por destruição endometrial (HUGHES et al., 1979). Nos casos em
que a fêmea apresenta genitália infantil, a consistência do útero permanece firme
pela ausência de glândulas endometriais, que nas potras só se desenvolvem após a
primeira fase luteal da puberdade (GRAY et al., 2001).
Na Tabela 1, observou-se que, das 135 éguas que apresentavam sistema
genital com características desejáveis no momento da ovulação, 88 (65,19%) foram
diagnosticadas como excelentes e boas no dia da inovulação (D5), enquanto que 47
(34,81%) foram descartadas por serem classificadas como marginalmente aceitáveis
ou rejeitadas, havendo diferença (P< 0,05%) entre elas. Na mesma tabela, observa-
se ainda que das 58 éguas do Grupo A (indesejáveis no dia da ovulação), 14
(24,14%) foram avaliadas como excelentes ou boas condições dos órgãos genitais
no dia da inovulação e 44 (75,86%) foram descartadas por serem classificadas como
marginalmente aceitáveis ou rejeitadas, havendo diferença (P< 0,05) entre elas.
Esses resultados, que caracterizam a mudança de classificação das receptoras
entre o dia da ovulação e da inovulação, podem ser justificados pelo fato de que,
entre a primeira e a segunda avaliação ocorreu ou não a formação de corpos lúteos
viáveis, responsáveis pela produção de progesterona, hormônio indutor das
características do sistema genital na fase do diestro (GINTHER,1986; HUGHES et
al., 1972).
Os principais problemas observados no dia da inovulação, quanto às
características do sistema genital, que motivaram o descarte de receptoras no D5,
encontram-se na Figura 2. Das éguas previamente classificadas no Grupo A
(indesejáveis no dia da ovulação), totalizando 44 receptoras, 12 (27,27%)
apresentaram problemas no corpo lúteo no D5 (imagem ecogênica não definida), 13
(29,55%) apresentaram presença de folículos com diâmetro maior que 20mm, 31
(70,45%) apresentaram tônus uterino 1 ou 2, 36 (81,82%) apresentaram dobras e
edema do endométrio e 31(70,45%) apresentaram cérvix aberta. Houve uma
porcentagem significativamente maior de problemas (P< 0,05) relacionados com
presença de dobras e edema uterinos, bem como baixo tônus uterino e cervical. Tal
aumento leva à abertura da cérvix quando comparada à porcentagem de problemas
apresentados no corpo lúteo e de presença de folículos maiores que 20mm. No
grupo em questão (grupo A), as éguas já vinham apresentando uma porcentagem
significativamente maior (P<0,05) de problemas relacionados com o tônus do útero,
desde o estro. Isto sinaliza para o fato de que seus úteros não responderam bem
aos estímulos estrogênicos desta fase. Tal fase compromete automaticamente o
tônus da fase seguinte pela ação da progesterona luteal (JONES et al.,1983;
HUGHES et al. 1972), diminuindo a dissipação do edema uterino e cervical
(PELEHACH et al., 2002).
70,4581,82
70,45
29,5527,27
93,6282,9880,85
31,91
63,83
0102030405060708090
100
Problemas nocorpo lúteo
Presença defolículos > 20 mm
Tônus uterino: 1 ou 2
Dobras, edema elíquidos no útero
Cérvix aberta
Problemas identificados
Freq
uênc
ia (%
)
Grupo A (indesejáveis), N = 44 éguas descartadas¹
Grupo B (desejáveis), N = 47 éguas descartadas
Características do sistema genital
Valores de χ² = 7,71* 0,14ns 0,71ns 0,12ns 2,25ns
1 Éguas descartadas: refere-se ao número de éguas classificadas como marginalmente aceitáveis ou rejeitadas. * Teste qui-quadrado entre grupos, significativo (GL=1, P<0,05). ns – não-ignifcativo.
Figura 2. Porcentagem de características indesejáveis no sistema genital de éguas da raça Mangalarga Machador, receptoras de embriões, avaliadas no dia da inovulação (n = 193 éguas avaliadas).
Das éguas do Grupo B (desejáveis no momento da ovulação),totalizando 47
receptoras, 30 (63,83%) apresentaram problemas no corpo lúteo no momento da
inovulação, 15 (31,91%) apresentaram presença de folículos com diâmetro maior
que 20mm, 38 (80,85%) apresentaram tônus uterino 1 ou 2, 39 (82,98%)
apresentaram dobras e edema do endométrio e 44 (93,62%) apresentaram cérvix
fechada. Portanto, observou-se que os principais fatores de descarte por ocasião da
inovulação foram os problemas apresentados no corpo lúteo e a diminuição do tônus
uterino e cervical, levando à abertura da última. CARNEVALE et. al. (2000)
demonstraram que os fatores mais importantes na seleção de receptoras visando à
transferência de embriões em eqüinos são o tônus do útero e a cérvix, que por sua
vez estão na dependência primária dos hormônios ovarianos (JONES et. al.,1983;
HUGHES et. al., 1972). Nesta fase do diestro a progesterona luteal é o hormônio
ovariano predominante, justificando o fato de os problemas relacionados com o
corpo lúteo também estarem envolvidos com as alterações mais importantes.
Com referência à taxa de prenhez de éguas receptoras inovuladas (Tabela
2), observou-se que, do Grupo A (éguas indesejáveis no dia da ovulação),14
apresentaram se no diagnóstico como aptas para a transferência de embriões.
Destas, 10 éguas foram inovuladas resultando em 50% de prenhez, as outras 4 não
foram inovuladas devido à coleta negativa de embriões das respectivas doadoras
nos dias previstos. No Grupo B, foram inovuladas 62 das 88 éguas consideradas
aptas, das quais 49 tornaram-se prenhes, o que corresponde à taxa de 79,03% de
prenhez. As restantes (26 éguas) também não foram inovuladas devido coleta
negativa de embriões das respectivas doadoras nos dias previstos. Portanto,
observou-se que a taxa de prenhez das receptoras do Grupo B foi significativamente
(P<0,05) superior à taxa de prenhez das receptoras do Grupo A. Esses resultados
ratificam que as receptoras classificadas como indesejáveis no dia da ovulação,
podem, com segurança, ser previamente rejeitadas para a transferência de embriões
nesse ciclo estral. Por outro lado, das 135 receptoras do grupo B que, no dia da
ovulação, foram classificadas como desejáveis, no momento da inovulação, 88
(65,19%) foram classificadas como excelentes e boas. Destas, 62 éguas foram
inovuladas resultando uma taxa de prenhez de 79,03%, ou seja, 49 éguas prenhes.
A partir desses dados, infere-se que as éguas do Grupo B, classificadas como
excelentes ou boas no dia da inovulação, apresentaram melhor performance
(P<0,05%) com referência à taxa de prenhez em comparação com as receptoras do
Grupo A, classificadas como excelentes ou boas.
Tabela 2. Porcentagem de prenhez de éguas receptoras da raça Mangalarga
Machador, considerando a classificação do sistema genital no dia da ovulação e da inovulação (n = 72 éguas inovuladas)
Inovulação e Taxa de prenhez Nº de casos (%)
Classificação dos órgãos genitais das receptoras no dia da ovulação Nº de casos (%)
Éguas classificadas como excelentes ou boas no dia da inovulação3 Nº de casos (%)
Éguas inovuladas
Éguas gestantes
Éguas não-
gestantes
Valor χ²
Grupo A - indesejáveis1
58 (30,05%)
14
(13,74%)
10
5
(50%)
5
(50%)
ns
Grupo B - desejáveis2
135 (69,95%)
88
(86,27%)
62
49
(79,03%)
13
(20,96%)
10,45*
Total = 193
(100%)
102
(100%)
72
(100%)
54
(75%)
18
(25%)
18,00*
Valor χ² = 53,69* 10,45*
1- Características não desejáveis dos órgãos genitais no dia da ovulação: a) tônus uterino classificado como 1, 3 e 4; b) presença de folículos com diâmetro maior que 20 mm ou e c) cérvix fechada. 2- Características desejáveis: a) tônus uterino 2; b) ausência de folículos com diâmetro maior que 20 mm e c) cérvix aberta. 3- Características excelentes ou boas no dia da inovulação: receptoras que apresentaram pelo menos um corpo lúteo ecogenicamente bem definido, tônus uterino de 3 ou 4, cérvix firmemente fechada e ausência de cistos, dobras e tumores uterinos. . * Teste qui-quadrado entre grupos, significativo (GL=1, P<0,05). ns – não-signifcativo.
As taxas de prenhez encontradas neste trabalho 50% no grupo A e 79,03%
no grupo B mostram que as do grupo B estão em sintonia com as relatadas por
pesquisadores como SQUIRES et al. (1998), JASKO (2002), CARNEY et al (1991),
CARNEVALE et al. (2000) que obtiveram taxas de 69 a 89%; 62,5 a 100%; 60 a
71% e 65,7%, respectivamente. A taxa de 50% encontrada no grupo A se mostrou
significativamente menor que a encontrada no grupo B, sendo portanto, considerada
baixa quando comparada com as dos trabalhos anteriormente citados.
A concentração de progesterona plasmática (ng/ml) foi avaliada no período de
D0 a D13 do ciclo estral de receptoras da raça Mangalarga Marchador, previamente
classificadas como indesejáveis (grupo A) ou desejáveis (grupo B), quanto às
características do sistema genital. Todas as equações de regressão investigadas
apresentaram efeito quadrático significativo (P<0,05). Essas equações indicaram
que, para as receptoras do grupo B, o ponto máximo para as concentrações de
progesterona plasmáticas ocorreu aos 7,43 dias atingindo 11,51ng/ml. Com
referência às receptoras do grupo A, a concentração máxima de progesterona
ocorreu aos 7,88 dias atingindo 10,13ng/ml (Figura 3). A análise da variância para os
pontos máximos indicou não haver diferenças significativas (P>0,05) entre os
grupos. As médias verificadas para o grupo B foram de 7,46 ± 2,13 dias após a
ovulação atingindo 12,18 ± 2,31ng/ml de progesterona plasmática, ao passo que,
para o grupo A, essas médias foram respectivamente, de 8,20 ± 1,41 dias e 9,37 ±
1,77ng/ml. Embora não estatisticamente significativos (P>0,05), as médias obtidas
para o grupo B foram maiores em relação às do grupo A. CARNEVALE et al. (2000)
e McCUE et al. (1999) descreveram em seus trabalhos que as receptoras eqüinas
selecionadas para receberem embriões, no quinto dia após a ovulação,
apresentaram concentrações significativamente maiores de progesterona que as não
selecionadas, justificando os resultados do presente experimento.
Figura 3 Concentração de progesterona plasmática (ng/ml) avaliada nos dias seguintes à ovulação (D0), de receptoras da raça Mangalarga Marchador, classificadas como indesejáveis (Grupo A) ou desejáveis (Grupo B) quanto às características do sistema genital no dia da ovulação.
