Universidad Central de Venezuela

Universidad Central de Venezuela

Facultad de Agronoma

Departamento de Qumica y Tecnologa

PRESENCIA DE PARASITOS INTESTINALES EN MUESTRAS DE LECHUGA Y ENSALADAS EMPACADAS AL VACO EXPENDIDAS EN LA CIUDAD DE MARACAY.

Br.: Jennifer, A. Rodrguez, G.

Tutor: Prof.: Rafael Oyn.

Asesor: Prof.: Clver Mendoza.

Maracay, Noviembre de 2006.

Universidad Central de Venezuela

Facultad de Agronoma

Departamento de Qumica y Tecnologa

PRESENCIA DE PARASITOS INTESTINALES EN MUESTRAS DE LECHUGA Y ENSALADAS EMPACADAS AL VACO EXPENDIDAS EN LA CIUDAD DE MARACAY.

Br.: Jennifer, A. Rodrguez, G.

Tutor: Prof.: Rafael Oyn.

Asesor: Prof.: Clver Mendoza.

Trabajo presentado como parte de los requisitos para optar al ttulo de Ingeniero Agrnomo Mencin Agroindustrial.Maracay, Noviembre de 2006.

APROBACION DEL JURADO

Quienes suscriben, miembros del jurado examinador designados por el Consejo de la Facultad de Agronoma de la Universidad Central de Venezuela del Trabajo de Grado titulado PRESENCIA DE PARASITOS INTESTINALES EN MUESTRAS DE LECHUGA Y ENSALADAS EMPACADAS AL VACO EPENDIDAS EN LA CIUDAD DE MARACAY presentado por la bachiller Jeniffer Adriana Rodrguez Giannotti, C.I:V-15.119.585, para optar al ttulo de Ingeniero Agrnomo Mencin Agroindustrial, consideramos que dicho trabajo cumple con los requisitos exigidos por los reglamentos respectivos y por lo tanto lo declaramos aprobado.

Maracay a los 29 das del mes de Noviembre de 2.006.

____________________

Rafael Oyn.C.I. 1.291.260.Tutor.

___________________ ___________________

Clver Mendoza Renato Crozzoli

Jurado Principal Jurado Principal_____________________

Nathalie Frgenas.

Jurado SuplenteDEDICATORIA

Quiero dedicar este trabajo en primer lugar a mi hija Andrea Valentina Por ser mi ms grande motivo de lucha desde que supe de su existencia, ser la luz de mi vida, por traer tanta alegra a mi vida, y con esa alegra facilit la elaboracin de este trabajo. Por ser lo ms grande que tengo en la vida y por ensearme que el amor no tiene lmites

.

A mi Mami Por confiar en m, y no abandonarme jams, Por ser quien siempre ha luchado a mi lado en contra de las adversidades, por ensearme todo lo que se de la vida, por ser mi mejor amiga, y sobre todo por ser como es, la ms incansable, incondicional y mejor madre de todo el mundo

A Ricardo Por ser un gran compaero en este largo camino que hemos recorrido juntos y estar presente en importantes momentos de mi vida

A mis hermanos Daniel, Edgar, Elvis y Javier Por ser una de las cosas ms importantes en mi vida, por ser los mejores hermanos del mundo, demostrarme su amor y adems por ser como mis hijos as los quiero

A Richard Por estar aqu y apoyarme siempre, por ensearme cosas importantes de la vida y ser como un padre para mA mi Padre por darme la vida.A todos quiero dedicarles este trabajo, el producto de mi esfuerzo

AGRADECIMIENTO.

Quiero agradecer en primer lugar a Dios por ser quien hace posible que seamos las personas que somos, y quien escribe el camino que cada uno tiene que recorrer. Adems pone a nuestro lado a las mejores personas

A la Prof. Clver Mendoza por su incondicional ayuda y todos sus consejos, por confiar en mAl Prof. Rafael Oyn por sus consejos, su ayuda y por su gran profesionalismoA las licenciadas en Bioanlisis Iris y Reina y a la Ingeniero Zuleique Cartaya por su colaboracin en la elaboracin de este trabajo, por ensearme y guiarme en la identificacin de microorganismos

A las Tcnicos de Laboratorio Natasha y Mirbi y a la Sra. Elba, por su colaboracin y amabilidad

A todos los profesores de la Facultad de Agronoma que de una u otra forma colaboraron par que llegara hasta aqu

Gracias, gracias de todo corazn.

TABLA DE CONTENIDO

PAGINA DE TTULO..iAPROBACIN DEL JURADOiiiDEDICATORIA.ivAGRADECIMIENTO.vTABLA DE CONTENIDOviNDICE DE CUADROSixNDICE DE FIGURAS..xNDICE DE ANEXOS...xiRESUMENxiiI.INTRODUCCIN.....1II. BJETIVOS..5III.REVISIN IBLIOGRFICA.6 3.1. Parsitos intestinales..6 4. Generalidades de la Entamoeba histolytica8

