CUIBFACULTAD DE MEDICINA

ESTUDIO DE CANALES PERMEABLES A CALCIO

DE MEMBRANAS INTRACELULARES

DE CLULAS VEGETALES

Tesis para obtener el grado de

Doctor en Ciencias Fisiolgicas

Presenta:

M.C. Vadim Prez Koldenkova

Asesor:

Dr. Igor Pottosin

Colima, Col. Junio de 2007

i

ndice ndice ............................................................................................................................................... i Abreviaturas ................................................................................................................................. iii 1. Introduccin ............................................................................................................................... 1

1.1 Generalidades ......................................................................................................................... 1

1.1.1 Concentraciones y transporte de Ca2+ en las plantas....................................................... 2

1.1.2 Depsitos intracelulares de Ca2+ en plantas.La vacuola ltica y el retculo endoplsmico................................................................................................................... 3

1.1.3 Transporte de Ca2+ en las vacuolas y el retculo endoplsmico....................................... 5

1.1.4 Transduccin de seales por calcio en clulas vegetales................................................. 8

1.2 Antecedentes ........................................................................................................................ 13

1.2.1 Canales vacuolares, permeables a Ca2+. ........................................................................ 13

1.2.2 SVel nico canal vacuolar permeable a Ca2+ establecido firmemente. ..................... 15

1.2.3 Canales permeables a Ca2+ del retculo endoplsmico .................................................. 28

2. Objetivos del proyecto............................................................................................................. 32 2.1 Hiptesis............................................................................................................................... 32

2.2 Objetivos .............................................................................................................................. 32

3. Metodologa.............................................................................................................................. 34 3.1 Preparaciones ....................................................................................................................... 34

3.1.1 Objeto de estudio. .......................................................................................................... 34

3.1.2 Obtencin de vacuolas. Soluciones de trabajo............................................................... 34

3.1.3 Obtencin de fraccin microsomal enriquecida de RE ................................................. 36

3.1.4 Obtencin de liposomas gigantes. Tcnica de deshidratacin-rehidratacin. ............... 36

3.2 Registros electrofisiolgicos ................................................................................................ 37

Patch Clamp............................................................................................................................ 37

3.2.1 Generalidades................................................................................................................. 37

3.2.2 Fabricacin de micropipetas .......................................................................................... 38

3.2.3 Registros de actividad de canales en las configuraciones attached, vacuola-completa, parche aislado. .............................................................................................................. 38

3.2.4 Medicin del potencial a travs de la membrana vacuolar. ........................................... 38

3.2.5 Protocolos de voltaje para el estudio del canal vacuolar SV. Obtencin de relacin corriente-voltaje del canal unitario................................................................................ 40

ii

3.2.6 Determinacin de la probabilidad de apertura. .............................................................. 40

3.2.7 Calibracin del efecto de Ca2+ vacuolar sobre el canal SV. .......................................... 41

3.2.8 Estimacin del nivel de calcio vacuolar libre, utilizando la curva de calibracin......... 41

3.2.9 Protocolos de voltaje para el estudio de canales permeables a Ca2+ del retculo endoplsmico................................................................................................................. 43

Microelectrodos ionoselectivos .............................................................................................. 43

3.2.10 Mediciones de la actividad de cationes vacuolares con la tcnica tradicional de electrodos ionoselectivos............................................................................................... 43

3.2.11 Tcnica MIFE (Microelectrode Ion Flux Estimation). ................................................ 44 4. Concentraciones libres de los principales cationes fisiolgicos vacuolares y sus efectos

sobre el canal SV. .................................................................................................................... 47 4.1 Introduccin. ........................................................................................................................ 47

4.2 Resultados. ........................................................................................................................... 47

4.2.1 Osmolaridad y valor del pH del jugo vacuolar. ............................................................. 47

4.2.2 Registros en configuracin attached. ............................................................................. 49

4.2.3 Concentraciones vacuolares fisiolgicas de K+, Na+, Ca2+ y Mg2+. .............................. 51

4.2.4 Efecto del pH vacuolar sobre el umbral de activacin del canal SV. ............................ 53

4.2.5 Efecto del Na+ vacuolar sobre la curva de activacin del canal SV en condiciones de pH fisiolgico...................................................................................................................... 56

4.2.6 Efecto conjunto de los cationes fisiolgicos ms importantes H+, Na+, Mg2+, Ca2+ que modulan la cintica de activacin del canal SV. .................................................... 60

4.2.7 Evaluacin de la actividad del canal SV en condiciones inicas fisiolgicas. .............. 62

4.3 Discusin.............................................................................................................................. 69

5. Estudios de canales permeables a Ca2+ del RE. .................................................................... 75 5.1 Introduccin. ........................................................................................................................ 75

5.2 Resultados. ........................................................................................................................... 75

5.2.1 Selectividad.................................................................................................................... 77

5.2.2 Modulacin por voltaje. ................................................................................................. 77

5.3 Discusin.............................................................................................................................. 77

6. Conclusiones............................................................................................................................. 82 Agradecimientos .......................................................................................................................... 84 Bibliografa................................................................................................................................... 85 Appndice ................................................................................................................................... 102

iii

Abreviaturas

ABA cido abscsico (fitohormona),

cADPR adenosin-fosfato-ribosa cclico,

CAX (cation exchangers), en este trabajo intercambiadores Ca2+/H+,

IP3 inositol-3,4,5-trisfosfato,

LCIC liberacin de calcio inducida por calcio,

MIFE (microelectrode ion flux estimation) tcnica de estimacin de flujo inico con microelectrodos,

RE retculo endoplsmico,

SV (slow vacuolar channel) canal vacuolar lento,

TPC (two pore channel) canal de doble poro,

V1% potencial de apertura de 1% del total de canales abiertos registrados.

1

1. Introduccin

1.1 Generalidades

A diferencia de otros seres vivos, las plantas no tienen la capacidad de escoger el entorno

en el que ocurre su crecimiento y desarrollo. Por esta razn, los organismos vegetales requieren

de mecanismos especficos, destinados a asegurar el funcionamiento normal de sus clulas en el

rango de condiciones que se puedan presentar en su medio ambiente. Entre los factores con

mayor variabilidad para las plantas se encuentra el suministro mineral procedente del suelo. En

base a las concentraciones de nutrientes disponibles en el suelo y las necesidades de las plantas,

stos pueden encontrarse en deficiencia o en exceso, obligando a las plantas a poner en

funcionamiento los mecanismos correspondientes para el mantenimiento de la homeostasis inica

celular. El mecanismo que tiene la mayor distribucin en el reino vegetal es el almacenamiento o

acumulacin, utilizado por las plantas tanto para la prevencin de deficiencias, como para la

eliminacin de excesos de nutrientes en el citoplasma y el aislamiento de metabolitos y

substancias txicas.

El calcio es uno de los elementos esenciales para la vida, que, sin embargo, se encuentra en su

mayor parte almacenado en organelas especiales o en el exterior de la clula el apoplasto, y se

encuentra en mnimas y rigurosamente mantenidas concentraciones (alrededor de 100-200 nM en

condiciones de reposo) en el citoplasma. Su alto grado de compartimentacin es una necesidad

para evitar su precipitacin en el citoplasma con el fosfato inorgnico (Sanders y col., 1999), y la

competencia por los sitios de unin con el Mg2+ citoslico (Marschner, 1995). La gran diferencia

de concentraciones entre el citoplasma, por una parte, y el apoplasto y los compartimentos

intracelulares, por la otra, probablemente son la razn del uso de las seales de Ca2+ como

vnculo entre los estmulos extracelulares y las respuestas intracelulares1. Actualmente, esta ruta

de sealizacin se encuentra en tal grado de desarrollo que permite con tan solo un evento la

elevacin del calcio citoplsmico generar respuestas opuestas, como, por ejemplo, el cierre o

1 Maathuis F. Ligand-gated ion channels. En: Blatt M.R. (Ed.) Membrane transport in plants. Blackwell Publishing, CRC Press, 2004, p. 199.

2

la apertura de las clulas de guarda en respuesta a la aplicacin de las hormonas reguladoras

ABA (cido abscsico) o IAA (cido indolilactico).

En las plantas la elevacin del Ca2+ citoslico en numerosos casos es el resultado del influjo a

travs de la membrana plasmtica. Sin embargo, muchos procesos fisiolgicos requieren la

participacin de depsitos intracelulares de calcio. Su presencia permite localizar la seal de Ca2+

y su tiempo de vida (patrn espacio-tiempo), y, por otra parte, amplificar y prolongar la seal

inicial de calcio, as como disear su forma (patrn amplitud-frecuencia) de manera especfica

para cada estmulo (Allen y col., 2001). Por esto, el estudio de los canales inicos permeables a

calcio los componentes primarios que permiten la entrada y la elevacin del nivel de Ca2+ en

el citoplasma es una de las principales tareas para el entendimiento del funcionamiento de la

maquinaria llamada sealizacin por calcio.

1.1.1 Concentraciones y transporte de Ca2+ en las plantas.

En las plantas que crecen en condiciones adecuadas de calcio en su medio habitual, el

contenido promedio de calcio en los tallos es de 0.1-5% de su masa seca (Marschner, 1995) o, en

trminos de concentraciones 0.3-16.5 mM (White y col., 1992; de Silva y col., 1998). Estos

valores reflejan tanto la disponibilidad del calcio en el suelo, como las diferentes necesidades de

las plantas en este mineral. La deficiencia por calcio raramente se presenta en la naturaleza pero

ocurre con ms frecuencia en la horticultura y se debe principalmente a la indisponibilidad

momentnea del mineral para los tejidos en desarrollo, causada por la imposibilidad de su

redistribucin de los tejidos ms maduros va la floema (White y Broadley, 2003). Por su relacin

al calcio, las plantas son agrupadas en calcfugas (calcifuges, de suelos cidos pobres en calcio) y

calccolas (calcicoles, habitantes de suelos calcreos). Aunque es la tolerancia a Al, Mn y Fe lo

que principalmente determina la flora de los suelos cidos, y la insensibilidad a la deficiencia de

P y Fe lo que determina la flora en suelos calcreos (Lee, 1999), las calcfugas generalmente

crecen bien en bajas concentraciones de calcio en la rizsfera y no presentan amplia respuesta al

incremento de calcio. Al contraste, se considera que los mecanismos que le permiten a las

calccolas mantener en su hbitat natural un bajo nivel de Ca2+ en el citoplasma, no les permiten

crecer en condiciones de bajo suplemento de ste, induciendo deficiencia por calcio (Lee, 1999).

Probablemente, calcio, al igual que otros iones, penetra por las puntas de las races, de donde

se mueve por el apoplasto hacia los vasos de la xilema (Ferguson y Clarkson, 1976; Clarkson,

3

1993; White, 2001), en los cuales principalmente ocurre su movimiento, siguiendo el flujo de

agua causado por la transpiracin (Epstein y Bloom, 2005). Por otra parte, en las races de cebolla

(Allium cepa) existen evidencias de que el transporte de calcio a la xilema puede ocurrir a travs

del simplasto (Cholewa y Peterson, 2004). Se considera que en esta ruta los iones de calcio entran

al simplasto a travs de canales permeables a calcio de la membrana plasmtica, siendo

bombeados despus a los tejidos de conduccin por las Ca2+-ATPasas y los intercambiadores

H+/Ca2+ (White y Broadley, 2003) los transportadores de Ca2+ ms importantes de las clulas

vegetales.