0
2
4
6
8
10
12
14
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13
Dias após a inovulação
Prog
este
rona
pla
smát
ica
(ng/
ml) Grupo A (indesejáveis)- y= 1,75+2,19x-0,14x² (R2=0,89*)
Ponto Max. Dia ng/ml 7,88 10,13
0
2
4
6
8
10
12
14
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13
Dias do ciclo estral
Prog
este
rona
pla
smát
ica
(ng/
ml) Grupo B (desejáveis)- y= 2,19+2,37x-0,15x² (R2=0,93*)
Ponto Max. Dia ng/ml 7,43 11,51
CONCLUSÕES
No dia da ovulação é possível realizar uma prévia seleção de receptoras da
raça Mangalarga Marchador, destinadas à inovulação no D5, com base no exame de
palpação retal dos seus órgãos genitais. Aquelas que apresentarem, neste dia,
características indesejáveis como tônus uterino 1, 3 ou 4, fechamento cervical e
persistência de folículos maiores que 20mm podem ser descartadas naquele ciclo. O
tônus uterino e cervical são os fatores mais importantes (P<0,05) neste descarte. As
receptoras que apresentarem características consideradas desejáveis para esta
fase, com tônus uterino 2; abertura cervical e ausência de folículos maiores que
20mm, que representam a maior parte das éguas ovuladas, deverão ser novamente
avaliadas para a transferência no dia da inovulação.
A taxa de prenhez das éguas consideradas portadoras de condições
desejáveis da genitália foi melhor (P<0,05) que a das consideradas indesejáveis.
Isto, somando-se ao fato de que apenas uma pequena parte dessas últimas se
tornam aptas à inovulação no dia da transferência, reforça a decisão do seu prévio
descarte.
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TRATAMENTO DE ÉGUAS DA RAÇA MANGALARGA MARCHADOR COM PROGESTERONA (P4) OU ALTRENOGEST VISANDO À SUA UTILIZAÇÃO
COMO RECEPTORAS DE EMBRIÕES NO SEGUNDO DIA APÓS A OVULAÇÃO
RESUMO
Durante as estações de monta de 2001 e 2002, 43 éguas da raça Mangalarga
Marchador, receptoras de embriões, que ovularam com características desejáveis da
genitália, foram tratadas aleatoriamente, via intramuscular, com 200mg/dia de
progesterona oleosa (P4) e um outro grupo de 41 éguas da mesma raça com
0,044mg/kg/dia de Altrenogest, aleatoriamente, via oral. Ambos os tratamentos
foram efetuados entre D0 ao D5 e as receptoras avaliadas no D2 e, se consideradas
aptas, inovuladas. Dois grupos de 85 éguas da mesma raça foram utilizadas
aleatoriamente como controle, não recebendo nenhum progestágeno, sendo da
mesma forma avaliadas e inovuladas em D2 ou D5, se consideradas aptas. Os
grupos D2, com P4, e D5, sem progestágeno, tiveram um maior (P<0,05) número de
éguas consideradas excelentes ou boas (aptas) no momento da avaliação,
respectivamente, 55 (64,71%) e 25 (65,12%). O grupo D2, com Altrenogest,
apresentou um número estatisticamente igual de receptoras consideradas aptas
para inovulação e descartadas (20 e 21 éguas respectivamente), no momento da
avaliação. O grupo D2 sem progestágeno apresentou, nesta avaliação, uma
quantidade significativamente maior de receptoras descartadas (P>0,05). Quanto à
relação entre éguas gestantes e não-gestantes após a inovulação, os grupos D2,
com P4, e D5, sem progestágeno, apresentaram um número maior (P<0,05) de taxa
prenhez, respectivamente, 72,72% e 76,36%. O grupo D2, com Altrenogest,
apresentou uma taxa de 52,38%, não sendo significativo (P>0,05), e o grupo D2,
sem progestágeno, apresentou uma quantidade significativamente maior de éguas
não-gestantes. Esses dados nos permitem inferir, que por meio do tratamento com
P4 do D0 ao D5, pode-se antecipar a inovulação de receptoras para o D2, com
resultados semelhantes ao D5.
Palavras-chave: eqüino, Mangalarga Marchador, transferência de embriões,
progestágenos.
ABSTRACT
During the reproductive season of 2001 and 2002, 43 mares of the breeding
Mangalarga Marchador, recipients of embryos, which ovulated presenting genital
organs with desirable characteristics on the day of ovulation, were treated randomly
with intra-muscular application of 200mg/day of oily progesterone (P4). Another
group of 41 mares of the same breeding, also presenting genital organs with
desirable characteristics, were treated with 0,044mg/kg/day of Altrenogest, randomly
via oral. Both treatments were performed between D0 and D5. The recipients were
evaluated on D2 and the ones considered in good or excelent conditions were
inovulated. Two groups of 85 mares of the same breeding were used randomly as
control and did not receive any progestogen. They were also evaluated and, when
considered appropriate, inovulated on D2 or D5. The groups D2/P4 and D5 without
progestogen presented a significantly greater (P<0.05) percentage of recipients
considered excelent or good (appropriate) during the evaluation, respectively 55
(64.71%) and 25 (65.12%). In the group D2 with Altrenogest, 20 mares were
considered appropriate for inovulation and 21 were considered not appropriate,
numbers considered statistically not different. The group D2 without progestogen
showed a significantly greater percentage of mares considered not appropriate. With
respect to the pregnancy rate after inovulation, the groups D2/P4 and D5 without
progestogen presented numbers significantly (P<0.05) greater of pregnant recipients,
respectively 72.72% and 76.36%, than non-pregnant. The group D2 with Altrenogest
presented a pregnancy rate of 52.38%, considered not significant greater than the
rate of non pregnancy (P>0.05). The group D2 without progestogen presented a
number significantly grater of not pregnant recipients. These data allow us to infer
that with the treatment of mares with P4 from D0 to D5, their use as recipients may
be anticipated to D2 with result similar to that if they are used on D5.
Keywords: equine, Mangalarga Marchador, embryo transfer, progestogens.
INTRODUÇÃO
Na espécie eqüina, a transferência de embriões tem sido a solução mais
utilizada no mundo inteiro, objetivando aumento do número de
descendentes/ano/matriz. O Brasil ocupa posição de destaque no cenário mundial,
no que tange a esta técnica, ocupando o terceiro lugar em importância, segundo
SQUIRES et al. (2003), perdendo apenas para os Estados Unidos da América e
Argentina.
A primeira transferência de embriões eqüinos (TEE) com sucesso foi realizada
no Japão por por OGURI et al. (1972). No Brasil, os trabalhos tiveram início em
1986, no estado de São Paulo, e foram realizados com sucesso na raça Mangalarga
(FLEURY,1998b). Na raça Mangalarga Marchador, a técnica foi reconhecida e aceita
pelo seu Conselho Deliberativo Técnico em 1995, sendo, a partir daí, muito utilizada
(CAIADO,2000).
HUGHES et al. (1980) estudaram o efeito da aplicação diária de
progesterona oleosa via intramuscular, em éguas ovariectomizadas, e
demonstraram que, para atingir níveis plasmáticos de 4ng/ml, considerados
satisfatórios para a manutenção da gestação, segundo SHARP (2000), as doses de
50 e 100mg/dia não foram suficientes, sendo tais níveis consistentemente atingidos
com doses de 200mg/dia, afirmando que os níveis séricos de progesterona abaixo
de 1ng/ml caracterizam o período do estro. BERGFELT e GINTHER (1996),
trabalhando com éguas e pôneis, verificaram que a concentração de progesterona
(ng/ml) foi próxima de zero no dia da ovulação, atingindo aproximadamente de 3,0
no D2 e 11,0 no D7 de ambos os tipos de fêmeas. No D4, a concentração de
progesterona foi menor nas éguas (em torno de 7,0ng) que em pôneis (em torno de
9,0ng). SOUZA et al. (1999), trabalhando com potras da raça Brasileiro de Hipismo,
encontraram concentrações médias de progesterona plasmática de 5,6ng/ml no
quarto dia após a ovulação, que permaneceram elevadas até o décimo quarto dia,
quando retornaram a valores basais.
WEBEL (1975) foi o primeiro pesquisador a reportar o uso de um
progestágeno sintético via oral (Altrenogest), para o controle do estro e ovulação na
égua. Desde então, tem havido numerosas citações do seu uso. WEBEL e
SQUIRES (1982), administraram Altrenogest na dose de 0,044mg/kg por 14 dias, no
período de transição do anestro invernal para a estação fisiológica de cobertura.
Durante o tratamento, o estro foi suspenso em 262 de 278 éguas (94%). Concluíram,
assim que, Altrenogest ajuda na normalização do ciclo estral no final da fase
transicional. Outros pesquisadores descreveram o uso de progesterona injetável no
controle do estro em éguas em fase de transição (LOY et al., 1981).
POOL et al. (1987), PARRY- WEEKS e HOLTAN (1987) utilizaram Altrenogest
(progestágeno) com propósito de sincronização do estro em éguas receptoras de
embrião. HINRICHS e KENNEY (1987) utilizaram 300mg/dia de progesterona em
óleo, via intramuscular, em éguas ovariectomizadas, com o mesmo objetivo.
MCKINNON et al. (1988) mostraram que é possível a postergação da ovulação por
meio da administração oral de Altrenogest. ALMEIDA (1990,) trabalhando com
éguas no cio do potro, conseguiu o bloqueio do cio e da ovulação em 100% das
éguas. SQUIRES et al. (1983) comprovaram que é possível suprimir o estro por
tempo prolongado, usando o mesmo progestágeno. LOY e SWAN (1966)
trabalharam com progesterona oleosa, aplicada via intra-muscular diariamente,
relatando que, na dose de 100mg ou mais, o cio e a ovulação foram inibidos.
HOLTAN et al. (1977), utilizando o mesmo produto, obtiveram resultados
semelhantes.
Uma baixa concentração de progesterona durante a prenhez precoce tem
sido considerada como um dos sinais associados à perda embrionária (DOUGLAS
et al. 1985; GINTHER 1985). O valor menor que 2,5ng/ml, no dia 12, foi usado como
valor crítico para identificação de éguas consideradas com “disfunção luteal.”
HINRICHS e KENNEY (1987) demonstraram que éguas ovariectomizadas tratadas
com 300mg de progesterona mantiveram a gestação após a transferência de
embrião. PARRY-WEEKS e HOLTON (1987) obtiveram o mesmo sucesso usando
Altrenogest, na dose de 0,044mg/Kg. Estes pesquisadores utilizaram os
progestágenos por um período superior a 100 dias, até que a placenta passasse a
suprir a necessidade fisiológica de progesterona, necessária para manutenção da
prenhez.
Aumentar o período útil de utilização de receptoras, atualmente situado na
faixa de 4 a 9 dias após-ovulação (JASKO, 2002), é sempre um desafio que traz
recompensas na redução de custos da técnica de TEE. Porém a utilização de
receptoras, em condições naturais, antes de quatro dias após a ovulação, não tem
sido recomendada na literatura e, a partir do nono dia, o índice de prenhez, após a
transferência, piora bastante, praticamente inviabilizando a sua utilização.
