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UNIVERSIDAD NACIONAL EXPERIMENTAL
“FRANCISCO DE MIRANDA”
ÁREA DE TECNOLOGÍA
NÚCLEO LOS PEROZO
PROGRAMA DE CIENCIAS AMBIENTALES
EVALUACIÓN DE LA CALIDAD MICROBIOLÓGICA AMBIENTAL EN EL
HUMEDAL QUEBRADA DE GUARANAO PARAGUANÁ ESTADO
FALCÓN
Trabajo de Grado presentado ante la Ilustre Universidad Nacional Experimental "Francisco de Miranda" Como último requisito para optar al Título de Licenciadas en Ciencias Ambientales
Autoras:
Br. Rojas. M. Yarubith T. C.I: V-15031498
Br. Jordán M. Milagro Del V. C.I: V- 20932738
Tutor Académico:
Dr. José Francisco Yegres
C.I: V- 2066979
Santa Ana de Coro, Octubre 2012
2
DEDICATORIA
Toda meta se alcanza cuando uno es capaz de vencer las adversidades y
los tropiezos, cuando se demuestra que nada es imposible que solo hace
falta tener motivos por el cual lograr las cosas, cuando nos sentimos
rodeados de seres especiales que nos fortalecen hasta el final. Sin esperar
nada a cambio.
Este trabajo especial de grado se lo dedico:
A Dios padre todopoderoso ser que me llena espiritualmente, me guía y me
da el regalo más preciado la vida.
A Mi madre querida María Geraldine mujer con admirable nobleza que me
llena de mucha paz, amor y ternura, mamita linda te amo. Este logro se lo
debo a usted por ser uno de los motivos más grande que existe en mi vida.
A Mi tía Miriam, mi segunda madre, que desde el cielo cuida de mí, guía
cada paso que doy. Tía como extraño su presencia, sus atenciones, ese
amor incondicional que solo usted sabia dar. Te quiero hasta el infinito…..
A José mi amigo, novio y compañero de vida que me enseño a luchar por lo
que se quiere en la vida, este logro te lo debo a ti. Te amo mi amor.
A María de los Ángeles mi hermosa hija que me llena de ternura, eres mi
motivo de vivir, de soñar, de reír, de luchar, Te amo mi princesa este
momento se lo debo a ti.
Yarubit Rojas
3
DEDICATORIA
A mi madre Moraima Morales por darme la vida y bridarme el apoyo en
tiempos difíciles, , sus buenos ejemplos, por su amor y dedicación... te amo
mama. Eres mi gran inspiración.
A mi padre Ángel Jordán por sus buenos ejemplos.
A mis hermanas y hermano que a un están estudiando, para que les sirva de
ejemplo, no se den por vencido y le pongan entusiasmo para que culmine
sus estudios como yo.
A mi hermana Agnnys Jordán por el apoyo brindado en tiempos difíciles
durante el final de mi carrera, y por animarme, gracias familia los amo a
todos.
A todos, muchas GRACIAS, que Dios los Bendiga, los Amo.
Milagro Jordán
4
AGRADECIMIENTOS
Gracias a Dios que me dio la vida, que me dio mi ser, que me permitió
culminar este trabajo especial de grado.
Gracias a mi Mama, que siempre ha sido y será mi gran ejemplo a seguir,
gracias por esperar con paciencia y mucha fe este momento.
Gracias a mi esposo que sembró en mi las esperanzas de seguir, que confió
en mí y me brindo todo el apoyo necesario para llegar hasta el final, Gracias
mi amor.
Gracias a mi hija querida que siempre estuvo a mi lado sacrificando sus
juegos, su descanso, sus vacaciones; Para yo poder avanzar en este largo
camino.
Gracias a mi tía Miriam que ha sido mi luz, aunque ya no estés físicamente
siempre te agradeceré lo que sembraste en mí.
Gracias a Milagro Jordán amiga, compañera de lucha que se dedico
simultáneamente conmigo para elaborar y culminar este trabajo especial de
grado, gracias milagrito por tu constancia, por compartir conmigo alegrías,
tristezas, rabias, sustos y risas.
Gracias a la señora Magaly Cuicas por brindarme su colaboración y
prestarme su apoyo para la realización de este Trabajo Especial de Grado.
Gracias a Leonel Martínez por su apoyo, paciencia y amabilidad.
Gracias al Dr. José Francisco Yegres por su gran disposición y su
incondicional apoyo realmente es un gran honor que usted sea mi tutor,
gracias por confiar en mí.
Gracias a mi tía Odalis por tenderme la mano cuando más la necesitaba
gracias querida tía.
5
Gracias a mi tío Germán y mi tío Ignacio por estar pendiente de mi y
brindarme cariño se que siempre han creído en mí, los quiero.
Gracias al Lic. Ángel Antequera por su valioso apoyo en la toma de muestras
Gracias a la Universidad Nacional Experimental Francisco de Miranda por
brindarme la oportunidad de formarme académicamente.
Yarubit Rojas
6
AGRADECIMIENTO
A Dios todo poderoso y a la virgen del valle por iluminar mi camino,
llenándome de fuerzas para salir adelante y llegar a mí meta.
Un especial agradecimiento:
Al Dr. José Francisco Yegres por darme el honor de ser mi tutor de este
Trabajo Especial de Grado.
A mi asesor Académico. José Araujo por su paciencia y dedicación. Gracias
a su dedicación logre culminar uno de mi más gran deseo: mi Trabajo
Especial de Grado. Gracias profesor Araujo se le quiere mucho...
A Sra. Magaly Cuica por brindarme su apoyo en el laboratorio de
Microbiología el alto hatillo cuando más lo necesite.
Al profesor Leonel Martínez por su apoyo y colaboración.
A mi familia, por toda su ayuda brindada a lo largo de mi carrera,
A mi novio Alberto Lugo por ayudarme en tiempos difíciles, apoyarme y
aconsejarme hasta el final de mi carrera, te amo.
A mi compañera de tesis Yarubith Rojas, por apoyarnos juntas en los
momentos más difíciles, por luchar, seguir adelante, y llegar a la meta y
finalmente hacer cumplir uno de nuestros sueños realidad. Te quiero mucho
amiga.
A mis compañeros de clases, por aportar un poquito cada uno para formar
parte de este sueño de nuevas metas y nuevas experiencias.
7
A mis amigos: el Lic. Ángel Antequera y Víctor Méndez por brindarme su
apoyo con el transporte para realizar algunos de los muestreos de campo...
Gracias amigos...
A mi amigo René González por apoyarme, y aconsejarme en el comienzo de
mi Trabajo Especial de Grado gracias amigo.
Al Decanato de Extensión de la Universidad Nacional Experimental Francisco
de Miranda, por el apoyo brindado con el transporte para realizar uno de los
muestreos de campo especialmente a el chofer; Sr. Castellano mil gracias…
A todos los profesores y profesoras de la Universidad Nacional Experimental
Francisco de Miranda, (Los Perozos) gracias, a ellos adquirí conocimientos
sobre la carrera de Ciencias Ambientales. Se les quiere.
Milagro Jordán
8
EVALUACIÓN DE LA CALIDAD MICROBIOLÓGICA AMBIENTAL EN EL
HUMEDAL QUEBRADA DE GUARANAO PARAGUANÁ ESTADO
FALCÓN. Rojas, Y.; Jordán M.; Araujo J. Trabajo Especial de Grado para
optar al título de Licenciadas en Ciencias Ambientales. UNEFM. Área de
Tecnología. Programa de Ciencias Ambientales. Coro, Octubre 2012.
RESUMEN
La presente investigación consistió en la evaluación microbiológica del
humedal Quebrada de Guaranao bajo el enfoque de la Microbiología
Ambiental. El estudio se realizó e cuatro estaciones representativas con
cuatro muestreos uno por mes en periodos secos para los meses de junio y
julio y lluvioso para los meses de agosto y septiembre. Se colectaron
muestras de los componentes de agua, suelo y aire. De estos componentes
se caracterizaron cepas de hongos, bacterias y microalgas, se
cuantificaron las bacterias, hongos asimismo se evaluaron los diversos
grupos de microalgas presentes en el agua superficial de dicho humedal.
Con medición de parámetros físico-químicos (pH, Oxigeno disuelto,
Temperatura) y microbiológicos del agua basado en la norma 883. Por otra
parte se determinó la diversidad funcional de las cepas previamente aisladas
mediante el empleo de pruebas bioquímicas. Los principales
microorganismos caracterizados son los diplococos en el componente agua y
aire y cocos Gram negativos en el suelo, los hongos Aspergillus flavus
seguido de Aspergillus niger, en los tres componentes. El principal grupo
encontrado de microalgas fueron las clorofitas, la diversidad funcional
obtenida fue de 0,72 en el Aire, 0,76 del suelo y 0,90 del agua, de todas las
pruebas evaluadas la glucosa fue la prueba con mayor porcentaje, los
resultados obtenidos permitieron diagnosticar un alto contenido de
microorganismos para el suelo y el aire. El diagnostico del componente agua
clasificó al agua en los subtipos 4A y 4B para las estaciones E1 y E2 y de
tipo A1 para la estaciones E3 y E4.
Palabras Claves: Diversidad Funcional, Microbiología Ambiental, Aspergillus,
diplococos, Microalgas.
9
INDICE GENERAL
INTRODUCCIÓN ..................................................................................................... 13
CAPITULO I EL PROBLEMA ................................................................................. 17
Planteamiento del problema ............................................................................... 17
Objetivos ................................................................................................................ 19
Objetivo General ............................................................................................... 19
Objetivos Específicos ..................................................................................... 19
Justificación ........................................................................................................... 20
Alcance y delimitación del Estudio .................................................................... 21
Limitaciones de la investigación ........................................................................ 22
CAPITULO II MARCO TEORICO .......................................................................... 23
Antecedentes ........................................................................................................ 23
Microbiología Ambiental .................................................................................. 26
Los microorganismos en el ambiente .......................................................... 26
Microorganismos en el Aire ............................................................................ 27
Microorganismos en el Agua .......................................................................... 28
Microorganismos en el Suelo ......................................................................... 28
Índices para el Diagnostico Microbiológico Ambiental ............................... 29
Bacterias ............................................................................................................ 30
Hongos ............................................................................................................... 30
Métodos en Microbiología Ambiental. ........................................................... 31
Cultivo y Aislamiento de Microorganismos .................................................. 35
Medios de cultivo para Hongos ...................................................................... 35
Medio de Cultivo para Bacterias .................................................................... 35
10
Aislamiento de Hongos en Cámara Húmeda (Métodos de Microcultivo de
Riddell) ............................................................................................................... 36
Aislamiento de bacterias por selección de colonias ................................... 36
Cultivo y Asilamiento de Microorganismos del agua .................................. 37
Cultivo y Aislamiento de Microorganismos del suelo ................................. 37
Cultivo y Aislamiento de Microorganismos del aire .................................... 37
Determinación de la Biomasa microbiana .................................................... 38
Identificación de microorganismos ................................................................ 39
Métodos basados en pruebas bioquímicas ................................................. 41
CAPITULO III MARCO METODOLÓGICO .......................................................... 42
Tipo y Diseño de la Investigación ...................................................................... 42
Fase de campo ..................................................................................................... 42
Área de estudio ................................................................................................. 42
Área de Muestreo ................................................................................................ 43
Tipo de muestreo y toma de la muestra ....................................................... 44
Número de muestra. ........................................................................................ 47
Traslado y procesamiento de muestra ......................................................... 47
Fase Descriptiva ................................................................................................... 48
Tipo de muestra y replicas ............................................................................. 48
Caracterización de bacterias, hongos y microalgas en los componentes
agua, suelo y aire. ............................................................................................ 49
Recuperación de hongos y bacterias del componente aire en placa de
Petri previamente muestreada. ...................................................................... 49
Promoción del crecimiento de hongos y bacterias de los componentes
suelo y agua con medios selectivos en placa de Petri. ............................. 49
11
Aislamiento de hongos y bacterias de los componentes agua, suelo y
aire. ..................................................................................................................... 51
Caracterización macromorfológica de hongos y bacterias aislados según
el sistema de (Thomas Kerr 1970). ............................................................... 51
Caracterización Micromorfológica de bacterias aisladas utilizando tinción
diferencial de Gram. ......................................................................................... 52
Caracterización Micromorfológica de hongos utilizando microcultivo de
Riddell. ............................................................................................................... 53
Caracterización Micromorfológica de microalgas mediante microscopía
fotónica. ............................................................................................................. 54
Cuantificación de la población microbiana de bacterias, hongos y
microalgas en los diferentes componentes.................................................. 54
Cuantificación de Hongos y Bacterias en el componente aire. ................ 54
Cuantificación de hongos, bacterias y microalgas en el componente
suelo. .................................................................................................................. 55
Cuantificación de hongos, bacterias y microalgas en el componente
agua. ................................................................................................................... 55
Establecimiento de la Diversidad Funcional de hongos bacterias y
microalgas para los componentes suelo, agua y las especies fúngicas y
bacterianas en el componente aire. .............................................................. 57
Pruebas físico –químicas del agua según decreto 883. ............................ 58
Diagnostico de la calidad microbiológica ambiental del suelo según
(Alexander 1980), Aire (OMS 1993), Agua (decreto 883) aplicando
adicionalmente criterios físicos – químicos para este ultimo. .................. 58
CAPÍTULO IV RESULTADOS ...................................................................................... 60
Análisis de los Resultados .............................................................................. 60
DISCUSIÓN DE LOS RESULTADOS .................................................................. 82
CONCLUSIONES ..................................................................................................... 85
12
RECOMENDACIONES ........................................................................................... 86
REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS ...................................................................... 87
ANEXO 1. Visita a la Quebrada de Guaranao con el personal de inparques 97
ANEXO 2. Muestreo realizado en la Quebrada de Guaranao .......................... 97
ANEXO 3. Toma de muestras de aire, agua, suelo .......................................... 98
ANEXO 4. Kit de campo para la medición de oxigeno disuelto ........................ 98
ANEXO 5. Medicion de Oxigeno Disuelto ............................................................ 99
ANEXO 6. Medicion de pH ..................................................................................... 99
ANEXO 7. Realizacion de pruebas de coliformes fecales termoresistente .. 100
ANEXO 8. Preparacion de medio PDA ............................................................... 101
ANEXO 9. Preparación de medios de cultivo .................................................... 101
ANEXO 10.Autoclave utilizado para esterilizar los medios de cultivo. .......... 101
ANEXO 11. Muestras de agua tomada en cada una de las estaciones ...... 102
ANEXO 12. Muestras madres de agua ............................................................. 102
ANEXO 13. Diluciones de muestras de suelo en placas ................................. 103
ANEXO14. Cepa de aire ....................................................................................... 103
ANEXO 15. Cepa de agua .................................................................................... 103
ANEXO 16.Cepa de suelo .................................................................................... 104
Anexo 17 Cálculo de cel / µl con cámara de Neubauer ................................... 105
ANEXO 18. Cálculo de UFC / m3 en el componente aire por el método de
sedimentación pasiva ............................................................................................ 106
ANEXO 19. Número Más Probable para series de diluciones en replicas de
cinco por nivel de dilución (Woomer, 1994) ....................................................... 107
13
INTRODUCCIÓN
Los Humedales Costeros constituyen áreas de gran importancia biológica,
con condiciones ambientales particulares entre el mar y la zona continental.