1.1.2 Depsitos intracelulares de Ca2+ en plantas. La vacuola ltica y el retculo endoplsmico.

La capacidad de secuestrar el calcio citoplsmico en las clulas vegetales ha sido probada

para la vacuola, el retculo endoplsmico, las mitocondrias y los cloroplastos (Bush, 1995). No

obstante, son escazos los estudios sobre las concentraciones de calcio libre presentes en estos

compartimentos, y generalizados sus resultados, a pesar de que las mediciones de calcio total

demuestran claramente una distribucin no uniforme de ste a nivel de rganos, tejidos e incluso

a nivel celular, en dependencia de la disponibilidad de Ca2+ en el suelo y las caractersticas

funcionales de los tejidos (Dietz y col., 1992; Fricke y col., 1995; Karley y col., 2000).

En las clulas vegetales la vacuola central o ltica es el mayor depsito (ms del 80% del

volumen de la clula) de calcio intracelular. A pesar de esto, existe solo un reporte ampliamente

conocido de la actividad del Ca2+ en vacuolas de las plantas superiores Riccia fluitans (en

rizoides) y Zea mays (en races) 2.3 y 1.5 mM, respectivamente (Felle, 1988).

Sorprendentemente, estos datos insuficientes han sido puestos en base de la opinin de un alto

nivel de calcio libre, existente en las vacuolas, y son utilizados en modelos de transporte a travs

de la membrana vacuolar, aunque estudios de tan solo calcio total demuestran una localizacin

asimtrica de este catin en las hojas con patrones distintos para diferentes tejidos (Fricke y col.,

1995; aparte Karley y col., 2000). Incluso as, ha sido mostrado que la concentracin de calcio

en los tejidos se encuentra en funcin del calcio presente en el suelo (Dietz y col., 1992) y

depende de la estacin del ao, sufriendo cambios en vacuolas de tejidos dedicadas al

almacenamiento en poca de invierno (Stelzer y col., 1990, 1993) y manipulndose de diferentes

4

formas en hojas deciduas e invernales (en Larix decidua es acumulado en vacuolas del

endodermo y desechado durante el deshoje; en la planta de hojas perenes Picea abies el Ca2+ es

almacenado hasta la primavera en las vacuolas y en el apoplasto del mesfilo; Gierth y col.,

1998; Stelzer y col., 1990).

Se considera, que la mayor parte del Ca2+ vacuolar se encuentra ligado por aniones orgnicos

(oxalato, citrato, isocitrato, malato) formando, en muchos casos, complejos de baja solubilidad

precipitados en forma de cristales (principalmente de oxalato de calcio). Las funciones

primarias de estos complejos son la regulacin de alta capacidad del calcio vacuolar (tanto

almacenamiento de Ca2+, como la precipitacin de sus excedentes en una forma osmtica- y

fisiolgicamente inerte), la defensa contra herbvoros, as como la detoxificacin de Al3+ y

metales pesados (ver Franceschi y Nakata, 2005 para una revisin reciente). En las plantas

conocidas como precipitadoras de oxalato (a las que pertenece el betabel (White y Broadley,

2003) el objeto de estudio del presente trabajo) en los tejidos en crecimiento se encuentran

clulas especializadas idioblastos que precipitan en sus vacuolas en forma de oxalato el

calcio del apoplasto impidiendo as que ste interfiera con el crecimiento de las clulas

inmaduras, que, debido a su pobre vacuolacin, tienen una capacidad reducida para secuestrar el

calcio (Franceschi y Nakata, 2005). Es interesante, que los idioblastos poseen una densa red de

retculo endoplsmico, cuya principal tarea, por lo visto, es el rpido secuestro del calcio entrante

al citoplasma y su transportacin a la vacuola central para su precipitacin (Kostman y col., 2003;

Franceschi y Nakata, 2005). Estos datos pueden revelar las funciones de los dos mayores

depsitos de calcio celulares: el retculo endoplsmico (como secuestrador de Ca2+) y la vacuola

central (como su almacn), en el mantenimiento de la homeostasis de calcio en la clula vegetal,

discutidos ms adelante (ver. p.1.1.3)

El retculo endoplsmico (RE) es el segundo depsito intracelular de calcio ms importante en

las clulas vegetales, despus de la vacuola. La concentracin libre de calcio en el RE fue

igualmente determinada en un solo trabajo y estimada en alrededor de 3 M (en clulas aleurnicas de cebada; Bush y col., 1989). Por otra parte, la similitud de las funciones del RE en

las clulas eucariotas permite considerar como cercana la actividad de Ca2+ en el RE de las

clulas vegetales a la observada en clulas animales y cuyos valores varan entre 0.1-2 M (Kendall y col., 1994, 1996) y 100-400 M (Solovyeva y Verkhratsky, 2003). El RE de las plantas pudiera presentar similar variacin en el nivel de Ca2+ libre lumenal en dependencia de la

5

presencia de calreticulina protena de gran capacidad para secuestrar el calcio con baja

afinidad, la funcin de la cual es mantener un alto nivel de Ca2+ en el lumen del RE (Persson y

col., 2001; Wyatt y col., 2002).

En otros organelos la concentracin libre de calcio en reposo determinada es menor que la

estimada para la vacuola, aunque presenta elevaciones en respuesta a diversos estmulos. La

concentracin de Ca2+ libre en mitocondrias, determinada con la tcnica camalen, en

condiciones de reposo se encuentra alrededor de 200 nM y puede aumentar hasta 800 nM durante

diferentes estreses (Logan y Knight, 2003). En cloroplastos el nivel de Ca2+ en reposo tambin es

relativamente bajo (menos de 150 nM), pero el cambio de exposicin luz-oscuridad genera una

elevacin transitoria del nivel de calcio hasta 5-10 M (Johnson y col., 1995). Igualmente, en el ncleo la concentracin libre de calcio es menor de 100 nM, pero presenta una breve elevacin

hasta cerca de 500 nM en condiciones de estrs (van der Luit y col., 1999).

1.1.3 Transporte de Ca2+ en las vacuolas y el retculo endoplsmico.

En general, los sistemas intracelulares de aislamiento de Ca2+ realizan cuatro importantes

tareas, necesarias para el funcionamiento normal de las clulas vivas (Sanders y col., 2002):

1. Mantienen el calcio citoplsmico al nivel de reposo y ayudan de esta forma a la extincin

de seales de calcio.

2. Acumulan el Ca2+ en compartimentos tales como el RE y la vacuola para liberarlo de forma

regulada durante el proceso de sealizacin.

3. Suplementan Ca2+ a organelos especficos que requieren un alto nivel de calcio para el

curso normal de sus reacciones bioqumicas. Por ejemplo, estas condiciones son necesarias

para el procesamiento adecuado de las protenas que van a ser secretadas desde el RE

(Rudolph y col., 1989; Gill y col., 1996).

4. Aislando el Ca2+, evitan su precipitacin con el fosfato inorgnico (Pi) en complejos de

baja solubilidad (Sanders y col., 1999).

Las protenas que ejercen el transporte de calcio en las clulas vegetales son los H+/Ca2+-

intercambiadores (del tipo CAX, por las siglas en ingls CAtion eXchangers) y las bombas de

calcio o Ca2+-ATPasas. Para el transporte de Ca2+ en direccin opuesta a su gradiente, los CAX

utilizan el gradiente de pH a travs de la membrana, generado y mantenido por la actividad de la

6

pirofosfatasa (PPiasa) y las bombas de protones (H+-ATPasas), mientras que las Ca2+-ATPasas

para este fin utilizan la energa del ATP.

La actividad de los intercambiadores H+/Ca2+ ha sido demostrada en vesculas de tonoplasto

de diferentes especies, por lo que se estima su amplia distribucin en el reino vegetal (Schumaker

y Sze, 1985; Blumwald y Pool, 1986; Blackford y col., 1990; Chanson, 1991; Hirschi y col.,

1996; Ueoka-Nakanishi y col., 1999). La primer isoforma definida de estos transportadores fue la

CAX1, localizada en vacuolas de Arabidopsis thaliana (Hirschi y col., 1996). El CAX1

intercambia H+ vacuolar por Ca2+ citoslico en razn de 3 por 1 y, en comparacin con las Ca2+-

ATPasas, con poca afinidad al calcio Km 10-13 M caracterstica general de los intercambiadores Ca2+/H+ (Schumaker y Sze, 1985; Blumwald y Pool, 1986; Hirschi y col., 1996;

Hirschi, 2001); no obstante, en comparacin con las Ca2+-ATPasas, la capacidad de transporte de

estas enzimas es ms alta (Hirschi, 2001) Vmax = 25 nMmin1mg1protena (Ueoka-Nakanishi

y col., 1999). De los miembros de la familia CAX investigados (que incluye 12 isoformas en el

genoma de Arabidopsis (Sanders y col., 2002) de las cuales han sido caracterizadas cuatro), solo

el CAX1 y el CAX2 (con menor afinidad) poseen la capacidad confirmada de transportar Ca2+

(Hirschi y col., 1996). Los otros miembros de esta familia (incluyendo el CAX2), al parecer,

confieren a las plantas tolerancia a otros metales potencialmente txicos (Mn2+, Cd2+, Zn2+)

mediante su aislamiento del citoplasma, y sus capacidades de transporte de Ca2+ se desconocen

(Sanders y col., 2002). Aparte de la vacuola, existen evidencias de la presencia de los CAX en la

membrana citoplasmtica (Kasai y col., 1990).

Al igual que los CAX, las Ca2+-ATPasas aslan el Ca2+ del citoplasma, transportndolo adentro

de organelos-depsitos de Ca2+ o hacia el apoplasto, pero con una mayor afinidad Km 1-10 M (Evans y Williams, 1998) y menor capacidad de transporte (White y Broadley, 2003) Vmax = 6

nMmin1mg1protena (Ueoka-Nakanishi y col., 1999).

Las Ca2+-ATPasas de las clulas vegetales pertenecen a la superfamilia de las P-ATPasas y

estn representadas por dos familias (Geisler y col., 2000a; Axelsen y Palmgrem, 2001): IIA (4

miembros identificados en el genoma de A. thaliana; nombrados, respectivamente, ECA1-4) y

IIB (reguladas por calmodulina o protein-kinasas dependientes de Ca2+ (CDPKs), 10 miembros

identificados en A. thaliana AtACA1, 2, 4 y 7-13, respectivamente). La localizacin interna de

las Ca2+-ATPasas tipo IIA incluyen el RE y el aparato Golgi (AtECA1, en A. thaliana; Liang y

7

col., 1997), y la membrana plasmtica y el tonoplasto (LeLCA1, en tomate Lycopersicon

esculentum; Ferrol y Bennet, 1996; Navarro-Avino y col., 1999), aunque en Arabidposis no

existen reportes de la presencia de Ca2+-ATPasas de ninguna de las dos familias en la membrana

vacuolar (Maeshima, 2001). Las Ca2+-ATPasas del tipo IIB residen en la membrana plasmtica

(AtACA8; Bonza y col., 2000), en el RE (AtACA2; Liang y col., 1997; Hong y col., 1999) y en

la membrana interna de los plstidos (AtACA1; Huang y col., 1993). Una alta actividad de Ca2+-

ATPasas en membranas vacuolares fue inicialmente reportada en clulas de raz de maz (Zea

mays; Gavin y col., 1993; Pfeiffer y Hager, 1993; estos dos estudios en el mismo objeto se

distinguen drsticamente en los niveles reportados de actividad de Ca2+-ATPasas asociada con el

RE). La presencia de una bomba de Ca2+ del tipo IIB fue demostrada en vesculas de tonoplasto

de Brassica (Askerlund, 1996; sta fue denominada ms tarde BCA1 por Malstrm y col., 1997).