São objetivos do presente trabalho:
1--Estabelecer um protocolo de aplicação de progesterona (P4) ou Altrenogest, por
um curto período de tratamento, visando à utilização precoce de receptoras na
transferência de embriões em eqüinos.
2- Comparar se o tratamento com uma ou ambas as drogas é eficiente para este fim,
indicando a droga mais eficiente.
MATERIAL E MÉTODOS
LOCAL DO EXPERIMENTO E ANIMAIS
O experimento foi desenvolvido em um criatório de eqüinos no município de
Guarapari-ES, durante a estação de monta dos anos de 2001 e 2002. 20 éguas da
raça Mangalarga Marchador, com idade variando de 3 a 18 anos e condição corporal
compatível com a atividade reprodutiva, foram utilizadas como doadoras dos
embriões durante o experimento, e 254 éguas da mesma raça, com idade variando
de 3 a 12 anos e condição corporal compatível com a atividade reprodutiva,
utilizadas como receptoras destes embriões. As éguas foram mantidas em regime de
campo, com pastagem de gramínea, água e sal mineral “ad libidum”, sendo
suplementadas, diariamente, com volumoso e concentrado em bretes com cochos
individuais.
MANEJO REPRODUTIVO
Uma vez ao dia, no próprio brete de suplementação alimentar, as éguas
foram rufiadas, submetidas a controle folicular e ultra-sonografia do trato reprodutivo.
A rufiação foi coletiva e realizada mediante utilização de um rufião eqüino com a
genitália intacta, fértil e com boa libido. Este foi conduzido próximo das fêmeas a
serem rufiadas, permitindo um contato estreito entre eles, porém separados por uma
cerca de réguas que impedia as coberturas e a recepção de coices de ambas as
partes. No caso de necessidade de uma rufiação individual, o rufião era conduzido
por meio de um cabresto à presença da fêmea, amarrada a um mourão, permitindo-
se o contato direto entre ambos, porém impedindo a cópula.
Os exames de palpação retal foram realizados no próprio brete, para o
acompanhamento do sistema genital. Durante o cio, observaram-se o tamanho e a
consistência dos folículos, as ovulações, a forma e o tônus uterino, a abertura ou o
fechamento da cérvix. Por meio de ultra-sonografia, realizada com um aparelho
Scaner-200 VetR (Pie Medical) acoplado a um transdutor transretal linear de 7,5MHz,
diariamente, confirmavam-se a medida do diâmetro folicular, as ovulações, o grau de
edema uterino e a abertura cervical. Se os exames fossem realizados visando à
escolha de receptoras para transferência, observavam-se a presença ou ausência
de corpos lúteos e folículos, bem como número, diâmetro e consistência dos
mesmos; forma e tônus do útero, presença de líquidos, tumores, cistos e edema
uterinos, e abertura ou fechamento da cérvix.
O tônus uterino foi classificado de um a quatro (GASTAL et al., 1998 e
McKINNON et al., 1988), seguindo os seguintes parâmetros:
• Tônus 1- Mínimo tônus verificado do anestro até o início da atividade cíclica.
O formato e a consistência do útero não são bem definidos ao exame de
palpação retal (HUGHES et al. 1977).
• Tônus 2- O tônus proporcionado pela fase estrogênica do ciclo estral (estro),
com útero de consistência macia e formato quase tubular (HUGHES et al.
1977). As contrações do útero ainda não são perceptíveis ao toque.
• Tônus 3- O tônus da fase progesterônica do ciclo estral (diestro). O útero
apresenta formato tubular bem definido, com aumento do tônus e
consistência (HUGHES et al. 1977). As contrações uterinas são perceptíveis.
• Tônus 4- Máximo tônus do início da prenhez, após o décimo terceiro dia. As
contrações uterinas são ainda mais perceptíveis. O útero mantém formato
tubular e consistência mais firme.
De acordo com a tonicidade, a cérvix foi classificada como aberta ou
fechada. A abertura cervical foi constatada pela sua flacidez e mudança de formato
ao toque, resultantes de uma baixa tonicidade, ocasionada pela ação de estrógenos.
O fechamento, resultante da ação de progesterona no diestro e gestação,
ocasionando uma alta tonicidade (HUGHES et al. 1977), observada pelo formato
tubular e pela consistência firme ao mesmo exame.
As receptoras que ovularam e apresentaram persistência de folículos
maiores que 20mm ou ovários poli foliculares, tônus uterino de 1, 3 ou 4 e/ou
fechamento cervical foram descartadas do experimento.
As doadoras foram inseminadas de 48 em 48 horas, utilizando-se sêmen de
um garanhão de conhecida fertilidade, a partir do dia em que se detectava a
presença de um folículo dominante, com diâmetro igual ou maior que 35mm, até a
ovulação (CAIADO et al., 2000).
TRANSFERÊNCIA DE EMBRIÕES E DIAGNÓSTICO DE GESTAÇÃO
Os embriões foram coletados de forma não-cirúrgica, entre os dias 6,5 e 8,5
após a ovulação da doadora (considerando-se D0 como o dia da ovulação),
seguindo os procedimentos descritos por SQUIRES et al. (2003). Utilizou-se a
solução de Ringer com lactato de sódio como meio de coleta (ALVARENGA et al.,
1993; FLEURY, 1998a; CARVALHO, 2000). Após a passagem da sonda pela cérvix,
o balonete foi inflado com ar e o líquido de lavagem foi introduzido no útero por
gravidade, retirado logo após as massagens uterinas via palpação retal, também por
gravidade. Este procedimento foi repetido por 3 vezes ou até a verificação da
presença do embrião no filtro coletor, no caso de embriões D8 ou mais velhos. Se,
após o rasteamento, o embrião não fosse localizado, repetia-se o procedimento por
mais 2 ou 3 vezes (SQUIRES et al., 2003).
Os embriões obtidos foram classificados em cinco graus de acordo com
MCKINNON e SQUIRES, (1988).
No momento da transferência, as receptoras foram examinadas por meio de
palpação retal e ultra-sonografia, observando-se o tônus uterino e cervical, a
morfologia dos corpos lúteos e a presença de edema, cistos, fluidos ou ar uterinos
(CARNEVALE et al., 2000). Estas foram classificadas como excelentes, boas,
marginalmente aceitáveis ou rejeitadas, de acordo com as seguintes características:
1-Excelentes. Receptoras que apresentaram pelo menos um corpo lúteo
ecogenicamente bem definido, tônus uterino de 3 ou 4, cérvix firmemente fechada e
ausência de cistos, dobras e tumores uterinos.
2-Boas. Apresentaram corpos lúteos nas mesmas condições das anteriores, porém
com um pouco de dobra endometrial, cistos no útero ou cérvix menos firmemente
fechada que nas do grupo anterior.
3-Marginalmente aceitáveis. O corpo lúteo estava presente, porém era pequeno ou
de imagem ecogenicamente ruim. O útero apresentava tônus entre 2 e 3 e a cérvix
apresentava um fechamento frouxo.
4-Rejeitadas. Não apresentavam corpo lúteo definido, com tônus uterino de 2 para
menos; presença de patologias uterinas e edema endometrial pronunciado, bem
como abertura cervical.
Somente as receptoras consideradas excelentes ou boas foram inovuladas
neste experimento. A técnica utilizada foi transcervical e não-cirúrgica (Pashen, 1985
citado por RIERA et al., 1993, com modificações), com a deposição do embrião no
corpo ou corno uterino, de acordo com a facilidade da inovulação.
Para o diagnóstico de gestação, as receptoras foram examinadas por
palpação retal e ultra-sonografia transretal aos 14 dias da ovulação da sua
respectiva doadora e, quando positivo, o diagnóstico foi confirmado aos 21, 28 e 50
dias de gestação.
TRATAMENTOS HORMONAIS
Durante o cio, as receptoras foram submetidas diariamente ao controle
folicular e à ultra-sonografia do trato reprodutivo com cuidadosa anotação das
características observadas. Foram divididas em quatro tratamentos, a saber:
• D2 com P4 (n=43)- As receptoras foram tratadas com 200mg de progesterona
em veículo oleoso (P4, Bet Laboratories do Brasil) via intra-muscular uma vez
ao dia, do dia da ovulação D0 até o D5, sendo avaliadas, por meio de
palpação retal e exame ultra-sonográfico, e inovuladas no D2.
• D2 com Altrenogest (n=41)- As receptoras foram tratadas com 0,044mg/kg de
Altrenogest (RegumateR), via oral, diariamente, do D0 ao D5, sendo
avaliadas, por meio de palpação retal e exame ultra-sonográfico, e inovuladas
no D2.
• D2 sem progestágeno (controle D2, n=85)- As receptoras não receberam
nenhum tratamento e foram avaliadas, por meio de palpação retal e exame
ultra-sonográfico, e inovuladas no D2.
• D5 sem progestágeno (controle D5, n=85)- As receptoras também não
receberam nenhum tratamento e foram avaliadas, por meio de palpação retal
e exame ultra-sonográfico, e inovuladas no D5.
Após a detecção da ovulação, as fêmeas pertencentes aos grupos D2 com P4
e D2 com Altrenogest foram iniciadas no tratamento na tarde do mesmo dia. As
doses subseqüentes foram administradas nos outros dias pela manhã (Figura 1).
ESQUEMA DO PROTOCOLO UTILIZADO
Progestágeno (P4 ou Altrenogest)
Administração
⇓ ⇓ ⇓ ⇓ ⇓ ⇓
| | | | | | | | | | | | | | __
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14
Figura 1- Esquema de aplicação de progestágenos (P4 ou Altrenogest), em éguas da raça Mangalarga Marchador, do D0 ao D5, objetivando inovulação no D2.
COLETAS DE SANGUE E ANÁLISE DE PROGESTERONA
As coletas de sangue das receptoras, para análise de progesterona, foram
realizadas entre 10 e 12 horas, diariamente, do dia em que a ovulação foi detectada
até o quinto dia após ovulação, continuando de 2 em 2 dias até o décimo terceiro
dia.
As amostras de sangue foram coletadas de 5 éguas, escolhidas ao acaso, em
cada grupo experimental, por punção na veia jugular, em tubos de ensaio estéreis e
heparinizados. Logo a seguir foram centrifugadas a 2.500rpm, sendo o plasma
obtido acondicionado, em tubos de polipropileno, e congelado a (-18ºC) até o dia da
análise hormonal (Figura 2).
ESQUEMA DAS COLETAS DE SANGUE
Coleta sangüínea
↓ ↓ ↓ ↓ ↓ ↓ ↓ ↓ ↓ ↓
| | | | | | | | | | | | | | _|
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14
Figura 2- Protocolo de coleta sangüínea de receptoras da raça Mangalarga Marchador, objetivando análise dos níveis de progesterona. Coleta diária do D0 ao D5 e de dois em dois dias, do D5 ao D13.
