Tesis Isabel Fortes

Isabel Mara Fortes Cuenca

Huspedes alternativos de tomato chlorosis virus: epidemiologa,

patologa y diversidad gentica en pimiento, presencia en patata y desarrollo

de un sistema gentico en Nicotiana benthamiana

Mlaga, 2010Tesis doctoral

Facultad de Ciencias Departamento de Biologa Celular, Gentica y Fisiologa

Huspedes alternativos de tomato chlorosis virus: epidemiologa, patologa y diversidad gentica en pimiento, presencia en patata y desarrollo de un

sistema gentico en Nicotiana benthamiana

Memoria de Tesis Doctoral presentada por Isabel Mara Fortes Cuenca

para optar al grado de

Doctora en Biologa

Director Jess Navas Castillo

Instituto de Hortofruticultura Subtropical y Mediterrnea La Mayora IHSM-UMA-CSIC

Mlaga, 2010

Don Jess Navas Castillo, Doctor en Ciencias Biolgicas, Investigador Cientfico del Consejo Superior de Investigaciones Cientficas y Profesor Asociado del Departamento de Biologa Celular, Gentica y Fisiologa de la Universidad de Mlaga, INFORMA que la Licenciada Isabel Mara Fortes Cuenca ha realizado bajo su direccin en el Laboratorio de Virologa de la Estacin Experimental La Mayora, integrada actualmente en el Instituto de Hortofruticultura Subtropical y Mediterrnea La Mayora (IHSM-UMA-CSIC) el trabajo que con el ttulo Huspedes alternativos de tomato chlorosis virus: epidemiologa, patologa y diversidad gentica en pimiento, presencia en patata y desarrollo de un sistema gentico en Nicotiana benthamiana se presenta en esta memoria y que constituye su Tesis Doctoral para aspirar al grado de Doctora en Biologa.

Y para que as conste y tenga los efectos que correspondan en cumplimiento de la legislacin vigente, firma el presente informe en Algarrobo-Costa (Mlaga), junio de 2010.

Fdo. Dr. Jess Navas Castillo

D. Jos Becerra Ratia, Director del Departamento de Biologa Celular, Gentica y Fisiologa de la Universidad de Mlaga,

Autoriza la presentacin de la Tesis Doctoral titulada Huspedes alternativos de tomato chlorosis virus: epidemiologa, patologa y diversidad gentica en pimiento, presencia en patata y desarrollo de un sistema gentico en Nicotiana benthamiana, realizada por la Licenciada Isabel Mara Fortes Cuenca para optar al Ttulo de Doctora en Biologa.

Mlaga, junio de 2010

Fdo. Jos Becerra Ratia

Este trabajo se ha llevado a cabo en el Laboratorio de Virologa de la Estacin Experimental La Mayora, integrada actualmente en el Instituto de Hortofruticultura Subtropical y Mediterrnea La Mayora (IHSM-UMA-CSIC), gracias a una beca predoctoral de Formacin de Personal Investigador del Ministerio de Educacin y Ciencia y ha sido financiado por los proyectos de los Planes Nacionales de I+D+I AGL2004-06959-C04-01 y AGL2007-66062-C02-01/AGR.

AGRADECIMIENTOS

AGRADECIMIENTOS

Bueno, pues ya estoy delante del orderandor para escribir los agradecimientos. Esto es difcil para m, pues quien me conoce sabe que no me gusta mucho expresar mis sentimientos. As que mi agradecimiento es mucho mayor que el que puedo expresar, a todas las personas que de un modo u otro me habis ayudado durante todos estos aos y habis hecho que en mi estancia en La Mayora haya distrufado muchsismo, tanto en los momentos de trabajo como en otros.

Gracias Jess, por confiar en m, por estar siempre disponible, ayudarme en todo y por darme esta oportunidad que para m ha significado mucho no slo a nivel profesional sino en lo personal.

Gracias Enrique por todos tus consejos, disponibilidad y ayuda.

Por supuesto, a quienes tengo que agradecer muchsimas cosas son a mis compaeros de Virologa. Muchas gracias Mara Victoria porque sin t el laboratorio no funcionara igual, gracias por preocuparte siempre por m y todos nosotros y por tu cario. Gracias Carmen por ayudarme tanto en el da a da en el laboratorio (gracias por ayudarme con tus consejos con el clon infectivo) y por estar siempre dispuesta con una sonrisa a contestar cualquier duda. Gracias Elena por tus consejos con las plantas y las inoculaciones, (fuiste la que me ense a coger mosca) y por hacerme reir con tus cosas de petarda. Gracias Beln por la tranquilidad que transmites y porque has trado la cordura al laboratorio, que a veces estamos todos un poco locos. Gracias Anelise por ser como eres, me ha encantado ser tu compaera de bancada, y muchas gracias por nuestras charlas. Eres una maqui. Gracias Juan por escucharme alguna vez que otra y ayudarme con tus consejos. Gracias Reme por ser siempre tan detallista, por ayudarme cuando lo he necesitado y no voy a olvidar nuestro momento pizza en el hotel de Almera cuando fuimos de muestreo. Gracias Diego por todas las charlas, confidencias y agobios que hemos compartido durante todos estos aos. Debajo de esa fachada, en el fondo se esconde una buena persona. Cuando lleg a La Mayora fue Helena la que me ense lo que estaba haciendo hasta que ya despegu yo sola, como ella me dice. Gracias Helena por estar siempre dispuesta a ayudar, por haber compartido tantos momentos juntas en el transcurso de esta tesis y haber sido la alegra y chicharrilla del laboratorio. Gracias Patri por tu alegra y tus abrazos. Gracias Gloria, ya que mi tesis contnua tu trabajo, y por ayudarme siempre en todo lo que he necesitado. Gracias a Roco por ayudarme con las plantas y las inoculaciones. Gracias Paco, el ltimo en llegar, por lo que me he redo contigo y los videos de youtube que me enseas para distraerme un ratito.