Aparte, una gran actividad de Ca2+-ATPasas ha sido reportada en vesculas de la misma fraccin

de membranas de diferentes especies de plantas (Sze y col., 2000), aunque el contenido de

protena fue insuficiente para su deteccin como banda en gel de SDS-poliacrilamida. Estudios

ms detallados en Arabidopsis mostraron la presencia de Ca2+-ATPasas (isoforma AtACA4) en

vacuolas pequeas, pero no en la membrana de la vacuola ltica (Geisler y col., 2000b). Por lo

tanto, queda abierta la cuestin estn las Ca2+-ATPasas asociadas con el tonoplasto o con

membranas de la misma fraccin, pero pertenecientes a organelas particulares.

En base a las propiedades de transporte de Ca2+ la capacidad de transporte y la afinidad al

Ca2+ de los CAX y las Ca2+-ATPasas, a estas protenas les fueron asignados diferentes papeles

en el mantenimiento de la homeostasis de Ca2+ en el citoplasma. En condiciones fisiolgicas, la

concentracin de Ca2+ libre en el citosol es de alrededor de 0.1 M, aumentando sta a centenas de nanomoles e incluso micromoles durante la aplicacin de diversos estmulos (McAinsh y

Hetherington, 1998) y pudiendo, probablemente, alcanzar el valor 10 M en regiones anexas a la vacuola durante el inicio de la sealizacin (Ueoka-Nakanishi y col., 1999). La gran capacidad de

transporte de Ca2+ de los CAX permite rpidamente disminuir este incremento, sin afectar, por su

baja afinidad al Ca2+ (Km 10-15 M), las enzimas Ca2+-dependientes y Ca2+-activadas del citosol, el Km de las cuales al Ca2+ se encuentra en el rango micromolar (Ueoka-Nakanishi y col., 1999).

Por otra parte, la poca afinidad al Ca2+ no permite a los CAX lograr un nivel de Ca2+ citoslico

menor de 1 M (Ueoka-Nakanishi y col., 1999). Es estimado que el nivel de Ca2+ citoslico es regresado a sus valores de reposo (alrededor de 0.1 M) por las Ca2+-ATPasas que poseen una

8

mayor afinidad (Km 1-10 M) al Ca2+ (Ueoka-Nakanishi y col., 1999). En otras palabras despus de la elevacin del Ca2+ citoslico, los CAX cumplen la funcin de la rpida

disminucin de ste a niveles en los cuales el Ca2+ es menos txico y las Ca2+-ATPasas se

encargan de la subsecuente disminucin de la concentracin de Ca2+ citoslico y de su

manutencin en un rango estrecho en condiciones de reposo.

Esta hiptesis es sostenida por las observaciones hechas en Saccharomyces cerevisiae

utilizadas como modelo de procesos de transporte en plantas, en las cuales los intercambiadores

H+/Ca2+, pero no las Ca2+-ATPasas, participan en la eliminacin de las seales de calcio despus

de la aplicacin de un choque hipertnico (Denis y Cyert, 2002). No, obstante, el mutante de

Arabidopsis det3 que posee una baja actividad de H+-ATPasa vacuolar y, probablemente, de

intercambio H+/Ca2+, presenta una relativamente alta concentracin de Ca2+ citoplsmico (Allen y

col., 2000) y las plantas tratadas con bafilomicina inhibidor de H+-ATPasas tipo V

presentan una mayor elevacin de Ca2+ citoslico en respuesta a choques hiperosmticos

(Takahashi y col., 1997).

1.1.4 Transduccin de seales por calcio en clulas vegetales

Los efectos de calcio pueden ser agrupados en 3 tipos, que describen su papel fisiolgico en

las clulas vegetales (Plieth, 2005): 1) Ca2+ como protector (un gran nmero de evidencias

demuestra una disminucin del efecto de estreses inico o toxicidad mineral en presencia de una

alta concentracin de Ca2+ en el apoplasma; ver Plieth, 2005 para ms detalles y referencias); 2)

Ca2+ como switch (interruptor) qumico (activador de canales y protenas dependientes y/o

reguladas por calcio); 3) Ca2+ como acarreador de la informacin codificada sobre los estmulos

que causan su liberacin.

La elevacin de la concentracin de calcio libre citoslico [Ca2+]cit es causada por numerosos

factores fisiolgicos y externos (Tabla 1), y es considerada un elemento clave para la generacin

de la respuesta fisiolgica adecuada (White y Broadley, 2003). Sanders y col. (1999) propusieron

su aparicin en el proceso evolutivo en base de la necesidad del mantenimiento de un nivel muy

bajo de [Ca2+]cit, en el fondo del cual las seales de calcio podran conferir sensibilidad y

velocidad a las respuestas originadas por estmulos de diferente naturaleza. Actualmente se

considera, que, para evocar la respuesta adecuada, la alteracin del [Ca2+]cit (Ca2+-signature

firma de Ca2+) generada por cada estmulo es nica. sta exclusividad se manifiesta en su

9

TABLA 1. Ejemplo de procesos de desarrollo y respuestas a estmulos biticos y abiticos, iniciados por la perturbacin en [Ca2+]cit (White y Broadley, 2003).

Evento de desarrollo o respuesta a estmulo externo Perturbacin de [Ca

2+]cit Liberador de Ca2+

al citosol Referencias selectas

Elongacin de tubos polinarios

Oscilaciones de alta [Ca2+]cit apical

Apoplasto e interno

Malh y Trewavas, 1996; Holdaway-Clarke y col, 1997; Malh y col., 1998, 2000; Messerli y col., 2000; Rudd y Franklin-Tong, 2001

Respuesta de autoincompatibilidad del tubo polinario

Onda de [Ca2+]cit en el tallo Apoplasto e interno (IP3 dependiente)

Rudd y Franklin-Tong., 2001; Straatman y col., 2001; Franklin-Tong y col., 2002

Polarizacin celular despus de fertilizacin

Onda de [Ca2+]cit desde el sitio de penetracin del espermo, causa la elevacin de [Ca2+]cit sostenida

Apoplasto Antoine y col., 2001

Divisin celular Elevacin de [Ca2+]cit Bush, 1995

Germinacin de semillas (giberelinas)

Elevacin lenta de [Ca2+]cit Bush, 1995; Anil y Sankara Rao, 2001

Apoptosis Elevacin lenta y sostenida de [Ca2+]cit

Levine y col., 1996

Luz roja Elevacin de [Ca2+]cit Apoplasto Shacklock y col., 1992; Malh y col., 1998

Luz azul Picos cortos de elevacin de [Ca2+]cit (segundos)

Apoplasto Malh y col., 1998; Baum y col., 1999

Ritmos circadianos Oscilaciones circadianas de [Ca2+]cit

Johnson y col., 1995; Wood y col., 2001

Cierre de clulas de guarda (ABA, esfingosina-1-fosfato)

1. Elevacin de [Ca2+]cit en la periferia celular 2. Elevacin de [Ca2+]cit alrededor de la vacuola 3. Oscilaciones de [Ca2+]cit

1. Apoplasto 2.Vacuola 3. Apoplasto e interno

McAinsh y col., 1992; Allen y col., 1999,2000; Blatt, 2000a,b; White, 2000; Anil y Sankara Rao, 2001; Evans y col., 2001; Ng y col., 2001a,b; Schroeder y col., 2001; Klsener y col., 2002

CO2 Elevacin de [Ca2+]cit en clulas de guarda

Apoplasto Webb y col., 1996

Incremento de Ca2+ en el apoplasto

Oscilaciones de [Ca2+]cit en clulas de guarda

Apoplasto McAinsh y col., 1995; Allen y col., 1999, 2000

Respuestas a auxinas 1. Elevacin lenta y prolongada de [Ca2+]cit 2. Oscilaciones de [Ca2+]cit

Felle, 1988; Malh y col., 1998; Ng y col., 2001b; Plieth, 2001; Plieth y Trewavas, 2002

Elevacin de K+ en el xilema

Elevacin de [Ca2+]cit De Boer, 1999

Exocitosis Elevacin de [Ca2+]cit Battey y col., 1999; Camacho y Malh, 2003

Elongacin de clulas de raz

Elevacin sostenida de [Ca2+]cit Apoplasto Cramer y Jones, 1996; Demidchik y col., 2002

Elongacin de pelos radiculares

Elevacin sostenida de [Ca2+]cit en el pex

Apoplasto Wymer y col., 1997; White, 1998; Bibikova y col., 1999

Inhibicin de la ciclsis citoplsmica

Elevacin de [Ca2+]cit Ayling y Clarkson, 1996

Nodulacin Elevacin inicial de [Ca2+]cit, con subsecuentes oscilaciones

Apoplasto Crdenas y col., 2000; Wais y col., 2000; Walker y col., 2000; Lhuissier y col., 2001; Shaw y Long, 2003

Senescencia Elevacin sostenida de [Ca2+]cit Huang y col., 1997

10

Radiacin UV Elevacin lenta de [Ca2+]cit, elevacin de [Ca2+]cit sostenida por minutos

Apoplasto Frohnmeyer y col., 1999

Estrs trmico Elevacin de [Ca2+]cit sostenida por 15-30 minutos

Apoplasto e interno (IP3-dependiente)

Gong y col., 1998; Malh y col., 1998

Estrs de fro 1. Picos unitarios de [Ca2+]cit 2. Oscilaciones de [Ca2+]cit

1. Apoplasto Knight y col., 1991; Malh y col., 1998; White, 1998; Plieth y col., 1999; van der Luit, 1999; Allen y col., 2000; Kiegle y col., 2000; Knight, 2000; Cessna y Low, 2001; Plieth, 2001

Enfriamiento gradual Bifsica 1. Picos cortos de elevacin de [Ca2+]cit (segundos) 2. Elevacin lenta de [Ca2+]cit

1. Apoplasto 2. Apoplasto e interno (IP3-dependiente)

Knight y col., 1996; Plieth y col., 1999; Knight, 2000; Knight y Knight, 2000; Moore y col., 2002

Estrs oxidativo (paraquat, superxidos, H2O2, ozono)