4.1. Clasificacin...8

4.2. Morfologa...9

4.2.1. Trofozoitos....9

4.2.2. Prequistes...10

4.2.3. Quistes.10

4.2.4. Metaquistes....11

4.3. Enfermedad (amibiasis).11

4.4. Ciclo vital..13

4.5. Prevalencia..14

4.6. Supervivencia..15

4.7. Diferenciacin morfolgica del gnero Entamoeba..17

5. Generalidades de Ascaris lumbricoides..19

5.1. Clasificacin19

5.2. Morfologa20

5.3. Enfermedad (ascariasis)21

5.4. Ciclo vital..22

5.5. Prevalencia..23

5.6. Supervivencia..24

6. Generalidades de Trichuris trichiura.24

7. Aislamiento de quiste de protozoarios y huevos de helmintos25

8. Presencia de parsitos intestinales en vegetales...28

8.1. La procedencia del agua de riego29

8.2. El tipo de riego empleado..30

8.3. Las caractersticas fsicas del cultivo y su proximidad al suelo..30

9. Hortalizas.31

10. Ensaladas31

10.1. Generalidades de los componentes de las ensaladas..32

11. Lechuga..32

11.1. Clasificacin...33

11.2. Caractersticas......33

12. Zanahoria35

12.1. De punta roma...35

12.2. Races medio largas.35

12.3. Races largas.35

13. Repollo.36

13.1. De primavera.37

13.2. De verano...37

13.3. De invierno.37

14. Hortalizas minimamnete procesadas..38

14.1. Valor nutritivo..39

15. Mtodo de Elaboracin de ensaladas empacadas (listas para servir)..40

1. Seleccin.42

2. Pelado..42

3. Trozado42

4. Secado.42

5. Mezclado..42

6. Envasado.43

7. Etiquetado43

8. Refrigeracin...43

9. Almacenamiento.43

16. Microflora inicial de la materia prima destinada a la produccin de ensaladas.44

17. Calidad microbiolgica en hortalizas..44

18. Principales fuentes de contaminacin microbiolgica.45

IV. METODOLOGA49

4.1. Toma de muestras..49

4.2. Preparacin de las muestras51

4.3. Anlisis microbiolgicos51

4.4. Anlisis estadsticos52

V. RESULTADOS Y DISCUSIN54

5.1. Presencia de quistes de Entamoeba histolytica en muestras de lechuga.54

5.2. Presencia de quistes de Entamoeba histolytica en muestras de ensaladas empacadas al vaco54

5.3. Presencia de huevos de Ascaris lumbricoides en muestras de lechuga.55

5.4. Presencia de huevos de Ascaris lumbricoides en muestras de ensaladas empacadas al vaco56

VI. CONCLUSIONES.58

VII. RECOMENDACIONES...60

VIII. REFERENCIAS BIBLIOGRFICAS62

IX. ANEXOS.72

INDICE DE CUADROS

Cuadro 1. Microorganismos patgenos presentes en hortalizas.2

Cuadro 2.Incidencia de parasitosis por Ascaris lumbricoides y Entamoeba histolytica a nivel mundial.7

Cuadro 3. Comparacin de algunas caractersticas morfolgicas y fisiolgicas de tres especies de Entamoeba17

Cuadro 4. Caractersticas diferenciales de 4 amebas intestinales.18

Cuadro 5: Perodos de supervivencia de ciertos agentes patgenos excretados en el suelo y en la superficie de los cultivos a 20C - 30C.....29

Cuadro 6. Composicin qumica de la parte comestible de la lechuga.34Cuadro 7. Composicin qumica de la parte comestible de la zanahoria.36Cuadro 8. Composicin qumica de la parte comestible del repollo..38Cuadro 9. Composicin nutritiva de macronutrientes de la parte comestible de algunos vegetales40INDICE DE FIGURAS

Figura 1. Esquema tecnolgico para el procesamiento de ensaladas crudas refrigeradas41RESUMEN

El consumo de vegetales frescos es cada vez mayor debido a su aporte nutricional a la dieta de los seres humanos, pero tambin se comportan como vehculo de las ms de 200 enfermedades de transmisin alimentaria que se registran actualmente, que pueden ser causadas por bacterias, virus, hongos, parsitos, productos qumicos y toxinas de origen vegetal o animal. Existen numerosos parsitos del hombre que pueden causar molestias sobre la salud. En el estado Aragua las enfermedades parasitarias son un problema de salud pblica, siendo la de mayor importancia la Amibiasis causada por la Entamoeba hIstolytica. Tambin el Ascaris lumbricoides es causante de importantes estragos en la salud, aunque en menores porcentajes. La diseminacin de este tipo de enfermedades puede tener varias posibles causas como por ejemplo el mal tratamiento de los cultivos, o la mala manipulacin de los alimentos por personas infectadas con los parsitos, y que desconocen la infeccin. En la presente investigacin se plante como objetivo general determinar la presencia de parsitos intestinales en muestras de lechuga fresca y ensaladas empacadas al vaco expendidas en la ciudad de Maracay, para lograr el cumplimiento de este objetivo se analizaron 15 muestras de ensaladas empacadas al vaco y 15 muestras de lechuga fresca, adquiridas en diferentes supermercados de la ciudad de Maracay, otras muestras se tomaron de mercados libres y de expendedores provenientes de la Colonia Tovar, cada muestra se analiz por cuadruplicado dando como resultado 60 observaciones de cada tipo de muestra (ensalada empacada al vaco y lechuga fresca). Para detectar la presencia de huevos de parsitos en las muestras se utiliz el mtodo directo propuesto por Monge y col., (1.995). En las muestras analizadas no se evidenciaron formas parasitarias de ninguna forma, ni huevos de helmintos (A. lumbricoides), ni quistes de protozoarios (E. histolytica).

Palabras claves: Enfermedad alimentaria/ E. histolytica/ A. lumbricoides/ Vegetales/ Ensalada.

I.INTRODUCCIN.

En la actualidad la incidencia de enfermedades producidas por parsitos y otros microorganismos patgenos gastrointestinales, presentes en vegetales ha aumentado de manera considerable; esta situacin se ha visto influenciada directamente por la mala manipulacin de estos productos, adems del tratamiento inapropiado de los cultivos; ya que los agentes infecciosos en estos casos se diseminan por la va oral fecal, y en nuestro pas por lo general el riego de los cultivos se realiza con aguas inapropiadas, servidas y contaminadas, lo que aumenta la presencia de microorganismos nocivos para la salud.

Los parsitos intestinales son causantes de enfermedades diarricas en Venezuela. La amibiasis es la segunda enfermedad parasitaria ms importante del mundo causada por Entamoeba histolytica, su distribucin mundial vara de un lugar a otro, observndose con mayor frecuencia en los pases pobres y con bajas condiciones socioeconmicas. Se han reportado actualmente alrededor de 500 millones de personas infectadas en todo el mundo de los cuales, el 10% presentan sntomas clnicos; intestinales en un 80% a 98% de los casos y del 2 al 20% extraintestinales, ocasionando una mortalidad que oscila entre 40.000 y 110.000 casos por ao (Mora y col., 2005). Las enfermedades causadas por parsitos ocurren a todas las edades pero son ms comunes en los nios entre 5- 9 aos de edad y jvenes escolares que estn ms expuestos que los adultos.