Gracias a gente que ha estado o est en el laboratorio de estancia, a Rita, Kelly, Elvira y Leo, con los que he compartido risas y buenos momentos.

En estos ltimos meses, desde que me sent a escribir esta tesis he estado en el cuartito y he compartido mucho tiempo y momentos con gente de Fruti. Gracias a Librada por ayudarme en lo que he necesitado, por aguantar mis locuras y mis canciones horteras. Gracias a Caro por tu alegra y simpata, me he redo mucho con vosotras. A Jorge por tus puntos que an hoy me sorprenden.

Gracias a Emilio y Fernando por tantos momentos que recuerdo con vosotros en La Mayora. Gracias Emilio por la alegra que transmites, por tu comprensin y por decirme que soy..( ja ja). Gracias Fernando por los ratos de charla, tus confidencias, por ayudarme en tantas cosas y aguantarme cuando te he dado la tabarra sobre todo con los problemas del ordenador. Sin vosotros dos La Mayora ya no es lo mismo.

Quera dar las gracias a gente que me ha ayudado cada ao en los muestreos, tanto a los tcnicos: Manolo Berenguer, Rafa Gmez y los tcnicos de Almera y Murcia, como a todos los compaeros que me han acompaado y ayudado: Helena, Anelise, Reme, Jess, Juanfra.

Gracias Mara Jos, por preocuparte siempre por cmo me va. Mil gracias a Severiano, Miguel ngel y Gonzalo por ayudar tanto en los invernaderos y ser tan eficientes. A Fali y Marta, por ayudarme con la estadstica. Gracias Antonio Cordn por atenderme siempre que lo he necesitado y resolverme mis dudas.

Gracias al resto de gente de Fruticultura, Mejora y Micologa y resto de La Mayora con los que he compartido algn momento, comidas, desayunos, charlas, y que sera difcil nombrarlos a todos: Mariola, Yolanda, Toi, Luis, Gabi, Xabi, Paola, Lourdes, Davinia, Roco, Carmelina, Pablo.

Gracias a Lola por tantsismas cosas, por ayudarme tanto, por haber compartido tantas cosas contigo y por informarme de la beca.

Gracias a los que sin formar parte de La Mayora, os habis preocupado por m, habis intentado comprender lo que hago en mi trabajo y me habis hecho pasar buenos momentos. Gracias a Juan y Vero por su apoyo.

Gracias a la familia de Seba por preocuparse siempre por m.

Gracias a mi hermano, Inma y mis sobrinos por darme tantos momentos de alegra.

A mis padres tengo muchsimas cosas que agradecerle, prcticamente todo lo que soy. Gracias pap y mam porque me habis enseado muchos valores en esta vida, me habis ayudado y me segus ayudando tanto que jams podr agradecerlo suficientemente.

A ti Seba te doy las gracias por apoyarme cada da, quererme muchsimo, subirme el nimo cuando lo he necesitado y hacerme sentir siempre especial.

Slohacefaltaquedisfrutesdepequeasalegrasparaquetellevenaunagranfelicidad

AmispadresASeba

LLegar a la meta no es vencer, lo importante es el camino y en l, caer, levantarse, insistir, aprender

RESUMEN

RESUMEN

El objetivo general de esta tesis doctoral es ampliar nuestro conocimiento

sobre el amarilleo del tomate, una enfermedad viral emergente en muchas zonas del

mundo, causada por dos virus pertenecientes al gnero Crinivirus (familia

Closteroviridae), tomato chlorosis virus (ToCV) y tomato infectious chlorosis virus

(TICV). En espaa, ToCV es el virus prevalente asociado a los amarilleos de tomate.

ToCV se transmite por tres especies de mosca blanca (Bemisia tabaci, Trialeurodes

vaporariorum y T. abutilonea ) y causa importantes epidemias en tomate en el sur y

sudeste peninsular y las Islas Canarias desde 1997. Adems, este virus infecta de

forma natural cultivos comerciales de pimiento en Espaa. ToCV posee un genoma

con la organizacin tpica de un crinivirus, formado por dos molculas de RNA

lineales y de polaridad positiva denominadas RNA1 y RNA2. El RNA 1 codifica

protenas relacionadas con la replicacin viral, mientras que el RNA 2 codifica

protenas involucradas en la proteccin del genoma, movimiento viral, y otras

funciones todava no identificadas. Adems, protenas codificadas por ambos RNAs

poseen actividad supresora del silenciamiento gnico.

En este trabajo se ha determinado la importancia que pueden tener las

infecciones de ToCV en pimiento. Por una parte, se ha estudiado la incidencia de la

enfermedad en las principales zonas de cultivo de las provincias de Murcia, Almera

y Mlaga, mediante muestreos sistemticos llevados a cabo desde 2006 a 2008. La

incidencia de ToCV en pimiento se ha mostrado variable segn las zonas y aos

estudiados. Adems, se ha desarrollado un sistema de inoculacin en condiciones

controladas mediante B. tabaci que ha puesto de manifiesto diferencias en la

susceptibilidad a la infeccin entre variedades as como la sintomatologa y las

prdidas de produccin que el virus ocasiona. Las plantas de pimiento infectadas

con ToCV presentaron una apreciable reduccin de altura y sntomas de amarilleo

internervial en hojas de altura media y basales, las cuales adems se apreciaban

ligeramente engrosadas, enrolladas longitudinalmente y quebradizas al tacto. Es de

destacar la significativa reduccin de produccin en las plantas infectadas como

consecuencia de un menor nmero de frutos y menor tamao de los mismos.

En este trabajo se describe por primera vez un nuevo husped experimental y

natural de ToCV, la patata. La confirmacin de la patata como husped experimental

de ToCV se ha llevado a cabo mediante la transmisin por B. tabaci en condiciones

controladas. A su vez, en los tubrculos procedentes de plantas infectadas se ha

detectado la presencia de ToCV mediante hibridacin molecular de improntas de

cortes transversales de yemas de tubrculos, as como en las plantas de patata

desarrolladas a partir de tubrculos infectados. Finalmente, se ha puesto de

manifiesto que las plantas de patata pueden actuar como fuente de inculo para la

infeccin de plantas de tomate mediante la transmisin por B. tabaci.