Estos ecosistemas particulares están definidos mayormente por una
compleja interacción en donde se producen amplias fluctuaciones de la
salinidad y de la temperatura, producto de la mezcla de los aportes marinos y
fluviales, la escasa profundidad de sus aguas, una elevada evaporación y
altas tasas de descomposición (López H, 2008).
Una de las definiciones más conocidas y aceptadas es la Convención de
Ramsar o Convención Relativa a los Humedales de Importancia
Internacional, especialmente como Hábitat de Aves Acuáticas, donde es
expuesta como: “extensiones de marismas, pantanos, turberas y aguas de
régimen natural o artificial”, permanentes o temporales, estancadas o
corrientes, dulces, salobres o saladas, incluyendo las extensiones de agua
marina cuya profundidad en marea baja no exceda de 6 m (Secretaría de la
Convención de Ramsar, 2010).
La quebrada de Guaranao es un humedal costero localizado en la
Península de Paraguaná Municipio Carirubana del Estado Falcón, que
cuenta con una extensión de 140 Hectáreas, en el cual se haya presente el
ecosistema de manglar, este cumple funciones tanto de carácter
geomorfológico y ecológico, al proporcionarle refugio a variedades de
especies de animales como peces y aves. De igual manera constituye una
zona de apareamiento cría y alimentación para gran número de peces e
invertebrados marinos (MARN, 1983).
14
En 1991 fue nombrada a través del Decreto Nacional 1.848 Parque
Metropolitano Guaranao, con una poligonal cerrada que abarca una
superficie mayor a 140 ha que se distribuye desde la intercomunal Alí
Primera Punto Fijo, Los Taques hasta la salida al mar en el puerto
internacional, atravesando los sectores Blanquita de Pérez, Bloques de BTV,
La Rosa, Los Caciques, Santa Irene, Josefa Camejo, Bolívar e Industrial
(Inparques, 1990).
Su principal atractivo radica en el hecho de ser el único curso natural
permanente de agua dulce que queda en Paraguaná y centro conservador
de plantas y animales que son extintos en otras áreas o están en vía de
extinción en el resto de la Península, como por ejemplo los riachuelos de
Moruy y Santa Ana, pero han sido afectados progresivamente por la
deforestación del bosque del cerro por los pobladores o por el ganado
caprino (Wilfer, 2009).
La contaminación de sistemas acuáticos naturales por el vertido de
aguas residuales doméstica y urbana representa una de las principales
causas de pérdida de calidad ambiental de los ríos, estuarios y las aguas
costeras en general. La gestión correcta de éste y otros problemas sólo
puede abordarse tras el conocimiento de la identidad e importancia de las
fuentes contaminantes descargadas en el sistema receptor. Las aguas
residuales domésticas pueden contener gran diversidad de agentes
contaminantes de naturaleza química, capaces de provocar cambios
importantes en los ecosistemas locales, así como numerosos
microorganismos patógenos (bacterias, virus), los cuales representan un
problema de salud pública, es por esta razón que se hace necesario evaluar
la calidad de las aguas y su grado de contaminación por materia fecal lo cual
15
representa importancia desde el punto de vista ecológico, sanitario y estético
(González, et al 2009).
Los microorganismos son importantes indicadores de la calidad del
suelo debido a que cumplen funciones vitales en el reciclado de nutrientes,
supresión de patógenos, transformación de residuos, degradación de
contaminantes, entre otras (Nielsen, 2002). Por otro lado la composición
sobre la estructura de las comunidades y su función bacteriana es
importante para establecer un índice del estado de los ecosistemas y
caracterizar la actividad fisiológica alta y rápida respuesta a los cambios
ambientales. (Nielsen, 2002).
Para esto las bacterias heterotróficas pueden ser usadas debido a que
son sensibles ante cambios y fluctuaciones de los factores abióticos del
sistema y a los efectos antrópicos sobre el ambiente (De Giorgio et al 1998,
Bobkova 2002, Kudryavtsev et al 2002). De igual manera la diversidad de
las comunidades microbiológicas generalmente disminuye en respuesta a
perturbaciones o estrés ambiental y el número de poblaciones sobrevivientes
poseen propiedades específicas que le permiten persistir dentro de las
comunidades perturbadas dando información sobre el estado ambiental
(Atlas et al. 1991).
En Venezuela, los estudios sobre estructura de comunidades
bacterianas acuáticas y diversidad funcional son muy escasos y, los pocos
que se han desarrollado se basan, en su mayoría, en el estudio de
sucesiones microbianas durante los procesos de descomposición de materia
vegetal (Bastardo 1988, Bastardo 1993, Danovaro et al. 1998, Bastardo
1999). Es por ello que bajo el enfoque que propone la Microbiología
Ambiental se estableció como objetivo de esta investigación, el evaluar la
calidad microbiológica ambiental de la Quebrada de Guaranao en sus
16
componentes Agua, Aire y Suelo, caracterizando los microorganismos como
hongos, bacterias y microalgas presentes y su cuantificación para establecer
un diagnostico ambiental. Por otro lado se pretende conocer la dinámica de
la población con el estudio de los grupos funcionales presentes.
17
CAPITULO I EL PROBLEMA
Planteamiento del problema
Muchos humedales del planeta están desapareciendo o siendo
alterados sustancialmente, lo que contribuye al aumento de la pobreza, los
problemas de suministro de agua, la inseguridad alimentaria y la degradación
de la biodiversidad del planeta. Algunas causas de esos problemas radican
en las presiones que el modelo desarrollista impone, el uso inadecuado a
nivel local y la implementación de políticas nacionales e internacionales no
sostenibles (Stolk et al, 2006).
La obtención de agua dulce se evidencia como uno de los problemas
ambientales más importantes de los próximos años; dado que la existencia
de agua limpia está relacionada con el mantenimiento de ecosistemas sanos,
la conservación y el uso sustentable de los humedales se vuelve una
necesidad impostergable.
El estado Falcón está situado en la zona Noroeste de Venezuela en
una posición geográfica privilegiada, La laguna quebrada de Guaranao se
encuentra ubicada en la Península de Paraguaná, Punto Fijo, la misma
atraviesa la ciudad desde el Puerto Guaranao hasta un poco más allá del
sector modelo de esa ciudad, sus aguas actualmente se encuentran
contaminadas porque en ella se han vertido las aguas residuales durante
muchos años, pero aun las amplias porciones de vegetación alrededor de la
laguna como: manglares y plantas de agua, atraen abundantes tipos de
aves que se posan en ese lugar (Wilferd, 2009).
18
En la actualidad, sólo cinco (5) humedales venezolanos se han
incluido en la lista de Sitios Ramsar o humedales de importancia
internacional, acorde a los criterios establecidos por esta convención y que
fue ratificada por Venezuela en 1988. Al respecto, el Comité Nacional
Ramsar está realizando acciones para aumentar la representatividad de los
distintos tipos de humedales en la lista de sitios Ramsar venezolanos
(Secretaria de la Convención Ramsar, 2010). A pesar de esta valiosa
iniciativa en aumentar el número de humedales de importancia internacional
decretados en territorio venezolano, existe una creciente amenaza sobre los
mismos. En el Diagnóstico de los Sitios Ramsar de Venezuela realizado por
el Comité Nacional Ramsar en el 2003, los principales problemas
ambientales de estas áreas resultaron ser: desarrollo urbano no planificado
de las comunidades locales y aledañas, realización de una actividad turística
no controlada y de alto impacto, mal manejo de los desechos sólidos y
actividad pesquera realizada de forma irracional. Dentro de las causas que
originan estos problemas se encuentran las formas de relación o uso que las
comunidades lo puede catalogarse como insostenible o irracional (Secretaria
de la Convención Ramsar 2010).
Por otro lado la escasa información actual sobre la calidad ambiental del
lugar propone el uso de un diagnostico ambiental de los diversos
componentes mediante la evaluación de los microorganismos y la
cuantificación, así como la diversidad funcional microbiana que se establece
en el humedal. Ya que en la actualidad no se conoce el estado ambiental y la
posible acción antropica que contamina al ambiente de estudio.
19
Objetivos
Objetivo General
Evaluar la Calidad Microbiología Ambiental del humedal quebrada de
Guaranao en sus componentes Agua, Suelo y Aire.
Objetivos Específicos
Caracterizar las bacterias, hongos y microalgas en los
componentes agua, suelo y aire de la quebrada de Guaranao.
Cuantificar la población microbiana de bacterias, hongos y
microalgas en los diferentes componentes de la quebrada de
Guaranao.
Establecer la diversidad funcional de los hongos, bacterias y
microalgas en los componentes agua, suelo y especies fúngicas y
bacterianas sobre el componente aire.
Diagnosticar en la quebrada de Guaranao la calidad
microbiológica ambiental del suelo según (Alexander 1980), aire
(OMS 1993) y agua (decreto 883) aplicando adicionalmente
criterios físicos-químicos.
20
Justificación
La importancia de valorar la calidad microbiológica ambiental del
humedal quebrada de Guaranao, en sus tres componentes agua, aire, suelo,
es propicia para conocer la situación ambiental de este lugar en la
actualidad. Caracterizando la diversidad funcional de los microorganismos
así como también estableciendo índices microbianos, ya que Los
microorganismos, procariotas (bacterias y archaea), eucariotas (hongos,
algas y protozoos), son responsables del reciclamiento de la mayoría de la
materia en la naturaleza y son elementos básicos en las cadenas tróficas.
Los microorganismos cumplen muy a menudo funciones únicas en los ciclos
biogeoquímicos (fijación del nitrógeno, nitrificación, desnitrificación, fijación
quimiolitotrófica del dióxido de carbono, formación de metano, reducción de
sulfatos), en la formación del suelo, en la regulación del clima, en la
composición atmosférica (incluyendo los gases invernadero).
El estudio de los parámetros fisicoquímicos tales como la temperatura,
pH, y oxigeno disuelto, juegan un papel importante en la composición y
cantidad de los microorganismos en un determinado hábitat, las cuales
influyen directamente en el crecimiento de los microorganismos.
En la actualidad el humedal quebrada de Guaranao es el único curso
de agua dulce permanente ubicado dentro de la ciudad de Paraguaná, posee
tres características resaltantes para ser considerado como un humedal de
importancia internacional, es el hábitat de aves acuáticas migratorias y
estacionales, en el se encuentra una especie de leguminosa única en el
occidente venezolano (Vigna longifolia) también habitan especies vegetales
endémicas y en peligro de extinción como el supí, el palo de Brasil y la
baricigua, lo cual puede considerarse como un pulmón vegetal y además de
21
ser un cuerpo de agua dulce extenso del semiárido de Paraguaná
(Wilferd,2009)
El presente trabajo es un aporte a las Ciencias Ambientales que es
impartida por la Universidad Nacional Experimental Francisco de Miranda
así mismo, es una contribución a la línea de investigación en el área de
Microbiología Ambiental. Metodológicamente brindará la oportunidad de
utilizar técnicas, métodos e instrumentos novedosos para la caracterización
de los microorganismos presentes que pueden ser usados como indicadores
de la calidad ambiental del sitio de estudio.
Alcance y delimitación del Estudio
El objetivo principal de esta investigación fue evaluar la calidad
microbiológica ambiental de los componentes: Agua, Suelo, Aire del
humedal quebrada de Guaranao con fines de evidenciar el estado ambiental
y su posible grado contaminación.
El trabajo de investigación fue desarrollado en laboratorios adscritos a
la Universidad Nacional Experimental Francisco de Miranda (UNEFM)
Laboratorio de Microbiología Agrícola Ambiental ubicado en el Hatillo y el
Laboratorio de Microscopía Electrónica ubicado en el Complejo Académico
Los Perozos Coro Estado Falcón. La realización de las diferentes actividades
se llevo a cabo en un periodo de aproximadamente 6 meses, comprendido
entre los meses de Mayo del 2012 hasta Octubre de 2012.
22
Para cumplir con los objetivos planteados, se realizo un muestreo
georeferenciado utilizando un mapa de la zona que se obtuvo de Google
Earth y un GPS marca Garmin modelo Etrex, para ubicar con mayor
precisión las estaciones de muestreo en la quebrada de Guaranao, poder
medir de manera metodológica las condiciones fisicoquímicas.
Limitaciones de la investigación
Recursos económicos muy reducidos, por lo tanto fue necesario
solicitar apoyo para el traslado a instituciones pública tales como
Hidrofalcón, al Decanato de acción social de la UNEFM.
La inseguridad fue un obstáculo para la recolección de muestras lo
que amerito la custodia de Funcionarios Policiales del Estado Falcón y del
Municipio Carirubana
La información escrita sobre el sitio de estudio fue muy limitada y
escasa.
23
CAPITULO II MARCO TEORICO
Antecedentes
Existen diversos trabajos de investigación reportados sobre estudios
microbiológicos de humedales. Entre los estudios más relevantes que tienen
relación con el tema se citan los siguientes:
Aguilar (2005). La degradación de los ecosistemas acuáticos en algunos
países desarrollados ha llevado al establecimiento de normas de calidad del
agua, éstas incluyen componentes biológicos dentro de los cuales están
macro invertebrados acuáticos, algas, peces y microorganismos; siendo
estos últimos grupos de Organismos considerados como herramientas para
monitorear, caracterizar y definir la calidad ambiental del agua en los
ecosistemas lóticos y lénticos.