Para Gavidea (2001) las parasitosis intestinales representan un problema de salud pblica y hace referencia a las principales parasitosis que azotan al Estado Aragua, las llamadas oportunistas y viajeras entre otras. Una de las principales es la Amibiasis producida por E. histolytica, en el Estado Aragua no se ha reportado altos porcentajes de mortalidad por esta causa, se ha registrado numerosos casos con sintomatologa semejante, los cuales son detectados y controlados inmediatamente. Aunque la incidencia de enfermedades parasitarias es menor en comparacin con las causadas por bacterias, virus, etc. los parsitos siguen siendo un problema de salud pblica, ya que los manipuladores de alimentos muchas veces desconocen la infeccin y no toman las precauciones higinicas pertinentes. Los vegetales y ensaladas que se sirven crudos pueden adquirir microorganismos patgenos a travs del ambiente o de los sitios donde se producen (el campo). Moreno (2000) seala que el consumo diario de hortalizas frescas ofrece una proteccin contra muchas formas de cncer y reduce la ocurrencia de enfermedades coronarias, pero a su vez ha producido una serie de enfermedades de intoxicacin por ser vehculo de transmisin, a continuacin se muestra el cuadro 1 que seala los efectos que causan algunos microorganismos patgenos al consumir hortalizas contaminadas.Cuadro 1. Microorganismos patgenos presentes en hortalizas

PatgenoEfecto

Virus de la HepatitisFiebre

Salmonella typhaFiebre

Shigella sp.Diarrea, fiebre y vmitos

Virus de NorwalkDiarrea, fiebre y vmitos

Fuente: Moreno, 2000.Hoy en da por las razones anteriores y por muchas otras ha surgido una tendencia de alimentos mnimamente procesados (Cuarta Gama), que abarca solo la LIMPIEZA, el troceado y envasado de vegetales, para ser consumidos frescos, siendo estos sometidos a rigurosos estudios de calidad y seleccin, con un tiempo establecido de caducidad (Cuarta gama 2001). El consumo de este tipo de productos se ha incrementado en los ltimos aos debido a la rapidez de su preparacin (en la mayora de los casos solo se deben servir). Los productos frescos tambin son de consumo masivo por la poblacin, estos no deberan ser causantes de problemas de salud pblica.Es importante acotar que de no llevarse a cabo cuidadosamente las labores de elaboracin de productos mnimamente procesados, se corre el riesgo de que ocurra contaminacin del producto lo que pondra en peligro la salud de los consumidores; por ello es necesario que la materia prima sea de ptima calidad; esto se lograra creando conciencia en productores, industriales de alimentos y consumidores; tomando en cuenta que estos son productos de consumo masivo (incluyendo nios, que son mas susceptibles a enfermedades), que pueden crear serios problemas de salud pblica.

Los manipuladores representan uno de los factores altamente involucrados en la contaminacin de los alimentos, en vista de que pueden actuar como portadores, los cuales pueden diseminar patgenos entricos por varios das o semanas; principalmente, porque desconocen que estn infectados y no toman las medidas higinicas necesarias, movilizndose de un lugar a otro sin ningn problema (Cartaya y col., 2002). La incidencia de este tipo de enfermedades tiene un origen importante en el hogar, donde no se manipula adecuadamente los vegetales frescos, por no tomarse en cuenta la presencia de microorganismos patgenos en los alimentos y las consecuencias que pueden tener sobre la salud.Una evidencia directa de la importancia de la manipulacin de los alimentos, respecto a la diseminacin de la amibiasis, se aprecia en un estudio realizado en Chile donde, despus del control y tratamiento de los manipuladores de alimentos durante tres aos descendi la enfermedad de 36,8% al 0,6% por aos (Atas y Neghne, 1991). El consumo de vegetales frescos es cada vez mayor, debido a su aporte nutricional a la dieta de los seres humanos; las hortalizas (lechugas y ensaladas en general), representan una fuente importante de vitaminas y minerales.

Cuando un alimento es consumido fresco, sin realizarse previamente una coccin, se corre un mayor riesgo de contraer una enfermedad de transmisin alimentaria, como es el caso de las enfermedades parasitarias.Por tal motivo resulta importante la determinacin y cuantificacin de microorganismos patgenos en alimentos, que por lo general, van a ser consumidos frescos (sin coccin) por toda la poblacin; esto para tratar de crear conciencia en las personas que manipulan los alimentos, independientemente del nivel de la cadena alimentaria (sector primario, secundario o terciario); para disminuir o evitar la incidencia de estas enfermedades que pueden llegar a causar graves estragos no solo en la salud, sino en la economa del pas. Todo lo anterior basado en la alta incidencia actual de enfermedades de transmisin alimentaria. II.OBJETIVOS.OBJETIVO GENERAL.

Determinar la presencia de parsitos intestinales en muestras de lechuga fresca y ensaladas empacadas al vaco expendidas en la ciudad de Maracay.

OBJETIVOS ESPECIFICOS.

Evaluar la presencia de parsitos intestinales en muestras de lechuga fresca y ensaladas empacadas al vaco. Identificar los parsitos intestinales que se encuentran en muestras de lechuga fresca y en ensaladas empacadas al vaco.

Determinar la carga de parsitos intestinales de las muestras de lechuga fresca y de las ensaladas empacadas al vaco.

III. REVISION BIBLIOGRAFICA3.1. Parsitos intestinales Hoy en da son muchos los microorganismos que causan dao a la salud, entre estos estn los parsitos y las bacterias. Los parsitos son seres (animales o vegetales) que viven de otro organismo causndole dao. Los parsitos pueden ser ectoparsitos si viven sobre el organismo o endoparsitos si viven dentro del mismo.

Ciertos parsitos solo pueden vivir como tales, llamados parsitos obligados, otros solo en ocasiones adoptan ese modo de vida, llamados parsitos accidentales y algunos, aun cuando habitualmente viven sobre el husped, pueden vivir libres (parsitos facultativos). Existen algunos parsitos llamados parsitos especficos, los cuales solo pueden vivir sobre un husped determinado. Y otros son parsitos verdaderos los cuales se alimentan del husped, y los falsos parsitos o inquilinos que se alojan sobre el husped, pero no se nutren de este (Botero y Restrepo, 1998).

Algunos de los parsitos que causan ms daos a la salud de los seres humanos son Entamoeba histolytica y Ascaris lumbricoides. A continuacin se muestra el cuadro 2 que resea cada parasitosis, el nmero de personas infectadas y el nmero de casos de enfermedades anuales.Cuadro 2. Incidencia de parasitosis por Ascaris lumbricoides y Entamoeba histolytica a nivel mundial.

ParasitosisN de personas infectadasN de casos de enfermedades anuales

Ascariasis1.000.000.0001.000.000

Amibiasis400.000.0001.500.000

Fuente: Atas y Neghne, 1991.