Con anterioridad a este trabajo se haba estudiado la variabilidad gentica de

poblaciones naturales de ToCV procedentes de distintas zonas de la cuenca del

Mediterrneo, habindose determinado la presencia de dos variantes de secuencia

nucleotdica del RNA1, denominadas I y II. En este trabajo se amplia el estudio de

la variabilidad gentica del RNA1 a una mayor coleccin de aislados obtenidos de

tomate y pimiento procedentes de cultivos comerciales del sudeste peninsular

(Murcia, Almera y Mlaga). Los datos obtenidos confirman la existencia de los dos

genotipos descritos y la asociacin de una subpoblacin del tipo I con las

infecciones de pimiento. Por otra parte, experimentos llevados a cabo mediante

pases sucesivos por tomate y pimiento de un aislado de ToCV apoyan la existencia

de fenmenos de adaptacin al husped sugeridos por los anlisis de secuencia.

Finalmente, se ha iniciado el desarrollo de un sistema gentico de ToCV

basado en la obtencin de clones infectivos completos de cDNA correspondientes a

los RNA1 y RNA2 del aislado espaol AT80/99. El anlisis de la infectividad se ha

realizado mediante la inoculacin de transcritos obtenidos in vitro en protoplastos de

Nicotiana benthamiana. Hasta el momento, los experimentos llevados a cabo han

permitido demostrar la replicacin del RNA1 de ToCV en ausencia del RNA2.

ABREVIATURAS

ABREVIATURAS VIRUS BYV beet yellows virus CMV cucumber mosaic virus CTV citrus tristeza virus CYSDV cucurbit yellow stunting disorder virus GLRaV-1 grapevine leafroll associated virus 1 GLRaV-1 grapevine leafroll associated virus 2 GLRaV-3 grapevine leafroll-associated virus 3 LChV little cherry virus LIYV lettuce infectious yellows virus PepMV pepino mosaic virus PMMV pepper mild mottle virus PLRV potato leafroll virus PVA potato virus A PVS potato virus S PVX potato virus X PVY potato virus Y PYVV potato yellow vein virus SPCSV sweet potato chlorotic stunt virus TAV tomato aspermy virus TBSV tomato bushy stunt virus TICV tomato infectious chlorosis virus TMV tobacco mosaic virus ToCV tomato chlorosis virus ToMV tomato mosaic virus ToTV tomato torrado virus TRV tobacco rattle virus TSWV tomato spotted wilt virus TYLCV tomato yellow leaf curl virus

OTRAS ABREVIATURAS BAC cromosomas artificiales bacterianos cDNA DNA complementario CP protena de la cpsida CPm protena menor de la cpsida dNTP desoxinucletido dsRNA RNA de doble cadena dRNA RNA defectivo gRNA RNA genmico g fuerza centrfuga relativa HEL dominio helicasa Hsp70h protena homloga a las protenas de choque trmico de 70 KDa Kb kilobase kDa kilodalton MTR dominio metiltransferasa nt nucletido ORF marco abierto de lectura PCR reaccin en cadena de la polimerasa pb pares de bases PEG polietilenglicol PRO dominio proteasa RdRp RNA polimerasa dependiente de RNA RNasa ribonucleasa rNTP ribonucletidos RT transcripcin reversa sgRNA RNA subgenmico U unidad de actividad enzimtica UTR regione no traducida