Arcos et al (2005) en un estudio sobre Indicadores microbiológicos de
contaminación de las fuentes de agua. Proponen el uso de indicadores
microbianos que se puedan identificar mediante el uso de métodos sencillos,
rápidos y económicos. El diagnóstico y la posterior recuperación de las
fuentes de aguas naturales contaminadas, debe hacerse teniendo en cuenta
las implicaciones que en términos ecológicos y sanitarios representa la
degradación del recurso. En este sentido, las microalgas se constituyen
como buenos indicadores del estado trófico de los ecosistemas y responden
a los disturbios ocurridos modificando su estructura en cuanto a composición
y abundancia se refiere.
24
López y Piñero (2007), emprendió un estudio con el fin de realizar el
rescate y conservación de la Laguna de Guaranao mediante un plan de
acción participativo establecido por la integración de la escuela- comunidad a
través del método de Investigación Acción Participativa (IAP) y siguiendo lo
establecido en el Currículo Básico Nacional de Educación (CBN, ob, cit),
donde plantea el fortalecimiento de los valores ambientales, éticos y
estéticos y la participación organizada de la ciudadanía en la solución de
problemas socio ambientales.
Bastardo A, et al., (2007). Realizaron una investigación que consistió en
conocer la diversidad funcional de las bacterias heterótrofas del Bajo río
Orinoco, Venezuela en el que realizaron cultivos en placas para obtener
cepas bacterianas las cuales se caracterizaron bioquímicamente para la
obtención de los grupos funcionales y la determinación del índice de
diversidad funcional (IDF).
Díaz L, et al., (2007). Realizaron un estudió en Maracaibo, Venezuela de la
estructura de las comunidades bacterianas heterotróficas de suelos
cultivados con Psidium guajava L. (guayaba) y suelos control (no cultivados)
desde el punto de vista morfológico y funcional para relacionarlos con las
características fisicoquímicas de los suelos, con el objetivo de evaluar la
diversidad funcional bacteriana.
Ávila y Escupiñan (2010) en un estudio realizado en las aguas del
humedal de Jaboque, Colombia afirman que estas aguas contienen un alto
número de coliformes y Enterococcus, lo cual confirma la contaminación de
origen fecal en todo el ecosistema, esta contaminación se asocia al
vertimiento de aguas residuales al humedal, por lo que no deben usarse para
fines de consumo humano y doméstico, agrícola o recreativo.
25
Morillo et al., (2010), realizaron un estudio en Venezuela, con la finalidad de
crear una matriz de evaluación del fitoplancton en diferentes zonas del Lago
de Maracaibo, en este estudio se seleccionó un área del Lago que
representaba las características de abundancia en fitoplancton y contenido de
nutrientes propios de aguas con problemas de eutrofización, se procedió a
realizar una caracterización físico-química de los principales elementos
contenidos en las muestras de agua. La dinámica de crecimiento de las
microalgas fue seguida mediante recuentos celulares realizados cada tres
días, hasta alcanzar la fase estacionaria. La abundancia de células se calculó
mediante el recuento de alícuotas en una cámara de Neubauer, los resultados
evidenciaron la ocurrencia de procesos de eutrofización en el agua,
demostrada por el aumento de la población del fitoplancton a 72×106 células
por mililitro de agua a los catorce días de cultivo para el caso del agua del
lago y a 99,7×106cél/ml en las muestras de agua enriquecidas con nitrofosca.
Abdulmoneim (2011) realizó un estudio para identificar los hongos presentes
en el aire de un mercado en Sudan, en cual se selecionó cuatro puntos
cardinales, y mediante el método de sedimentación pasiva recuperaron en
medio Papa Dextrosa Agar (PDA) diversos tipos de hongos que fueron
aislados de los cuales se identificaron 27 cepas de los generos: Aspergillus,
Penicillium, Alternaria, Curvularia, Fusarium y Rhizopus.
26
Bases Teóricas
Microbiología Ambiental
Microbiología ambiental, trata sobre el estudio de la composición,
fisiología, diversidad microbiana, la interacción, la asociación y los procesos
que ocurren en el ambiente. Sin embargo, se ha ampliado enormemente en
los últimos años con el desarrollo de la comprensión del medio ambiente y el
papel de los microbios en el mismo, por lo que la microbiología ambiental es
aplicada en la actualidad en el suelo, agua, aire y sedimentos que cubren
determinado hábitat y también puede incluir a los animales y plantas que
habitan en estas áreas (Pradipta, 2008).
Los microorganismos pueden ser usados para conocer la situación
ambiental de un espacio, área o ecosistema determinado así como también
ser pueden ser usados para beneficio de la restauración ambiental, por eso
la microbiología ambiental establece la función para el mantenimiento del
equilibrio ambiental, así como también su uso para la valoración de la calidad
ambiental o la restauración de ambientes contaminados (Keya, y Nicolas
2011).
Los microorganismos en el ambiente El ambiente puede ser divido en los componentes de la atmosfera
(aire), de la hidrosfera (agua), y de la litosfera (suelo). En la atmosfera no se
presenta una flora típica de microorganismos por lo que no se considera que
la atmosfera alberge poblaciones microbianas autóctonas, sin embargo este
sirve como un medio de dispersión de los microorganismos, que al ser
transportados son sometidos a diversos efectos de estrés como temperatura,
radiación y desecación. La hidrosfera es un buen ambiente para el
crecimiento microbiano, y este se encuentra poblaciones autóctonas de
diversas variedades que dependen de las características del sistema
27
acuático y la profundidad así como también de los factores abióticos.
Mientras que el suelo se considera un buen ambiente para el crecimiento de
los microorganismos sobre todo en la capa orgánica de este (Atlas, y Baltha
2005).
Microorganismos en el Aire
Aunque el aire no posee un flora autóctona la cantidad de
microorganismos de la atmosfera varía según la altura (101 -104 UFC / m3), y
los valores más altos son los que se encuentran a nivel del suelo, con un
rango efectivo de dos metros desde el suelo, este es considerado el
microclima más importante que comparte el hombre y los animales, por
encima de los 200 a 5000 metros se hacen escasos los microorganismos y
es rara en el límite de la troposfera y no se encuentran en la estratosfera. Los
microorganismos son más abundantes en lugares poblados al compararlos
de lugares abiertos, y el número varía según la actividad de la zona donde se
evalúa, bien sea zonas pobladas que incluye ambientes, industriales o
agrícolas o citadinos. Sin embargo el número de microorganismos es mayor
en las zonas pobladas y después en el mar, y cerca de las costas (De la
rosa, 2002). Por otro lado el tiempo que permanecen los microorganismos
en el aire depende de la forma, tamaño y peso del microorganismo y de la
existencia y potencia de las corrientes aéreas que los sostengan y los eleven
(Mohr, 1997).
Existe una inter fase la cual recibe el nombre de neuston, es decir la
fase entre el aire-agua, en ella se encuentran grandes poblaciones
microbianas, en ella hay un intercambio entre el aire y el agua, los
microorganismos fotosintéticos son los más destacados en esta fase y de la
columna de agua subyacente donde penetra la luz. Las algas y las bacterias
28
se distribuyen por lo general cercanas a la superficie. Mientras que la
anaerobias más hacia los fondos (Atlas, y Baltha 2005).
Microorganismos en el Agua
La hidrosfera alberga gran cantidad de microorganismos y es también
un medio por el cual estos se distribuyen por el planeta, en este medio los
microorganismos se adaptan y colonizan diversos espacios acuáticos según
las características que este posee incluyendo aspectos como temperatura,
radiación solar y distribución de nutrientes. El mismo hecho de la
heterogeneidad del la hidrosfera hace que los ambientes también sean de
igual forma y así mismo los microorganismos que se encuentra en el ella. Sin
embargo, los microorganismos fotosintéticos se encuentran en la superficie
del agua y a medida que desciende la radiación solar por el agua estos se
estratifican para usar los diversos rangos radiantes. Por otro lado es de
interés que los cuerpos de agua que contienen microalgas pueden revelar su
estado debido a las poblaciones presentes. Las bacterias heterotróficas y
hongos también constituyen indicadores de la situación del agua tanto en su
cantidad como por la presencia de especies indicadoras como por ejemplo
Escherichia Coli (Hellawell, 1986; Kelly y Whitton, 1995).
Microorganismos en el Suelo
Un aspecto a considerar sobre la microbiología del suelo es que los
microorganismos que se encuentran en este dependen del tipo de suelo.
Puesto que los estudios que las poblaciones microbianas tienden
correlacionarse con la cantidad de materia orgánica presente en el suelo, y
las características de este. Sin embargo el suelo contiene diversas
poblaciones microbianas entre las que se incluyen a las bacterias, hongos,
algas y protozoarios y estos varían según el lugar y la profundidad u
29
horizonte de estudio clásico realizado por Alexander, en 1980 muestra como
se distribuyen los microorganismos en los horizontes del suelo.
Tabla 1. Cantidad de microorganismos a diferentes profundidades de un perfil
de suelo.
PROFUNDIDAD
(cm)
BACTERIAS
AEROBIAS
(NMP/g)
BACTERIAS
ANAEROBIAS
(NMP/g)
HONGOS
(NMP/g)
ALGAS
(NMP/g)
3-8 7,800 1,950 119 25
20-25 1,800 379 50 5
35-40 472 98 14 0.5
65-75 10 1 6 0.1
135-145 1 0.4 3 -
Fuente: Alexander, 1980
Índices para el Diagnostico Microbiológico Ambiental
En la actualidad no existe un índices único para la determinación de la
calidad ambiental con el uso de los microorganismos es por ello que se
busca evaluar a este con el uso de índices determinados para los
componentes agua, suelo y aire. Para el componente agua en Venezuela
puede ser usado como base lo establecido en el instrumento jurídico de la
norma 883, (Anexos). Para el aire se propone los índices de la OMS de
(1993) y para suelo los índices propuestos por Alexander (1880). Los índices
Internacionales propuestos por la OMS para el Estudio de la calidad de Aire
se muestran a continuación se describen en el documento de edición de
1993, de la comisión de Comunidades Europeas (Cost Project 63 Report
n°12)
30
Bacterias
Tabla 2 Niveles de UFC/m3 (unidad formadora de colonia / m3) de Bacterias
en Aire.
Nivel de Contaminación Concentración de Bacterias
UFC / m3 en el aire
Muy Baja < 50
Baja 50-100
Intermedia 100-500
Alta 500-2000
Muy Alta >2000
Hongos
Tabla Nº 1 UFC / m3 (unidad formadora de colonia / m3 ) de hongos en Aire
Nivel de Contaminación Concentración de hongos
UFC / m3 en el aire
Muy Baja < 25
Baja 25-100
Intermedia 100-500
Alta 500-2000
Muy Alta >2000
31
Métodos en Microbiología Ambiental.
Morfología
Los Microorganismos pueden ser identificados por su morfología tanto
las bacterias como los hongos, las bacterias presentan diversas formas para
su identificación mientras que los hongos pueden ser identificados por la
presencia de hifas y cuerpos fructíferos ríos (Madigan et al., 2006).
Las Bacterias
Son seres vivos microscópicos procariotas que pertenecen al dominio
bacteria su tamaño se mide en micras (1 µm = 10-6 m) y oscila entre 0,2 µm
de algunos cocos y las 5-8 µm de largo por 1,5 µm de ancho de los bacilos.
Las bacterias pueden presentar diferentes formas como: cocos, bacilos,
espirilos, vibrio, cuadrados, estrellas, amorfas o con apéndices. Al mismo
tiempo estas pueden estar dispersas, agrupadas, solas, en pares, tétradas,
octadas, cadenas, paquetes ríos (Madigan et al., 2006).
Coco: La morfología de un coco es circular o más o menos esférica.
Diplococos: Formado por parejas de dos cocos. Algunos diplococos
poseen capsula como el Streptococcus pneumoniae (llamado antes
Diplococcus pneumoniae) es un diplococo encapsulado de bordes
adyacentes redondeados y extremos puntiagudos que le proporcionan una
forma lanceolada ríos (Madigan et al., 2006).
32
Estreptococos: Son bacterias en forma de cadena pertenecientes al
filo Firmicutes producto de una división celular sucesiva en un solo eje, del
Griego στρεπτος streptos, significa que se dobla o retuerce con factibilidad,
como una cadena ríos (Madigan et al., 2006).
Estafilococos: Son cocos, de 0,8 a 1 micras, inmóviles en forma de
racimo de uvas producto de un crecimiento celular sucesivo en varias
direcciones o ejes de crecimiento, del Griego σταυσλή, staphylē, "racimo de
uvas" y κόκκος, kókkos, "gránula" aunque al ser aislados se pueden ver en
diplo o cadena ríos (Madigan et al., 2006).
Cocobacilo: Bacilo muy corto de forma oval, es una bacteria que
incluye la forma de bacilo (bastón) como la de coco (oval) ríos (Madigan et
al., 2006).
Bacilo: Los bacilos son bacterias con forma de barra o vara que se
encuentran en diferentes ambientes y solo se pueden observar con un
microscopio ríos (Madigan et al., 2006).
Los bacilos se pueden dividir en:
Bacilos Gram positivos: Fijan el violeta de genciana (tinción de
Gram) en la pared celular porque carecen de capa de lipopolisacárido ríos
(Madigan et al., 2006).
33
Bacilos Gram negativos: No fijan el violeta de genciana porque
poseen la capa de lipopolisacárido (peptidoglicano) ríos (Madigan et al.,
2006).
Los Hongos
Los hongos pertenecen al dominio eukarya, desde el punto vista
morfológico son un grupo heterogéneo. Unos son unicelulares y están
constituidos por células, redondeadas o ovales con tamaños entre 3-10
micra de diámetro denominadas levaduras (Atlas y Bartha 2005).
Estructuras de los hongos
Micelio es el conjunto de filamentos y un trozo del mismo se
denomina hifa.
Las hifas pueden presentar septos y entonces el micelio está
tabicado.
Septos primarios son los formados cuando hay división nuclear y
adventicios los otros. Si los tabiques están ausentes se habla de
micelio
Los mohos son micromicetos filamentosos. El hongo es una célula
aislada se dice unicelular o levadura. Los cortos filamentos
compuestos por las células que brotan de una levadura constituyen el
pseudomicelio.