Dentro de los parsitos que afectan al ser humano se destacan dos grupos de gran importancia como lo son los protozoarios y los helmintos.Los protozoarios: algunos estn constituidos por una sola clula se multiplican directamente en el husped por divisin nuclear, algunos sin tener que pasar por el entorno exterior a travs de huspedes intermediarios. Son pequeos, pueden ser parsitos intracelulares o extracelulares; algunos se localizan en el tubo digestivo, tejidos o son de vida libre, los cuales pueden parasitar al hombre y afectar su sistema nervioso central (Ejemplo: Entamoeba histolytica).

Los helmintos: son endoparsitos y ectoparsitos que comprenden los llamados comnmente gusanos o lombrices los cuales son relativamente grandes. Estos muy rara vez pueden multiplicarse dentro del ser humano, solo existen algunas excepciones y cuando lo hacen se reproducen sexualmente, generando huevos o larvas que deben ser expulsadas al medio externo mediante las heces, orina o insecto picador vector. Muchos viven libres o se han adaptado a la vida parasitaria en vegetales, animales y hombre (Ejemplo: Ascaris lumbricoides).

4. Generalidades de la Entamoeba histolytica4.1. Clasificacin de la Entamoeba histolyticaReino: Protista.

Filo: AmoebozoaClase: Rhizopodea.

Orden: Entamoebida.

Familia: Endamoebidae.

Gnero: Entamoeba Nombre binomial: Entamoeba histolytica.

(http://es.wikipedia.org/wiki/Entamoeba_histolytica, 2006)

La E. histolytica es un protozoario patgeno que se encuentra distribuido mundialmente y especialmente en regiones tropicales y subtropicales; causa la amibiasis (disentera amebiana), enfermedad que se transmite va oral fecal. Estos microorganismos son anaerobios, aerotolerantes que necesitan glucosa o galactosa como principal sustrato respiratorio (Adams y Moss, 1997).

Estos parsitos pueden provocar evacuaciones frecuentes llamadas diarreas debido a que estos protozoarios invaden las clulas epiteliales del colon e leon distal causando microabcesos y lceras, especialmente cuando la infeccin intestinal es causada por una cepa patgena de E. histolytica (Organizacin Panamericana de la Salud O.P.S, 1997).

Atias y Neghne (1991) indican que la E. histolytica presenta varias fases de desarrollo durante su ciclo vital: trofozoitos, prequistes, quistes y metaquistes.

La infestacin del hombre se da por la ingestin de quistes maduros, por los cuales las frutas y vegetales pueden contaminarse cuando se emplean las heces fecales humanas como abono, cuando se les lava con agua contaminada o son manipuladas por portador de quistes de ameba.

4.2. Morfologa de la E. histolytica.

A continuacin se presentan las fases de desarrollo de la E. histolytica durante su ciclo vital.

4.2.1. Trofozoitos (fase vegetativa)Es la forma parasitaria ms activa ya que se alimenta y multiplica constantemente. Miden de 10 a 40 m. Presenta movimientos continuos debido a la emisin de pseudpodos. Pierde su movilidad en forma progresiva, cuando las condiciones del medio son desfavorables. Prez y Guzmn (1999) sealan que la emisin de pseudpodos se observa en una de las extremidades del trofozoito. En la regin contraria a la emisin de ste, se observa una cola o polo uroide, a la cual se adhieren clulas, bacterias, hemates y detritus.

En esta fase se diferencian algunas estructuras que se explicaran a continuacin:

- Membrana celular o plasmtica: es una envoltura limitante entre el medio interno y el externo. - Estructura superficial: Glicoclix: contiene glicoprotenas, glicolpidos y mucopolisacridos cidos. - Citoplasma: se divide en dos regiones claramente diferenciadas, el ectoplasma o zona ms externa, de aspecto claro, hialino, limpio, constituyendo la mayor rea de emisin de pseudpodos; y el endoplasma, el cual constituye el citoplasma propiamente dicho, presentndose como una masa protoplasmtica de aspecto granuloso (Icani y col., 2000). Dentro de los componentes citoplasmticos se tienen:

a) Sistema vacuolarb) Ribosomas

c) Citoesqueleto d) Ncleo(Clavel, 1999).

4.2.2. PrequistesEs un estado pasajero, inactivo e intermedio, entre la forma vegetativa y la forma qustica. Se presenta como un organismo ms o menos redondeado, con una membrana ms gruesa, perfectamente observable. Mide de 10 a 20m. Caracteriza a esta forma transitoria la ausencia de residuos y vacuolas alimentarias en su citoplasma, a fin de reducir las actividades metablicas al mnimo en los procesos de multiplicacin nuclear (Icani y col., 2000). 4.2.3. QuistesSe caracteriza por su tamao de 10 a 20 m, tienen una membrana qustica refringente que envuelve al citoplasma, en cuya estructura es posible observar inclusiones, vacuolas de glucgeno (quistes inmaduros) y cuerpos cromatoidales en nmeros de 1 a 3, los cuales son refringentes. Los ncleos varan de 1 a 2 para las formas inmaduras y hasta 4 en la forma madura, siendo solo diferentes en cuanto al tamao, los ncleos de los quistes inmaduros son de mayor tamao (Icani y col., 2000).

4.2.4. MetaquisteEs una masa protoplasmtica con 4 ncleos cuyas caractersticas morfolgicas son las mismas de los quistes tetranucleados, debido a que estas son las formas que abandonan los quistes durante el proceso de desenquistamiento.

Jay (1997) la clasifica como fase de quiste y fase de Amiba, tambien llamada trofozoito, que se divide en dos porciones, donde el ectoplasma es claro de aspecto cristalino y el endoplasma, menos refringente y de estructura finamente granular. Posee un ncleo a veces claramente visible; aunque puede como un anillo con pequeos grnulos refringentes dentro del endoplasma.