As concentrações séricas de progesterona foram obtidas por RIA
(radioimunoensaio), com utilização de kits comerciais (Coat-A-Count, DPC, Los
Angeles,CA) seguindo as recomendações do fabricante, com todas as amostras
analisadas duplamente, apresentando um coeficiente de variação menor que 5%. A
dose mínima detectável foi de 0,023 nanograma de progesterona por mililitro de
plasma.
ANÁLISE ESTATÍSTICA
As receptoras foram agrupadas em 4 tratamentos: 1) avaliadas em D2 sem
administração de progestágeno, 2) avaliadas em D5 sem progestágeno, 3) avaliadas
em D2 com P4, e 4) avaliadas em D2 com administração de Altrenogest. Dentro de
cada grupo no dia da inovulação, classificou-se o sistema genital das receptoras
como marginalmente aceitável ou rejeitado, ou, excelente ou bom. Esses resultados
foram analisados conforme o teste Qui-quadrado (P<0,05), considerando, como
hipótese de nulidade, 50% de freqüência entre as classes. A hipótese alternativa
pressupõe que o tratamento adotado altera a proporção igualitária entre as classes.
Similarmente, analisou-se a taxa de prenhez.
Dentro de cada tratamento, foram analisados, segundo o teste Qui-quadro
(P<0,05), os números de receptoras com problemas no corpo lúteo, a presença de
folículos > de 20mm, presença de tônus uterino 1 e 2, as dobras, edema e líquidos
no útero e a cérvix aberta. A hipótese de nulidade pressupõe 50% de freqüência
entre as receptoras com e sem o problema identificado. A hipótese alternativa
pressupõe que o tratamento adotado altera a proporção igualitária entre as classes.
As concentrações plasmáticas de progesterona foram analisadas por meio de
delineamento estatístico inteiramente casualizado com 5 (cinco) repetições e 4
(quatro) tratamentos (=grupos: D2 sem progestágeno, D5 sem progestágeno, D2
com P4 e D2 com Altrenogest). Os resultados foram submetidos à análise da
variância da regressão para os teores de progesterona no período de D0 a D13 do
ciclo estral. Por meio de derivações, calculou-se o ponto de máximo das equações
de regressão para cada repetição e os resultados foram submetidos à análise da
variância e à comparação de médias (Teste Tukey, P<0,05).
RESULTADOS E DISCUSSÃO
A avaliação da genitália de 85 éguas receptoras no D2, sem administração de
progestágeno, indicou que apenas 20 (23,53%) foram classificadas como excelentes
ou boas para inovulação, sendo que a maior parte foi descartada destes
procedimentos (P<0,05). Todavia, na avaliação no D5, 55 (64,71%) éguas foram
classificadas como excelentes ou boas para a inovulação, sendo que uma porção
significativamente menor (P<0,05) foi descartada. Das que foram consideradas
aptas para inovulação, em ambos os grupos D2 e D5 respectivamente, 20 e 55
éguas foram utilizadas na transferência, cujos resultados se encontram na Tabela 1.
Tabela 1. Classificação de éguas receptoras da raça Mangalarga Machador, quanto às características do sistema genital, com ou sem administração de Progestágeno do primeiro (D0) ao sexto dia do ciclo estral (D5) e avaliação no terceiro dia (D2) e no sexto dia do ciclo estral (n= 254)
Classificação do sistema genital das
receptoras no dia da inovulação Número de casos (%)
Dia da avaliação da receptora com ou sem administração de Progestágeno (T)
Número de éguasavaliadas
Marginalmente aceitável ou
rejeitado
Excelente ou bom
Qui-quadrado dentro de (T)
Número de receptoras inovuladas
D2 sem Progestágeno 85
65
(76,47%)
20
(23,53%)
23,82* 20
D5 sem progestágeno 85
30
(35,29%)
55
(64,71%)
7,35* 55
D2 com P4 43
15
(34,88%)
28
(65,12%)
3,93* 22
D2 com Altrenogest 41
20
(48,78%)
21
(51,22%)
0,02ns 21
Total = 254 130 124 - 118
Teste qui-quadrado para efeito (T): 17,97* *Teste qui-quadrado entre tipos de problemas, significativo (GL=1, P<0,05). ns- não-signifcativo.
Os valores de progesterona endógena só alcançam os níveis de 4ng/ml,
considerados como suficientes para a manutenção da prenhez (SHARP, 2000), a
partir do D3, pois no D2 estes níveis ainda se encontram, em média, em 3ng/ml,
segundo BERGFELT e GINTHER (1996), justificando que, no D2, apenas uma
pequena parte das éguas se encontra em condições de ser inovulada, muito embora
com uma taxa de prenhez significativamente menor que nas que foram inovuladas
no D5.
Com referência às 43 éguas que receberam progesterona (P4), observou-se
que 28 (65,12%) éguas foram classificadas como excelentes ou boas no dia da
inovulação (P<0,05). Quando administrou-se Altrenogest, das 41 éguas tratadas,
apenas 21 (51,22%) foram classificadas como excelentes ou boas no dia da
inovulação (P>0,05). Foram inovuladas 22 e 21 éguas dos grupos que receberam P4
e Altrenogest, respectivamente.
Neste experimento, a administração de progesterona (P4) em éguas
receptoras, aumentou significativamente (P<0,05) a proporção de receptoras
classificadas como excelentes ou boas no D2, ampliando assim o período útil para
inovulação destas receptoras. Desse modo, as receptoras submetidas a esse
tratamento, apresentaram performance similar àquelas avaliadas no D5, controle
utilizado nesse experimento, que está dentro do período utilizado pela maioria dos
pesquisadores em transferência de embriões em eqüinos, como SCHMIDT et al.
(1995); SQUIRES et al. (1998); MCKINNON (1999); SQUIRES et al. (2003) e JASKO
(2002).
Para a avaliação dos principais problemas observados nas éguas
classificadas como marginalmente aceitáveis ou rejeitadas, quanto às características
do sistema genital, no dia da avaliação das receptoras, com ou sem administração
de progestágeno, foram calculadas as porcentagens de ocorrência do problema em
relação ao número de éguas utilizadas no grupo, apresentando os seguintes
resultados (Figura 3).
616161
9
n=25 2320
19
8
15 107
11
14
202020
5
10
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
Problemas nocorpo lúteo
Presença defolículos > 20 mm
Tônus uterino como 1 e 2
Dobras, edema elíquidos no útero
Cérvix aberta
Problemas identificados
Freq
üênc
ia (%
)
Avaliação em D2 sem progestágeno (N=85) Avaliação em D5 sem progestágeno (N=85)Avaliação em D2 com P4 (N=43) Avaliação em D2 com Altrenogest (N=41)
Qui-qudrado = 0,34ns 0,88ns 4,75* 6,37* 4,60*
2
* Teste Qui-quadrado entre problemas identificados, significativo (GL=1, P<0,05). ns – não-
signifcativo.
Figura 3. Porcentagem de características indesejáveis no sistema genital de éguas da raça Mangalarga Machador, receptoras de embriões, avaliadas no dia D2 e no D5, com e sem administração de progestágeno (n = 254 éguas).
A respeito da porcentagem de manifestação destes problemas, pode-se
concluir que:
a) Observou-se que 25 (29,4%) éguas receptoras que não receberam progestágeno
apresentaram problemas no corpo lúteo no D2 e 15 (22,2%), no D5. Das que
receberam progestágeno, 14 (32,6%) e 10 (24,4%), respectivamente para P4 e
Altrenogest, apresentaram problemas no corpo lúteo, não havendo diferença (P>
0,05) entre os diferentes grupos. Praticamente 100% das estruturas que vão dar
origem aos corpos lúteos são visíveis no dia da ovulação, permanecendo visíveis,
nesta proporção, até o D10, quando a porcentagem de sua detecção começa a
diminuir. A metade dos corpos lúteos se forma com uma massa não ecogênica em
seu interior (sangue e fibrina). Esta massa diminui progressivamente à medida que o
Avaliação em D2 sem progestágeno x com Altrenogest Valor χ² Problema no corpo lúteo 0,11 ns Presença de folículos > 20 mm 0,09 ns Tônus uterino 1 ou 2 0,99 ns Presença de dobras, edema e líquidos no útero 0,99 ns Cérvix aberta 0,99 ns
tecido ecogênico se forma (GINTHER,1986), justificando que, na avaliação no D5,
foi encontrada a menor porcentagem de problemas, embora não significativa.
b) A presença de folículos com diâmetro superior a 20mm foi observada na
proporção de 9 (15,5%), 8 (11,1%), 2 (4,7%) e 5 (12,2%) para os tratamentos sem
progestágeno no D2 e D5, e com P4 e Altrenogest no D2, respectivamente, sendo
de ocorrência baixa e não apresentando diferença entre os grupos (P> 0,05%). Os
folículos com diâmetro entre 2 e 5mm aparecem um pouco antes da ovulação, ao
passo que os folículos maiores, de diâmetro superior a 16mm, aparecem no meio do
diestro e sofrem atresia ou ovulam (GINTHER, 1986; GASTAL et al., 1997). Isto
explica sua baixa ocorrência no início do diestro, neste experimento. Contudo, nota-
se que o grupo D2 sem progestágeno é o que apresentou maior e o D2 com P4 o
que apresentou menor porcentagem do problema, fato explicável pelas baixas
concentrações de progesterona endógena neste dia (BERGFELT e GINTHER,
1996), droga que é inibitória para o crescimento folicular.
c) Com referência ao baixo tônus uterino, observou-se que das receptoras que não
receberam progestágeno, 61 (71,8%) apresentaram esse problema no D2 e 19
(28,1%) no D5. Quanto às éguas que receberam progestágeno e foram avaliadas no
D2, 11 (25,8%) e 20 (48,8%) éguas que foram tratadas com P4 e Altrenogest,
respectivamente, apresentaram baixo tônus uterino (P<0,05).
d) Quanto à presença de dobras e edema do endométrio, observou-se que 61
(71,8%) e 20 (28,9%) éguas que não receberam progestágeno e foram avaliadas
respectivamente no D2 e D5, apresentaram esses problemas. Do mesmo modo, as
receptoras tratadas com P4 e Altrenogest apresentaram esses problemas ao D2,
respectivamente, 7 (16,3%) e 20 (48,8%) éguas.
e) Cérvix aberta – Observou-se que 61 (71,8%) éguas receptoras que não
receberam progestágeno apresentaram problemas de abertura cervical no D2 e 23
(32,6%) no D5. Daquelas que receberam progestágeno, apenas 10 (23,3%) e 20
(48,8%), respectivamente para P4 e Altrenogest, apresentaram os mesmos
problemas.
A porcentagem de receptoras dos grupos D2 com P4 e D5 sem progestágeno
que apresentaram tônus uterino insuficiente, edema, dobras e líquidos no útero bem
como cérvix aberta foi significativamente menor que nos outros grupos (P< 0,05).