1. Picos cortos de elevacin de [Ca2+]cit 2. Elevacin sostenidade [Ca2+]cit 3. Oscilaciones de [Ca2+]cit

1. Apoplasto 2.Apoplasto e interno (IP3-dependiente)

Price y col., 1994; Levine y col., 1996; McAinsh y col., 1996; Knight y col., 1998; Malh y col., 1998; Clayton y col., 1999; Allen y col, 2000; Kawano y Muto, 2000; Knight, 2000; Klsener y col., 2002; Lecourieux y col., 2002

Anoxia Bifsica 1. Picos cortos (duracinminutos) 2. Elevacin sostenida de [Ca2+]cit (horas)

1. Apoplasto 2. Interno, incluyendo mitocondrias

Subbaiah y col., 1994, 1998; Sedbrook y col., 1996; Malh y col., 1998; Plieth, 2001

Sequa / Estrs hiperosmtico (mannitol)

Bifsica 1. Picos cortos (duracin de minutos) 2. Elevacin sostenida de [Ca2+]cit (horas)

Apoplasto y vacuola

Knight y col., 1997; Malh y col., 1998; Kiegle y col., 2000, Cessna y col., 2001; Pauly y col., 2001; Plieth, 2001

Estrs salino (NaCl) Bifsica Ondas de elevacin de [Ca2+]cit en tejidos 1. Picos cortos (de minutos de duracin) 2. Elevacin sostenida de [Ca2+]cit (horas) 3. Disminucin de [Ca2+]cit (das)

Apoplasto y vacuola (IP3-dependiente)

Knight y col., 1997; Kiegle y col., 2000; Knight, 2000; DeWald y col., 2001; Pauly y col., 2001; Moore y col., 2002; Halperine y col., 2003

Estrs hipoosmtico Bifsica 1. Pequea elevacin de [Ca2+]cit 2. Gran elevacin de [Ca2+]cit

1. Apoplasto 2. Apoplasto e interno

Takahashi y col., 1997; Malh y col., 1998; Knight y col., 2000; Cessna y Low, 2001; Cessna y col., 2001; Pauly y col., 2001; Plieth, 2001

Estimulacin mecnica (movimiento, roce, viento)

Picos unitarios de [Ca2+]cit (segundos) Onda de elevacin de [Ca2+]cit en tejidos

Interno Knight y col., 1991, 1992; Haley y col., 1995; Legu y col., 1997; Malh y col., 1998; van der Luit, 1999; Plieth, 2001 Fasano y col., 2002

Estrs de Al elevacin de [Ca2+]cit Zhang y Rengel, 1999

Patgenos (elicitors) Bifsica 1. Picos lentos de elevacin de [Ca2+]cit (duracin de minutos) 2. Elevacin sostenida de [Ca2+]cit (horas) 3. Oscilaciones de [Ca2+]cit (la magnitud relativa de las diferentes fases dependen del patgeno)

1. Apoplasto 2. Apoplasto e interno (IP3-dependiente)

Knight y col., 1991; Malh y col., 1998; Mithfer y col., 1999; Blume y col., 2000; Fellbrich y col., 2000; Grant y col., 2000; Cessna y Low, 2001; Cessna y col., 2001; Rudd y Franklin-Tong, 2001; Klsener y col., 2002; Lecourieux y col., 2002

11

localizacin subcelular y/o en su cintica o magnitud de la alteracin de [Ca2+]cit (Mcainsh y

Hetherington, 1998; Trewavas, 1999; Rudd y Franklin-Tong, 2001). Para la coordinacin de la

respuesta celular, son producidas ondas de [Ca2+]cit que involucran sucesivamente canales

dependientes de Ca2+. Varios mecanismos han sido propuestos para la generacin de estas ondas

(ver White y Broadley, 2003 para ms detalles y referencias): la generacin por la elevacin de

[Ca2+]cit de segundos mensajeros (IP3, cADPR) que a su vez activan canales de Ca2+ distantes; la

activacin de canales de Ca2+ mecanosensibles (por la penetracin del espermo durante la

fecundacin); influjo repetitivo a travs de la membrana plasmtica (en la respuesta de

autoincopatibilidad durante el crecimiento del tubo polinario); la activacin sucesiva de canales

de la membrana plasmtica activados por hiperpolarizacin y canales activados por ligandos en el

tonoplasto (en clulas de guarda tratadas con ABA).

Sin embargo, la elevacin de [Ca2+]cit no puede ser prolongada, ya que de otra forma causara

la muerte de la clula (la elevacin sostenida del Ca2+ citoslico se encuentra implicada en la

apoptosis, tanto durante el desarrollo normal, como en respuestas de hipersensibilidad; White y

Broadley, 2003) y, por lo tanto, debe ser transitoria o de pequea amplitud. Entre los patrones

que caracterizan la distribucin temporal de la alteracin de [Ca2+]cit se destacan los siguientes

(ver Tabla 1.): 1. evento transitorio elevacin de [Ca2+]cit inmediata y transitoria, con la

restauracin del nivel de Ca2+ de reposo en minutos (causada por estmulos mecnicos no dainos

y choque de fro cold shock); 2. respuesta bifsica elevacin inmediata y transitoria de

[Ca2+]cit seguida por una elevacin de [Ca2+]cit ms prolongada (minutos-horas; inducida por

choque trmico, estrs salino agudo, estrs hiperosmtico, anoxia, estrs oxidativo; aplicacin

prolongada de temperaturas menores a las umbrales; patgenos y elicitors); 3. oscilaciones

con variaciones en su duracin, periodicidad y amplitud, as como en su forma, en dependencia

de la intensidad y la combinacin de estmulos especficos; los modelos propuestos para su

generacin incluyen (i) el vaciado y rellenado sucesivo de depsitos de Ca2+ agotables, (ii) la

activacin / desactivacin sucesiva de canales de Ca2+ mediante cascadas de sealizacin

concurrentes, (iii) la distensin y relajacin de la membrana (White y Broadley, 2003). En cuanto

al origen espacial del Ca2+ este puede provenir tanto del exterior de la clula el apoplasto,

como de depsitos internos. En la Fig. 1 se representan el origen y la localizacin de seales de

calcio en respuesta a algunos estmulos especficos.

Luz / Oscuridad

Fro,Sequa

Polarizacin,Choque hipoosmtico

ABA,Seales polarizantes endgenas,

Choque osmtico,Fro,

Sequa

Vacuola1-3 mM Ca

2+

0.1-200 M Ca2+

RE

Cloroplasto

0.1-10 MCa

2+

Citoplas

ma

0.1-10M

C

a2+

Fig.1 Representacin esquemtica de las seales conocidas que inician la liberacinde calcio en la clula vegetaln (fuente: Sanders y col., 2002, modificado).

Las flechas sealan a los compartimirnetos celulares, donde es notada la liberacin de Ca , originadapor los estreses mencionados.

2+

13

1.2 Antecedentes

1.2.1 Canales vacuolares, permeables a Ca2+.

Actualmente existe un gran nmero de reportes de canales vacuolares permeables a Ca2+,

tanto dependientes de voltaje, como activados por ligandos. A continuacin son mencionados

algunos de ellos y sus caractersticas.

SV (Slow Vacuolar channels; Hedrich y col., 1986) es el canal permeable a calcio ms comn

de la membrana vacuolar, y, probablemente, como es discutido ms adelante es el nico canal

permeable a Ca2+ firmemente establecido en el tonoplasto. Este canal posee una severa

rectificacin saliente y modulacin por Ca2+ por ambos lados de la membrana vacuolar, y es

regulado por numerosos factores. Una descripcin ms detallada del canal SV es realizada en el

p.1.2.2.1.

VVCa (Vacuolar Voltage-gated Ca2+ channels; Johannes y col., 1992; Allen y Sanders, 1994b,

Johannes y Sanders, 1995) fueron reportados en vacuolas de la raz napiforme de Beta y en

clulas de guarda de Vicia faba y caracterizados como rectificadores-entrantes activos a

potenciales fisiolgicos y activados por Ca2+ vacuolar. La ausencia de corrientes generadas por

este canal en parches en la configuracin vacuola-completa (anlogo de whole-cell) y la

comparacin cuantitativa de la conductancia, selectividad y de los valores absolutos de la

modulacin por calcio y por voltaje, les permiti a Pottosin y Schnknecht (2007) concluir que

en los experimentos reportados se trataba del canal SV, registrado en parches invertidos (con una

orientacin opuesta a la asumida por los investigadores). Aparte, otra corriente de Ca2+ de

rectificadores-entrantes distinta a la del VVCa fue reportada en vacuolas de betabel (Gelli y

Blumwald, 1993), aunque, segn Pottosin y Muiz (2002), la existencia de canales permeables a

Ca2+, permanentemente abiertos a potenciales fisiolgicos es poco probable, ya que mediaran

una rpida liberacin de Ca2+ al citoplasma, que causara la muerte de la clula.

Canales permeables a Ca2+, activados por ligandos (IP3, cADPR) pudieran encontrarse en la

membrana vacuolar. Varios estudios sostienen esta suposicin:

14

Estudios en clulas completas: (i) tanto IP3, como cADPR causan el cierre de la estoma en las

clulas de guarda (Blatt y col., 1990; Leckie y col., 1998); (ii) el tratamiento con ABA induce,

por una parte el aumento del nivel de cADPR (Wu y col., 1998), por otra una onda de

Ca2+ en el citosol, que inicia la liberacin de calcio de depsitos intracelulares, inhibida por

rianodina (Grabov y Blatt, 1999); (iii) el bloqueo de la fosfolipasa C (PLC, enzima-productora

de IP3) elimina los efectos de ABA oscilaciones de [Ca2+]cit y el cierre de las clulas de

guarda (Staxen y col., 1999); (iv) choques hiperosmticos (NaCl, en raz de Arabidopsis)

producen IP3 y la simultnea movilizacin del Ca2+ intracelular (DeWald y col., 2001).

Estudios en preparaciones de membranas: (i) IP3 causa la liberacin de Ca2+ en vesculas de

membrana vacuolar (de avena Avena Shumaker y col., 1987; y Beta Allen y col., 1995).

Un estudio ms detallado (Muir y Sanders, 1997) en coliflor (Brassica) mostr la asociacin

de este efecto del IP3 principalmente con la fraccin de membrana plasmtica, y en menor

grado con la fraccin enriquecida de RE y la de membranas vacuolares; (ii) cADPR induce

la liberacin de Ca2+ en vesculas de RE (pero no en membranas plasmticas) de Brassica

(Navazio y col., 2001); (iii) al igual que IP3, cADPR induce la liberacin de Ca2+ en vesculas

de membrana vacuolar de Beta (Allen y col., 1995).

Aparte, se ha reportado la participacin de ligandos en la mediacin de respuestas a diversos

estmulos: IP3 media la respuesta a los estreses salino e hiperosmtico (Drobak y Watkins, 2000;

DeWald y col., 2001) y gravitropismo (Perera y col., 1999) y cADPR participa en la activacin

de genes de defensa (Durner y col., 1998) y en la transduccin de la seal generada por ABA

(Wu y col., 1997; McAinsh y Htherington, 1998). No obstante, a pesar de estos encuentros, los

canales-responsables de la liberacin de Ca2+ todava no han sido caracterizados.