4.3. Enfermedad. (Amibiasis)

La infeccin se produce por ingesta de un quiste maduro, el desenquistamiento se produce en la regin inferior del intestino delgado, el prequiste se divide rpidamente para dar lugar a 8 trofozoitos, estos penetran en el intestino grueso experimentando fisin binaria y pueden: 1)Invadir los tejidos del husped, 2)Vivir en la luz del intestino grueso sin invasin o 3)Evolucionar a quistes y ser expulsados del husped con las heces (Prescoott y col., 2000)

La amibiasis es la infeccin causada por E. histolytica y es prevalente en todo el mundo; los focos endmicos son particularmente frecuentes en las reas con niveles socioeconmicos y sanitarios bajos. E. histolytica causa pocas secuelas o ninguna en la mayora de las personas infectadas. En una pequea proporcin de personas los organismos invaden la mucosa intestinal o pueden diseminarse a otros rganos, especialmente el hgado. Pueden provocar evacuaciones frecuentes llamadas diarreas debido a que estos protozoarios invaden las clulas epiteliales del colon causando microabcesos y ulceras. Especialmente esto ocurre cuando la infeccin intestinal es causada por una cepa patgena de E. histolytica. Alrededor del 90% de los casos la infeccin que se le atribuye a este patgeno es causada por cepas no virulentas, por lo cual no provocan sntomas, aunque se pueden identificar los quistes y trofozoitos en las heces reportando la presencia de E. histolytica (OPS, 1997).

La prevalencia de las infecciones amebianas vara en el mbito mundial desde 5% a 81% de la poblacin. Se calcula que el 10% de la poblacin mundial esta infectada por E. histolytica. Esta infeccin esta asociada con 50 millones de casos de enfermedad sintomtica y 70.000 100.000 muertes/ao. La amibiasis es la tercera causa de muertes debido a parsitos en el mundo. La disentera amebiana debida a la invasin de la mucosa intestinal se produce en aproximadamente entre el 1% y el 17% de las personas infectadas. La diseminacin de los parsitos a los rganos internos como el hgado ocurre en una fraccin aun menor de las personas infectadas y es menos comn en los nios que en los adultos (OPS, 1997).En Venezuela, no solo se le implica a los alimentos como factor causal de la amibiasis, sino tambin al consumo de agua contaminada por materia fecal, ya sea porque la poblacin consume agua no tratada o ineficientemente tratada o porque actualmente se riegan los cultivos con aguas residuales en algunas zonas de nuestro pas. No solo pueden ser contaminados los alimentos crudos, tambin los cocidos estn propensos a contaminacin ya sea por moscas o cucarachas, que actan como vectores mecnicos, o personas asintomticas que no toman las precauciones necesarias para la manipulacin del alimento preparado; aunque la incidencia de la amibiasis se le atribuye al consumo de verduras y frutas crudas, donde la contaminacin puede ser directa a travs de heces humanas utilizadas como abono o por otros vehculos (Mossel y Moreno, 1982).4.4. Ciclo vital de la E. histolytica.

La infeccin se inicia con la ingestin de quistes, resistentes a la acidez gstrica, a travs de la va digestiva, al consumir agua, alimentos y con residuos fecales con presencia de quistes tetranucleados. Al parecer las dietas ricas en carbohidratos y bajas en protenas favorecen la penetracin de la amiba en la pared intestinal (Markell y Voge, 1990).Clavel (1999) indica que la ingestin de un solo quiste, es suficiente para que ocurra la infeccin. Grandes dosis se asocian con periodos de incubacin cortos es decir, pocos das.

En el tubo digestivo ocurre la ingestin parcial de la pared del quiste, por diversas enzimas proteolticas presentes en el jugo gstrico y en la secrecin pancretica del hospedador y luego llega al intestino delgado y ocurre la salida de una ameba metaqustica de 4 ncleos. Rpidamente ocurre una divisin nuclear que da origen a 8 ncleos, y posteriormente una divisin citoplasmtica que resulta en 8 ambulas (Prez y Guzmn, 1999).Los trofozoitos en contacto con la pared intestinal aumentan de tamao y se multiplican por biparticin en loa luz del intestino grueso donde se alimentan de bacterias y restos celulares. Estos pueden salir con las heces (Zaman, 1979).

Los trofozoitos pueden enquistarse disminuyendo su tamao en los tejidos o e la luz intestinal, proceso aparentemente estimulado por las condiciones de la luz del colon menos ideales para ellos. Primero se redondean, adquiriendo una pared de quitina, dando lugar a los quistes inmaduros y al dividirse el ncleo hasta dos veces se da lugar al tpico quiste tetranucleado, los cuales originan la forma parasitaria de eliminacin, que garantiza la transmisin de la infeccin (Clavel, 1999).La amibiasis intestinal puede producirse en un plazo de dos semanas de la infeccin o puede demorarse durante meses. El comienzo es normalmente gradual con dolores abdominales de tipo clico y movimientos intestinales frecuentes. Las heces estn teidas de sangre y contienen una cantidad apreciable de moco con pocos leucocitos, en algunos casos la disentera amebiana est asociada con comienzo sbito de fiebre y escalofros que pueden traducirse en deshidratacin. 4.5. Prevalencia

Las condiciones favorables presentes en los pases en vas de desarrollo conllevan a la proliferacin de estos protozoarios; las malas condiciones higinicas, los bajos niveles econmicos donde las personas consumen lo que pueden y la poca cultura de consumo son factores altamente responsables de la alta incidencia de este parsito en la poblacin (Cartaya, 2002).

Bonilla y Dikdan (1981) indican que en Venezuela las tasas de infeccin por amibiasis reportadas varan de 1,8% a 29,5% en reas urbanas y hasta un 20% en reas rurales con vas de aumento. Segn Atas y Neghne (1991) se puede eliminar 1,5 x 107 quistes por da en aguas servidas y durante epidemia 5.000 quistes por litro de agua, lo cual puede ocasionar grandes epidemias.

Morn (1983) indica que en Venezuela especficamente en la zona Metropolitana existi para ese mismo ao una prevalencia de E. histolytica y A. lumbricoides del 32%, E. histolytica y Giardia de 7,9%; registrndose solo para la ciudad de Caracas un 14% de E. histolytica para ese mismo ao.

Jackson (1990) seala que la E. histolytica es uno de los principales parsitos protozoarios relevantes en E.E.U.U debido al consumo de alimentos contaminados con heces fecales.

La Organizacin Mundial de la Salud citado por Palomo (2002), estima que entre 400 y 500 millones de personas en todo el planeta estn infectadas con E. histolytica y que 50 millones de personas sufren de amibiasis invasivas. Esta ltima tanto en la forma intestinal como extraintestinal y es responsable de 11.000 a 40.000 muertes por ao. 4.6. Supervivencia.