NDICE

INTRODUCCIN Y OBJETIVOS.. 3 EL CULTIVO DEL TOMATE.. 3

EL CULTIVO DEL PIMIENTO 4

EL CULTIVO DE LA PATATA 5

VIRUS CAUSANTES DEL AMARILLEO DEL TOMATE.... 6

FAMILIA CLOSTEROVIRIDAE....... 7

Caractersticas generales.. 7

Taxonoma 8

Organizacin genmica 10

Mecanismos de expresin gnica. 16

Ciclo de infeccin de los closterovirus............. 17

Escenario evolutivo de la familia Closteroviridae 19

EL VIRUS DEL AMARILLEO DEL TOMATE

(TOMATO CHLOROSIS VIRUS, ToCV) 20

Organizacin genmica 20

Transmisin de ToCV por vectores.. 22

Sntomas en tomate............... 24

Gama de huspedes.............. 26

Distribucin geogrfica 28

Diagnstico.. 30

GENERACIN DE CLONES INFECTIVOS DE VIRUS DE RNA... 31

Clones infectivos de virus de la familia Closteroviridae. 34

VARIABILIDAD Y EVOLUCIN DE LAS POBLACIONES

DE VIRUS DE PLANTAS 39

Mecanismos generadores de diversidad gentica en los genomas virales... 39

Procesos que determinan la estructura gentica de las poblaciones virales. 42

Variabilidad gentica dentro de la familia Closteroviridae..... 45

OBJETIVOS.. 49

CAPTULO 1. INFECCIONES DE TOMATO CHLOROSIS VIRUS EN

PIMIENTO: INCIDENCIA EN EL SUDESTE PENINSULAR Y EXPRESIN

DE SNTOMAS EN CONDICIONES CONTROLADAS 1.1. ANTECEDENTES.. 53

1.2. MATERIAL Y MTODOS. 54

1.2.1. Muestreos de campo 54

1.2.2. Deteccin de ToCV. 54

1.2.3. Transmisin de ToCV a tomate a partir de plantas de pimiento

infectadas de forma natural........................... 57

1.2.4. Desarrollo de un sistema de infeccin de pimiento con ToCV

mediante Bemisia tabaci... 58

1.2.4.1. Inoculacin de ToCV en pimiento utilizando distinto

nmero de insectos. 58

1.2.4.2. Inoculacin de ToCV en diversas variedades de pimiento y

estudio del efecto de la infeccin viral... 58

1.2.5. Evaluacin de sntomas.. 60

1.3. RESULTADOS....... 61

1.3.1. Incidencia de ToCV en cultivos de pimiento y tomate de las

provincias de Mlaga, Almera y Murcia..... 61

1.3.2. Deteccin de ToCV en plantas de tomate inoculadas mediante

Bemisia tabaci a partir de pimiento.. 63

1.3.3. Influencia del nmero de adultos de Bemisia tabaci sobre la

eficiencia de transmisin de ToCV a pimiento. 64

1.3.4. Susceptibilidad a ToCV de diversas variedades de pimiento. 65

1.3.5. Determinacin de la sintomatologa inducida por la infeccin por

ToCV en pimiento........ 66

1.3.5.1. Anlisis del efecto de ToCV sobre la altura de las plantas 66

1.3.5.2. Sntomas foliares asociados a la infeccin por ToCV... 68

1.3.5.3. Efecto de la infeccin por ToCV en la produccin de

plantas de pimiento. 71

1.4. DISCUSIN 73

CAPTULO 2. LA PATATA (SOLANUM TUBEROSUM), UN NUEVO

HUSPED DE TOMATO CHLOROSIS VIRUS

2.1. ANTECEDENTES.. 83

2.2. MATERIAL Y MTODOS 84

2.2.1. Muestreos de campo, aislado viral y poblacin de mosca blanca.. 84

2.2.2. Deteccin de ToCV 84

2.2.3. Inoculacin de ToCV en plantas de patata mediante Bemisia tabaci. 85

2.2.4. Deteccin de ToCV en tubrculos de patata mediante hibridacin

molecular . 86

2.2.5. Inoculacin de plantas de tomate con ToCV a partir de plantas

de patata.... 86

2.3. RESULTADOS... 87

2.3.1. Infeccin natural de ToCV en patata.. 87

2.3.2. Infeccin de plantas de patata inoculadas con ToCV mediante

Bemisia tabaci.. 88

2.3.3. Presencia de ToCV en tubrculos de patata y en las plantas

desarrolladas a partir de ellos... 90

2.3.4. Infeccin de ToCV en plantas de tomate inoculadas a partir de

plantas de patata 92

2.4. DISCUSIN.... 93

CAPTULO 3. ESTUDIO DE LA DIVERSIDAD GENTICA DEL RNA1 DE

TOMATO CHLOROSIS VIRUS EN TOMATE Y PIMIENTO: POSIBLE

IMPLICACIN DE FENMENOS DE ADAPTACIN AL HUSPED 3.1. ANTECEDENTES.. 101


3.2.1. Material vegetal.. 102

3.2.2. Diagnstico de ToCV...... 108

3.2.3. Extraccin de RNA total. 108

3.2.4. Regiones del genoma de ToCV analizadas. 108

3.2.5. Diseo de los iniciadores empleados en la sntesis y amplificacin

de cDNAs mediante RT-PCR... 109

3.2.6. Sntesis y amplificacin de cDNAs del RNA1 de ToCV mediante

RT-PCR 110

3.2.7. Secuenciacin de los productos de amplificacin.. 111

3.2.8. Anlisis de las secuencias nucleotdicas. 111

3.2.9. Anlisis de la secuencia nucleotdica del aislado MM8 de ToCV

procedente de pimiento en tomate y pimiento.................................................. 112


3.3.1. Variabilidad nucleotdica en el RNA1 de ToCV 115

3.3.2. Anlisis filogentico de las regiones genmicas analizadas... 116

3.3.3. Influencia del husped en la estructura genmica de la poblacin

de ToCV 123

3.3.4. Implicacin de fenmenos de adaptacin al husped en la

variabilidad del RNA1 de ToCV.. 124

3.4. DISCUSIN 127

CAPTULO 4. DESARROLLO DE UN SISTEMA DE CLONES

INFECTIVOS DE TOMATO CHLOROSIS VIRUS 4.1. ANTECEDENTES.. 137


4.2.1. Aislado viral... 139

4.2.2. Extraccin de RNA de doble cadena.. 139

4.2.3. Sntesis y amplificacin de DNAs complementarios (cDNAs) a los

RNAs genmicos de ToCV.. 140

4.2.3.1. Sntesis y amplificacin de cDNAs del RNA1. 140

4.2.3.2. Sntesis y amplificacin de cDNAs del RNA2.. 143

4.2.4. Obtencin de clones de los RNA1 y RNA2 completos de ToCV.. 147

4.2.4.1. Construccin de un clon completo del RNA1 de ToCV... 147

4.2.4.2. Construccin de un clon completo del RNA2 de ToCV... 148

4.2.5. Transcripcin in vitro del RNA1 y RNA2 de ToCV.. 150

4.2.6. Aislamiento, cultivo e inoculacin de protoplastos de mesfilo

de hoja de Nicotiana benthamiana... 150

4.2.7. Extraccin de RNA total de protoplastos de Nicotiana benthamiana 152

4.2.8. Sntesis de sondas marcadas con digoxigenina.. 153

4.2.9. Anlisis mediante northern blot. 153


4.3.1. Obtencin de clones de cDNA del RNA1 de ToCV.. 154

4.3.2. Obtencin de clones de cDNA del RNA2 de ToCV.. 158

4.3.3. Anlisis de los transcritos obtenidos in vitro correspondientes

al RNA1 y RNA2 de ToCV.. 165

4.3.4. Anlisis de la replicacin de transcritos obtenidos in vitro del RNA1

y RNA2 de ToCV en protoplastos de Nicotiana benthamiana.... 170

4.4. DISCUSIN 174

CONCLUSIONES.. 183 BIBLIOGRAFA 187

INTRODUCCIN Y OBJETIVOS

Introduccin y objetivos

INTRODUCCIN Y OBJETIVOS

Las virosis constituyen uno de los problemas ms serios que afectan a la

agricultura moderna, provocando el deterioro de la planta, disminuciones en la

productividad y productos de baja calidad. A diferencia de otros microorganismos,