Isto mostra a eficiência do hormônio natural, endógeno ou exógeno, no
estabelecimento do tônus característico desta fase do ciclo estral, reforçando
BONAFOS et al. (1994) que afirmaram que a progesterona é o único hormônio
produzido pelo corpo lúteo necessário para o desenvolvimento da turgidez uterina na
égua e PELEHACH et al. (2002), que mostraram a importância da progesterona na
dissipação do edema uterino. MCCUE et al. (1999) e CARNEVALE et al. (2000) que
concluíram que as receptoras selecionadas para inovulação, após o exame de
palpação retal e ultra-sonografia, apresentam concentrações de progesterona
significativamente mais altas que as marginalmente aceitáveis ou rejeitadas.
Segundo os mesmos autores, os baixos níveis de progesterona plasmáticas estão
relacionados com inadequado tônus uterino e/ou cervical, podendo ser um
parâmetro utilizado para descartar receptoras para transferência de embriões,
reforçando os dados encontrados neste trabalho.
Vários autores têm demonstrado a eficácia do Altrenogest como
progestágeno sintético e eficaz, como WEBEL (1975); WEBEL e SQUIRES (1982);
POOL et al. (1987); PARRY- WEEKS e HOLTAN (1987); MCKINNON et al. (1988) e
ALMEIDA (1990). Contudo, neste experimento, o seu efeito não foi estatisticamente
comprovado (P> 0,05), embora tenha se distinguido em termos numéricos, no grupo
D2 sem progestágeno.
Na tabela 2, encontram-se os dados referentes à taxa de prenhez de éguas
receptoras com e sem administração de progestágeno. As maiores (P<0,05) taxas
de prenhez foram observadas nas éguas inovuladas no D5 sem aplicação de
progestágeno (76,36%) e nas éguas inovuladas no D2 com administração de P4
(72,72%). Estas taxas estão em sintonia com as encontradas em trabalhos recentes
da literatura, para transferência não-cirúrgica de embriões eqüinos a fresco, como
SQUIRES et al. (1998), JASKO (2002), CARNEY et al. (1991), CARNEVALE et al.
(2000), que obtiveram taxas de 69 a 89%; 62,5 a 100%; 60 a 71% e 65,7%,
respectivamente. Apesar dos valores não serem significativos (P>0,05), as éguas
tratadas com Altrenogest e inovuladas em D2 apresentaram 52,38% de taxa de
prenhez, enquanto que, para as éguas inovuladas em D2 sem a administração de
progestágeno, a taxa foi de 30%
Tabela 2. Porcentagem de prenhez de éguas receptoras da raça Mangalarga Machador com ou sem administração de progestágeno do primeiro (D0) ao sexto dia do ciclo estral (D5) e avaliação no terceiro dia (D2) e no sexto dia do ciclo estral (n= 118)
Número de inovulações e prenhez Dia da avaliação da receptora
com ou sem administração de
progestágeno (T)
Éguas
inovuladas
Éguas
gestantes
Éguas não
gestantes
Taxa de
prenhez
(%)
Valor qui-
quadrado
(χ²)
D2 sem Progestágeno 20 06 14 30,00 3,2ns
D5 sem Progestágeno 55 42 13 76,36 15,29*
D2 com P4 22 16 6 72,72 4,55*
D2 com Altrenogest 21 11 10 52,38 0,05ns
Total =
118 75 43 63,53 -
Teste Qui-quadrado para (T): 11,54* *Teste Qui-quadrado entre tipos de problemas, significativo (GL=1, P<0,05). ns- não-signifcativo.
A análise de variância da regressão para a concentração de progesterona
plasmática (ng/ml) encontra-se na Tabela 3. As equações de regressão, sem
exceções, ajustaram-se significativamente (P<0,05) ao modelo quadrático.
Tabela 3. Análise da variância da regressão para concentrações de progesterona
plasmática (ng/ml) avaliadas no período de D0 a D13 do ciclo estral de receptoras da raça Mangalarga Marchador
Tratamento Fonte de Variação GL QM F P
D2 sem progestágeno Efeito de regressão 2 161,827 20,68 0,0001
Efeito independente 47 7,825
D5 sem progestágeno Efeito de regressão 2 206,840 18,54 0,0001
Efeito independente 46 11,155
D2 com P4 Efeito de regressão 2 146,801 28,37 0,0001
Efeito independente 44 5,174
D2 com Altrenogest Efeito de regressão 2 197,745 25,51 0,0001
Efeito independente 46 7,753
Na comparação das equações de regressão (Figura 4), verificou-se que as
receptoras do grupo D2 com P4 apresentaram o ponto máximo mais elevado, além
da precocidade com relação aos demais grupos de tratamentos, quanto às
concentrações de progesterona plasmáticas. Todavia, observou-se que a equação
de regressão obtida para tal grupo é a que menos explica seus dados (R²=0,61). Isto
pode ser conferido observando-se a concentração de progesterona plasmática no
D0 (8,37ng/ml), estimado pela equação de regressão em comparação com a
concentração média (1,84 ± 3,02ng/ml), obtida no mesmo dia (Tabela 4).
BERGFELT e GINTHER (1996) afirmaram que a concentração de
progesterona (ng/ml) em éguas e pôneis foi próxima de zero no dia da ovulação,
atingindo aproximadamente 3,0 no D2 e 11,0 no D7. A concentração de
progesterona plasmática, nesse experimento, alcançou no D2 médias de 5,61 ±
1,41; 6,40 ± 1,53 e 5,35 ± 2,60; respectivamente, para os grupos D2 sem
progestágeno, D5 sem progestágeno e D2 com Atrenogest. Esses resultados são
superiores aos descritos por BERGFELT e GINTHER (1996). Entretanto, no
presente experimento, as amostras de sangue foram coletadas apenas uma vez ao
dia, sendo que existem 3,33 pulsos diários de liberação de progesterona (PERKINS
et al., 1993), sempre das 10 às 12 horas com a primeira coleta no dia em que a
ovulação foi detectada, por meio de toque retal uma vez ao dia. Isto associado às
variações raciais podem justificar os resultados obtidos. Os valores mais elevados
de progesterona em D2, encontrados nesses grupos, não qualificam estas
receptoras para serem inovuladas no mesmo dia, pois a concentração considerada
suficiente para manter a prenhez, que é de 4ng/ml (SHARP, 2000), atingida no D3
de acordo com BERGFELT e GINTHER (1996), não resultou em recomendações
para inovulação de receptoras nesse mesmo dia. A literatura consultada recomenda
a inovulação a partir do D4 (CAIADO, 2000; JASKO, 2000; CARNEVALE 2000;
SQUIRES et al., 2003).
O grupo D2 com P4 apresentou média da concentração de progesterona no
D1 (17,60±14,13ng/ml) significativamente (P<0,05) maior que os demais grupos. Isto
pode ser justificado pelo fato de que, além da progesterona endógena, foi
administrada progesterona natural (P4). Segundo HUGUES et al. (1980), os níveis
plasmáticos médios de progesterona acima de 4ng/ml podem ser alcançados em
éguas ovariectomizadas submetidas à aplicação diária de 200mg de progesterona
oleosa. O grupo em questão recebeu a dose de 200mg/dia de progesterona oleosa,
além da naturalmente produzida.
Com referência ao Altrenogest, este não é detectado na análise hormonal
pelo método utilizado nesse experimento, pois não apresenta similaridade com a
molécula de progesterona. Sendo assim, a concentração de progesterona nesse
grupo de receptoras manteve-se em sintonia com os grupos sem administração de
progestágeno.
Tabela 4. Média e desvio padrão das concentrações plasmáticas de progesterona (ng/ml) em relação aos dias do ciclo estral das receptoras da raça Mangalarga Marchador
Tratamentos*
Dia do ciclo
estral
D2 sem
progestágeno
D5 sem
progestágeno
D2 com
P4
D2 com
Altrenogest
D0 2,51 ± 2,56 A 2,06 ± 2,15A 1,84 ± 3,02A 0,46 ± 0,35A
D1 3,41 ± 2,77B 4,25 ± 2,64B 17,60 ± 14,13A 2,12 ± 0,87B D2 5,61 ± 1,41A 6,40 ± 1,53A 8,71 ± 1,60A 5,35 ± 2,60A
D3 6,90 ± 2,55B 8,33 ± 3,88B 16,34 ± 12,17A 6,07 ± 2,53 B D4 6,84 ± 2,48B 9,13 ± 5,17AB 15,36 ± 7,57A 6,51 ± 2,77B D5 9,86 ± 4,56A 10,65 ± 4,32A 13,02 ± 3,67A 6,35 ± 4,19A
D7 11,85 ± 4,09A 11,88 ± 3,23A 12,10 ± 2,66A 10,61 ± 3,48A
D9 8,37 ± 0,60A 9,38 ± 1,66A 10,76 ± 1,84A 8,81 ± 0,57A
D11 9,29 ± 2,01A 11,48 ± 2,33A 8,71 ± 0,84A 7,51 ± 3,87A
D13 8,09 ± 3,03A 7,30 ± 5,26A 8,10 ± 1,70A 6,32 ± 4,41A
* Médias seguidas das mesmas letras na linha não diferem entre si (Tukey, P<0,05)
Figura 4. Concentração de progesterona plasmática (ng/ml), avaliada no período de D0 a D13, de receptoras da raça Mangalarga Marchador, classificadas como indesejáveis (Grupo A) ou desejáveis (Grupo B) quanto às características do sistema genital no dia da ovulação.
As análises da variância para o ponto máximo das equações de regressão
(Tabela 5) indicaram que existem efeitos significativos (P<0,05) entre os grupos de
receptoras quanto ao dia do ciclo estral em que se manifesta o pico de concentração
plasmática de progesterona, todavia não existem efeitos significativos (P>0,05) entre
os grupos quanto à concentração máxima alcançada. As médias obtidas para o dia
do ciclo estral em que ocorrem os pontos de máximo (Tabela 6) indicaram que o
grupo D2 com P4 apresentou, aos 5,69 ± 1,43 dias (P<0,05), a concentração de
14,59 ± 4,19 ng/ml de progesterona (P>0,05). Esses resultados podem ser
justificados pela administração exógena de P4 nesse grupo de receptoras.