La forma de resistencia de la amiba son quistes; a los que la cloracin normal del agua no afecta. Aunque los destruye la desecacin o temperaturas superiores a 55C, siendo su temperatura optima de 16C a 25C. Vela y col. (1997) indican que los quistes se mantienen viables durante un lapso de 5 minutos en las manos y hasta 45 minutos debajo de las uas. Ello implica el importante papel que desempea la manipulacin antihiginica de los alimentos en la difusin de la enfermedad.

Tambin se puede decir que el periodo de supervivencia en alimentos hmedos es aproximadamente 15 das a 4C, en alimentos congelados no se presenta este riesgo si se les mantiene de -10C a -15C por 24 horas (Quevedo y Thakur, 1980).

Los quistes tienen la capacidad de resistir algunas condiciones ambientales y pueden permanecer en la tierra o en el agua por periodos largos sin perder su viabilidad. En condiciones favorables estos mismos quistes pueden permanecer viables durante semanas tras su excrecin. Estos conservan la vida del endoparsito fuera del husped y generalmente su va de entrada es la boca; por lo cual la transmisin en muy simple. Es sumamente resistente a las condiciones del medio y a los jugos gstricos del tubo digestivo. Pueden sobrevivir en las heces por lo menos 8 dias a temperaturas que oscilan entre 20C a 40C y durante 40 dias a 2C hasta 6C, resistiendo incluso temperaturas de congelacin (Vela y col., 1997).

Feachem y Chischester (1983) indican que los quistes pueden ser destruidos por los procesos de filtracin y por el mtodo de electrolisis, aplicacin de yodo y cido actico a las aguas purificadas.

4.7. Diferenciacin morfolgica del gnero Entamoeba.

Las caractersticas morfolgicas de cada especie del genero Entamoeba varan, adems, existen diferencias en cuanto al husped susceptible, tamao, temperatura de crecimiento, movimiento, etc, en cada etapa de su vida (ver cuadros 3 y 4).

Cuadro 3. Comparacin de algunas caractersticas morfolgicas y fisiolgicas de tres especies de Entamoeba.

E.coliE. histolyticaE. gingivalis

HuspedHombre Hombre Hombre

Tamao del

trofozoito20 30 20 40 10 20

Posicin del

NucleoloExcntricoCentral, varaCentral

Tamao del

Quiste10 - 30 6,4 15,2 Quistes no formados

Cuerpos cromatoides

En los quistesAlgunas veces se presentan en forma de astillas A menudo en forma de barra______

Ncleos en los

QuistesGeneralmente 8Generalmente 4______

Temperatura

mxima de desarrollo37C37C37C

Temperatura

mnima para sobrevivir______32 41 C______

Fuente: Smyth, (1965) citado por Zaman (1979)

Cuadro 4. Caractersticas diferenciales de cuatro amebas intestinales.

E.histolyticaE. coliE. poleckiE.nana

Movimiento

TrofozoitoActivo especialmente en disenteria agudaLentoLentoLento

InclusionesEritrocitos en caso de invasin de los tejidosNo hay eritrocitosNo hay eritrocitosNo hay eritrocitos

Trofozoito (coloracin con hematoxilina)

N de ncleos1111

NucleoloGeneralmente central y pequeoGeneralmente excntrico y grandeGeneralmente excntrico y pequeoGrande

Cromatina perifricaGeneralmente simtrica y finaGeneralmente asimtrica y finaGeneralmente simtrica y finaPoco notable

Quistes (maduro coloracion con hematoxilina)

N de ncleos4811

Forma Circular CircularCircularGeneralmente ovalada

Dimetro 12 20 15 25 11 15 8 12

Cuerpo cromatoideGeneralmente grande extremos redondeadosGeneralmente pequenio extremos astilladosForma variableAusente

Vacuola de glucogeno coloracion con yodoDifusa DifusaDifusaAusente

Otras inclusionesNo NoMasa por lo general grande y dbilmente coloreadaNo

Fuente: Zaman, (1979)

5. Generalidades de Ascaris lumbricoides5.1. Clasificacin de Ascaris lumbricoidesReino: Animalia.

Phylum: Nematoda.

Clase: Secernentea.

Orden: Ascaridia.

Familia: Ascarididae.

Gnero: Ascaris.

Especie: A. lumbricoides.

Nombre binomial: Ascaris lumbricoides.(http://es.wikipedia.org/wiki/Entamoeba_histolytica, 2006)

Para el desarrollo de su ciclo vital no es necesario contar con un husped intermediario. Generalmente exhiben una fase de vida libre (en el suelo o agua), y otra parasitaria interna en el intestino, tejidos del hombre, etc (Markell y col., 1996).

Botero y Restrepo (1998) indican que el A. lumbricoides se localiza en el intestino delgado donde permanece en forma asintomtico o bien puede producir cuadros digestivos inespecficos, alteraciones de la nutricin con riesgos vitales. Los huevos al ser eliminados en las deposiciones no estn an segmentados y salen al medio externo en forma inmadura. Su desarrollo depender de las condiciones ambientales tales como: la temperatura, la humedad, calidad del suelo y sombra adecuados. La enfermedad que se genera por huevos redondos de A. lumbricoides es la Ascariasis. 5.2. Morfologia de A. lumbricoides.

El A. lumbricoides es un nemtodo blanco o rosado que puede identificarse por:

1) La longitud de los machos que es de 10 a 31 cm, y las hembras de 22 a 35 cm.

2) La cutcula finamente estriada y lisa.

3) Extremos cnicos.

4) El macho tiene en su extremidad posterior papilas incurvadas centralmente con dos espculas.

5) Boca terminal con tres labios ovales con papilas sensitivas.

6) rganos reproductores apareados en los dos tercios posteriores de la hembra, largos y tortuosos en el macho.

El orden Ascaridia es el ms representativo, es el nematodo intestinal ms grande. Fernndez y col., (1999) sealan que, es un gusano cilndrico; la hembra es ms grande que el macho y produce 200.000 huevos diarios que son eliminados en el material fecal. Estos huevos pueden ser frtiles o infrtiles.

Los huevos frtiles son de forma oval casi esfrica de 45 a 70 micras de longitud x 35 a 50 micras de ancho, color pardo amarillento, contenido finamente granular sin segmentacin (clulas nicas), cscara con 3 capas bien definidas, presentando el huevo un aspecto hialino (Martnez y col., 1994).Los huevos infrtiles son provenientes de hembras no fecundadas, debido a infecciones unisexuales, y se presentan tambin en 2/5 de las infecciones generales por A. lumbricoides. Estos son de un color pardo amarillento menos intenso, de forma elptica (mas largos y estrechos), de mayor tamao 88-94 micras de longitud x 39-44 micras de ancho, de cscara delgada y el contenido interno es de grnulos gruesos desorganizados (Martnez y col., 1994).