34
Plecténquima es un conjunto de hifas entrelazadas que se asemejan
a un tejido. Se dice prosénquima si las hifas pueden ser reconocidas y
pseudoparénquima cuando han perdido su individualidad.
Esclerocio es un plecténquima generalmente macroscópico que
puede permanecer en vida latente.
Rizomorfa es un cordón grueso donde el conjunto de las hifas
fusionadas ha tomado el aspecto de raíz.
Rizoides son las hifas de succión, como raicillas, que penetran en el
substrato.
Haustorio es la hifa de succión del hongo parásito dentro de la célula
del hospedador.
Apresorios son unas hifas achatadas que se adhieren al substrato o
al hospedador como sostén, especialmente en el comienzo de la
infección (Carrillo, L 2003)
Microalgas (Fitoplancton)
Las microalgas son seres vivos que contienen clorofila, un pigmento
verde que sirve como molécula captadora de luz que hace posible que las
algas realicen fototrofía, la mayoría de las microalgas se encuentran en
ambientes acuáticos sin embargo también es posible encontrarlas en el
suelo. Casi las tres cuartas partes del planeta están cubiertas por agua, solo
el 0.8% corresponde al agua dulce, como lagos lagunas y ríos (Madigan et
al., 2006).
35
Cultivo y Aislamiento de Microorganismos
El Cultivo de células viables es método útil para el contaje de células
vivas, una célula viable es aquella que es capaz de dividirse para dar lugar
a la descendencia, la forma habitual se hace contando a un número de
células capaces de generar colonias sobre la superficie de un medio sólido.
(Schlegel, et at 1997).
Medios de Cultivo
Para el cultivo de diferentes microorganismos se utilizan medios de
cultivos que pueden variar según su composición química como definida o
simple e indefinida o compleja, según su naturaleza, puede ser liquida,
semisólida o sólida según la cantidad del agente solidificante en este caso el
agar (Schlegel, et al 1997).
Medios de cultivo para Hongos
Agar Papa Dextrosa Agar PDA
El Agar PDA es un medio de cultivo utilizado para el cultivo de
hongos. Este agar tiene como base la presencia dextrosa y carbohidratos
obtenidos de la infusión con de la papa lo cual provee un medio propicio para
la recuperación de hongos (AOAC, 1995; Marshall RT, 1993).
Medio de Cultivo para Bacterias
Agar Nutritivo
El Agar Nutritivo es un medio de cultivo utilizado para una amplia
variedad de microorganismos. Su formulación fue sugerida por la APHA
(American Public Health Association) a principios de 1900, como un medio
36
de cultivo estándar para el análisis de agua (APHA, 1917; APHA 1923). Este
medio de cultivo se encuentra descrito en los Métodos Estándar de la APHA
y de la AOAC (Association of Oficial Analytical Chemists) como un medio útil
para el análisis de agua, alimentos y otros materiales (AOAC, 1995; Marshall
RT, 1993).
Aislamiento de Hongos en Cámara Húmeda (Métodos de Microcultivo
de Riddell)
El método de microcultivo desarrollado por Riddell este método crea
un ambiente propicio para generar la esporulación de especies fúngicas el
cual consiste en inocular con aguja de inoculación estéril pequeños cubos de
medio agar con aproximadamente 1 cm3 dispuestos sobre láminas
portaobjetos, la cual estará sobre una base en forma de U realizado con una
barrilla de vidrio o pipeta Pasteur doblada al calor, posteriormente estos
cubos serán cubiertos con una lámina cubreobjetos y se colocaran sobre
papel de filtro estéril humedecido dentro de una capsula de Petrí estéril la
cual será incubada a temperatura ambiente y en condiciones de luz natural
durante un lapso de 10-15 días (Casas R., 1994).
Aislamiento de bacterias por selección de colonias
El aislamiento de bacterias a partir de muestras naturales se realiza,
en la mayoría de los casos, mediante la producción de colonias aisladas en
cultivos sólidos. El crecimiento explosivo de las bacterias permite producir un
gran número de ellas a partir de una única célula inicial de forma que, tras un
periodo de incubación en las condiciones ambientales adecuadas, se
produce una colonia observable a simple vista y formada por individuos
iguales (un clon bacteriano) (Schlegel, 1997).
37
Cultivo y Asilamiento de Microorganismos del agua
En Venezuela hasta los momentos las Normas COVENIN establecen
métodos desarrollados para el análisis de muestras de agua con fines de
consumo, mientras que no se estableces procedimientos normados para el
análisis de aguas con fines recreacionales, por otro lado algunos
investigadores y laboratorios de análisis adoptan el uso de la metodología
estándar desarrollada por el ISO, la cual puede ser usada con diversos
niveles de sensibilidad según, el uso de menor o mayor cantidad de tubos
ajustando los resultados bajo las tablas usadas para el cálculo del NMP este
tipo de estudio hace más confiable los resultados (APHA, 1992).
Cultivo y Aislamiento de Microorganismos del suelo
Las muestras de suelo deben ser tomadas a una profundidad
determinada para evitar interferencia con posibles contaminantes del aire,
para este procedimiento se utiliza una pala estéril y un cubo o una bolsa
plástica nueva, en donde se colocan entre 200g a 1Kg colectados a 20 o 30
cm del suelo, esta técnica permite recuperar la gran abundancia de
microorganismos presentes en el suelo (Lorch et al., 1998).
Cultivo y Aislamiento de Microorganismos del aire
Cada vez somos más consientes de que el aíre es vehículo transmisor
de agentes biológicos, entre lo que se incluyen hongos, bacterias, protozoos,
y sus subproductos, además de polen y otros elementos presentes, estos
microorganismos son trasladados y pueden cambiar las condiciones de los
ambientes donde se posan o logran colonizar de allí la importancia de
reconocer y determinar los microorganismos presentes en el aire o
aerplancton microbiano (Microkit, 1999).
38
Sedimentación pasiva
El Método más utilizado es el conocido como Sedimentación pasiva.
El cual se basa en dejar placas abiertas que contienen medio de cultivo de
agar, durante varios minutos y esperar que las corrientes de aíre lleven a los
microorganismos suspendidos en el aíre choquen y se pongan en contacto
con ellas (Kolwzan et al., 2006 Microkit, 1999).
Este método consiste en dejar abiertas placas de Petri por un periodo
de tiempo de 10 a 20 minutos y esperar que sedimenten los
microorganismos de la columna de aíre. Es un método claramente
cualitativo y semi cuantitativo, algunos autores recomiendan no utilizar el
estándar de UFC/m3 mientras que otros sugieren el cálculo de las UFC/Placa
multiplicada por 10 para obtener resultados en UFC/m3, Temperaturas de
Incubación: en general en el aire intramural hay dos tipos de poblaciones
microbianas a parte de de los actinomicetos de cierto tipo de aire como el de
las tenerías, fabricas, silos, textiles entre otros que incluye la flora saprófita y
la asociada al hombre que puede ser patógena (Microkit, 1999).
Determinación de la Biomasa microbiana
Método UFC y NMP
Una ventaja especial de los medios de las pruebas en agar es que
proporcionan números - unidades formadoras de colonias (UFC). Para el
análisis de UFC se debe utilizar las herramientas estadísticas diseñadas para
la distribución de Poisson (Ilstrup 1990) o bien convertir los datos para
aproximar la distribución normal. Esta conversión de datos se puede hacer
mediante el uso de sus valores en log10 o tomando la raíz cuadrada de (n
+1) (Ilstrup 1990).
39
El método del Número Más Probable consiste en la enumeración de
los microorganismos y es el método más comúnmente utilizado en el
laboratorio (USP 2003b) o en otras situaciones en que la muestra no se
puede poner en una suspensión apropiada o ser filtrada (Aspinall y Kilsby
1979).
Método de Cámara de Neubauer
La cámara de Neubauer es una cámara de contaje adaptada al
microscopio de campo claro o al de contraste de fases. Se trata de un
portaobjetos con una depresión en el centro, en el fondo de la cual se ha
marcado con la ayuda de un diamante una cuadrícula como la que se ve en
la imagen. Es un cuadrado de 3 x 3 mm, con una separación entre dos
líneas consecutivas de 0.25 mm. Así pues el área sombreada y marcada L
corresponde a 1 milímetro cuadrado. La depresión central del cubreobjetos
está hundida 0.1 mm respecto a la superficie, de forma que cuando se
cubre con un cubreobjetos éste dista de la superficie marcada 0.1
milímetro, y el volumen comprendido entre la superficie L y el cubreobjetos
es de 0.1 milímetro cúbico, es decir 0.1 micro litro (INE, 1982).
Identificación de microorganismos
Macroscópica
Las bacterias y los hongos pueden ser estudiados de forma
macroscópica al ser cultivados en placa de Petri este tipo diverso de formas
es útil para la identificación de las colonias que crecen en el medio cultivo,
identificando tres elementos de interés. 1) La Forma: puede ser puntiforme,
circular y ovalada, filamentosa, irregular, rizoide, fusiforme. 2) La Elevación:
plana, elevada, convexa, pulvinada, umbonada, montañosa, crateriforme. 3)
40
El Margen: entero, ondulado, lobulado, erosionado, filamentoso, rizado
(Rossi, 1936).
Microscópica
Microscopía Óptica
El microscopio es un instrumento que permite la observación de
organismos que no pueden ser apreciados en detalle a simple vista, es decir
de los microorganismos (Rossi, 1936).
Preparación de Muestra
Preparación húmeda:
Se realiza colocando una gota de la suspensión de microorganismos
entre un portaobjeto y un cubreobjeto, para luego realizar una observación
directa en microscopio fotónico (Kerr, 1970).
Preparación fijada:
Se coloca una suspensión homogénea de microorganismos en una
gota de agua sobre el portaobjetos y se fija (mediante calor o agentes
químicos) y después se tiñen mediante diferentes técnicas (Rossi, 1936).
Tinción
Las tinciones son técnicas que permiten observar microorganismos en
función de la capacidad de los mismos para retener (o no) determinadas
sustancias colorantes, lo que depende de la carga de la célula y del colorante
(Rossi, 1936).
41
Tinción Simple (Azul de metileno)
Azul de metileno (Tinción positiva). Permite teñir el interior celular.
Tiñe microorganismos procarióticos (vivos o muertos). Los eucarióticos sólo
se tiñen si están muertos. Algunas estructuras, como los corpúsculos
metacromáticos, se tiñen más intensamente con este colorante que el resto
de la célula (Rossi, 1936).
Tinción Diferencial (Método de Gram)
La tinción de Gram es un método empírico para diferenciar especies de
bacterias en dos grandes grupos (Gram-positivas y Gram-negativas), basado
en las propiedades químicas y físicas de sus paredes celulares (Beveridge,
1991).
Métodos basados en pruebas bioquímicas
Las pruebas bioquímicas han sido ampliamente utilizadas para diferenciar
bacterias. Estas pruebas se fundamentan en demostrar si el microorganismo
es capaz de fermentar azúcares, la presencia de enzimas, la degradación de
compuestos, la producción de compuestos coloreados, etc. Aun bacterias
fuertemente relacionadas pueden separarse en dos especies diferentes con
base a pruebas bioquímicas (MAC FADDIN, 1993).
42
CAPITULO III MARCO METODOLÓGICO
Tipo y Diseño de la Investigación
Tipo de Investigación
Esta investigación fue de tipo exploratoria según el nivel de
profundidad del conocimiento ya que, esta nos permitió ampliar la
información sobre la calidad microbiológica ambiental del humedal quebrada
de Guaranao.
La investigación consto de dos fases, una fase de campo en donde se
evaluaron diversos aspectos presentes en las estaciones de estudio así
como la toma de muestra en los componentes agua, suelo y aire. Otra fase
descriptiva donde se estudiaron las características de los microorganismos
de forma cualitativa y cuantitativa para diagnosticar la calidad de los
componentes en las diferentes estaciones del humedal quebrada de
Guaranao (Risquez et al 1999).
Fase de campo
En esta fase los métodos que se aplicaron nos permitieron recoger
datos de forma directa del humedal quebrada de Guaranao (Risquez et al
1999).
Área de estudio
La zona de estudio corresponde al humedal quebrada de Guaranao,
la cual presenta características ambientales de interés por ser un humedal
marino costero y porque es un humedal que se encuentra dentro de una
zona urbana. La quebrada de Guaranao se encuentra ubicada en el Sector
Suroeste de la Península de Paraguaná, Estado Falcón.
43
En su curso bajo, atraviesa la ciudad de Punto Fijo, para desembocar
finalmente en el Golfo de Venezuela, al Norte del Puerto de Guaranao. El
área definida por la poligonal es atravesada por cuatro calles, generando
cinco (5) espacios con características particulares. Desde el punto de vista
urbano la Quebrada en sus últimos 7,5 kilómetros de recorrido forma parte
del área definida por MINDUR como Área Metropolitana Punto Fijo- Los
Taques, según Gaceta Nº 3034 de Fecha 18/ 10/1982 (INPARQUES, 1990).
Área de Muestreo
Se establecieron 5 estaciones de muestreo para abordar los cincos
espacios descritos en la poligonal. Para la ubicación de las siguientes
estaciones se tomaron como criterios: la accesibilidad, el posible efecto de la
actividad antrópica la entrada y salida del cuerpo de agua.
Las estaciones de muestreo fueron georeferenciadas utilizando un
GPS marca Garmin modelo Etrex.
44
Figura N° 2. Mapa de las estaciones de muestreo en el humedal
quebrada de Guaranao.
Fuente: Modificado de Geoportal SIGOT y Google Earth, 2012.
Tipo de muestreo y toma de la muestra
La toma de muestra se realizo en tres periodos de tiempo durante 3
meses uno por mes, para ello se aplicaron muestreos de tipo aleatorio simple
45
en cada estación, por triplicado para la toma de las muestras de los
diferentes componentes:
Se realizo un muestreo aleatorio simple de un radio no mayor de 5
mts en cada estación para la captura de los microorganismos presentes en
el aire, aplicando el método se sedimentación pasiva, el cual consistió en
exponer a las corrientes de aire placas de Petri que contenían medios de
cultivos previamente preparados Agar Nutritivo (AN) y Agar Sabouraud (AS)
o Papa Dextrosa Agar (PDA), colocándolas a una altura de
aproximadamente de 1.5 mts en un lapso de tiempo de 10 a 15 minutos,
posterior a este tiempo se procedió a cerrar las placas para su traslado
(Kolwzan et al., 2006 Microkit, 1999).