como hongos o bacterias, no es posible aplicar tratamientos curativos contra los

virus y en ello radica la dificultad de su control. Como consecuencia del constante

intercambio de material vegetal y la desaparicin de barreras comerciales, cada vez

son ms los cultivos hortcolas que se ven afectados por enfermedades vricas. El

hecho de que muchos virus sean capaces de transmitirse mediante vectores dificulta

an ms su control. Entre los vectores ms importantes estn los insectos,

destacando los pulgones, las moscas blancas y los trips. Una estrategia

frecuentemente empeada para el control de las virosis es la lucha contra los insectos

vectores mediante tratamientos con insecticidas. La utilizacin indiscriminada de

esta estrategia puede traer consigo la generacin de poblaciones de insectos

resistentes y la destruccin de la fauna auxiliar autctona, adems de un impacto

negativo sobre el medio ambiente. En la mayora de los casos, la utilizacin de

control biolgico de los vectores y la introduccin de resistencia gentica son las

mejores alternativas para el control de las enfermedades virales. Para ello, es

fundamental poseer un conocimiento profundo de la biologa de los virus y sus

vectores, de la variabilidad natural que presentan las poblaciones virales y de las

interacciones entre los virus y las plantas husped.

EL CULTIVO DEL TOMATE

El tomate (Solanum lycopersicum L., familia Solanaceae) es una planta

perenne que cultivada se comporta como anual. Su centro de origen es la regin de

los Andes, actuales Colombia, Ecuador, Per, Bolivia y Chile. Su domesticacin y

cultivo comenz en Mxico, que se considera un centro secundario de

diversificacin.

3


El tomate es uno de los principales cultivos hortcolas en extensin y

produccin a nivel mundial, con una superficie cultivada de 5.227.883 hectreas y

una produccin de 129.649.883 toneladas (FAO, 2008). El principal productor

mundial es China (33.811.702 toneladas). Espaa es el segundo pas productor

europeo, tras Italia, con 55.300 hectreas cultivadas y 3.664.1000 toneladas de

produccin. Las zonas donde se concentra el cultivo son Extremadura, Islas

Canarias, Murcia, Almera, Granada, Sevilla y Mlaga (MAPA, 2008). La mayor

parte de nuestra produccin se dedica a la exportacin para su consumo en fresco en

los pases europeos. Por tanto, la importancia del tomate en la agricultura espaola

es manifiesta, de ah que sea de gran inters disponer de medidas de control eficaces

frente a las enfermedades que afectan a este cultivo y que limitan su produccin,

como son numerosas virosis. En Espaa, las principales enfermedades virales que

afectan al cultivo del tomate estn causadas por cucumber mosaic virus (CMV)

(Jord et al., 1992), tomato spotted wilt virus (TSWV) (Jord, 1993), el complejo de

especies relacionadas con tomato yellow leaf curl virus (TYLCV) (Moriones y

Navas-Castillo, 2000; Daz-Pendn et al., 2010), tomato mosaic virus (ToMV)

(Alonso et al., 1989), potato virus Y (PVY) (Aramburu et al., 2006), tomato

chlorosis virus (ToCV) (Navas-Castillo et al., 2000), pepino mosaic virus (PepMV)

(Aguilar et al., 2002) y tomato torrado virus (ToTV) (Verbeek et al., 2007).

EL CULTIVO DEL PIMIENTO

El pimiento (Capsicum annuum L.) es una planta herbcea perenne, con ciclo

de cultivo anual, perteneciente a la familia Solanaceae. Originario de la zona de

Bolivia y Per, su cultivo ya se haba difundido en el siglo XVI en Espaa, desde

donde se distribuy al resto del Viejo Mundo.

Actualmente, el mayor productor mundial es China, seguido de Mxico,

Turqua, Indonesia y Espaa. En Espaa, el pimiento es uno de los cultivos

hortcolas ms importantes, siendo ste el pas con mayor produccin de la Unin

4


Europea (1.059.500 toneladas) (FAO, 2008). Las provincias espaolas con una

mayor produccin de pimiento son Almera, Murcia, Ciudad Real, Cdiz y Mlaga

(MAPA, 2008). Los virus que mayoritariamente infectan los cultivos de pimiento en

Espaa son los tobamovirus pepper mild mottle virus (PMMV), tobacco mosaic

virus (TMV) y ToMV (Alonso et al., 1989), PVY (Prez et al.,1995), TSWV (vila

et al., 1991), CMV (Avilla et al., 1996) y tomato bushy stunt virus (TBSV) (Luis-

Arteaga et al., 1996). Recientemente, se ha mostrado que el pimiento tambin es

husped de una serie de virus emergentes transmitidos por mosca blanca, TYLCV

(Reina et al., 1999; Morilla et al., 2005), ToCV (Lozano et al., 2004) y ToTV

(Amari et al., 2008).

EL CULTIVO DE LA PATATA

La patata (Solanum tuberosum L., familia Solanaceae) se origin en la

cordillera andina y lleg a Europa en el siglo XVI a travs de Espaa y las Islas

Britnicas. Es una planta herbcea, dicotilednea, provista de un sistema caulinar

areo y otro subterrneo constituido por los tubrculos.

La patata es uno de los cultivos ms importantes en todo el mundo, con una

produccin anual de 314.140.107 toneladas en 18.192.405 hectreas de superficie

cultivada (FAO, 2008). Actualmente, el mayor productor mundial es China, seguido

de Rusia, India y Estados Unidos. En Espaa, la produccin de patata se concentra

en Castilla y Len, Andaluca, Galicia, Pas Vasco y la Rioja (MAPA, 2008).