Alexandre y col. (1990) reportaron la existencia de canales activados especficamente por IP3

en vacuolas de raz de betabel. Este fue el nico trabajo en clulas vegetales, en el que fueron

registrados canales unitarios activados por ligandos, no obstante, estos registros no pudieron ser

reproducidos posteriormente en varios trabajos (Chasan y Schroeder, 1992; Gelli y Blumwald,

1993). Allen y Sanders (1994a, 1995) mostraron la generacin de corrientes a travs de la

membrana vacuolar de Beta con la aplicacin de IP3 y cADPR. No obstante, en ambos casos la

corriente registrada constituy una pequea fraccin sobre la corriente de fuga no especfica y

probablemente es un artefacto causado por el intercambio de solucin. Adems, a diferencia de

los canales activados por ligandos de clulas animales, las corrientes generadas por IP3 y cADPR

15

en estos trabajos fueron independientes del nivel de Ca2+ citoslico hasta concentraciones

milimolares, en contraste con el reporte de Leckie y col (1998) de un Km de ~100 nM para la

inhibicin por Ca2+ citoslico de corrientes vacuolares originadas por cADPR en clulas de

guarda. No obstante, este valor de Km para calcio coincide con el Km de inhibicin del canal

vacuolar rpido (Fast Vacuolar channel FV), las corrientes del cual no fueron eliminadas en

este estudio. Otra de las evidencias en contra de los estudios realizados para la determinacin de

canales activados por ligandos en clulas vegetales es la alta concentracin de rojo de rutenio

100 M con la que fue inhibida la corriente inducida por cADPR (la concentracin utilizada es 100 veces mayor a la empleada para el bloqueo del receptor de ryanodina en las clulas

animales).

De esta manera, de todos los canales permeables a Ca2+ reportados, la existencia y la

permeabilidad a Ca2+ hasta el momento solamente han sido establecidas para el canal SV uno

de los objetos de estudio del presente trabajo.

1.2.2 SVel nico canal vacuolar permeable a Ca2+ establecido firmemente.

Los primeros estudios de los mecanismos de transporte a travs de la membrana vacuolar

fueron realizados utilizando como objetos experimentales hojas enteras de plantas y grandes

cantidades de vacuolas por lo que estos experimentos no permitan distinguir la aportacin de

transportadores individuales como canales inicos o bombas (Hedrich y col. 1986). Con el fin de

detallar estos mecanismos, en 1986 Hedrich y col. aplicaron la tcnica de patch-clamp a vacuolas

individuales aisladas del mesfilo de cebada en una configuracin analga a la whole-cell

conocida como whole-vacuole. Entre otros resultados, este trabajo revel la presencia en el

tonoplasto de un canal rectificador entrante ( del lado vacuolar) no selectivo que

posteriormente (Hedrich y Neher, 1987), debido a su lenta cintica de activacin, recibi el

nombre de canal vacuolar lento (SV del ingls slow vacuolar) y fue el primer canal de la

membrana vacuolar caracterizado.

La relativamente alta expresin del canal SV en la membrana vacuolar, as como la

modulacin de su actividad tanto por el calcio citoslico como vacuolar, hizo de este canal un

blanco muy atractivo para numerosos estudios de selectividad, permeabilidad, bloqueo-activacin

y, recientemente de participacin en la sealizacin por Ca2+; todos stos realizados en objetos

16

y condiciones inicas muy diferentes que dificultan enormemente el anlisis comparativo de los

datos obtenidos.

La adopcin de la convencin sobre mediciones electrofisiolgicas en endomembranas (Bertl

y col, 1992) sirvi como primer paso para la estandarizacin de la tcnica de obtencin de

registros, particularmente, de las corrientes vacuolares. Por esta convencin, el potencial Vm a

travs de las endomembranas es registrado respecto al potencial del citoplasma y calculado para

la vacuola como Vm = Vcytosol Vvacuola. En este caso, las corrientes positivas o salientes

representan el flujo de cationes fuera del citosol (entrantes a la vacuola). Siguiendo esta

convencin, el canal SV actualmente es caracterizado como canal-rectificador saliente.

1.2.2.1 Localizacin y Estructura del Canal SV Localizacin

Originalmente, la presencia del canal SV fue reportada en vacuolas de raz de betabel (Beta

vulgaris; Coyaud y col., 1987; Hedrich y Neher, 1987). En estudios posteriores fue demostrado

que el canal SV est ampliamente distribuido en reino vegetal y se encuentra presente en

diferentes tejidos de las plantas (Tabla.2). Canales de la misma familia, aparte, se encuentran

presentes en animales (Ishibashi y col., 2000 ver Peiter y col., 2005).

TABLA 2. Especies de plantas en las que ha sido mostrada la presencia del canal SV (fuente: elaboracin propia).

Especie Referencia Musgos y heptica Trebacz y Schnknecht., 2000 Posidonia oceanica Carpaneto y col., 1997

Allium cepa Amodeo y col., 1994 Eichhornia crassipes Paganetto y col., 2001

Triticum aestivum Wherret y col., 2005 Hordeum sp. Bethke y Jones, 1994; Pottosin y col., 1997

Oriza sativa Furuichi y col., 2001; Hashimoto y col., 2004; Kurusu y col., 2004 Chenopodium rubrum Reifarth y col., 1994

Plantago sp. Maathuis y Prins, 1990 Vicia faba Schulz-Lessdorf y Hedrich, 1995

Beta vulgaris Hedrich y Neher, 1987; Pottosin y col., 2004; 2005 Daucus carota Scholz-Starke y col., 2004

Lycopersicon sp. Pantoja y col., 1989 Raphanus sativus Gambale y col., 1993; Carpaneto, 2003

Arabidopsis thaliana Colombo y col., 1994; Peiter y col., 2005

17

En las plantas antofitas, el canal SV ha sido registrado ordinariamente en la membrana vacuolar

de distintos tejidos (Tabla 3.). No obstante, en trabajos recientes en arroz (Oriza sativa) se ha

apuntado que el TPC1 (TPC two-pore channel, que, segn Peiter y cols (2005) corresponde al TABLA 3. Localizacin del canal SV en tejidos de plantas superiores (fuente: elaboracin propia).

Tejido o tipo de clula Referencia Hojas Hedrich y col., 1986 Raz Gambale y col., 1993; Pottosin y Schnknecht, 2007

Mesfilo Pottosin y col., 1997

Clulas de guarda Ward y Schroeder, 1994; Schulz-Lessdorf y Hedrich, 1995 Clulas aleurnicas Bethke y Jones., 1994 Clulas cultivadas Colombo y col., 1988; Weiser y col., 1990

canal SV de la membrana vacuolar, se localiza en la membrana plasmtica celular (Furuichi y

col., 2001; Hashimoto y col., 2004; Kurusu y col., 2004) aunque no se presentan claras

evidencias de ello y, probablemente, esta conclusin es errnea.

En las vacuolas la expresin del canal SV es relativamente alta, alcanzando valores de varios

miles de copias por vacuola (Schulz-Lessdorf y Hedrich, 1995; Pottosin y col., 1997) que pueden

mediar una corriente de 100-1000 pApF-1.

Estructura

La estructura del canal SV fue revelada recientemente por Peiter y col. (2005) en

experimentos con plantas modificadas de Arabidopsis thaliana. Segn este trabajo, el canal SV

pertenece a la familia de canales de doble poro TPC ampliamente presentada en mono-,

dicotiledneas, gimnospermas, musgos, as como en animales (ver. Peiter y col., 2005). La

estructura del canal SV (TPC1, producto de la expresin del gen tpc1) comprende dos unidades

similares al canal Shaker, con 6 dominios transmembranales cada una y un sitio de unin en el

lado citoslico con dos motivos EF-hand (Fig.2) y varios sitios de fosforilacin. Interesante, que

la estructura presentada potencialmente explica la sensibilidad del canal SV al Ca2+ citoslico

(por la presencia de los motivos EF-hand) pero no incluye motivo conocido que explicara la

afinidad del SV al Ca2+ vacuolar.

Dobrovinskaya y colaboradores (1999b) en un estudio con bloqueadores permeables del canal

SV determinaron algunas de las caractersticas fsicas del poro del canal SV. ste, en su parte

ms angosta, tiene un dimetro mayor al del catin cuaternario permeable tetrametilamonio

(TMA+) de aproximadamente 5.5 , pero es menor que el catin impermeable tetraetilamonio

(TEA+) de aprox. 8 (Fig. 2). Adems, utilizando las propiedades estructurales de poliaminas

1 2 3 4 5+

+6 7 8 9 10 11 12

P P

EF EF

+

+

Vacuola

Citosol

Fig.2 Estructura del canal TPC1, correspondiente al SV, y representacin esquemtica(fuente: A. Peiter y col., 2005; B. elaboracin propia).

.A Es considerado que el canal TPC1, la estructura del cual fue revelada recientemente, corresponde al canalSV. El gen codifica una protena que presenta una estructura similar a dos unidades de Shakerfusionadas, con dos estructuras EF-hand en el lado citoslico, residuos bsicos en el cuarto dominio decada unidad (+) que, probablemente, constituyen el sensor de voltaje, y dominios formadores de poro entrelos quintos y sextos dominios transmembranales. B. Representacin esquemtica de la estructura del canalSV, mostrando caractersticas fsicas del poro del canal, obtenidas en experiementos con bloqueadorespermeables (Dobrovinskaya y cols., 1999b).

TPC1

vacuola

citosol

20

8

19

(bloqueadores permeables del canal SV; especficamente espermina (Spm4+), espermidina

(Spd3+) y putrescina (Put2+) y apoyndose en los registros con TMA+ y Tris+, en este estudio fue

determinada la asimetra de la localizacin de la mayor barrera elctrica (probablemente el

filtro de selectividad) dentro del tonoplasto a una distancia de 30% de el lado vacuolar (en

trminos de distancia elctrica). Utilizando la espermidina y putrescina (por su rigidez y cargas

uniformemente distribuidas a lo largo de las molculas que las permitieron utilizar como reglas)

fue calculado el largo fsico del poro del canal que constituye alrededor de 20 (Fig. 2). La

aproximacin del poro a un cilindro de 8 de dimetro y 20 de largo resulta (en condiciones

de 0.1 M K+ simtrico) en una conductancia mxima calculada de 206 pS, que concuerda bien

con el valor experimental de 208 8 pS registrado (Dobrovinskaya y col., 1999).

1.2.2.2 Caractersticas del canal SV Selectividad y Permeabilidad

Originalmente, el canal SV fue caracterizado como canal selectivo para cationes

monovalentes permeable al K+ y al Na+ (Coyaud y col., 1987; Colombo y col., 1988; Pantoja y

col., 1989; Maathuis y Prins, 1990; 1991), que, adems, pudiera presentar una notable

permeabilidad a aniones (Hedrich y col., 1986; Coyaud y col., 1987; Hedrich y Kurkdjian, 1988).

Sin embargo, sta ltima propuesta, deducida del anlisis de los potenciales de inversin en

gradientes de KCl, no fue sostenida por experimentos con sustitucin de Cl por aniones

impermeables (Colombo y col., 1988; Lado y col., 1989; Amodeo y col., 1994; Allen y col.,

1996) y experimentos donde se estableca un potencial de inversin para Cl diferente del

potencial de inversin para los otros iones (Ward y col., 1995). Finalmente, Pottosin y col. (2001)

mostraron que la permeabilidad a Cl del canal SV no sobrepasa el 1% de su permeabilidad al K+.