0
2
4
6
8
10
12
14
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13
Dias do ciclo estral
Prog
este
rona
pla
smát
ica
(ng/
ml) D2 com altrenogest y= 0,481+2,299x-0,145x² (R2=0,95*)
Ponto Max. Dia ng/ml 7,92 9,58
0
2
4
6
8
10
12
14
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13
Dias após a inovulação
Prog
este
rona
pla
smát
ica
(ng/
ml)
D2 com P4 y= 8,371+1,942x-0,165x² (R2=0,61*)
Ponto Max. Dia ng/ml 5,88 14,08
0
2
4
6
8
10
12
14
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13
Dias após a inovulação
Prog
este
rona
pla
smát
ica
(ng/
ml)
D2 sem progestágeno y= 2,117+1,942x-0,116x² (R2=0,87*)
Ponto Max. Dia ng/ml 8,35 10,24
0
2
4
6
8
10
12
14
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13
Dias do ciclo estral
Prog
este
rona
pla
smát
ica
(ng/
ml) D5 sem progestágeno y= 1,75+2,19x-0,14x² (R2=0,89*)
Ponto Max. Dia ng/ml 7,88 10,13
Tabela 5. Análise da variância para o ponto de máximo das equações de regressão para concentrações de progesterona plasmática (ng/ml), avaliadas no período de D0-D13 do ciclo estral de receptoras da raça Mangalarga Marchador
Tratamentos (D0-D13) Fonte de Variação GL QM F P Dia do ciclo estral Tratamento 3 8,73 4,89 0,0133
Resíduo 16 1,78
Concentração de progesterona Tratamento 3 21,577 2,43 0,1031
Resíduo 16 8,88
Tabela 6. Média e desvio-padrão do dia do ciclo estral e da concentração máxima de
progesterona plasmática de receptoras da raça Mangalarga Marchador nos períodos de D0-D13
Período de D0-D13
Tratamento Ciclo estral (dias) Progesterona Plasmática (ng/ml)
D2 s/ progestágeno 8,20 ± 0,43 A* 10,23 ± 2,70 A
D5 s/ progestágeno 8,32 ± 1,59 A 12,18 ± 2,31 A
D2 com P4 5,70 ± 1,43 B 14,59 ± 4,19 A
D2 com Altrenogest 8,32 ± 1,53 A 10,20 ± 2,32 A
* Médias seguidas de mesmas letras na coluna não diferem entre si (Tukey, P<0,05).
CONCLUSÕES
1-Tais resultados indicam que o tratamento com progesterona (P4) em
receptoras eqüinas, no período de D0 (dia da ovulação) a D5, possibilita a
inovulação dessas receptoras no D2, mantendo a taxa de prenhez,
estatisticamente similar à de éguas, consideradas excelentes e boas para
inovulação no D5.
2-O tratamento com Atrenogest no mesmo período aumentou a taxa de
prenhez quando comparada ao grupo D2 sem progestágeno, porém este
aumento não foi estatisticamente significativo.
3-O protocolo utilizado se mostrou eficiente para a P4, com um período curto
de aplicação deste hormônio.
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COMPARAÇÃO ENTRE DOIS DIFERENTES MEIOS PARA TRANSFERÊNCIA DE
EMBRIÕES EM ÉGUAS DA RAÇA MANGALARGA MARCHADOR
RESUMO
Diferentes tampões são utilizados nos meios de lavagem e manutenção embrionária
durante os procedimentos de transferência de embriões em eqüinos. Os tampões
carbonato, fosfato e Zwitteriônico são os mais usados. Durante os procedimentos de
transferência, é comum que o embrião permaneça por um tempo maior que o
previsto, em espera no meio de manutenção utilizada. Este experimento foi realizado
com o objetivo de comparar o custo/benefício de dois meios contendo tampões
diferentes DPBS (fosfato) e Embriocare (zwitteriônico), na transferência de embriões
em éguas da raça Mangalarga Marchador. Os embriões foram divididos
aleatoriamente em dois grupos, Zwitteriônico e fosfato, permanecendo em descanso
por 0,30,60 ou 120 minutos em ambos os meios. Zwitteriônico: 0 (15 embriões), 30
(15 embriões), 60 (16 embriões), ou 120 (14 embriões). Fosfato 0 (13 embriões), 30
(18 embriões), 60 (16 embriões), ou 120 (19 embriões). Os resultados indicam que
ambos são igualmente eficientes (P>0,05) nos processos de rasteamento, lavagem,
manutenção à temperatura ambiente por diferentes períodos de tempo (0 a 120
minutos) e inovulação de embriões em éguas da raça Mangalarga Marchador, em
ambiente tropical, com taxas de prenhez de 65% e 69,7%, respectivamente. Porém,
a maior taxa de prenhez encontrada com DPBS foi obtida com tempo de
manutenção do embrião de 60 minutos no meio. No tampão zwitteriônico, a maior
taxa de prenhez foi alcançada com 30 minutos no meio. Como a aquisição do
Embriocare foi mais onerosa, o DPBS apresentou o melhor custo benefício.
Palavras-chave: eqüino, Mangalarga Marchador, transferência de embriões, tampão
fosfato e Zwitteriônico.
ABSTRACT
Different buffers are used in the media for washing and embryo maintenance during
the procedures of equine embryo transfer. The buffers carbonate, phosphate, and
zwitterionic are the most used. During the procedures of transference, it is common
to keep the embryos into the maintenance media during a time longer than
previewed. This experiment was realized with the objective of comparing the costs
and benefits of using two media with different buffers for embryo transfer in mares of
the breeding Mangalarga Marchador. The medias are DPBS (phosphate) and
Embriocare (zwitterionic). The embryos were divided randomly in two groups,
zwitterionic and phosphate, and kept in the media for 0, 30, 60, and 120 minutes. In
the zwitterionic media, the distribution was as following: 15 embryos were kept during
0 minute, 15 embryos during 30 minutes, 16 embryos during 60 minutes, and 14
embryos during 120 minutes. In the phosphate media, 13 embryos were kept during
0 minute, 18 embryos during 30 minutes, 16 embryos during 60 minutes, and 19
embryos during 120 minutes. The results indicate that both media are equally
efficient (P>0.05) in the processes of scanning, washing, maintenance at ambient
temperature for different time periods (0 to 120 minutes), and inovulation of equine
embryos under tropical conditions. The pregnancy rates using the media were 65%
and 69.7%. The greatest pregnancy rate using DPBS was obtained with embryos
kept in the media for 60 minutes (P<0.05). Using zwitterionic buffer, the greatest rate
of pregnancy was obtained with embryos kept during 30 minutes in the media
(P<0.05). Since Embriocare is more expensive, DPBS presented the best cost-
benefit ratio.
Keywords: equine, Mangalarga Marchador, embryo transfer, Phosphate and
zwitterionic buffer.
INTRODUÇÃO
Durante o processo de transferência de embriões a fresco em eqüinos, é
comum que os embriões permaneçam no meio de manutenção, por períodos acima
do tempo inicialmente previsto, que é de aproximadamente 15 minutos, antes da
inovulação. Este é o tempo necessário para os processos de rasteamento, lavagem
e envasamento do embrião. Contudo, em muitas situações, a receptora escolhida
para ser inovulada é rejeitada na última hora (por não adentrar no tronco de
contenção, por apresentar tortuosidades no canal cervical que impedem sua
penetração pelo instrumento inovulador, por temperamento agressivo ou outras
situações inusitadas); ou se encontra em local diferente do da doadora, a uma
distância que não justifique o resfriamento do embrião, obrigando a permanência no
meio de manutenção, por um período de tempo maior que o desejado. A
manutenção de embriões, em temperatura ambiente por períodos variados, em
diferentes tipos de tampões, é importante para determinar a eficiência de cada um
deles.
Os veterinários que praticam a transferência de embriões em eqüinos, no
Brasil, utilizam diferentes meios para manutenção, manipulação e inovulação. Dentre
os mais utilizados,atualmente, destacam-se os que apresentam tampão bicarbonato,
fosfato e Zwitteriônico.
A solução de Ham’s F10, a solução fosfato tamponada modificada por
Dulbeco (DPBS) e o Embriocare são constituídos, respectivamente, por estes
tampões citados, e são os mais utilizados na prática. Além das diferenças entre a
utilização desses tipos de tampões, existem outras entre as quais a que diz respeito
à composição química, embalagem, preço e taxa de prenhez.
Os meios tamponados por bicarbonato requerem atmosfera gasosa (5%
CO2, 5% O2 e 90% N2) para manterem estabilidade tamponante (CARNEVALE,
2000), dificultando muito seu uso, na rotina de transferência de embriões a campo.
Os meios tamponados por fosfato e tampão Zwitteriônico não requerem este artifício,
sendo mais utilizados na prática e, por isto, testados neste experimento.
Por definição, “Zwitterion” é um íon que apresenta cargas positiva e negativa
no mesmo grupo de átomos, podendo ser formado por compostos que contêm
grupos ácidos e básicos. Juntos, são internamente neutralizados e, então,
metabolicamente inertes. O tampão Hepes é do grupo Zwitteriônico.
Os primeiros tampões biológicos estudados foram misturas de sais
inorgânicos, tamponados com grandes quantidades de fosfato e bicarbonato de
sódio (GONÇALVES et al., 2001). A dificuldade maior da utilização de soluções
tamponadas por bicarbonato é a necessidade do uso de atmosfera de CO2 para
manter o pH constante (MOUSSA et al., 2003a). GOOD et al. (1966) desenvolveram
o Hepes, tampão orgânico para pesquisas biológicas, que mantém o pH de maneira
mais eficiente e mais constante que a utilização única de bicarbonato. Além disto,
apresenta máxima solubilidade em água, dificuldade em atravessar a membrana
celular, não forma complexo com substâncias biológicas, tem baixa toxicidade e não
age como inibidor em reações bioquímicas.
No início da década de 1970-1980, os meios tamponados com bicarbonato
eram os mais usados para manutenção de embriões. Estes meios foram mais tarde
substituídos por outros contendo tampão fosfato, uma vez que a necessidade de
incubação com CO2, exigida nos meios com tampão bicarbonato, inviabilizava a
técnica em nível de campo (NELSON e NELSON, 2001).
A solução tamponada por fosfato, modificada por Dulbeco ( DPBS), foi
utilizada por vários pesquisadores na transferência de embriões em eqüinos, como
MCKINNON (1999), SQUIRES (1995) e EAST et al. (1999), acrescentando que, se o
embrião for inovulado em tempo inferior a 1 hora, poderá permanecer á temperatura
ambiente em DPBS + 10% SFB. Havendo necessidade de um tempo maior de
armazenamento, os autores recomendam a utilização de Ham’s F10 em atmosfera
de CO2. CARNEY et al. (1991), ALVARENGA et al. (1993), CAIADO (2000),
CARVALHO (2000) e PASHEN et al. (1993) também utilizaram, com sucesso, o
DPBS com SFB ou BSA (soro albumina bovina) em diferentes etapas da TEE.
FLEURY (1998b) obteve uma taxa de gestação de 73,3% quando utilizou embriões
transportados em temperatura ambiente (23 a 35ºC), por um período máximo de 60
minutos, envoltos em meio DPBS.
NELSON e NELSON (2001) apontaram o Hepes como um sistema tampão
eficiente e estável em atmosfera de oxigênio.
CARNEVALE et al. (1987) compararam a taxa de prenhez aos 14 dias, de
éguas inovuladas com embriões resfriados a 5oC, em Ham’s F10, com atmosfera
CO2 (5% CO2, 5% O2 e 90% N2) ou tampão Hepes, relatando uma taxa de prenhez
maior (70% versus 20%) quando o meio utilizado foi o Ham’s F10 em atmosfera de
CO2. FLEURY at al. (2002) utilizaram o meio Ham’s F-10, com tampão Hepes, na
transferência não cirúrgica de embriões eqüinos, a fresco e resfriados por até 18
horas, com diferentes diâmetros. Concluíram que o meio é satisfatório para todos os
casos empregados, com taxa de prenhez em torno de 75%.