Suelo: En cada estación se realizo un muestreo aleatorio simple por
triplicado. Tomando para cada replica un área cuadrada de 3mts, en la que
se colectaron 200 gramos de suelo con una pala previamente esterilizada
con Gerdex (esterilización química con halógeno) a una profundidad de 20
cm, distribuidos en el área de la siguiente manera: cuatro muestras en las
esquinas y una en el centro como se muestra en la Figura N° 3, colocando
las porciones en bolsas plásticas transparentes que fueron identificadas.
Posteriormente el contenido de cada una de las bolsas fueron integradas en
una sola bolsa para la obtención de una muestra representativa por cada
estación, luego se trasladaron al laboratorio para su respectivo análisis y
procesamiento (Lorch et al., 1998).
46
Las muestras de agua fueron colectadas de tres formas:
1. Para la caracterización y cuantificación de bacterias, hongos y
coliformes termoresistente y fecales. En embaces de vidrio de 250 ml
previamente esterilizada a 120 °C a 15 libras de presión (Kerr, 1970,
Eaton y Col, 1995).
2. Para el estudio de las microalgas en embaces estériles fijando con
lugol al 0,9 %. Esta muestra fue tomada aproximadamente a un metro
de la orilla en la parte superficial de la columna de agua (Vicente et al
2005).
3. Se colectaron en envase de plástico ámbar de litro y medio
previamente curado con agua superficial para los análisis físico-
químicos (APHA, 1992).
Figura N° 3 Espacio cuadrado de 3 mts para la
extracción de muestra de suelo
47
Número de muestra.
Tabla N° 3 Números de muestras colectadas en el estudio
Simple Integrada Total
Aire 36 - 36
Suelo 90 18 18
Agua 18 B y H
18 M
18 F-Q
- 42
TOTAL 86
B: baterías, H: hongos, M: microalgas, F-Q: físico-química.
Traslado y procesamiento de muestra
Todas las muestras previamente colectadas fueron selladas,
rotuladas, e identificadas en una cava provista de hielo para su conservación.
Las placas de Petri utilizadas para el componente aire fueron selladas en sus
bordes con cinta adhesiva, y rotuladas para su identificación. Las muestras
tomadas en los diferentes embaces con cinta para embalar y rotuladas para
su posterior procesamiento. Las diferentes muestras de hongos y bacterias
fueron procesadas en el laboratorio de microbiología agrícola en el complejo
académico José Bastidas en el alto hatillo. Las muestras de microalgas
fueron procesadas en el laboratorio central de la Unidad de Microscopia
Electrónica UME en el complejo académico los Perozos. Todas las
micrográficas fueron procesadas en la Unidad de Microscopia Electrónica.
Los microcultivos e identificación fúngica se realizaron en el laboratorio
LIADSA, en el edificio Santa Ana de coro adscrito al área de ciencias de la
salud de la UNEFM.
48
Fase Descriptiva
En esta fase se describieron las características distintivas para los
diversos elementos y microorganismos como hongos, bacterias, y microalgas
que se encuentren en los diversos componentes para ser usados como
indicadores de la situación ambiental tanto por su presencia como por su
cuantía al ser evaluados (Risquez, et al 1999).
Tipo de muestra y replicas
Las diversas muestras colectadas por triplicado fueron estudiadas
para cada uno de los componentes así como también para las diversas
caracterizaciones, cuantificaciones y el estudio de la diversidad funcional
incluyendo las pruebas físico-químicas (Tabla N°4).
Tabla N° 4 Tipos de Muestras y Replicas
S= simple, I = integrada, 3= numero de replicas
Muestras Caracterización Cuantificación Establecimiento
de la diversidad
funcional
Pruebas físico-
químicas
Muestra
de aire
3 S 3S 3 S -
Muestra
de suelo
3 I 3 I 3 I -
Muestra
de agua
3 S 3 S 3 S 3 S
49
Caracterización de bacterias, hongos y microalgas en los componentes
agua, suelo y aire.
Para lograr la evolución de los microorganismos fue necesario
recuperar y promover los microorganismos, esto permitió la identificación de
las diversas cepas que crecieron en los medios de cultivo.
Recuperación de hongos y bacterias del componente aire en placa de
Petri previamente muestreada.
Las Placas que se obtuvieron del muestreo del componente aire
fueron colocadas en incubación a una temperatura de 37°C. Durante un
periodo 8 días de crecimiento para los hongos y 1 día para las bacterias,
evaluando este crecimiento de forma diaria, puesto que fue posible la
existencia de cepas de rápido crecimiento y cuando se considero necesario
se reportaron las características de las cepas presentes en las mismas antes
de que existiera un crecimiento excesivo en las Placas. Transcurrido ese
tiempo se identificaron las diversas cepas ya crecidas en las placas de Petri
para su posterior caracterización y cuantificación (Lorch et al., 1998., Bossert
y kosson, 1997).
Promoción del crecimiento de hongos y bacterias de los componentes
suelo y agua con medios selectivos en placa de Petri.
Suelo: De las muestras integradas obtenidas del suelo, se tomaron
10 gr de suelo y se diluyo en un embase que contenía 100 ml de agua
destilada con cloruro de sodio al 0.9% (solución isotónica). Esta solución
representa la solución madre a partir de ella se realizaron diluciones seriadas
en proporción de 1.10 -1 hasta 1.10-5 en 5 tubos de ensayos. Cada placa fue
50
preparada con 0.5 ml de la solución obtenida (inoculo) esparciendo el
inoculo en toda la placa (Kerr, 1970).
La solución madre fue utilizada inoculando placas previamente
preparadas con medios sólidos de Agar Nutritivo (AN) y Papa dextrosa PDA
para promover el crecimiento de bacterias y hongos respectivamente. Este
procedimiento se realizó por triplicado para cada estación de muestreo con la
finalidad de realizar posteriormente el aislamiento de las cepas obtenidas
para su caracterización. A partir del tubo de la solución madre se realizaron
diluciones seriadas con el mismo solvente desde 10-1 hasta llegar a la 10-5,
de cada una se tomo con una micropipeta 3-5 µl y se inocularon tres gotas
separadas en una porción de una placa de Agar Nutritivo (AN) y Agar PDA,
en una placa dividida en cinco partes iguales como lo señala la figura N° 4.
Este material fue llevado a incubación según lo especificado, al cabo de este
lapso se cuantificaron los puntos de crecimiento determinándose el NMP
(Numero más probable), aplicando los tiempos y temperaturas de incubación
anteriormente descritos para hongos y bacterias (Kerr, 1970).
Agua: las Muestras de Agua fueron inoculadas a partir de las
muestras tomadas en campo utilizando dos métodos uno para la
identificación de las diversas cepas fúngicas y bacterianas realizando
Figura N° 4 División de la placa de Petri en 5 partes iguales
51
inoculaciones en AN y PDA, para la caracterización de bacterias y hongos
respectivamente. Para este se tomo una alícuota de aproximadamente 0,5 ml
se colocaron en los medios esparciendo el inoculo en la placa e incubando
por un periodo de 8 días para hongos y 1 día para bacterias a 37 °C, con
evaluación diaria (Kerr, 1970). El segundo método se realizo aplicando el
método descrito por la Norma COVENIN 3047 para la determinación de los
coliformes fecales y totales. En el caso de los grupos fúngicos se procedió a
realizar tomando un inoculo de 1ml de la muestra inicial y se realizo 0,9% de
Cloruro de Sodio desde 10-1 hasta llegar a la 10-5, posteriormente se
inocularon placas con PDA en placas divididas como muestra la figura N° 4.
Tomando con una micropipeta 3-5 µl e inoculando tres gotas separadas en
cada cuadrante de la división (Casas, 1994; Kerr, 19970; Woomer, 1994).
Aislamiento de hongos y bacterias de los componentes agua, suelo y
aire.
Una vez que las colonias han alcanzado su crecimiento se procedió a
identificar los diferentes tipos de colonias que se repiten en los diversos
componentes estudiados (agua, aire y suelo). Estas colonias fueron
identificadas como cepas que contendrán la letra inicial del componente y el
número de estación en que se repiten aislando cada una, en tubos con
medio de cultivo solido de AN y PDA guardadas en refrigeración para
pruebas posteriores.
Caracterización macromorfológica de hongos y bacterias aislados
según el sistema de (Thomas Kerr 1970).
Las bacterias y hongos previamente aisladas fueron caracterizadas
según el sistema propuesto por Thomas Kerr (1970), luego de ser crecidas
nuevamente en Agar Nutritivo y PDA en placas. Para ello se identifico el
52
número de colonia, color, forma, elevación y margen presente en la placa
de Petri, tomando fotografías en diferentes contrastes para el registro digital
de los diversos crecimientos en Placa.
Caracterización Micromorfológica de bacterias aisladas utilizando
tinción diferencial de Gram.
La caracterización micromorfologica se realizo utilizando la tinción
diferencial de Gram para cada una de las cepas aisladas. Mediante el
siguiente método:
1. Se aislaron las bacterias en portaobjetos con un aza de platino, luego
con otro portaobjeto se realizo un frotis aplicando gotas de agua
destilada para humedecer el esparcimiento de las bacterias aisladas.
2. Se agrego gotas de alcohol para fijar las bacterias en el cubre objeto.
3. Elaboración de preparaciones fijas de las bacterias a observar.
4. Se Añadió 1 ó 2 gotas de cristal violeta a la preparación, hasta que
se cubrió por completo. Se dejo actuar el colorante durante 1 minuto.
5. Una vez transcurrido el tiempo, se lavo la preparación con la piceta
sobre el recipiente de plástico para tinciones.
6. Se agregar 1 ó 2 gotas de solución lugol a la preparación, y se dejo
actuar 1 minuto. Transcurrido el tiempo, se lavo.
7. Se añadió gota a gota el alcohol-acetona lavando la preparación
durante 10 segundos.
8. Se Añadió el colorante de contraste, safranina (1 ó 2 gotas) y dejo
actuar durante 30 segundos. Lavo con la piceta.
9. Se dejar secar al aire y observar al microscopio,
10. Visualización al microscopio 40x y 100x con aceite de inmersión
(Beveridge, 1991).
53
Caracterización Micromorfológica de hongos utilizando microcultivo de
Riddell.
La caracterización de la micromorfología de hongos se realizo aplicando
el siguiente método:
1. Se cortaron cuadros de PDA de una caja Petri de 1 cm de lado y 3
mm de espesor con un bisturí estéril y caliente.
2. Se coloco el cuadro de PDA en un portaobjetos que está sobre una
varilla de vidrio doblada en forma de “V” en una caja de Petri
previamente esterilizada.
3. Se tomo él inoculo del moho previamente seleccionado con aza de
siembra microbiológica.
4. Luego se Inoculo por punción en el cuadrante de agar en los extremos
laterales.
5. Se coloco sobre el agar un cubreobjeto y se presiono ligeramente para
que se adhiera al medio.
6. Se incubo la caja a 28° C durante 48 h.
7. Se realizo observaciones para identificar los cuerpos fructíferos.
8. Si el moho ya se ha desarrollado se identifico
9. Se adiciono 5 ml de formaldehído para inactivar el moho durante 15
minutos.
10. Se desprendió con cuidado el cubreobjetos que se encuentra sobre el
cuadro de agar y se coloco sobre un portaobjetos que contenía una
gota de azul de algodón, se sello la preparación con barniz de uñas
transparente.
11. Por último se desprendió con cuidado el cuadro de agar y se le coloco
una gota de azul de algodón, y se cubrió con un cubreobjetos sobre el
colorante. Finalmente se sello la preparación y se observo las
preparaciones a 10X y 40X (Riddell, R, 1950)
54
Caracterización Micromorfológica de microalgas mediante microscopía
fotónica.
Los diferentes grupos de microalgas fueron caracterizados como
Diatomeas, Clorófitas y Cianobacterias según el método e identificación
propuesto por el INE (1982), en un microscopio fotónico Marca Nikón- FDX,
realizando micrografías digitales luego de la identificación de
microorganismos representativos de los diversos grupos.
Cuantificación de la población microbiana de bacterias, hongos y
microalgas en los diferentes componentes.
Para realizar la cuantificación se aplicaron métodos que permitieron
establecer las poblaciones presentes de hongos, bacterias y microalgas en
cada uno de los componentes como se presenta a continuación.
Cuantificación de Hongos y Bacterias en el componente aire.
La cuantificación de hongos y bacterias en el aire se realizo mediante
el cálculo de la UFC aplicando la siguiente fórmula:
tr
aX
2
4
.
10.5.
X - número de microorganismos en el aire (UFC/m3),
a - el número de colonias en la placa de Petri,
r2 - la superficie de la placa de Petri (cm2)
t - Tiempo de exposición (minutos) (Kolwzan et al., 2006).
55
Las placas obtenidas fueron reportadas como UFC / m3 además todos los
resultados obtenidos de los triplicados serán promediados y colocados en
tablas descriptivas (Kolwzan et al., 2006).
Cuantificación de hongos, bacterias y microalgas en el componente
suelo.
La cuantificación en el componente suelo para hongos y bacterias se
realizo aplicando el método del Número Más Probable (NMP) que consistió
en la enumeración de los microorganismos y es el método más comúnmente
utilizado en el laboratorio (Sutton, 2005). Para ello las diversas cepas
crecidas según el método propuesto como en la Figura N° 4. Se identificaron
los puntos de crecimiento para cada dilución seriada, los resultados fueron
colocados en tablas descriptivas y ponderadas aplicando el método
propuesto por Woomer (1994) y así estimar el NMP de colifoformes fecales y
totales. Adicionalmente las microalgas fueron evaluadas en el componente
suelo aplicando el método de portaobjeto en el suelo (Paul y Clark, 1989).
Cuantificación de hongos, bacterias y microalgas en el componente
agua.