A diferencia de la mayora de cultivos hortcolas, la patata se reproduce

vegetativamente mediante tubrculos, que actualmente se producen en la mayor

parte de los pases desarrollados en condiciones de estricto control sanitario de las

enfermedades que puedan transmitir. Se han descrito alrededor de 40 virus capaces

de infectar el cultivo de la patata (Jeffries, 1998), de los cuales los ms importantes

son potato leafroll virus (PLRV), potato virus X (PVX), PVY y potato virus S (PVS)

(de Bokx y van der Want, 1987; Stevenson et al., 2001).Adems, existe un nmero

5


de virus emergentes que constituyen una amenaza reciente para el cultivo de la

patata, como son tobacco rattle virus (TRV) y los crinivirus potato yellow vein virus

(PYVV) y tomato infectious chlorosis virus (TICV) (Wei et al., 2009).

VIRUS CAUSANTES DEL AMARILLEO DEL TOMATE

Se conocen ms de cincuenta especies virales capaces de infectar tomate,

pertenecientes a numerosas familias y transmitidas por diversos vectores como

nemtodos, pulgones, moscas blancas y trips.

A finales de los aos 80 del siglo pasado se observ en cultivos de tomate de

California un sndrome que se denomin desorden de la hoja amarilla o

amarilleo (Duffus et al., 1994). Los sntomas presentados por las plantas afectadas

se caracterizaban por la aparicin de manchas clorticas internerviales que aparecan

inicialmente en las hojas inferiores y que posteriormente se extendan hacia la parte

superior de la planta. Inicialmente, esta sintomatologa se atribuy a desrdenes

fisiolgicos o nutricionales e incluso a fitotoxicidad por pesticidas, aunque tambin

se sospech de una posible causa viral, puesto que su aparicin se asoci a la

presencia de mosca blanca. Los anlisis iniciales de las plantas que mostraban los

sntomas citados pusieron de manifiesto la presencia de un nuevo crinivirus (gnero

Crinivirus, familia Closteroviridae) al que se denomin tomato infectious chlorosis

virus (TICV), transmitido por la mosca blanca Trialeurodes vaporariorum (Duffus

et al., 1996).

Posteriormente, los estudios llevados a cabo con plantas de tomate con

sntomas similares procedentes del estado de Florida revelaron la existencia de otro

crinivirus, tomato chlorosis virus (ToCV) (Wisler et al., 1998b). La principal

diferencia biolgica entre ambos virus es la capacidad de ToCV para ser transmitido

por tres especies de mosca blanca, T. vaporariorum, T. abutilonea y Bemisia tabaci,

mientras que TICV se transmite slo por T. vaporariorum, as como un rango de

huspedes diferente. Adems de tomate, TICV puede infectar otros cultivos como

6


patata, alcachofa, lechuga y varias especies ornamentales como petunia y especies

silvestres (Duffus et al., 1996).

En 1997 se observaron de forma espordica en cultivos de tomate bajo

plstico de las provincias de Almera y Mlaga sntomas inusuales y similares a los

descritos para las infecciones de ToCV y TICV. Los anlisis llevados a cabo

pusieron de manifiesto que el agente causal era ToCV (Navas-Castillo et al., 2000)

(ver ms adelante). En verano de 2001 se identific en cultivos de tomate de la

provincia de Castelln afectados de amarilleo la presencia de TICV, que

posteriormente fue detectado en Alicante y Murcia (Font et al., 2003). Este virus

tambin se ha encontrado en nuestro pas infectando las malas hierbas Chenopodium

murale y C. album (Font et al., 2004). Recientemente se ha obtenido la secuencia

nucleotdica completa de un aislado de TICV de California (Wintermantel et al.,

2009) y del RNA2 de aislados de Espaa y California (Orlio y Navas-Castillo,

2009).

La organizacin genmica, sintomatologa, gama de huspedes y distribucin

geogrfica de ToCV se describen en un apartado posterior de esta introduccin.

FAMILIA CLOSTEROVIRIDAE

Caractersticas generales

La familia Closteroviridae comprende virus de plantas filamentosos con

genomas de RNA de cadena sencilla que presentan el mayor tamao entre los virus

de RNA de plantas. Los virus de esta familia estn limitados fundamentalmente a

clulas del parnquima floemtico del hospedador, aunque en algunas interacciones

especficas hospedador-virus algunas clulas del mesfilo pueden infectarse

(Medina et al., 1999; Karasev, 2000). En muchos casos, esta restriccin tiene como

consecuencia un bajo rendimiento en la purificacin viral, lo que, unido al gran

7


tamao del RNA genmico y la incapacidad de ser transmitidos mecnicamente, ha

limitado el estudio y caracterizacin de estos virus.

Los miembros de la familia Closteroviridae se transmiten de manera

semipersistente por insectos incluidos en tres familias del orden Homoptera, que

determinan los tres gneros existentes en esta familia, Closterovirus, transmitidos

por pulgones (Aphididae), Crinivirus, por moscas blancas (Aleyrodidae) y

Ampelovirus, por pseudocccidos (Pseudococcidae) (Karasev, 2000).

Estos virus infectan numerosos cultivos de gran importancia econmica como

ctricos, remolacha, tomate, lechuga, patata, batata, vid, pia, cerezo, etc., as como

especies ornamentales y silvestres. Generalmente, los sntomas de las enfermedades

causadas por los miembros de esta familia recuerdan a ciertas deficiencias

nutricionales y a senescencia prematura. Entre estos se incluyen amarilleos,

amoratamientos, aclaramiento de las venas y en ocasiones reduccin del crecimiento

y marchitamiento, que en algunos casos pueden dar lugar al colapso final de la

planta (Karasev, 2000).

Taxonoma

El principal carcter biolgico que separa los tres gneros de la familia

Closteroviridae (Closterovirus, Crinivirus y Ampelovirus) es el vector que los

transmite de forma natural (Karasev, 2000; Martelli et al., 2002). Las caractersticas

ms importantes de cada uno de estos gneros se describen a continuacin y su

estructura genmica se muestra en la figura 1.

Gnero Closterovirus. Los viriones tienen un tamao que oscila entre 1250 y 2200

nm de longitud y contienen una nica molcula de RNA de cadena sencilla, de

polaridad positiva y lineal de entre 15,5 y 19,3 kb. La especie tipo del gnero es Beet

yellows virus (BYV). Este gnero incluye virus transmitidos exclusivamente por

pulgones de manera semipersistente e infectan especies dicotiledneas. Algunos de

8


sus miembros son transmitidos mediante inoculacin mecnica, aunque con

dificultad.