Os meios que utilizam tampão Hepes ou Zwitteriônico têm sido os mais
utilizados em substituição ao DPBS, na indústria de transferência de embriões em
bovinos nos Estados Unidos da América (NELSON e NELSON, 2001). O tampão
Zwitteriônico apresenta um íon tamponante metabolicamente inerte, que não
atravessa a barreira celular, estabiliza a zona pelúcida e previne uma possível
inibição do desenvolvimento que pode ser causado pelo tampão fosfato
(SESHAGIRI et al., 1991).
BARROS e BENYEI (2000) compararam os resultados, na transferência e
armazenamento de embriões bovinos, de dois meios contendo diferentes tampões:
fosfato e Zwitteriônico, em ambiente tropical. Concluíram que não existiu diferença
significativa na taxa de prenhez em vacas que foram inovuladas com embriões a
fresco, mantidos em um ou outro meio. Porém, afirmaram que somente o tampão
Zwitteriônico pode ser utilizado para embriões destinados ao congelamento.
Diversos trabalhos, na área de biotécnicas da reprodução, têm usado e comparado
o efeito do tampão Zwitteriônico com outros comumente utilizados. WALKER et al.
(1989) estudaram a substituição de bicarbonato por Hepes (ácido N-2-
hidroxietilpiperazina-N’-2-etanosulfônico), em quantidades crescentes de 0; 6,25;
12,5; 18,75 e 25mM, no meio de cultivo de embriões ovinos, comprovando um efeito
adicional na capacidade tamponante, porém, com aumento de danos aos
blastocistos, em concentrações superiores a 12,5mM. MOUSSA et al. (2002)
compararam a taxa de prenhez e o número de células mortas, em embriões eqüinos
resfriados por 24 horas, em meio contendo tampão bicarbonato ou Zwitteriônico.
Concluíram que não existiu diferença significativa entre os meios, nem na taxa de
prenhez após transferência nem no número de células mortas, após o tempo de
cultivo. MOUSSA et al. (2003a) estudaram a viabilidade e o índice de apoptose, em
embriões eqüinos estocados sob meios tamponados com bicarbonato e
Zwitteriônico, concluindo que não existiu diferença significativa no índice de
apoptose e de células mortas.
DONNISON et al. (1996) analisaram desenvolvimento embrionário e o
incremento do metabolismo de blastocistos bovinos cultivados por 24 ou 48 horas,
sob temperatura de 25oC, em dois diferentes meios contendo tampões fosfato ou
Zwitteriônico. Seus resultados apontam uma viabilidade embrionária e aumento na
taxa metabólica (incremento na produção de CO2), em embriões mantidos em meio
com tampão Zwitteriônico. MOUSSA et al. (2003b) também compararam três
diferentes meios, objetivando resfriamento de embriões eqüinos, com dois diferentes
tampões: bicarbonato (Ham’s F10) e Zwitteriônico (Emcare e ViGro holding plus).
Descreveram que os meios com tampão Zwitteriônico não apresentaram diferença
estatística, quando comparados ao meio com tampão bicarbonato, na taxa de
prenhez e na quantidade de células mortas após período de resfriamento. Também
demonstraram que embriões maiores que 400µm, podem ter uma maior viabilidade
após 24 horas de resfriamento que os menores de 400µm, por apresentarem,
significativamente, um número menor de células mortas.
RUBIO POMAR et al. (2004) relataram que embriões de suínos,
armazenados por 24 horas em meio com tampão Zwitteriônico (Emcare)
apresentaram, significativamente, menores danos que os armazenados em meios
com tampão fosfato (DPBS e TCM 199). No mesmo experimento, os embriões
maiores (5 dias versus 4 dias) e os que foram incubados a temperaturas mais altas
(36oC versus 18 e 25oC) também apresentaram, em ambos os meios,
significativamente, maiores danos e maior quantidade de embriões degenerados.
COUTINHO da SILVA et al. (2002) utilizaram o Emcare no “flushing” de
folículos de éguas doadoras de ovócitos, nos 10 minutos finais de cultivo e como
meio de transferência dos ovócitos. Tornaram-se prenhes 15 das 17 receptoras
destes ovócitos.
KEEFER et al. (2002) utilizaram, com sucesso, o Emcare no momento de
desnudar e enuclear ovócitos, destinados à produção de cabras clonadas por
transferência nuclear usando células somáticas adultas.
São objetivos deste trabalho:
Verificar a eficiência de dois meios comerciais, contendo diferentes tampões -
fosfato e zwitteriônico - na manutenção, por diferentes períodos de tempo (0, 30, 60
e 120 minutos) de embriões eqüinos com idade entre 6,5 e 8,5 dias (D0= dia da
ovulação da doadora), mantidos em descanso, envoltos em bolhas do meio em
questão, à temperatura ambiente, em placa de Petri tampadas.
Verificar a taxa de prenhez, após inovulação não-cirúrgica dos embriões.
Apontar qual deles tem o melhor custo/benefício.
MATERIAL E MÉTODOS
LOCAL DO EXPERIMENTO E ANIMAIS
O experimento foi desenvolvido em um criatório de eqüinos no município de
Guarapari-ES, nas estações de monta dos anos de 2001 e 2002. 30 éguas da raça
Mangalarga Marchador, com idade variando de 3 a 15 anos e condição corporal
compatível com a atividade reprodutiva, foram utilizadas como doadoras dos
embriões durante o experimento, e 126, da mesma raça, com idade variando de 3 a
12 anos e condição corporal compatível com a atividade reprodutiva, utilizadas como
receptoras destes embriões. Elas foram mantidas em regime de campo, com
pastagem de gramínea, água e sal mineral “ad libidum”, sendo suplementadas,
diariamente, com volumoso e concentrado em bretes com cochos individuais.
CONTROLE FOLICULAR E RUFIAÇÃO
Uma vez ao dia, no próprio brete de suplementação alimentar, as éguas
foram rufiadas, submetidas a controle folicular e ultra-sonografia do trato reprodutivo.
A rufiação foi coletiva e realizada mediante utilização de um rufião eqüino com a
genitália intacta, fértil e com boa libido, que foi conduzido próximo das fêmeas a
serem rufiadas, permitindo um contato estreito entre eles, porém separados por uma
cerca de réguas que impedia as coberturas e a recepção de coices de ambas as
partes. No caso de necessidade de uma rufiação individual, o rufião era conduzido
por meio de um cabresto à presença da fêmea, amarrada a um mourão, permitindo-
se o contato direto entre ambos, porém impedindo a cópula.
Os exames de palpação retal foram realizados no próprio brete, conduzidos
por um médico veterinário com comprovada experiência nesta atividade. Os exames
de ultra-sonografia foram realizados por meio de um aparelho Scaner-200 VetR (Pie
Medical) acoplado a um transdutor transretal linear de 7,5MHz, sendo, diariamente,
observados o desenvolvimento folicular, a detecção da ovulação e de características
ultra-sonográficas do aparelho genital feminino durante o ciclo estral.
INSEMINAÇÕES
As doadoras foram inseminadas de 48 em 48 horas, utilizando-se sêmen de
um garanhão de conhecida fertilidade, a partir do dia em que se detectava a
presença de um folículo dominante, com diâmetro igual ou maior que 35 mm, até a
ovulação (CAIADO, 2000).
TRANSFERÊNCIA DOS EMBRIÕES
Os embriões foram coletados de forma não-cirúrgica, entre os dias 6,5 e 8,5
após a ovulação da doadora (considerando-se D0 como o dia da ovulação),
seguindo os procedimentos descritos por SQUIRES et al. (2003). Utilizou-se a
solução de Ringer com lactato de sódio como meio de coleta (ALVARENGA et al.,
1993; FLEURY, 1998a; CARVALHO, 2000). Após a passagem da sonda pela cérvix,
o balonete foi inflado com ar e o líquido de lavagem introduzido no útero por
gravidade, retirado logo após as massagens uterinas via palpação retal, também por
gravidade. Este procedimento foi repetido por três vezes ou até a verificação da
presença do embrião no filtro coletor, no caso de embriões D8 ou mais velhos. Caso,
após o rasteamento, o embrião não fosse localizado, repetia-se o procedimento por
mais duas ou três vezes (SQUIRES et al., 2003).
Figura 1-Coleta não-cirúrgica de embriões em égua, com sonda de coleta já inserida
no corpo uterino, após ultrapassagem da cérvix e enchimento do balonete com ar. O sistema genital feminino, a sonda de coleta ligada à solução de lavagem e ao filtro de coletor estão representados (VANDERWAL, 2000).
Na etapa de rasteamento, realizada em placa de Petri descartável, com
auxílio de microscópio estereoscópio com aumento máximo de 35 vezes, os
embriões encontrados foram divididos, aleatoriamente, em dois grupos:
Meio A - Os embriões foram rasteados, mantidos em repouso de acordo com o
tratamento e inovulados em meio comercial Embriocare, com tampão Zwitteriônico
(Laboratório Cutilab, Campinas- SP. Embriocare solução para lavagem, frasco de
50ml. Embriocare holding plus 0,4% BSA, frasco de 15ml).
Meio B - Os embriões sofreram os mesmos procedimentos dos do grupo 1,
porém, envoltos em meio comercial DPBS com 0,4% de BSA, tampão fosfato
(Laboratório Nutricell, Campinas-SP, frasco com volume de 30ml).
Em ambos os grupos, os embriões foram submetidos a diferentes períodos de
descanso:
• P0 n(Meio A=15; Meio B=13) - Os embriões foram imediatamente
transferidos logo após sua observação, classificação, lavagem e
envasamento. A classificação foi feita seguindo os critérios estabelecidos
por MCKINNON e SQUIRES (1988), admitindo-se para o experimento
somente embriões considerados bons e excelentes.
• P30 n(Meio A=15; Meio B=18) - Os embriões permaneceram no meio em
repouso por 30 minutos, logo após sua observação, classificação e
lavagem. As bolhas do meio comercial, destinadas à lavagem do embrião,
foram feitas de modo similar na periferia da placa. A bolha central, com um
volume dobrado, era então preparada para o período de repouso e
envasamento. Durante este período, os embriões permaneceram em placa
de Petri fechada, em temperatura ambiente, no laboratório de
transferência de embriões da própria fazenda, com temperaturas que
variaram de 28 a 35OC. Decorrido este tempo, os embriões foram
reclassificados, envasados e transferidos.
• P60 n(Meio A=16; Meio B=16) - Igual ao tratamento B, exceto no tempo
em que os embriões permaneceram em descanso, que neste caso foi por
60 minutos.
• P120 n(Meio A=14; Meio B=19) - Igual ao tratamento B, exceto no tempo
em que os embriões permaneceram em descanso, que neste caso foi por
120 minutos.