Los hongos y bacterias fueron cuantificados a partir de las diluciones
seriadas aplicando el método de NMP con el método propuesto por Woomer
(1994) para hongos, y el método propuesto por COVENIN 3047 para
bacterias comparando los resultados con las tablas de NMP que son el
resultado de la distribución de Poisson o la aproximación de la distribución
normal (Ilstrup 1990).
Prueba Presuntiva: Aguas naturales
56
Se proporcionaron 9 tubos de cultivo con un medio de cultivo Lauril
Triptosa a los cuales se le colocaron loa siguientes volúmenes de agua:
Se agrego a 3 tubos 10 ml de la muestra, posteriormente se procedió a
taparlos.
Se agrego 1mil de la muestra en 3 tubos.
En 3 tubos se agregaron 1 ml de la muestra diluida 1:10 (1ml de
muestra en 9ml de agua estéril), el volumen final de la muestra 0,1ml.
Se incubaron a una temperatura de 35ºC y se observaron durante 24 y
48 horas al cabo de este tiempo se examinaran los tubos. La presencia
de cualquier cantidad de gas en los tubos de la serie constituye una
prueba positiva presuntiva de forma cualitativa; lo contrario es una
prueba negativa.
Prueba Confirmativa:
Se emplearon 5 tubos de fermentación con caldo lactosado con bilis y
verde brillante, este es selectivo para los miembros del grupo coliforme
e inhibidor para la flora restante. Los tubos positivos de la serie anterior
se inocularon en una serie de 5 tubos con el medio de cultivo
mencionado, se incubaron a 35ºC por 48 horas.
Método de Camara de Neubauer
Las microalgas fueron cuantificadas aplicando el método de cámara de
Neubauer contando los cuadrantes de cuadriculados de la cámara y
aplicando para el cálculo la siguiente fórmula:
57
(Vicente et al 2005).
Establecimiento de la Diversidad Funcional de hongos bacterias y
microalgas para los componentes suelo, agua y las especies fúngicas y
bacterianas en el componente aire.
Se estudiaron las diversas cepas aisladas para conocer su posible
función según la capacidad de degradación bioquímica.
Las cepas aisladas como puras presentes en tubos mantenidas a 4°C
en agar nutritivo y PDA fueron reactivadas en cultivos no mayor de 48 horas.
En cada cepa aislada se determino la capacidad de fermentar la
glucosa, lactosa, y la producción de ácido sulfhídrico, indol, sulfuro y
motilidad, y la prueba de VP-RM según el manual propuesto por Mac Faddin
(1993).
Basado en los resultados de las pruebas bioquímicas que se
aplicaron, se realizo un análisis utilizando el programa estadístico InfoStat
versión 2.0 con el fin de obtener grupos de bacterias con las mismas
características funcionales. Se utilizo como medida la distancia euclidiana
media (Sneath y Sokal 1973). Aquellas cepas cuya distancia es cero, se
considero Integrantes de un mismo grupo funcional (Vargas et al. 1992).
Con la obtención de estos datos se procedió a calcular la frecuencia de
aparición de los grupos funcionales (Fi), el índice de diversidad funcional
58
(IDF) y el índice de importancia (Pi), según Ramos (1996) mediante las
siguientes relaciones matemáticas, con el fin de observar los cambios en la
estructura funcional de la comunidad bacteriana en el tiempo y el espacio.
Fi = (Número de grupos funcionales/Total de grupos funcional) x 100
IDF =Número de grupos funcionales/Total de cepas
Pi = Número de cepas en el grupo funcional (ni)/Total de cepas (N)
Pruebas físico –químicas del agua según decreto 883.
En cada estación de muestreo, se tomo la temperatura (T Cº), pH y
también se medio el oxígeno disuelto (OD) a través de una reacción
química mediante método (Winckler, 1980).
Diagnostico de la calidad microbiológica ambiental del suelo según
(Alexander 1980), Aire (OMS 1993), Agua (decreto 883) aplicando
adicionalmente criterios físicos – químicos para este ultimo.
Todos los diagnósticos se realizaron aplicando normas nacionales e
internacionales. En caso del suelo se compararon los resultados obtenidos
con los propuestos por Alexander 1980.
59
Tabla N° 5 Niveles de microorganismos en el suelo según Alexander
1980
PROFUNDIDAD
(cm)
BACTERIAS
AEROBIAS
(NMP/g)
BACTERIAS
ANAEROBIAS
(NMP/g)
HONGOS
(NMP/g)
ALGAS
(NMP/g)
3-8 7,800 1,950 119 25
20-25 1,800 379 50 5
Para el componente Aire los resultados obtenidos serán comparados
con las siguientes tablas:
Tabla N° 6 Niveles de UFC/m3 de Bacterias en Aire segun (OMS)
Nivel de Contaminación Concentración de Bacterias
UFC/ m3 en el aire
Muy Baja < 50
Baja 50-100
Intermedia 100-500
Alta 500-2000
Muy Alta >2000
Tabla N° 8 Niveles UFC / m3 de Hongos en Aire Según Organización
Mundial de la Salud (OMS)
Nivel de Contaminación Concentración de Hongos
UFC/ m3 en el aire
Muy Baja < 25
Baja 25-100
Intermedia 100-500
Alta 500-2000
Muy Alta >2000
60
CAPÍTULO IV RESULTADOS
Análisis de los Resultados
Características de las bacterias, hongos y microalgas en los
componentes agua, suelo y aire de la quebrada de Guaranao.
Tabla N° 9 Caracterización Macromorfológica en Placa y morfotinción
de Gram de bacterias recuperadas de los componentes Agua de la
quebrada de Guaranao.
N Cepa Micromorfología Borde Elevación Color Forma
1 3AGE1AN,A Cocos Gram (-) Ramificado Plano Blanco Irregular
2 3AGE1AN,B Cocos Gram (-) Entero Plano Amarillo Circular
3 3AGE2AN,A Estafilococos Gram (+) Entero Plano Blanco Circular
4 3AGE2AN,B Cocos Bacilos Gram (+) Entero Plano Amarillo Circular
5 3AGE2AN,B Cocos Bacilos Gram (-) Ramificado Plano Amarillo Irregular
6 4AGE1,MAN,A Diplococos Gram (+) Entero Plano Amarillo Circular
7 4AGE2,MAN,A Cocos Gram (+) Filamentoso Plano Beige Rizoide
8 4AGE1,3,4AN Diplococos Gram (-) Entero Plano Beige Irregular
61
Análisis de la varianza
Variable N R² R²Aj CV
NUMERO 48 0,28 0,05 230,94
Test : Duncan Alfa: 0,05
Error: 0,1875 gl: 36
MICROMORFOLOGÍA Medias n
Estafilococos Gram (-.. 0,00 4 A
bacilos Gram (-) 0,00 4 A
bacilos Gram (+) 0,00 4 A
Estafilococos Gram (+.. 0,00 7 A
Estreptococos Gram (-.. 0,00 4 A
Estreptococos Gram (+.. 0,00 1 A
coco bacilos Gram (-).. 0,25 4 A
Diplococos Gram (+) 0,25 4 A
coco bacilos Gram (+).. 0,25 4 A
cocos Gram (+) 0,25 4 A
cocos Gram (-) 0,50 4 A
Diplococos Gram (-) 0,75 4 A
Letras distintas indican diferencias significativas(p<=0,05)
La caracterización de las bacterias (Tabla N° 9) recuperadas del agua
mostró 8 cepas que difieren en los caracteres macro y microscópicos, el
análisis estadístico entre las cepas mediante el test de Duncan no mostró
diferencias significativas p<0,05 ni grupos de diferencia. Sin embargo este
grupo muestra a los diplococos G (-) como el más representativo con una
media de 0,75, seguido de los cocos G (-), con una media de 0,50, seguido
del resto de las cepas caracterizadas. Además se presentaron 4 cepas de
bacterias Gram negativas y 4 cepas de bacterias Gram positivas
respectivamente.
62
Tabla N° 10 Caracterización Macromorfológica en Placa y morfotinción
de Gram de bacterias recuperadas de los componentes Suelo de la
quebrada de Guaranao.
N Cepa Micromorfología Borde Elevación Color Forma
1 1SE1,AN Diplococo Gram (-) Entero Plano Blanco Irregular
2 1SE2,AN Cocos Gram (+) Entero Plano Blanco Irregular
3 1SE3,AN Estreptococo Gram (+) Entero Plano Blanco Irregular
4 4SE1,2,3,4MAN Cocos Gram (-) Entero Plano Beige Irregular
5 4SE2AN,A Diplococos Gram (-) Entero Plano Amarillo Circular
6 4SE2PDA,A Diplococos Gram (-) Lobulado Plano Amarillo Granular
Análisis de la varianza
Variable N R² R²Aj CV
NUMERO 48 0,85 0,81 108,01
Test : Duncan Alfa: 0,05
Error: 0,2917 gl: 36
MICROMORFOLOGÍA Medias n
coco bacilos Gram (+) 0,00 4 A
Estreptococos Gram (-) 0,00 4 A
Diplococos Gram (+) 0,00 4 A
bacilos Gram (-) 0,00 4 A
bacilos Gram (+) 0,00 4 A
coco bacilos Gram (-) 0,00 4 A
Estafilococos Gram (+) 0,00 7 A
Estafilococos Gram (-) 0,00 4 A
Estreptococos Gram (+) 0,25 1 A
cocos Gram (+) 0,25 4 A
Diplococos Gram (-) 1,50 4 B
cocos Gram (-) 4,00 4 C
Letras distintas indican diferencias significativas(p<=0,05)
63
La evaluación de las cepas (Tabla N° 10) por las características
macromorfológicas y micromorfológicas en el suelo presentó 6 cepas en
donde 2 cepas eran bacterias Gram (+) y 4 cepas eran bacterias Gram (-) se
muestra que la principal macro morfología fue la caracterizada como borde
entero, elevación plana y forma irregular. La evaluación mediante el test de
Duncan logro establecer tres grupos con diferencias estadísticas con una
p<=0,05, el grupo más representativo son los cocos Gram (-) con una media
de 4,00 seguido de los diplococos Gram (-) con una media 1,50, el resto de
las cepas se comportó similar estadísticamente, como un grupo el cual
presentó una media de 0,25.
64
Tabla N° 11 Caracterización Macromorfológica en Placa y morfotinción
de Gram de bacterias recuperadas de los componentes Aire de la
quebrada de Guaranao.
N Cepa Micromorfología Borde Elevación Color Forma
1 2AiE2AN,A Coco bacilos
Gram(+)
Entero Plano Beige Circular
2 2AiE2AN,B Bacilos Gram (+) Entero Plano Amarillo Irregular
3 2AiE3AN,A Cocos Gram (+) Ramificado Plano Blanco Irregular
4 2AiE3AN,B Diplococo Gram
(-)
Entero Plano Blanco Circular
5 2AiE4AN,A Cocos Gram (-) Ramificado Plano Blanco Irregular
6 2AiE4AN,B Bacilos Gram (+) Entero Plano Blanco Circular
7 3AiE1PDA,A Cocos Bacilos
Gram (-)
Entero Plano Blanco Circular
8 3AiE1PDA,B Diplococos Gram
(-)
Entero Plano Amarillo Circular
9 3AiE1A,A Cocos Gram (+) Entero Plano Blanco Irregular
10 3AiE2AN,A Diplococos Gram
(+)
Ramificado Plano Blanco Irregular
11 4AiE4MAN,A Diplococos Gram
(-)
Entero Plano Amarillo Circular
12 4AiE4MAN,B Cocos Gram (+) Lobulado Plano Naranja Irregular
13 4AiE4MAN,C Diplococos Gram
(-)
Ramificado Elevado Gris Algodonoso
14 4AiE4MAN,D Cocos Gram (-) Lobulado Elevado Marrón Granulado
15 4AiE4MAN,E Diplococos Gram
(-)
Entero Elevado Negro Circular
65
Análisis de la varianza
Variable N R² R²Aj CV
NUMERO 48 0,36 0,16 182,82
Test : Duncan Alfa: 0,05
Error: 0,3264 gl: 36
MICROMORFOLOGÍA Medias n
Estafilococos Gram (-) 0,00 4 A
bacilos Gram (-) 0,00 4 A
Estafilococos Gram (+) 0,00 7 A
Estreptococos Gram (-) 0,00 4 A
Estreptococos Gram (+) 0,00 1 A
Diplococos Gram (+) 0,25 4 A
coco bacilos Gram (+) 0,25 4 A
coco bacilos Gram (-) 0,25 4 A
cocos Gram (-) 0,50 4 A B
bacilos Gram (+) 0,50 4 A B
cocos Gram (+) 0,75 4 A B
Diplococos Gram (-) 1,25 4 B
Letras distintas indican diferencias significativas(p<=0,05)
Las cepas recuperadas del aire (Tabla N° 11) mostraron 15 cepas
bacterianas de las cuales 7 fueron bacterias Gram (+) y 8 fueron bacterias
Gram (-), diferentes en sus características macroscópicas y microscópicas de
las cuales, el análisis estadístico aplicado a los datos mostró que la principal
cepa que señaló diferencias significativas a p<0,05 fue Diplococos Gram (-)
con una media de 1,25 seguido de cocos Gram (+) con una media de 0,75 y
el resto de las cepas fueron representadas con una media entre 0,50 y 0,25.
66
Tabla N° 12 Caracterización Macromorfológica en Placa y Microcultivo
de Hongos recuperados de los componentes Agua de la quebrada de
Guaranao.
N Cepa Micromorfología Borde Elevación Color Forma
1 3AGE1PDA,A Aspergillus flavus Entero Plano Negro Irregular
2 3AGE1PDA,B Aspergillus flavus Entero Elevado Blanco Redondo
3 3AGE2PDA,C Aspergillus niger Entero Elevado Verde Irregular
Análisis de la varianza
Variable N R² R²Aj CV
NUMERO 24 0,19 0,00 365,15
Test : Duncan Alfa: 0,05
Error: 0,2083 gl: 18
MICROMORFOLOGÍA Medias n
Geotrichum sp 0,00 4 A
Penicillum sp 0,00 4 A
Rizophus sp 0,00 4 A
Asperigillus sp 0,00 4 A
Aspergillus niger 0,25 4 A
Aspergillus flavus 0,50 4 A
Letras distintas indican diferencias significativas(p<=0,05)
La caracterización de las cepas de hongos del agua (Tabla N° 12) en
base a la micromorfología y macromorfología señalo tres cepas. El análisis
de varianza no mostró diferencias significativas a (p<=0,05). Sin embargo la
cepa más representativa fue Aspergillus flavus con una media de 0,50
seguido de Aspergillus niger con una media de 0,25.