Segn Burrows (1973), las hembras de A. lumbricoides, pueden llegar a medir 20 cm o mas de longitud por 5mm de dimetro5.3. Enfermedad (Ascariasis)

La infeccin usual consiste de 10 a 20 gusanos; a menudo pasa inadvertida por el husped y solo se descubre en estudios sistemticos de materia fecal, o por la observacin de un gusano adulto expulsado espontneamente en las heces (Clavel, 1999).Los efectos graves, a veces mortales, de la ascariasis, se deben a la migracin de los gusanos adultos, que pueden ser regurgitados o vomitados, escapar a travs de las ventanas nasales o rara vez ser inhalados a un bronquio. Se han descrito muchos casos de invasin de vas biliares, vescula, hgado y apndice. Pueden causar pancreatitis hemorrgica aguda o bien transportan bacterias intestinales a estos sitios causando abscesos. Llegan a penetrar por la pared intestinal, a la cavidad peritoneal, produciendo peritonitis. La fiebre y ciertos frmacos son los que producen la migracin de Ascaris (Martnez y col., 1994).Los jvenes infectados no aumentan normalmente de peso, esto puede deberse a que los alimentos son consumidos por los gusanos o a la sustancia inhibidora de la tripsina que estos producen que interfiere con la digestin de protenas del husped (Markell y col., 1996).

5.4. Ciclo vital de A. lumbricoidesNo existe intermediario que sirva de husped, los huevos se transmiten por va oral. Los huevos infectantes al ser ingeridos por el hombre se fijan en el intestino delgado, liberando sus larvas que penetran en la pared intestinal y llegan a los vasos linfticos. Por la circulacin pasan al hgado, de ah al corazn y pulmones, pudiendo llegar a stos aun siete das despus de la infeccin. En los pulmones las larvas tienen la segunda y tercer muda. Emigran o son trasportadas de los bronquiolos a la traquea y glotis, y de ah al esfago e intestino delgado. Algunos casos pueden ser sintomticos, los cuales pueden estar relacionados con las distintas fases de su migracin: neumona, neumonitis, hemorragias pulmonares, nauseas, vmitos, dolor abdominal, etc (Clavel, 1999).

Los gusanos adultos normalmente viven en la luz del intestino delgado. Obtienen su nutricin de la comida semidigerida por el husped y probablemente de las clulas de la mucosa intestinal. Las hembras o los machos se encuentran solos en las personas muy ligeramente infectadas. Un gusano hembra tiene capacidad reproductora de 26 millones de huevos y en promedio pone 200.000 huevos diarios. Si las condiciones son favorables, de los huevos, en tres semanas, se forman embriones en segunda etapa infectante, despus de la primera muda, dentro de la cubierta del huevo. La temperatura ptima para su desarrollo es de 25C aproximadamente variando de 21C a 30C; las temperaturas inferiores retardan el desarrollo pero favorecen la supervivencia. Como los huevos requieren oxgeno, su desarrollo se retarda en materiales putrefactos (Fernndez y col., 1999).5.5. PrevalenciaEl A. lumbricoides es un parsito prominente en zonas templadas y tropicales, pero abunda ms en pases clidos, y sobre todo, donde la sanidad es deficiente. Se calcula que en territorios rurales tropicales la tasa de infestacin gira en torno al 80% (Fernndez y col., 1999).Los huevos infectantes son principalmente trasmitidos de mano a boca por los nios, que se ponen en contacto directo con el suelo contaminado. Pero tambin los huevos llegan al ser humano por el agua consumida y por los alimentos como frutas y verduras de consumo crudo contaminados con los huevos embrionados. Los insectos, las aves y los roedores pueden ser vectores de la infestacin o puede existir transmisin al hombre por el polvo u objetos a los que se adhieran los huevos del parasito. Ramos (1984) indica que en Venezuela, segn la divisin de endemias rurales del M.S.A.S (Ministerio de Sanidad y Asistencia Social, actualmente Ministerio de Salud y Desarrollo Social, 1992), para los aos 1960 a 1974 el 56,9% de las muestras de heces de 80.000 personas presentaron parsitos intestinales, e indicaron que en el 14,17% de estas se encontr huevos de A. lumbricoides.

Morn (1983) indic que en las enfermedades rurales endmicas en Venezuela, A. lumbricoides estuvo presente en un 45%, y solo en la ciudad de Caracas este mismo parasito prevaleci en un 21% en la poblacin.Direccin de Malariologa y Saneamiento Ambiental (1998) indica que al analizar 8867 muestras de heces fecales en la ciudad de Maracay se present A. lumbricoides en el 25,6% de las mismas, estibndose que para los meses de Enero y Octubre de ese mismo ao aumentara este porcentaje.

Las alteraciones nutricionales son ms evidentes en relacin directa a la cantidad de la infestacin y en relacin inversa a la edad del paciente y a su estado nutricional previo.

5.6. Supervivencia.Los huevos de A. lumbricoides son resistentes a temperaturas extremas, secado y a la accin qumica, y en condiciones de sequa o fro pueden permanecer en vida latente durante muchos meses, pero en lugar hmedo y sombreado, el desarrollo requiere de tres a cuatro semanas (Storer y col., 1975).

Los huevos de A. lumbricoides son susceptibles a la desecacin. El suelo flojo y hmedo, con sombra moderada constituye un ambiente adecuado, los huevos son destruidos por la luz solar directa en 15 horas por temperaturas superiores a 40C, persistiendo solo una hora a 50C. La exposicin de los huevos de Ascaris a -8C hasta -12C no los afecta. Los huevos son resistentes a los desinfectantes qumicos y pueden soportar la inmersin transitoria en agentes qumicos enrgicos. Sobreviven meses en albaales o aguas negras (Markell y col., 1996).

6. Generalidades de Trichuris trichiura.

Son parsitos del tubo digestivo, con cuerpo pequeo o mediano, con regin anterior filiforme y posterior gruesa, fusiforme, esfago delgado, muy largo, formado por una capa de clulas glandulares, los gusanos machos son fcilmente reconocibles por presentar la extremidad posterior en forma de espiral. Su color es blanco nacarado y miden 3 5 cm de longitud. La hembra puede eliminar hasta 7000 huevos/da (Icani y col., 2000).