A manipulação embrionária nas diferentes etapas foi realizada com auxílio
de uma palheta de 0,25 ou 0,50ml unida a uma seringa de 1ml, através de um
adaptador. Os embriões de até 8 dias foram envasados em palhetas de 0,25ml e
inseridos num inovulador eqüino, devidamente preparado, sendo depositadas no
corpo ou corno uterino de receptoras sincronizadas com as doadoras, que
estivessem com um tempo de ovulação entre 4 a 8 dias. Os embriões maiores foram
manipulados em palhetas de 0,50 ml e inovulados com auxílio de uma pipeta de
inseminação (PROVAR, SP) no mesmo local que os menores (CAIADO, 2000).
DIAGNÓSTICO DE GESTAÇÃO
No décimo quarto dia da ovulação da doadora, as receptoras foram
submetidas à palpação retal e exame ultra-sonográfico, visando ao diagnóstico de
gestação. Se o resultado fosse negativo, elas voltavam para o regime de toques de
receptoras vazias, quando tinham mais uma chance de serem inovuladas. Se o
diagnóstico fosse positivo, elas permaneciam no regime destinado às fêmeas
gestantes.
ANÁLISE ESTATÍSTICA
Foi aplicado o teste do qui-quadrado para testar a hipótese de independência dos
variados tipos de meio comercial utilizado (1 e 2) e o número de éguas gestantes e
não gestantes em cada grupo. O mesmo teste estatístico foi utilizado para verificar a
hipótese de homogeneidade entre os tratamentos (A, B, C e D), dentro de cada
meio, detectando a diferença estatística sobre a taxa de gestação, após a
transferência não-cirúrgica dos embriões.
RESULTADOS E DISCUSSÃO
Os embriões a serem inovulados podem ser mantidos à temperatura
ambiente em meios específicos, por determinado período até o momento da
transferência (Tabela 1). Foram inovulados 60 embriões envoltos em meio A
(Embriocare, com tampão Zwitteriônico) em receptoras da raça Mangalarga
Marchador. Destes, 39 (45,88%) resultaram em gestação após 14 dias da
ovulação da sua respectiva doadora. A maior taxa de prenhez (80%),embora não
estatisticamente significativa, foi observada nas éguas inovuladas com embriões
tratados com o meio A com 30 minutos de descanso. Observou-se a taxa de 50% de
prenhez para as receptoras inovuladas com embriões que permaneceram 120
minutos em descanso neste meio. Tala resultado fica bem aquém das taxas de
transferência não cirúrgica em eqüinos encontrada em literatura mais recente, como
SQUIRES et al. (2003) que relataram um índice de prenhez entre 70 e 75%, nos dois
últimos anos em seus laboratórios, FLEURY et al. (2002) que obtiveram 73,5 a 77%
de prenhez para embriões resfriados e de 75% encontrado no grupo controle de
CAIADO (2000).
Tabela 1- Número de embriões inovulados e taxa de prenhez de éguas receptoras
da raça Mangalarga Marchador, submetidos a diferentes períodos de descanso em meio A (tampão Zwitteriônico) e meio B (tampão fosfato)
Períodos de descanso (min.)
0 30 60 120
Meio Meio Meio Meio
Número de embriões
inovulados e Taxa de
Prenhez (%) A B A B A B A B
Número de Embriões 15 13 15 18 16 16 14 19
Éguas Gestantes (EG) 09 10 12 12 11 12 07 12
Éguas não-gestantes 06 03 03 06 05 04 07 07
Taxa de Prenhez: 60 76,90 80
66,67
68,75 75
50
63,16
Valor Qui-quadrado (EG): 2,18ns 3,36ns 3,13 ns 0,66 ns
Taxa de Prenhez para Meio (M): A: 39/60 (65,00%) B: 46/66 (69,70%)
Valor Qui-quadrado (M): 0,58 ns
*Teste qui-quadrado entre tipos de problemas, significativo (GL=1, P<0,05). ns- não-signifcativo.
No meio B (DPBS com 0,4% de BSA, com tampão fosfato), foram utilizados
66 embriões para inovulação. Destes, 46 (69,70%) resultaram em gestação após 14
dias da ovulação da sua doadora. A maior taxa de prenhez (75%), embora também
não significativa, foi observada em receptoras com embriões que permaneceram em
descanso no meio por 60 minutos. As taxas de prenhez observadas neste grupo
corroboram com aquelas encontradas na literatura, como as dos trabalhos de
CARNEY et al. (1991), que obtiveram taxas de prenhez de 64 a 71% para embriões
conservados à temperatura ambiente, por períodos de até 60 minutos, em meio
DPBS com 10% de SFB. Do mesmo modo, FLEURY (1998b) obteve uma taxa de
gestação de 73,3% quando utilizou embriões transportados em temperatura
ambiente (23 a 35ºC), por um período máximo de 60 minutos, envoltos em meio
DPBS.
Com referência à comparação entre a performance do meio utilizado,
verificou-se o número de éguas gestantes independentemente do meio utilizado
para manutenção dos embriões, durante os diferentes períodos de descanso.
Observou-se que os embriões mantidos em meio B, apresentaram taxa de prenhez
de 69,70% das éguas inovuladas, ao passo que essa taxa foi de 65% para o meio A,
sendo estatisticamente iguais entre si (�²= 0,58; GL= 1; P>0,05). Esses dados
demonstram que ambos meios são eficientes na manutenção de embriões, por
período de até 120 minutos em temperatura ambiente de clima tropical.
Semelhantemente, BARROS e BENYEI (2000), que trabalhando com bovinos
compararam os resultados, na transferência e armazenamento de embriões, entre
dois meios contendo diferentes tampões (fosfato e Zwitteriônico), em ambiente
tropical e não observaram diferença significativa na taxa de prenhez entre os meios.
Além disso, a taxa de gestação encontrada para ambos os meios, nos diferentes
períodos de descanso, está em sintonia com aquela encontrada na literatura para
transferência não cirúrgica de embriões eqüinos, de acordo com os trabalhos de
SQUIRES et al. (1999) 50 a 75%; EAST et al. (1999) 12,5 a 71%, PASHEN et al.
(1993) 61%,CARNEY et al. (1991) 60 a 71% e FLEURY (1998b) 73,3%.
Os embriões utilizados neste experimento foram classificados, de acordo com
MCKINNON e SQUIRES (1988), antes e após serem colocados no meio, a fim de se
assegurar à qualidade e a homogeneidade dos mesmos. Dentre os embriões
utilizados no meio A, 24 (40%) foram classificados com grau 1 (excelente) e 36
(60%) com grau 2 (bom). No meio B, 32 (51,52%) embriões foram classificados com
grau 1 e 34 (48,48%) com grau 2. Nos trabalhos de CARNEY et al. (1991), os
embriões dos graus 1 e 2 apresentaram taxas de prenhez após transferência,
estatisticamente, iguais entre si e, significativamente, maiores que os do grau 3 e 4.
Na reclassificação dos embriões que permaneceram por 30 minutos em ambos os
meios, não se observou alteração perceptível em microscópio estereoscópio que
justificasse uma mudança na classificação inicial. Dos embriões que permaneceram
em descanso por 60 minutos, nenhum no meio B sofreu reclassificação. Porém, os
do meio A, dois (3,33%) embriões foram reclassificados de grau 2 para grau 3
(regular). Após a inovulação, apenas um deles resultou em prenhez aos 14 dias.
Quanto aos embriões que permaneceram 120 minutos em descanso, em ambos os
meios, foram observados reclassificações com queda de grau. 3 (5%) embriões do
meio A, foram reclassificados sendo que dois de grau 1 para grau 2 e um de grau 2
para grau 3. Após 14 dias da ovulação da doadora, apenas 1 desses embriões
resultou em gestação. No meio B, 4 (6,06%) embriões sofreram queda de um grau
na sua primeira classificação. Dois deles tinham sido classificados como excelentes
e dois como bons. Após a inovulação, apenas dois deles resultaram em gestação.
MOUSSA et al. (2002), utilizando meios com tampão bicarbonato e Zwitteriônico,
para conservação de embriões eqüinos refrigerados, concluíram que o número de
células mortas aumenta com acréscimos no tempo de conservação e a qualidade
dos embriões piora.
Quanto ao custo/benefício dos meios Embriocare e DPBS+BSA, o do
segundo foi melhor, pois o preço equivalente a 30 ml do produto (Laboratório
Nutricel, Campinas-SP), suficiente para as fases de rasteamento, lavagem,
manutenção por diferentes períodos e inovulação do embrião, usado durante o
experimento, foi de R$ 17,40 ou US$5,87 (dezessete reais e quarenta centavos ou
cinco dólares e oitenta e sete centavos), em 02/05/2004. Já o preço, na mesma
data, de um frasco de 50ml de Embriocare® solução de lavagem, utilizado na fase
de rasteamento foi de R$5,90 ou US$1,99 (cinco reais e noventa centavos ou um
dólar e noventa e nove centavos). O preço de um frasco de 15ml de Embriocare
Holding Plus® 0,4% BSA, utilizado nas fases de lavagem, manutenção por
diferentes períodos e inovulação do embrião foi de R$19,10 ou US$6,44 (dezenove
reais e dez centavos ou seis dólares e quarenta e quatro centavos), perfazendo um
total de R$25,00 ou US$8,43 (vinte e cinco reais ou oito dólares e quarenta e três
centavos) por transferência.
Pelos trabalhos consultados na literatura, esperava-se um melhor resultado
com o tampão Zwitteriônico que com o tampão fosfato. Neste trabalho, contudo,
ambos se mostraram com igual eficiência, na manutenção por períodos de até 2
horas, seguida de transferência de embriões eqüinos, em ambiente tropical.
Valor do dólar em 02/05/2004: R$2.966
CONCLUSÃO
Ambos os meios (Embriocare e DPBS com 0,4%BSA) são igualmente
eficientes na manutenção de embriões eqüinos, à temperatura ambiente entre 25-
35ºC, por períodos de até 60 minutos podendo chegar a 120 minutos, seguida de
transferência não-cirúrgica. Contudo, percebeu-se uma queda na qualidade dos
embriões, quando estes permaneceram em descanso no meio entre 60 e 120
minutos, embora, tal resultado não tenha sido, estatisticamente, não significativo. O
meio DPBS com 0,4% BSA apresentou o melhor custo/benefício, ou seja,
apresentou a mesma eficiência do Embriocare, por um preço mais baixo.
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APÊNDICE
Tabela 1- Composição química de dois diferentes meios utilizados na transferência
de embriões (HAFEZ, 1982)
INGREDIENTES (mg/l) DPBS HAM’S F10
NaCL 8000 7400
KCl 200 285
CaCl2 100 33
MgCl2.6H2O 100 ------
MGSO4.7 H2O ----- 153
NaHCO3 ----- 1200
Na2HPO4 1150 154
KH2PO4 200 83
GLICOSE 1000 1100
PIRUVATO de Na 36 110
AMINOÁCIDOS ------- contém 20 diferentes
VITAMINAS ------- CONTÉM 10 DIFERENTES