67
Tabla N° 13 Caracterización Macromorfológica en Placa y Microcultivo
de Hongos recuperados de los componentes Suelo de la quebrada de
Guaranao.
N Cepa Micromorfología Borde Elevación Color Forma
1 3SE1PDA,A Rizophus sp Ramificado Elevado Blanco Algodonoso
2 3SE2PDA,A Aspergillus niger Ramificado Elevado Negro Algodonoso
3 2SE3PDA,A Aspergillus flavus Entero Elevado Verde Redondo
4 2SE3PDA,B,C Geotrichum sp Lobulado Elevado Verde Irregular
5 2SE2AN,A Aspergillus flavus Entero Plano Amarillo Irregular
Análisis de la varianza
Variable N R² R²Aj CV
NUMERO 24 0,18 0,00 203,96
Test : Duncan Alfa: 0,05
Error: 0,1806 gl: 18
MICROMORFOLOGÍA Medias n
Asperigillus sp 0,00 4 A
Penicillum sp 0,00 4 A
Aspergillus niger 0,25 4 A
Geotrichum sp 0,25 4 A
Rizophus sp 0,25 4 A
Aspergillus flavus 0,50 4 A
Letras distintas indican diferencias significativas(p<=0,05)
Aunque no hay grupos significativos estadísticamente en las cepas de
hongos evaluados del suelo (Tabla N° 13) dentro de estas 5 cepas, el grupo
que presento la media más alta fue Aspergillus flavus con una media de de
0.50, seguido de un grupo de tres cepas con una media similar de 0,25 para
Aspergillus niger, Gotrichum sp, y Rizophus sp respectivamente.
68
Tabla N° 14 Caracterización Macromorfológica en Placa y Microcultivo
de Hongos recuperados de los componentes Aire de la quebrada de
Guaranao.
N Cepa Micromorfología Borde Elevación Color Forma
1 2AIE2PDA,A Aspergillus flavus Entero Elevado Blanco Circular
2 2AIE3PDA,A Rizophus sp Entero Elevado Marrón Irregular
3 2AIE3PDA,B Aspergillus sp Ramificado Elevado Blanco Irregular
4 2AIE3PDA,C Aspergillus sp Ramificado Elevado Blanco Irregular
5 2AIE4PDA,A Penicillum sp Ramificado Elevado Blanco Irregular
6 2AIE4PDA,B Aspergillus niger Entero Plano Negro Irregular
7 2AIE4PDA,C Aspergillus niger Entero Elevado Blanco Irregular
8 3AiE2PDA,A Aspergillus niger Entero Elevado Blanco Redondo
9 3AiE2PDA,B Aspergillus flavus Entero Elevado Negro Redondo
Análisis de la varianza
Variable N R² R²Aj CV
NUMERO 24 0,12 0,00 201,23
Test : Duncan Alfa: 0,05
Error: 0,5694 gl: 18
MICROMORFOLOGÍA Medias n
Geotrichum sp 0,00 4 A
Penicillum sp 0,25 4 A
Rizophus sp 0,25 4 A
Asperigillus sp 0,50 4 A
Aspergillus flavus 0,50 4 A
Aspergillus niger 0,75 4 A
Letras distintas indican diferencias significativas(p<=0,05)
La caracterización de hongos recuperados del aire (Tabla N° 14)
mostró 9 cepas que difieren en los caracteres macro y microscópicos, el
análisis de la prueba de Duncan, no mostró diferencias estadísticas
69
significativas entre las cepas estudiadas con una p<0,05 para la generación
de grupos al ser evaluado. Sin embargo este grupo muestra al Aspergillus
niger como el más representativo con una media de 0,75 seguido de
Aspergillus flavus con una media de 0,50 seguido del resto de las cepas
caracterizadas.
Cuantificación de la población microbiana de bacterias, hongos y
microalgas en los diferentes componentes de la quebrada de Guaranao.
Tabla N° 15 Promedio aritmético de UFC/m3 cuantificado del
componente Aire de la quebrada de Guaranao
Componente Estación Bacterias Hongos
Aire
(UFC/m3)
E1 584 93
E2 889 650
E3 2229 3636
E4 1367 650
Tabla N° 16 Promedio aritmético NMP cuantificado del componente
Suelo de la quebrada de Guaranao
Componente Estación Bacterias Hongos
Suelo
(NMP/g)
E1 10861 960
E2 9068 189
E3 9149 2716
E4 1901 2716
70
Tabla N° 17 Promedio aritmético NMP cuantificado del componente
Agua de la quebrada de Guaranao
Componente Estación Bacterias Hongos
Agua
(NMP/ml)
E1 7735 525
E2 5257 204
E3 7735 270
E4 2716 270
Tabla N° 18, Figura N° 5, Promedio de Distribución de Microalgas
evaluadas por Cámara de Neubauer provenientes de la quebrada
Guaranao.
71
Análisis de la varianza
Variable N R² R²Aj CV
CÉLULA . µl -1 192 0,05 0,04 103,75
Cuadro de Análisis de la Varianza (SC Tipo III)
F.V. SC gl CM F Valor p
Modelo 60678125000,00 2 30339062500,00 4,69 0,0103
GRUPO 60678125000,00 2 30339062500,00 4,69 0,0103
Error 1,221921875E12 189 6465195105,82
Total 1,2826E12 191
Test : Duncan Alfa: 0,05
Error: 6465195105,8201 gl: 189
GRUPO Medias n
DIATOMEAS 52968,75 64 A
CIANOBACTERIAS 85000,00 64 B
CLOROFITAS 94531,25 64 B
Letras distintas indican diferencias significativas (p<=0,05)
Tabla N° 18 y Figura N° 5 de la distribución de las microalgas
evaluadas por la cámara de Neubauer señaló que las microalgas más
representativas fueron las clorófitas y las diatomeas, las cuales alcanzan
simultáneamente un mismo nivel lo que indica que estos dos grupos son los
que más predominan en la estación E1, mientras que las diatomeas solo
representaron un pequeño grupo de microalgas.
En la estación 2 el grupo de las clorofitas fueron las más
representativas al compararlas con el grupo de las cianobacterias, mientras
el grupo de las diatomeas presentaron un nivel bajo las cuales fueron muy
poco representativas para esta estación.
72
En la estación 3 los grupos de microalgas como las clorofitas y las
diatomeas presentaron un nivel similar, mientras que el grupo de
cianobacterias fueron las más representativas para esta estación.
En la estación 4 el grupo de las clorofitas fueron las más significativas
ya que predominaron en un mayor nivel, mientras las diatomeas y
cianobacterias alcanzaron un nivel similar para esta estación.
La Tabla de análisis de varianza señala que los grupos de microalgas
más representativos para todas las estaciones de muestreo fueron las
clorofitas con una media de 94531,25 y las cianobacterias con una media
de 85000,00 por otro lado el grupo de las diatomeas en comparación con los
grupos mencionados anteriormente presento una media de 52968,75 siendo
este el nivel más bajo en todas las estaciones de muestreo.
73
Establecimiento de la diversidad funcional de los hongos,
bacterias y microalgas en los componentes agua, suelo y especies
fúngicas y bacterianas sobre el componente aire.
Tabla N° 19, Diversidad Funcional de Cepas recuperadas del Aire
S I M V H2S Glu Lac N
Cepas
Pi
1 0 0 1 0 0 1 1 1 0,04
2 0 0 1 1 0 1 0 1 0,04
3 0 1 1 1 0 0 1 1 0,04
4 0 1 1 0 0 0 0 1 0,04
5 1 1 1 1 0 1 0 2 0,08
6 0 0 0 1 0 1 0 1 0,04
7 0 1 0 1 0 1 0 2 0,08
8 0 1 1 1 0 1 0 3 0,12
9 0 0 1 1 0 1 1 1 0,04
10 1 1 1 1 1 1 0 2 0,08
11 1 1 1 0 1 1 1 1 0,04
12 1 1 1 0 1 1 0 2 0,08
13 0 1 1 0 0 1 0 1 0,04
14 0 1 0 1 0 1 1 1 0,04
15 1 1 1 0 0 1 0 1 0,04
16 0 1 1 0 0 1 1 1 0,04
17 0 1 1 1 0 1 1 2 0,08
18 0 1 0 1 0 1 1 1 0,04
∑ 5 14 14 11 3 16 8 25
% 20 56 56 44 12 64 32 100
S: sulfuro; I: Indol; M: motilidad; V: Voges-P, H2S, Glu: Glucosa, Lac: Lactosa; Pi: Índice de
Importancia.
74
Figura N° 6, Grupos Funcionales del Aire
S: sulfuro; I: Indol; M: motilidad; V: Voges-P, H2S, Glu: Glucosa, Lac: Lactosa
La diversidad funcional del aire (Tabla N° 19) muestra 18 grupos
funcionales de 25 cepas evaluadas, el grupo funcional que presentó mayor
índice de importancia funcional fue el grupo funcional 8 con una Pi de 0,12
seguido de los grupos funcionales 5, 7, 10, 12, 17 con Pi de 0,08. Las
diversas pruebas bioquímicas (Grafico N° 2) evaluadas muestran a la
Glucosa con un 64% luego muestran al indol y a la motilidad con un 56%. Y
por otro lado seguido muestran a Vogues Proskauer con un 44% y
finalmente la lactosa con un 32%, la prueba de sulfuro con un 20% y la
generación de H2S con 12% el cual representa el porcentaje más bajo al
compararlo con las demás pruebas bioquímicas.
75
Tabla N° 20, Diversidad Funcional de Cepas recuperadas del suelo
S I G V H2S Glu Lac
N
Cepa Pi
1 0 0 1 1 0 1 1 2 0,15
2 0 0 1 1 0 0 1 2 0,15
3 0 1 0 1 0 1 1 2 0,15
4 0 0 0 1 0 1 1 1 0,08
5 0 1 0 1 0 1 0 1 0,08
6 1 1 1 1 1 1 0 1 0,08
z7 1 1 1 0 1 1 0 1 0,08
8 0 1 1 0 1 1 1 1 0,08
9 0 1 0 0 0 1 1 1 0,08
10 0 0 1 0 0 1 1 1 0,08
∑ 2 6 6 6 3 9 7 13 1
% 15 46 46 46 23 69 54 100
S: sulfuro; I: Indol; M: motilidad; V: Voges-P, H2S, Glu: Glucosa, Lac: Lactosa; Pi: Índice de
Importancia
Figura N° 7, % Diversidad Funcional de cepas recuperadas del suelo
S: sulfuro; I: Indol; M: motilidad; V: Voges-P, H2S, Glu: Glucosa, Lac: Lactosa
76
La diversidad funcional del suelo (Tabla N° 20) muestra 10 grupos
funcionales de 25 cepas evaluadas, el grupo funcional que presentó mayor
índice de importancia funcional fue el grupo funcional 1,2,3 con una Pi de
0,15 seguido de los grupos funcionales 4,5,6,7,8,9,10 con Pi de 0,08. Las
diversas pruebas bioquímicas (Grafico N° 3) evaluadas muestran a la
Glucosa con un 69% luego muestra a la lactosa con un 54 % y
seguidamente muestra a la glucosa, el indol, y vogues proskauer con un 46
%. Y por otro lado seguido muestran al gas con un 23% y finalmente el
sulfuro con un 15%, el cual representa el porcentaje más bajo al compararlo
con las demás pruebas bioquímicas.
Tabla N° 21, % Diversidad Funcional de cepas recuperadas del agua
S I M V H2S Glu Lac
N
Cepa Pi
1 1 1 1 1 1 1 1 1 0,091
2 1 0 1 0 1 1 0 1 0,091
3 0 1 1 0 0 1 0 2 0,182
4 1 1 1 0 1 0 0 1 0,091
5 0 1 0 1 0 0 0 1 0,091
6 0 1 1 1 0 1 0 1 0,091
7 0 1 0 1 0 1 0 1 0,091
8 0 1 0 0 0 1 0 1 0,091
9 0 1 0 0 0 1 1 1 0,091
10 0 0 1 0 0 1 1 1 0,091
∑ 3 8 6 4 3 8 3 11 1
% 27 73 55 36 27 73 27 100
S: sulfuro; I: Indol; M: motilidad; V: Voges-P, H2S, Glu: Glucosa, Lac: Lactosa; Pi: Índice de
Importancia
77
Figura N° 8, % Diversidad Funcional de cepas recuperadas del agua
S: sulfuro; I: Indol; M: motilidad; V: Voges-P, H2S, Glu: Glucosa, Lac: Lactosa
La diversidad funcional del agua (Tabla N° 21) muestra 10 grupos
funcionales de 25 cepas evaluadas, el grupo funcional que presentó mayor
índice de importancia funcional fue el grupo funcional 3 con una Pi de 0,182
seguido de los grupos funcionales 1,2 4,5,6,7,8,9,10 con Pi de 0,091. Las
diversas pruebas bioquímicas (Grafico N° 4) evaluadas muestran a la
Glucosa y al indol con un 73% luego muestra a la motilidad con un 55 % y
seguidamente muestra a Vogues Proskauer con un 36 %. Y por otro lado
seguido se muestran al gas, lactosa, sulfuro con un 27% el cual representa
el porcentaje más bajo al compararlo con las demás pruebas bioquímicas.
78
Tabla N° 22 Índices de grupos funcionales encontrados en los diversos
componentes
18 GF / 25 CEPAS IDF 0,72 AIRE
10 GF / 13 CEPAS IDF 0,76 SUELO
10 GF / 11 CEPAS IDF 0,90 AGUA
IDF número de grupos funcionales/ total de cepas
La Tabla N° 22 señala el índice de diversidad funcional de los
diferentes componentes estudiados, para el aire el índice de diversidad
funcional (IDF) fue de 0,72 este valor representa el numero de grupo
funcional más importante dentro de los componentes estudiados. Asimismo
el componente suelo muestra un índice de diversidad funcional (IDF) de gran
interés con un valor de 0,76 seguido del (IDF) del agua el cual fue de 0,90.