En trabajos posteriores fue mostrada la permeabilidad del SV para Ca2+, Ba2+ (Pantoja y col.,

1992; Ward y Schroeder, 1994; Schulz-Lessdorf y Hedrich, 1995) y Mg2+ (Pottosin et al., 2001).

Los diferentes valores de la permeabilidad relativa PCa : PK, obtenidos en estos trabajos, le

permitieron a Allen y col. (1996) sugerir que el canal SV posee un poro multiinico, para el cual

es caracterstico la dependencia anmala de fracciones molares (anomalous mole-fraction

dependence) el valor de la permeabilidad relativa disminuye con el aumento de la relacin de

concentraciones [K+] / [Ca2+]. La permeabilidad absoluta para los cationes divalentes es en un

orden de magnitud menor a la misma para los cationes monovalentes (Ward y Schroeder, 1994) y

20

los cationes divalentes en su moviemiento a travs del poro se comportan como bloqueadores

permeables (Pottosin y col., 2004).

Las filas de selectividad determinadas para los canales SV de diferentes especies de plantas,

son mostradas en la Tabla 4.

TABLA 4. Selectividad y permeabilidad del canal SV (fuente: elaboracin propia). Especie Fila Referencias

Allium cepa Selectividad: Na+ > K+ > Rb+ > Cs+ Amodeo y col., 1994 Beta vulgaris, Vicia faba Selectividad: Ba2+ > Ca2+ > Mg2+ Pottosin y col., 2001; 2000

Permeabilidad relativa a: K+ +4NH > Rb

+ > Cs+ >> TMA+ TEA+ Dauca carota

Conductancia : K+ > Rb+ > Cs+ > +4NH >> TMA

+ TEA+

Scholz-Starke y col., 2004

a. Determinado por los potenciales de inversin.

Conductancia

En diferentes objetos la conductancia del canal SV vara entre 26 y 280 pS en condiciones

de 100 mM KCl simtrico y potenciales entre 20 y 80 mV, con actividad media del canal

(Schulz-Lessdorf y Hedrich, 1995). La mayor conductancia en estas condiciones la presentan los

canales SV de las clulas de guarda 280 pS (Vicia faba, Schulz-Lessdorf y Hedrich, 1995) y

210 pS (Allium cepa, Amodeo y col., 1994). La conductancia mas baja corresponde al canal SV

de vacuolas de reserva de aleurona 26 pS (Bethke y Jones, 1994). La conductancia del canal

unitario SV depende principalmente de la concentracin de K+, con los parmetros de Km ~ 100

mM y Gmax ~ 280 pS determinados para vacuolas de betabel (Gambale y col., 1996; Pottosin et

al., 2001).

El incremento de la concentracin libre de cationes divalentes en el lado vacuolar afecta la

conductancia del canal SV. En presencia de 100 mM KCl y pH 7.5 simtricos y 2 mM Ca2+ del

lado citoplsmico, el aumento de calcio o magnesio vacuolar libre de nanomoles a 10 mM causa

la reduccin dependiente de voltaje de la corriente del canal unitario, siendo esta reduccin

mayor a potenciales ms negativos (Pottosin y col., 2004): a 200 mV la corriente relativa del

canal unitario para condiciones de 10 mM de Ca2+ o Mg2+ vacuolar, respectivamente, constituye

solamente el 21 y 28% de la corriente en control, mientras que a potenciales positivos (+200 mV)

no hay diferencia en las corrientes del control y con la aplicacin vacuolar de uno de los cationes

divalentes; a 0 mV (potenciales fisiolgicos) la corriente relativa representa el 35 o 50% (Ca2+,

Mg2+, respectivamente) de la corriente en el control. Los potenciales negativos (citoslicos)

21

favorecen la aproximacin de Ca2+ y Mg2+ al sitio de unin dentro del poro. A la vez, estos

ltimos impiden el flujo libre de cationes monovalentes. Bloqueadores

En la Tabla 5. se muestran algunos de los bloqueadores del canal SV, con las respectivas

caractersticas del bloqueo. Interesantemente, el canal SV es bloqueado por concentraciones

submicromolares de rojo de rutenio agente qumico empleado como bloqueador del receptor

de ryanodina (RR) e inhibidor de la liberacin de calcio inducida por calcio en clulas animales,

lo que pudiera sugerir cierta similitud de los papeles que juegan el RR y el SV en los respectivos

organismos.

TABLA 5. Bloqueadores y caractersticas del bloqueo del canal SV (fuente: elaboracin

propia). Bloqueadores Caractersticas del bloqueo Referencias

Fisiolgicos Ca2+, Mg2+ vacuolar y

citoslico Dependiente de voltaje, Kd ~ 1-3 mM (Beta)

Ca2+ citoslico causa la rectificacin saliente de la corriente Pottosin y col., 2000

Poliaminas citoslicas Dependiente de voltaje, Spm4+ > Spd3+ > Put2+ Kd: 30; 400;

2,500 M (Beta) Dobrovinskaya y col., 1999a, b Zn2+ Kd = 5 M Hedrich y Kurkdjian, 1988

No fisiolgicos DIDS, SITS Kd = 1 M Hedrich y Kurkdjian, 1988

A-9-C Kd = 25 M Charibdotoxina Kd = 20 nM Tubocurarina Kd = 60 M Quinacrina Kd = 15 M

Weiser y col., 1990, 1991a, 1993

Rojo de rutenio

22

TABLA 6. Factores moduladores de la actividad del canal SV (fuente: elaboracin propia). Factor Modulacin Referencias

Voltaje

El SV es activado por voltaje positivo. Los potenciales de punto medio se encuentran en funcin del Ca2+ y Mg2+ citoslicos y del Ca2+ vacuolar. El SV es modulado por el potencial de superficie. El apantallamiento inespecfico del potencial de superficie por el cambio de 10 a 100 mM K+ reduce por 81 mV el desplazamiento total del umbral tcnico V1%, causado por el cambio de 0 a 0.5 mM Ca2+vac.

Pottosin y col., 2004 Carpaneto y col, 1997 (determinacin de dependencia de voltaje en ausencia de cationes divalentes) Pottosin y col., 2005

Cationes divalentes Ca2+, Mg2+

El alto Ca2+ citoslico es necesario para la activacin del canal (Kd ~100 M a +100mV; Beta, Hordeum, Vicia). El aumento de la concentracin de Ca2+ vacuolar disminuye la probabilidad de apertura del canal. Aplicado en el lado citoslico, el Mg2+ refuerza el efecto del Ca2+ citoslico (sensibilizacin del SV al Ca2+). En presencia en el lado vacuolar, el Mg2+ tiene un efecto ms modesto.

Pottosin y col., 2000; Pottosin y col., 1997; Pei y col., 1999. Pottosin y col., 2000; Pottosin y col., 1997; Pei y col., 2001

Calmodulina No tiene efecto sobre la corriente del canal unitario, pero aumenta la probabilidad de apertura del canal SV. Inhibidores de calmodulina (W-7, TFP, R 24571) disminuyen la probabilidad de apertura del canal. Este efecto es reversible con la agregacin de calmodulina de plantas

Schulz-Lessdorf y Hedrich, 1995; Allen y Sanders., 1995; Bethke y Jones, 1994; Weiser y col., 1991b

pH

Regulacin negativa por protones en los lados citoslico y vacuolar, pK=6.9 y 5.0 (Beta). Regulacin insignificante por pH vacuolar en presencia de Ca2+ vacuolar > 50 M (Hordeum) En Dauca carota, el canal SV presenta la mayor conductancia en condiciones de pH citoslico neutro (pH 7.0), disminuyendo con la acidificacin o alcalinizacin del medio. El pH ptimo se encuentra en dependencia de la presencia de agentes oxidantes-reductores (es recorrido a valores ms bsicos con el aumento de la concentracin de agentes reductores)

Schulz-Lessdorf y Hedrich, 1995 Pottosin y col., 1997 Scholz-Starke y col., 2004

Agentes oxidantes-reductores

Los agentes reductores DTT, GSH (1 mM; pH neutro), cido ascrbico incrementan la probabilidad de apertura del canal SV. Cloramina-T (agente oxidante) causa la inhibicin irreversible del canal.

Scholz-Starke y col., 2004; 2005; Carpaneto y col., 1999

Fosforilacin

Activacin por la fosfatasa calcineurina (0.4 unidades/ml). El aumento de la concentracin de calcineurina causa la disminucin de las corrientes registradas. Se proponen dos sitios de fosforilacin del canal SV, con distintos efectos: +, sensible al cido okadaico inhibidor de fosfatasas, y , sensible a H-7 inhibidor de kinasas

Allen y Sanders, 1995 Bethke y Jones, 1997

Protenas 14-3-3 La 14-3-3B (100 nM) reduce la corriente acarreada por el SV en un 80% (1/2 = 5s). La dependencia de voltaje no es afectada. Van den Wijngaard y col., 2001

Metales pesados Ni2+ citoslico (Km = 99 M, Eichornia crassipes; Km = 25 M, Beta vulgaris) disminuye la corriente del canal SV y afecta moderadamente la corriente del canal unitario, unindose a un sitio diferente al del Ca2+.

Paganetto y col., 2001; Carpaneto, 2003;

Al3+ 1.4 M Al3+ vacuolar causa la reduccin en un orden de magnitud la probabilidad de apertura por desplazamiento de la dependencia de voltaje.

Wherret y col., 2005

Neomicina neomicina en el citosol causa los siguientes efectos: a) (10-200 M) aumenta el tiempo de activacin (modestamente) y desactivacin (>100 veces) del canal, b) >10 M causa el desplazamiento de la dependencia de voltaje a potenciales ms negativos, sin afectar la carga de compuerta.

Scholz-Starke y col., 2006

Na+ (especficamente)

Aumento de Na+ vacuolar causa el desplazamiento de la dependencia de voltaje a potenciales ms positivos (en el cambio de 150 mM K+ a 150 mM Na+, 0 Ca2+, el desplazamiento total es por ~80 mV).

Ivashikina y Hedrich., 2005

23

actividad del canal son el resultado de la accin directa sobre l, o sobre protenas-reguladoras

adicionales, cooexpresadas junto con en el canal SV en la membrana vacuolar.

La regulacin del canal SV es efectuada por los lados tanto vacuolar como citoslico y puede

consistir igualmente en la disminucin de la probabilidad de apertura del canal, como en su

aumento (Tabla 6.). Entre todos los agentes que regulan la actividad del canal SV, los cationes

monovalentes (K+, Na+) y los divalentes (especialmente Ca2+, Mg2+), son, probablemente, los

factores conocidos ms importantes que modulan la actividad del canal SV en condiciones

fisiolgicas.