Gnero Ampelovirus. El tamao de sus viriones oscila entre 1400 y 2200 nm de

longitud y contienen una nica molcula de RNA de cadena sencilla, de polaridad

positiva y lineal de entre 16,9 y 19,5 kb. La especie tipo del gnero es Grapevine

leafroll associated virus-3 (GRLaV-3). En este gnero se incluyen virus que infectan

especies dicotiledneas y monocotiledneas y que son transmitidos de manera

semipersistente por pseudocccidos. Ninguno de ellos es transmisible por

inoculacin mecnica.

Gnero Crinivirus. El genoma est constituido por RNA de cadena sencilla, de

polaridad positiva y lineal de entre 15,3 y 19 kb de tamao, dividido en dos

molculas, a las que se denomina RNA1 y RNA2, siendo ambas necesarias para

llevar a cabo la infeccin. Los dos RNAs se encapsidan por separado en partculas

virales cuyos tamaos oscilan entre 650-850 nm y 700-900 nm de longitud,

respectivamente. En el caso de PYVV, su genoma se encuentra dividido en tres

molculas, denominndose a la tercera RNA3. Los genes localizados en el RNA1

codifican protenas relacionadas con la replicacin, mientras que en el RNA2, y

RNA3 en PYVV, se encuentran genes que codifican protenas implicadas en la

proteccin del genoma, el movimiento del virus y la interaccin con el vector. Tres

especies de mosca blanca estn implicadas en la transmisin de crinivirus (B. tabaci,

T. vaporariorum y T. abutilonea).

9


Clos

tero

viru

sAm

pelo

viru

sC

riniv

irus

Figura 1. Organizacin genmica de especies virales representativas de los gneros que integran la familia Closteroviridae. BYV, Beet yellows virus; CTV, Citrus tristeza virus; LIYV, Lettuce infectious yellows virus; SPCSV, Sweet potato chlorotic stunt virus; GLRaV-3, Grapevine leafroll-associated virus-3 (Adaptado de Dolja et al., 2006).

Organizacin genmica

La mayor cantidad de material gentico que poseen los miembros de esta

familia en comparacin con otros virus de plantas se traduce en una mayor

complejidad estructural y variacin gentica. Por una parte, los viriones

filamentosos de los virus pertenecientes a esta familia son inusualmente largos y

complejos (Dolja et al., 2006). Sus partculas virales estn compuestas por al menos

cinco protenas que se ensamblan en una estructura en serpiente de cascabel

(rattlesnake), con un largo cuerpo de morfologa uniforme y una cola corta y

segmentada (Agranovsky et al., 1995; Febres et al., 1996; Tian et al., 1999; Dolja,

2003; Dolja et al., 2006). En la figura 2 se muestran imgenes de las partculas

virales de BYV, la especie tipo del gnero Closterovirus, obtenidas mediante

microscopa electrnica de transmisin (A) o microscopa de fuerza atmica (B) que

pone de manifesto la estructura segmentada de la cola (C).

10


Cola

Cola Cuerpo Extremocuerpo

Figura 2. Morfologa de los viriones de beet yellows virus. A: Micrografa electrnica de dos viriones con las colas marcadas mediante tcnicas inmunolgicas empleando un antisuero especfico de la protena CPm (flechas). B: Imagen de una partcula viral obtenida mediante microscopa de fuerza atmica. C y D: Reconstruccin tridimensional de los extremos del virin obtenida mediante microscopa de fuerza atmica (Adaptado de Dolja, 2003).

En el genoma de los closterovirus se distinguen dos bloques principales de

genes, uno constituido por los implicados en la replicacin y otro integrado por

aquellos relacionados con la proteccin del genoma, el movimiento viral y la

interaccin con el vector. El bloque de genes implicados en la replicacin se localiza

aproximadamente en la mitad 5 del genoma de los virus monopartitos, gneros

Closterovirus y Ampelovirus, y en el RNA1 de las especies del gnero Crinivirus. El

producto del marco abierto de lectura (open reading frame, ORF) situado ms

cercano al extremo 5 codifica una poliprotena que posee los dominios proteasa

(PRO), RNA metiltransferasa (MTR) y RNA helicasa (HEL). Adems de la funcin

autoacataltica de PRO esta protena estara implicada en la activacin de la

replicasa viral o proteccin del RNA ante la degradacin por parte del sistema de

defensa de la planta (Dolja et al., 2006). La RNA polimerasa dependiente de RNA

(RdRp) est codificada por el siguiente ORF, denominado ORF1b, que

11


probablemente se expresa mediante el desplazamiento de la pauta de lectura del

ribosoma un nucletido (+1 ribosomal frameshift) (Agranovsky et al., 1994;

Karasev et al., 1995). As, la traduccin del RNA genmico dara lugar a dos

protenas de gran tamao, una que abarca los dominios MTR- HEL, y otra que

incluira adems el dominio RdRp. La segunda poliprotena se produce en menor

cantidad debido a la baja eficiencia del desplazamiento del ribosoma, cuantificada

en un 2% en BYV (Agranovsky, 1996). El mdulo MTR-HEL-RdRp est

universalmente conservado en toda la superfamilia de virus , en la que se incluyen virus con genoma de RNA de polaridad positiva (Koonin and Dolja, 1993; Dolja et

al., 2006).

El bloque de genes relacionado con la proteccin del genoma, el movimiento

viral y la interaccin con el vector, se localiza en la mitad 3 del genoma de las

especies virales de los gneros Closterovirus y Ampelovirus y en el RNA2 (y

RNA3) de las especies del gnero Crinivirus. En este bloque se incluyen los genes

que codifican una protena hidrofbica de unos 6 kDa, una protena homloga a las

de la familia Hsp70 de eucariotas (Hsp70h), una protena de unos 60 kDa, la

protena de la cpsida (CP) y la protena menor de la cpsida (CPm) (Dolja et al.,

2006). Este bloque es indispensable para el movimiento del virus y es exclusivo de

los miembros de esta familia (Dolja et al., 1994).