Diagnostico en la quebrada Guaranao de la calidad microbiológica
ambiental del suelo según (Alexander 1980), aire (OMS 1993) y agua
(decreto 883) aplicando adicionalmente criterios físicos-químicos.
Diagnostico mi ambiental del suelo según (Alexander 1980)
Tabla Nº 23, Distribución de microorganismos en el perfil del suelo a 20
cm en las estaciones de muestreo.
PROFUNDIDAD 20-25 (cm) BACTERIAS AEROBIAS
(NMP/g)
HONGOS
(NMP/g)
Valor
Estándar
1,800 50
Estación 1 10861 960
Estación 2 9068 189
Estación 3 9149 2716
Estación 4 1901 2716
Fuente: Alexander (1980); Propia
79
La Tabla N° 23 muestra los valores obtenidos en las estaciones 1,2,3 se
encuentran muy elevados, es decir que sobre pasan los valores estándar
establecidos, sin embargo los valores obtenidos de la estación 4 señala un
valor cercano al establecido por el valor estándar.
Tabla N° 24, Diagnostico ambiental del Aire por medio de UFC de
Hongos / m3 propuesto por la OMS (1993).
Nivel hongo E1 E2 E3 E4
Muy Bajo < 25
Bajo 25-100 93
Intermedio 100-500
Alto 500-2000 650 650
Muy Alto >2000 3636
Esta tabla N° 24 muestra los diversos niveles de hongos encontrados
en cada una de las estaciones de muestreo. Para la estación 1 el nivel de
hongos fue Bajo (93) según el rango de valor establecido por la OMS, luego
siguen los niveles de hongos de la estación 2 y 4 que se encuentran en un
rango alto (650) y por último la estación 3 presento un nivel de hongos muy
alto (3636).
Tabla N° 24, Diagnostico ambiental del Aire por medio de UFC de
bacterias / m3 propuesto por la OMS (1993)
Nivel bacteria E1 E2 E3 E4
Muy Bajo < 50
Bajo 50-100
Intermedio 100-500
Alto 500-2000 584
Muy Alto >2000 889 2229 1367
80
La Tabla N° 24 señala los niveles de bacterias encontradas en el aire, para
la estación 1 los valores propuestos por la OMS, fue alto representada por
584, asimismo para las estaciones 2,3,4 representadas por valores de 889,
2229,1367 fueron muy significantes ya que se encontraban en el rango muy
alto.
Promedio aritmético de nivel de bacterias en agua (NMP/100 ml)
evaluadas en la quebrada Guaranao, Falcón, Venezuela.
Tabla Nº 25, Resultados de las pruebas fisicoquímicas
PARAMETROS E1 E2 E3 E4 Aguas
del tipo
1A 1B
Aguas
del
subtipo
4A y4B
pH 5,9 5,9 6,0 5,8 6,0-8,5 S/L
TEMPERATURA °C 33 33 33 32 S/L S/L
OXIGENO
DISUELTO(mg/L)
18 6 5 7 4mg/L 6mg/L
Coliformes Totales y
Coliformes
Termoresistentes
≥16 16 ≤2,2 ≤2,2 ≤2,2
CLASIFICACIÓN 4B 4A 1A 1A
Parámetros evaluados según el decreto 883. Fuente: Rojas Y, Jordan M,
2012.
En la Tabla N° 25 se muestran los diferentes parámetros
fisicoquímicos evaluados en cada una de las estaciones de muestreo. El
valor obtenido del pH que se midió en la estación 3, señala que fue de 6,0 el
cual indica que esta dentro de los límites establecidos para clasificarlo como
un parámetro correspondiente a las aguas del tipo 1A y 1B. Sin embargo las
81
estaciones 1, 2,4 mostraron valores muy cercanos al establecido por el
decreto 883.
En cuanto a la temperatura los valores registrados en cada una de las
estaciones de muestreo fueron entre 32 °C y 33 °C lo que señala que los
valores fueron similares y para clasificarla no existe límite.
El oxigeno disuelto en la estación 1, fue muy alto lo cual sobrepaso
los límites establecidos por el decreto 883, mientras la estación 2 obtuvo un
valor de 6mg/L siendo este el rango apropiado para señalarlo como apto
para aguas de subtipo 4Ay 4B.
Por otra parte las estaciones 3 y 4 no presentaron valores aceptables
para ser clasificados por el decreto 883 ya que estuvieron fuera de los
rangos establecidos. Con respecto a los coliformes fecales y
termoresistentes los valores obtenidos de las estaciones 3 y 4 señalan que
estos son los aceptados por los límites establecidos en el decreto 883 para
aguas de tipo 1A Y 1B.
82
DISCUSIÓN DE LOS RESULTADOS
La microbiología ambiental es usada como una herramienta para el
diagnostico diversos espacios que son impactados por el hombre de este
modo los microorganismos son usados como indicadores del estado del
ambiente. La evaluación a través de las características micro y
macromorfológicas en los componentes estudiados muestra a los diplococos
como el grupo más representativo en las 8 cepas recuperadas del Agua
(Tabla N° 9). Mientras que en el suelo el principal grupo caracterizado fueron
los cocos Gram negativos con una media de 4,00 seguido de los diplococos
Gram (-) en grupo de 6 cepas (Tabla N° 10). En componente agua de igual
manera el grupo más representativo fueron los diplococos Gram (-) con una
media 1,25 seguido de cocos Gram (+) con una media 0,5 en 15 cepas. Esta
data muestra como bacterias formadas por dos cocos que se asocian en
forma de parejas estuvieron presentes en todos los componentes, esto
puede ser posible ya que algunos diplococos poseen capsula que le permite
resistir a los diversos cambios presentes en todos los componentes ríos
(Madigan et al., 2006).
La especie fúngica más representativa en los tres componentes fue
Aspergillus flavus con una media de 0,50 para todos los componentes
(Tablas 12, 13, 14) seguido de Aspergillus niger, la cual fue también
encontrada en todos los componentes en especial en el componente aire
(Tabla 14). Esto propone al género Aspergillus como un microorganismos
con capacidad de estar presente en la arena (Isquierdo y Col 1986), el suelo,
el agua y el aire debido a su versatilidad para degradar tanto compuestos
simples como xenobióticos lo que le da un valor ambiental a este
microorganismo como agente capaz de reciclar la materia orgánica a las
diferentes cadenas tróficas (De Hoog 2000).
83
Los datos evaluados (Tabla 18) muestran al grupo de microalgas
clorofitas como el grupo estadísticamente alto, seguido de las cianobacterias
y las diatomeas en todas las estaciones. Sin embargo las estaciones E1 y E2
presentan valores mayores para todos los grupos en comparación de las
estaciones E3 y E4. La presencia marcada de clorofitas en mayor proporción
con respecto a los demás grupos propone la posibilidad de que este cuerpo
de agua en especial en las estaciones E1 y E2 contenga un alto contenido
de nutrientes y esto se evidencia incluso en el color de las muestras tomadas
(Vicente, 2005) (Ver Anexo).
De los resultados obtenidos de las pruebas bioquímicas, en todos los
componentes evaluados la glucosa presento el porcentaje más elevado. Al
evaluar los diferentes grupos funcionales en los diversos componentes
(agua, suelo, aire) se evidencio que el componente aire, fue de mayor
importancia porque es mayor el número de grupos funcionales con respecto
al número de cepas evaluadas con un IDF de 0,72 seguido del componente
suelo con un IDF de 0,76 y el componente agua con un IDF de 0,90,
Nuestros resultados del agua son consistentes con los obtenidos por un
estudio similar realizado por Bastardo en el (2007).
La variación de la diversidad funcional bacteriana en el agua de la
Quebrada de Guaranao determinada en este estudio, es comparable con la
reportada para un ecosistema costero de Venezuela, donde este índice varió
entre 0,90 y 0,72 (Linares, 1996). La diversidad de las comunidades
microbiológicas generalmente disminuye en respuesta a perturbaciones o
estrés ambiental, mientras que el número de poblaciones sobrevivientes
poseen propiedades específicas que le permiten persistir dentro de las
comunidades perturbadas (Atlas et al. 1991).
84
El diagnostico de los componentes nos permitió establecer que el
suelo presentó niveles superiores a los propuestos por Alexander (1980)
(Tabla 23), por su lado las bacterias presentaron valores altos en las
estaciones E1 y E2 que están en una zona donde hay mayor cantidad de
flora y fauna asociado a la cantidad de nutrientes presentes en el suelo que
está cerca del agua (Nielsen, 2002). Sin embargo los valores más altos de
los hongos se presentaron en el suelo de las Estaciones E3 y E4 que se
encuentran cerca de una zona urbana lo cual puede influenciar para el
crecimiento de estos grupos sobre todo porque los hongos son capaces de
utilizar no solo compuestos orgánicos simples sino también compuestos
xenobióticos (De Hoog 2006) generados por la actividad antrópica.
El diagnostico del aire por el índice propuesto por la OMS (1993)
(Tabla 24, 25) evidenció que el aire contenía niveles altos y muy altos de
microorganismos, en especial las estaciones 2,3,4 excepto la estación E1 y
esto se correlaciona con los valores altos de hongos en las ultimas
estaciones del suelo. Esta misma tendencia ocurrió también para las
bacterias recuperadas del aire puesto las estaciones 2, 3, 4 presentaron
valores muy altos, esto considera la posibilidad que la zona urbana presente
estos valores ya que existe una relación entre la actividad humana y el
aumento de los microorganismos en el aire (De la Rosa, 2002)
El diagnostico del agua utilizando los criterios microbiológicos y
fisicoquímicos propuestos por el decreto 883 (Tabla 25) permitió clasificar las
dos primeras estaciones en agua de tipo 4 y subtipo 4B para E1 estación que
tiene contacto con la costa y 4A estación que representa a la laguna de la
quebrada de Guaranao. A diferencia de las aguas de las estaciones E3 y E4
cuyas agua transparentes visualmente (Anexo 11) presentaron una
clasificación de tipo 1A.
85
CONCLUSIONES
De los componentes estudiados se muestra a los diplococos como el
grupo más representativo recuperados del Agua.
En el suelo el principal grupo de bacterias caracterizadas fueron los
cocos Gram negativos.
De los tres componentes estudiados la especie fúngica más
representativa fue Aspergillus flavus., aunque también se encontró en
todos los componentes Aspergillus niger, en especial en el
componente aire
La presencia marcada de clorofitas en mayor proporción con respecto
a los demás grupos propone la posibilidad de que el cuerpo de agua
contenga un alto contenido de nutrientes y esto se evidencia incluso
en el color de las muestras tomadas.
De las pruebas bioquímicas evaluadas en todos los componentes la
glucosa presento el porcentaje más elevado.
Los valores más altos de los hongos se presentaron en el suelo
Se evidenció que en el componente aire los niveles de
microorganismos fueron muy altos.
La metodología aplicada permitió la recuperación de un alto
porcentaje de microorganismos presentes en el aire.
Los criterios microbiológicos y fisicoquímicos propuestos por el
decreto 883 permitieron clasificar las aguas de tipo 1A y1B y subtipo
4A y 4B.
86
RECOMENDACIONES
Se recomienda al Instituto Nacional de Parques establecer medidas para la
conservación, protección, desarrollo sostenible de este ecosistema.
Se recomienda implementar un monitoreo que incluya la observación del
sistema a estudiar, la obtención de muestras para analizar los aspectos
bióticos (ej. presencia de cianobacterias y toxinas) y el registro de variables
abióticas relacionadas con el crecimiento de las cianobacterias (ej.
temperatura, lluvia, tiempo de residencia, nutrientes).
Se recomienda para posteriores estudios, hacer un estudio de línea base
para contribuir al conocimiento científico y así de esta forma conocer el
estado ambiental de los componentes aire, agua, suelo, del humedal
quebrada de guaranao.
Se recomienda para posteriores trabajos darle continuidad a la realización
de pruebas bioquímicas tales como: Citrato, ornitina, gelatinasa, lipasa,
catalasa. Para contribuir al complemento de estas.
Se recomienda medir para posteriores trabajos de investigación los
parámetros fisicoquímicos como la demanda bioquímica de oxigeno (DQO) y
la demanda biológica de oxigeno (DBO).
Se recomienda la identificación de los grupos bacterianos encontrados
mediante el uso de pruebas bioquímicas o moleculares.
87
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ANEXOS
97
ANEXO 1. Visita a la Quebrada de Guaranao con el personal de
inparques
Toma de muestra de suelo de
ANEXO 2. Muestreo realizado en la Quebrada de Guaranao
98
ANEXO 3. Toma de muestras de aire, agua, suelo
ANEXO 4. Kit de campo para la medición de oxigeno disuelto
99
ANEXO 5. Medicion de Oxigeno Disuelto
ANEXO 6. Medicion de pH
100
ANEXO 7. Realizacion de pruebas de coliformes fecales termoresistente
101
ANEXO 8. Preparacion de medio PDA
ANEXO 9. Preparación de medios de cultivo
ANEXO 10.Autoclave utilizado para esterilizar los medios de cultivo.
102
ANEXO 11. Muestras de agua tomada en cada una de las estaciones
ANEXO 12. Muestras madres de agua
103
ANEXO 13. Diluciones de muestras de suelo en placas
ANEXO14. Cepa de aire
ANEXO 15. Cepa de agua
104
ANEXO 16.Cepa de suelo
105
Anexo 17 Cálculo de cel / µl con cámara de Neubauer
La fórmula utilizada para el cálculo de la biomasa es la siguiente:
Cámara: Neubauer improved
Ejemplo
1. células contadas: 528 células
2. superficie contada: 5 cuadrados medianos corresponden a 0,2 mm2
3. profundidad cámara: 0,1 mm
4. dilución: 1: 200 (Vicente, 2005).
106
ANEXO 18. Cálculo de UFC / m3 en el componente aire por el método de
sedimentación pasiva
Para el Cálculo de la UFC en el aire se puede usar la siguiente formula
empírica: tr
aX
2
4
.
10.5.
X - número de microorganismos en el aire (UFC/m3),
a - el número de colonias en la placa de Petri,
r2 - la superficie de la placa de Petri (cm2)
t - tiempo de exposición (minutos) (Kolwzan 2006).
107
ANEXO 19. Número Más Probable para series de diluciones en replicas
de cinco por nivel de dilución (Woomer, 1994)