K+ y Na+, a pesar de ser cationes monovalentes, regulan al canal SV de maneras diferentes. La

modulacin causada por K+ (Tabla 6.) es de carcter inespecfico y es efectuada a travs del

cambio del potencial de superficie del tonoplasto, que se encuentra en funcin de la fuerza inica

del contenido vacuolar. La sustitucin de K+ en este caso por una concentracin equivalente de

otros cationes orgnicos impermeables devuelve el mismo resultado la disminucin de la

sensibilidad al voltaje aplicado con el aumento de la fuerza inica de la solucin vacuolar

(Pottosin y col., 2005). El efecto de Na+ vacuolar, en contraste, al parecer es de carcter

especfico, ya que no es reproducido por el reemplazamiento de un concentracin equivalente de

K+ (Tabla 6., Ivashikina y Hedrich., 2005), y puede, segn los autores, jugar un papel importante

en el mantenimiento de la homeostasis inica durante el estrs salino.

Los efectos de Ca2+ y Mg2+ en ambos lados del tonoplasto sobre la actividad del canal SV son

similares (Tabla 6.), aunque el SV presenta una afinidad superior al Ca2+ que al Mg2+: para

evocar los efectos del primero es necesario aplicar una concentracin mucho mayor (en rdenes

de magnitud) de Mg2+. El aumento de la concentracin libre de Ca2+ o Mg2+ en el lado citoslico

causa el desplazamiento de la curva de activacin del canal SV a potenciales ms negativos. El

canal SV es activado ya por concentraciones micromolares de Ca2+ citoslico (Bethke y Jones,

1994; Reifarth y col., 1994; Schulz-Lessdorf y Hedrich., 1995; Allen y col., 1996), aunque los

valores del desplazamiento de la dependencia de voltaje difieren en los trabajos mencionados,

principalmente por la presencia de Mg2+ en las soluciones de trabajo. Para originar una activacin

similar a la causada por micromoles de Ca2+, son necesarias concentraciones milimolares de Mg2+

(Pei y col., 1999; Carpaneto y col., 2001), aunque en Hordeum el canal SV no era activado ni en

la aplicacin de 50 mM Mg2+ citoslico + EGTA agente quelante de Ca2+ (Pottosin y col.,

1997). No obstante, el Mg2+ citoslico fue propuesto como sensibilizador del canal SV al Ca2+

que pudiera jugar cierto papel en la regulacin del canal SV durante la elevacin fisiolgica del

24

Ca2+ citoplsmico (Pei y col., 1999; Carpaneto y col., 2001) mediante la sensibilizacin del canal

SV a las bajas concentraciones de Ca2+ presentes en el citoplasma.

A diferencia de sus efectos en el lado citoslico, el aumento de la concentraciones de

Ca2+/Mg2+ en el lado vacuolar disminuye la probabilidad de apertura del canal SV mediante el

desplazamiento de la dependencia de voltaje a potenciales ms positivos (Pottosin y col., 1997;

Ward y Schroeder, 1994; Pei y col., 1999; Pottosin y col., 2004). En un estudio detallado de la

modulacin del SV por cationes divalentes, Pottosin y col. (2004) determinaron que la

dependencia de voltaje de la probabilidad de apertura del canal en funcin del Ca2+ vacuolar

aplicado es bifsica y no se describe con la simple ecuacin de Boltzmann. A potenciales ms

negativos la dependencia de voltaje es muy abrupta, pero esta funcin disminuye drsticamente

su pendiente a potenciales ms positivos. Por esta razn, segn los autores, el esquema cintico

mnimo que describe la transicin del canal SV entre los estados cerrado y abierto debe contener

3 estados:

C2 C1 O. Cada uno de los procesos de transicin C2C1 y C1O es descrito por la ecuacin de

Boltzmann y es caracterizado por sus potenciales de punto medio (midpoint potentials, V2 y V1),

en los cuales la ocupacin de los respectivos estados se encuentra en equilibrio, y por sus cargas

de compuerta (gating charges; z2 y z1), que definen la pendiente de la transicin dependiente de

voltaje entre los respectivos estados. La probabilidad de apertura del canal, de esta forma, es

determinada con la ecuacin

1 1 2 2

1

1 exp(- ( - ) ) (1 exp(- ( - ) ))Po

F Fz V V z V VRT RT

=+ +

,

parte del modelo matemtico, elaborado por Pottosin y col. (2004) que describe las transiciones

del canal y permite describir de una manera muy exacta la dependencia de voltaje de la

probabilidad de apertura del canal en presencia de diferentes niveles de calcio vacuolar. En

concordancia con el modelo, la transicin al estado abierto del canal (C1O) es la menos dependiente de voltaje (z1 = 0.7), mientras que la precedente (C2C1) es caracterizada por una mayor dependencia de voltaje (z2 = 2.9). Aparte, fue determinado, que ambos equilibrios V1

(C1O) y V2 (C2C1) son afectados por el incremento de la concentracin de calcio vacuolar, aunque de distinta manera: en condiciones de bajo calcio vacuolar V2 es menor que V1 y

25

predomina la transicin C1O. El aumento del calcio vacuolar causa el desplazamiento del equilibrio hacia el estado C1 y el umbral de activacin del canal se recorre a potenciales ms

positivos. Un aumento mayor de la concentracin del calcio vacuolar trae como consecuencia el

desplazamiento del equilibrio hacia el estado C2 de la transicin C2C1. En otras palabras, el incremento del calcio vacuolar suprime efectivamente la actividad del canal: un aumento del

calcio vacuolar de 0 a 10 mM causa el desplazamiento de la probabilidad de apertura del canal a

potenciales ms positivos (a nivel 1% de canales abiertos desde 80 a +70 mV). A potenciales

fisiolgicos (alrededor de 0 mV) en presencia de 2 mM de Ca2+ simtricos la probabilidad de

apertura del canal SV es menos de 0.01% o menos de un canal por vacuola, incluso en

condiciones que favorecen la activacin del canal (2 mM Ca2+ citoplsmico) (Pottosin y col.,

2004). La modulacin causada por Mg2+ vacuolar es similar a la originada por Ca2+, aunque su

efecto es ms modesto: un incremento del Mg2+ vacuolar de 0 a 10 mM causa el desplazamiento

de la dependencia de voltaje de solo unos 70 mV (desde 80 hasta 10 mV) a 1% de canales

abiertos.

El modelo propuesto por Pottosin y col. (2004) indica la existencia de una unin cooperativa

de varios cationes divalentes para la regulacin de la apertura del canal SV, especifica la etapa

limitante (C1O) de la activacin del canal y predice correctamente la dependencia de los tiempos medios de activacin y desactivacin del canal en funcin de la concentracin vacuolar

de los cationes divalentes. No obstante, este modelo describe la regulacin de la compuerta

(gating) del canal SV en condiciones lejanas de las fisiolgicas pH vacuolar neutro

(probablemente, presentado solo en vacuolas aleurnicas de almacenamiento, pero no en

vacuolas lticas, utilizadas en los experimentos de ese trabajo) y alto Ca2+ citoslico (2 mM),

empleado para activar las corrientes del canal SV. Por lo tanto, no es posible estimar la

probabilidad de apertura del canal en condiciones fisiolgicas y determinar si la elevacin del

calcio citoslico es suficiente para la activacin del canal SV.

Posibilidad de la participacin del canal SV en la Liberacin de Calcio Inducida por Calcio, LCIC (Calcium-Induced Calcium Release, CICR).

La permeabilidad del canal SV al calcio, as como su activacin por el incremento del calcio

citoslico, permiti a Ward y Schroeder (1994) proponer la participacin del canal en la

liberacin de calcio inducida por calcio (LCIC; de calcium-induced calcium release) en la

regulacin del cierre de las clulas de guarda y en las clulas vegetales en general. Esta propuesta

26

rpidamente recibi amplia aceptacin sin revisin previa (Allen y col., 1996; Barkla y Pantoja,

1996; Ward y col., 1995). Segn Ward y Schroeder (1994) la liberacin de calcio, mediada por el

canal SV, requiere un incremento inicial del calcio citoslico, inducido por un estmulo (por

ejemplo, por la fitohormona ABA). La subsecuente activacin de canales de potasio dependientes

de Ca2+ (VK) pudiera causar un desplazamiento del potencial a travs de la membrana vacuolar a

valores ms positivos. Finalmente, el aumento del calcio citoslico y el potencial positivo de la

membrana puede causar la apertura de los canales SV, permeables a calcio, dando paso, de esta

forma, a la liberacin de calcio de la vacuola (Ward y col., 1995; 1994).

Pottosin y col. (1997) argumentaron que en condiciones fisiolgicas, caracterizadas por un

nivel bajo de calcio citoslico y alto dentro de la vacuola, as como por potenciales negativos

a travs de la membrana vacuolar, la probabilidad de apertura del canal SV es muy baja. Para

aumentar la probabilidad de la apertura del SV en presencia del alto calcio vacuolar, como fue

mencionado ms arriba, se requiere Ca2+ citoslico en el rango de micromoles, as como

potenciales positivos de varias decenas de milivoltios. Sin embargo, estas condiciones reducen la

fuerza motriz de la liberacin del calcio de las vacuolas de mesfilo de cebada (Pottosin y col.,

1997). Aplicando concentraciones de calcio en el rango 13-2000 M en el lado citoplsmico en presencia de 50 M o 2 mM en el lado vacuolar, este grupo de colaboradores determin que la probabilidad de la apertura del canal depende en un mayor grado del gradiente de calcio aplicado

a travs de la membrana vacuolar, que de la concentracin del calcio citoslico sola. En

condiciones de nula fuerza motiva neta para calcio (Ca = V ECa = 0), la probabilidad de apertura del canal SV es de 0.35% o, aproximadamente, 10 canales abiertos por una vacuola

tpica de 20 m de dimetro. Para las condiciones que favorecen la liberacin de calcio de la vacuola (Ca < 0) esta probabilidad es menor todava asumiendo una actividad de calcio vacuolar 1000 veces mayor que en el citoplasma (ECa = +87 mV) y un pequeo potencial de

membrana, estos autores calcularon una actividad promedia mucho menor de 1 canal abierto por

vacuola (Po = 0.0025%), y solo en condiciones que favorecen la acumulacin de calcio dentro de

la vacuola esta probabilidad de apertura aumentaba considerablemente (Pottosin y col., 1997).

Esta observacin les permiti a los autores sealar la dificultad de la participacin del canal SV

en la liberacin de calcio inducida por calcio.

Este resultado, a su vez, fue criticado por Bewell y col. (1999), argumentando que en

presencia de milimoles de Mg2+ citoslico, como sensibilizador, el umbral de activacin del

canal SV puede recorrerse a potenciales ms negativos obtenindose as las condiciones para la

27

liberacin de calcio a potenciales fisiolgicos. Este mecanismo fue respaldado por Carpaneto y

col. (2001). En condiciones de 10 mM de Mg2+y nanomoles de Ca2+ en el citoplasma, y 2 mM y 1

mM, respectivamente, de Mg2+ y Ca2+ vacuolar condiciones que favorecen la salida de calcio

de las vacuolas, fue obtenida la actividad del canal SV, aunque solamente a partir de +100

mV. El aumento del calcio citoslico recorre el umbral de activacin del canal y el potencial de

reversin de calcio ECa a potenciales ms negativos. Pero a 100 M de calcio citoslico el potencial de reversin ECa es ms negativo que el potencial del umbral de activacin del canal SV

y en estas condiciones el calcio a travs de los canales SV puede fluir solamente desde el citosol

adentro de la vacuola. Adicionalmente, estos autores remarcan que la concentracin citoplsmica

utilizada (10 mM), puede corresponder solamente al Mg total en las clulas vegetales y es lejana

de la concentracin libre de magnesio citoslico, aunque ya su cambio en el rango fisiolgico

(0.1-1 mM; Bruggemann y col., 1999) puede causar el desplazamiento del potencial de

membrana unos 20 mV hacia potenciales ms negativos. No obstante, el umbral de activacin del

canal SV sigue situado considerablemente lejos del potencial vacuolar en condiciones

fisiolgicas. Por esta razn, la presencia de activadores adicionales es requerida para la liberacin

de calcio (Carpaneto y col., 2001).