Los parsitos adultos se localizan en el intestino grueso. No obstante para poder cumplir el ciclo biolgico deben vivir temporalmente fuera del hospedero o sobre el hospedero (Icani y col., 2000).

El ciclo comienza con la postura de los huevos, estos son elpticos (forma de barril) de 50 x 24 m con dos tapones mucoides polares, el contenido es granuloso y fino. La postura de las hembras grvidas se realiza en la luz intestinal. Los huevos en el momento de la postura pueden estar embrionados o no. Los huevos son vehiculizados al medio exterior a travs del ano por medio de las heces. La formacin de la larva infectante tiene lugar en el suelo, llegando a la forma infectante sin mudas (Icani y col., 2000).

Los huevos infectantes son ingeridos con los alimentos, agua o bebidas contaminados. Las lesiones cuantificables y frecuentes son realizadas por los adultos introduciendo su larga extremidad anterior en la mucosa, producindose desde erosiones leves en la mucosa hasta ulceraciones mltiples de grado variable a nivel del sector intestinal involucrado. La diarrea puede tomar un carcter crnico, alternndose con periodos de constipacin, tambin se observa anemia moderada, que se produce por la expoliacin sangunea, con sntomas de mareos, vmitos, palidez de las mucosas y somnolencia (Icani y col., 2000).

7. Aislamiento de quistes de protozoarios y huevos de helmintos.

Internacional Comission on Microbiological Specification For Foods (ICMSF) (1996), indica que el estado de la metodologa utilizada en parasitologa alimentaria, en comparacin con la bacteriologa de los alimentos es ms primitivo pero cabe destacar que debido a la incidencia de parsitos existen una gama de autores que han comparado mtodos para la determinacin de parsitos en vegetales pero su recuperacin es muy baja y variable en comparacin con la utilizacin de estas tcnicas para heces fecales.

Existen pocos mtodos para determinar con precisin el nmero de parsitos en alimentos. Las tcnicas para el aislamiento y recuento son generalmente tcnicas adaptadas de las que se utilizan para anlisis de heces, tejidos o suelos y varan mucho en sus eficiencias.

Una vez aisladas, la identificacin morfolgica a menudo es imposible, sobre todo si se trata de fases larvarias.

Uno de los mtodos coproparasitoscpicos adaptados a la determinacin de parsitos en vegetales y frutas, es el mtodo directo utilizado para la determinacin de parsitos en heces fecales, el cual consiste en tomar una lamina portaobjetos y dividirla en dos, se le agrega una gota de lugol en una parte y en la otra una gota de solucin salina al 0,85%. Se toma una muestra de heces del tamao de un grano de arroz y luego se realiza un frotis; se cubre con un cubreobjetos y se procede a la observacin al microscopio (Urbina y col., 1999).

Monge y Chinchilla, (1995) en su trabajo titulado, Presencia de parsitos y bacterias intestinales en hortalizas que se consumen crudas en Costa Rica, utilizaron el mtodo directo donde realizaron una preparacin previa de la muestra a travs de un lavado; posteriormente concentraron el liquido obtenido centrifugando a 900 G por 30 minutos. Luego prepararon un frotis del sedimento obtenido; en presencia de lugol y solucin salina al 0,85% para realizar la observacin microscpica.

Robertson y Gjerde, (1999) en su trabajo titulado Aislamiento y enumeracin de quistes de Giardia intestinalis, Oocytes de Cryptosporidium y huevos de Ascaris en frutas y vegetales combinan la concentracin por centrifugacin, separacin inmunomagntica realizando la identificacin a travs del mtodo de inmunofluorescencia, realizando las observaciones al microscopio. Estos realizan un lavado de la fruta o vegetal en un bao snico por 3 minutos luego el liquido obtenido es centrifugado durante 3 a 5 minutos a 1000 G en un tambor rotatorio con el objeto de obtener un sedimento, al cual posteriormente se le agregara un antgeno monoclonal fluorescente para Giardia y Cryptosporidium (Agar Clo G-/C Diretc) y 4 diamino-2 phenylindole. Luego se procede a la observacin microscpica.

Robertson y col., (2000) obtuvieron una recuperacin baja y variable entre centrifugar el lquido obtenido del bao snico en un periodo de tiempo de 3 y 5 minutos, observando que existi mayor efectividad a los 3 minutos

Rivero y col., (2001), estudiaron la prevalencia de parsitos intestinales en escolares de 5 a 10 aos de un instituto del Municipio Maracaibo, Estado Zulia Venezuela, para ello efectuaron un anlisis de un espcimen fecal, sometiendo las muestras a los anlisis coproparasitolgicos de examen al fresco con solucin salina fisiolgica y lugol, asi como la tecnica de concentracin con formol eter. A las mismas muestras se les efectu la Tcnica de Gram. y el Mtodo de Markey. En los resultados obtenidos observaron que el 87% de los escolares presentaba enteroparsitos (entre ellos el complejo Entamoeba histolytica/Entamoeba dispar), con un marcado predominio del poliparasitismo (73,53%). 8. Presencia de parsitos intestinales en vegetalesEl agua utilizada en los cultivos y procesos postcosecha de frutas y hortalizas pueden ser una fuente de contaminacin por si misma o un vehculo para diseminar la contaminacin de microorganismos patgenos de un producto a muchos otros, mediante la aplicacin de riegos, fertilizantes, plaguicidas, lavado, enfriamiento, encerado, desinfeccin de productos, etc.Al ser irrigados los cultivos con aguas residuales los agentes patgenos sobreviven en la superficie de los cultivos por perodos ms cortos que si estuviesen en el suelo, ya que en la superficie estn menos protegidos contra los efectos nocivos de la luz solar y la desecacin. Sin embargo, los perodos de supervivencia pueden ser suficientemente prolongados en algunos casos poniendo en peligro la salud de los individuos (Fos y col., 2000).

Los perodos de supervivencia de los diferentes agentes patgenos vara dependiendo de si estn en el suelo o en el cultivo y ms directamente dependen del agente patgeno como tal (ver cuadro 5).Cuadro 5. Perodos de supervivencia de ciertos agentes patgenos excretados en el suelo y en la superficie de los cultivos a 20C - 30C.

Agente patgeno

Supervivencia En el suelo

Das En los cultivos

Das

Virus

Enterovirus 15 das