Trabajos ms recientes se han centrado en la bsqueda de agentes que pudieran actuar como

activadores adicionales del canal SV y que le permitieran participar en la liberacin de Ca2+

inducida por Ca2+. Como tales posibles factores fueron determinados los agentes reductores

particularmente DTT, la forma reducida de glutationa (GSH) y el cido ascrbico (Tabla 6.;

Carpaneto y col., 1999; Scholz-Starke y col., 2004; 2005) y recientemente el antibitico

neomicina. Este ltimo agente mostr la mayor potencia de modulacin positiva del canal SV,

desplazando el umbral de activacin a potenciales negativos (Scholz-Starke y col., 2006). No

obstante, probablemente estos resultados muestran ms que nada la posibilidad de una activacin

adicional del canal SV en condiciones fisiolgicas por algn agente, no precisamente neomicina,

que pueda determinar la especificad de la liberacin de Ca2+ desde la vacuola como respuesta a

diferentes estmulos (ver. Tabla. 1).

1.2.2.3 Funcin del Canal SV

Actualmente, la funcin del canal SV en las clulas vegetales no est determinada. Por una

parte, su amplia distribucin en el reino vegetal y el alto nmero de canales expresados en una

vacuola llevan a considerar como muy importante el papel que puede jugar este canal. Por otra

28

parte, lneas de Arabidopsis con knock-out por el gen tpc (tpc1-2 SALK_125658, tpc1-1

SALK_145413) no presentan genotipos letales e incluso, aparentemente, las plantas modificadas

llegan a reproducirse (Peiter y col., 2005). Sin embargo, es necesario sealar que las condiciones

experimentales, utilizadas en este trabajo (agua desionizada, 10 mM MES-KOH, pH 6.0 como

substrato), son lejanas de las que se presentan en cualquier suelo; adems, de el artculo no se

entiende si las semillas transgnicas examinadas fueron obtenidas de plantas cultivadas en ese

medio o con suministro de una composicin inica mas compleja. Por esto, existe la posibilidad

que no se hayan cumplido las condiciones necesarias para revelar la funcin del canal SV a travs

de disfunciones a nivel de organismo.

Ward y Schroeder (1994) propusieron la participacin del canal SV en procesos vinculados

con la liberacin de calcio inducida por calcio (ver p.1.2.2.2), basndose principalmente en la

permeabilidad del SV al Ca2+, as como por su activacin por el Ca2+ citoplsmico, mostrada ya

en 1987 en el trabajo de Hedrich y Neher. Esta propuesta fue argumentada por el encuentro que

en clulas de guarda la actividad del canal SV aumenta con la alcalinizacin del medio de

cualquier lado de la membrana vacuolar (Shulz-Lessdorf y col., 1995) efecto inducido en

condiciones fisiolgicas en el lado citoslico por la fitohormona ABA durante el cierre de las

clulas de guarda (Irving y col., 1992; Blatt y Armstrong, 1993). De este modo, la actividad del

canal SV refleja la direccin de los cambios de Ca2+ y pH citoslicos que acompaan el cierre de

las clulas de guarda2 . No obstante, en experimentos con vacuolas de mesfilo de cebada

(Hordeum) y en base del estudio de Shulz-Lessdorf y Hedrich (1995) en clulas de guarda de

Vicia faba, Pottosin y col. (1997) descartaron la posibilidad de la participacin del canal SV en la

sealizacin de calcio mediante la liberacin de calcio inducida por calcio.

1.2.3 Canales permeables a Ca2+ del retculo endoplsmico

Actualmente existen reportes de solamente dos canales permeables a calcio en el retculo

endoplsmico de las clulas vegetales: el primero fue descubierto en los rganos

mecanoreceptivos de Bryonia dioica (BCC1, de Bryonia Calcium Channel; Klsener y col.,

1995; 1997) y el segundo fue reportado en el retculo endoplsmico del pex de raz de lechuga

2 Allen G.J., Sanders D. Vacuolar Ion Channels in Higher Plants. En: Roger A. Leigh, Dale Sanders (Eds.) The Plant Vacuole. Advances in Botanical Research incorporating Advances in Plant Pathology. V. 25. Acdemic Press, 1997, p. 227.

29

Lepidium sativum (LCC1, de Lepidium Calcium Channel; Klsener y col., 1999), estudiados

ambos con la tcnica de bicapas lipdicas.

El canal BCC1 presenta actividad en rfagas y posee al menos dos estados abiertos (Klsener

y col., 1995; 1997), mientras que el LCC1 tiene solamente un estado abierto, caracterizado por su

tiempo medio de 2.8 ms (Klsener y col., 1999). En la Tabla.7 se hace una comparacin de estos

dos canales reportados.

Aunque los estudios presentes fueron realizados en bicapas lipdicas y la orientacin absoluta

de los canales no se puede determinar, las caractersticas registradas permiten solo una

orientacin compatible con las condiciones fisiolgicas, esta es permitiendo la salida de Ca2+

del RE al citoplasma (Klsener y col., 1995, 1997, 1999). El canal BCC1 fue propuesto para la

participacin en la transduccin de las seales en los rganos mecanoreceptivos de Bryonia,

TABLA 7. Caracterstica de los canales catinicos del RE reportados en plantas superiores

Parmetro BCC1 (Klsener y col., 1995; 1997) LCC1 (Klsener y col., 1999)

Conductancia

Es funcin del gradiente de Ca2+ aplicado (Km = 8.8 mM):

50/50 mM Ca2+ 29 pS 50/5.0 mM Ca2+ 23.6 pS 50/0.5 mM Ca2+ 14.4 pS

Ca2+ Gmax(100 mM) = 27.9 pS (Km = 7.3 mM)

Selectividad Ba2+ Ca2+ > Sr2+ > Mg2+ > X+

PCa:PK = 6.6 Ca2+ > Ba2+ > Sr2+

PCa:PK = 9.4

Bloqueadores Gd3+ EC50 1.1 M Cu2+ EC50 1.2 M Zn2+ EC50 3.4 M La3+ EC50 9.0 M Cd2+ EC50 100 M

(obstruyen la entrada del poro del canal)

Eritrosina-B EC50 1 M

Verapamila (10-30 M) causa 2 efectos: i) reduce tiempo de apertura dentro de rafagas de actividad ii) aumento de intervalos entre paquetes

NO causan efecto: Ryanodina (70 M), thapsigargina (inhibidor de Ca-ATPasas, 20 M), trifluoperazina (antagonista de CM, 40

M)

Cu2+ EC50 5 M La3+ EC50 5 M

Gd3+ EC50 10 M

Eritrosina-B EC50 1.8 M

NO tiene efecto:Verapamila (10-100 M)

30

Regulacin

Voltaje

pH

Otros

Activacin por potenciales positivos. Los potenciales de punto medio son funcin del gradiente de Ca2+ aplicado:

V1/2 50/50 mM Ca2+ +46.2 mV V1/2 50/5.0 mM Ca2+ +15.7 mV V1/2 50/0.5 mM Ca2+ 16.6 mV

La elevacin citoplsmica del pH disminuye la conductancia del canal (de 29 a 16 pS en el rango pH 7.0 - 7.75) NO tienen efecto: IP3 (10 M), ADP o ATP (2 mM) H2O2 citoslico (0.1-1 mM) inhibe la actividad del canal (a 1 mM completamente)

Activacin por potenciales positivos.Con el aumento del potencial disminuye el tiempo medio del estado cerrado. El tiempo medio del estado abierto no es afectado.

formando junto con la Ca2+-ATPasa del RE un oscilador de Ca2+ que permite la identificacin

espacio-temporal del estmulo (Klsener y col., 1995).

Por otra parte, la inhibicin del canal LCC1 (as como el BCC1) por el inhibidor de Ca2+-

ATPasa eritrosina-B en bajas concentraciones pudiera ser indicacin de que estos canales pueden

aparecer como resultado del desacoplamiento de la Ca2+-ATPasa, cuyos dominios

transmembranales, como se ha mostrado en el caso de protenas de retculo sarcoplsmico,

pueden actuar como canales permeables a Ca2+ (de Meis y col., 1996). Este desacople, segn

Klsener y col. (1999), puede fcilmente ocurrir durante el procedimiento de extraccin de la

membrana, por lo que estudios ms minuciosos son requeridos.

Aparte, en varios estudios fue reportada la liberacin de Ca2+ de vesculas de RE, causada por

ligandos cADPR, NAADP (Navazio y col., 2000; 2001). Martinec y col (2000) reportaron en

este compartimiento la presencia de sitios de unin a IP3. Sin embargo, en ninguno de estos

trabajos fueron determinados o caracterizados los canales sensibles a ligandos responsables de la

liberacin de calcio.

En la Fig.3 son resumidos los mecanismos de transporte y liberacin de Ca2+ conocidos hasta

hoy en las membranas intracelulares, especficamente del tonoplasto y el retculo

endoplsmico, de las clulas vegetales.

Ca2+

ATP

ADP+Pi

ADP+Pi

H+

PPi

ATPADP+Pi

H+

Ca2+

Ca2+

Vacuola

1-3 mM

0.1-200 M Ca2+

RE

Citoplasma 0.1-20 M Ca2+

H -ATPasa+

H -PPasa+

CAX

SVACA

pH 4..6.5

ACAECA

ATP

ADP+PiBCC1LCC1

Fig.3 Rutas conocidas de transporte de Ca en los mayores depsitos de Caen las clulas vegetales (fuente: elaboracin propia)

2+ 2+

ATPasas

Transportadores

Canales

: ACA - ATPasas con mecanismo de autoihibicin y regulacin por calmodulina, ECA - ATPasas

tipo RE; H -ATPasa, H -PPasa - respectivamente, bomba de protones y pirofosfatasa vacuolares que

generan el gradiente de H , necesario para el funcionamiento de los CAX.

: CAX - intercambiadores H /Ca .: SV - canal vacuolar lento, el nico establecido firmemente hasta el momento en la membrana

vacuolar con permeabilidad al Ca ; BCC1, LCC1 - canales determinados en vesculas del retculoendoplsmico.

+ +

+

+ 2+

2+

32

2. Objetivos del proyecto

2.1 Hiptesis

La actividad del Ca2+ en vacuolas vegetales vara. En el rango micromoles-1 mM es posible

realizar el monitoreo de la actividad de Ca2+ en la vacuola