La protena p6 posee un dominio transmembrana, se localiza en el retculo

endoplasmtico y estara implicada en las funciones del movimiento del virus de

clula a clula (Alzhanova et al., 2000; Peremyslov et al., 2004b).

La protena de la cpsida cubre aproximadamente el 95% del RNA viral,

formando el cuerpo helicoidal de los viriones filamentosos y flexuosos. La cola, que

ocupara el 5% restante, est integrada por las protenas CPm, como componente

principal, y p60 y Hsp70h, como componentes menores. Se ha propuesto que la cola

constituye un dispositivo de propulsin del virin hacia los plasmodesmos, gracias a

12


la interaccin de la protena Hsp70h con el citoesqueleto de la clula (Peremyslov et

al. 1999, 2004a; Napuli et al. 2000, 2003; Satyanarayana et al., 2000, 2004;

Alzhanova et al. 2001). En el caso de BYV, la protena p20 tambin forma parte de

la cola del virin (unida a Hsp70h) y es necesaria para el transporte sistmico del

virus a travs del floema (Prokhnevsky et al., 2002).

Se ha postulado que los ORFs CPm y p60 se originaron mediante la

duplicacin del gen de la protena CP, lo que explica que en las regiones carboxilo-

terminal de estas protenas se encuentren los residuos Ser, Arg y Asp conservados en

las protenas de la cpsida de los virus filamentosos de plantas (Boyko et al., 1992;

Napuli et al., 2003). La protena CPm est implicada en el movimiento clula a

clula, en la formacin de la cola de virin y en la transmisin de las partculas

virales por B. tabaci al menos en el caso de LIYV (Tian et al., 1999; Alzhanova et

al., 2001, 2007).

La protena Hsp70h, cuyo origen es eucariota, es homloga a las chaperonas

celulares de la familia de choque trmico Hsp70. En esta protena se distinguen dos

regiones, una amino-terminal y otra carboxilo-terminal. En la primera de ellas se

encuentra un dominio ATPasa altamente conservado, mientras que la segunda

presenta un dominio de unin a sustrato con menor grado de conservacin

(Agranovsky et al., 1991; Boorstein et al., 1994). Ambos dominios estn implicados

en el ensamblaje del virin (Alzhanova et al., 2001, 2007). Esta protena ejerce un

papel fundamental en la translocacin intracelular del virin anclndose a los

plasmodesmos en asociacin con el citoesqueleto de actina de la clula (Medina et

al., 1999; Prokhnevsky et al., 2005). En BYV, la protena Hsp70h acta de manera

cooperativa con la protena p64 (homloga a p59 de crinivirus), que actuara como

cochaperona, para facilitar la incorporacin de la protena CPm e interviene en la

definicin de la longitud apropiada de la cola que encapsida aproximadamente unos

700 nt de la regin 5 terminal del RNA genmico, donde deben localizarse seales

reconocidas por la protena CPm (Peremyslov et al. 2004a; Satyanarayana et al.,

13


2004; Alzhanova et al., 2007). Se ha propuesto que la cola del virin es un

dispositivo que se origin y evolucion para facilitar el movimiento de los genomas

de gran tamao de los closterovirus, tanto clula a clula como de manera sistmica

(Alzhanova et al., 2001; Prokhnevsky et al., 2002, 2005; Dolja, 2003).

A pesar de que este bloque de genes est conservado en toda la familia, no

ocurre lo mismo con el orden de los distintos genes. En los gneros Ampelovirus y

Crinivirus, el ORF CPm se sita en direccin 3 respecto al ORF CP, mientras que

en el gnero Closterovirus el orden es inverso y su tamao es significativamente

menor.

Aparte de estas funciones, en distintos miembros de la familia

Closteroviridae se han descrito protenas implicadas en la supresin del

silenciamiento gnico, como son la protena p21 de BYV (Reed et al., 2003; Ye y

Patel, 2005; Chiba et al., 2006), las protenas p20, p23 y CP de CTV (Lu et al.,

2004) y p24 de grapevine leafroll-associated virus-2 (GLRaV-2) (Chiba et al.,

2006). En el gnero Crinivirus se han descrito con esta funcin la protena p22 y una

protena homloga a la RNasa III de sweet potato chlorotic stunt virus (SPCSV)

(Kreuze et al., 2005), las protenas p22, CP y CPm de ToCV (Caizares et al., 2008)

y la protena p25 de cucurbit yellow stunting disorder virus (CYSDV) (Kataya et al.,

2009).

Las secuencias de los extremos 5 y 3 no codificantes (untranslated regions,

UTR) de los genomas de los virus de RNA de cadena sencilla lineal y sentido

positivo contienen elementos, que actan en cis, implicados en el inicio de la sntesis

de las cadenas positivas y negativas genmicas y de los RNAs subgenmicos.

Asmismo, controlan el inicio de la traduccin, el ensamblaje de los viriones, la

regulacin de la expresin gnica y el movimiento dentro del husped (Duggal et

al., 1994; Buck, 1996; Turner y Buck, 1999; Miller y Koev, 2000; Dreher y Miller,

2006).

14


Las secuencias de los extremos 5-UTR estn implicadas en distintos

procesos del ciclo viral, aunque la informacin disponible sobre los elementos

reguladores es escasa. Por analoga con los elementos descritos en el extremo 3 de

la cadena positiva, las estructuras del extremo 3 de la cadena negativa

(complementaria al extremo 5 de la positiva) deben actuar como promotores de la

sntesis de la cadena positiva (Guan et al., 1997; Sivakumaran y Kao, 1999; Nagy y

Pogany, 2000; Panavas y Nagy, 2003; Panavas et al., 2003). En CTV se ha

demostrado la implicacin de las estructuras secundarias predichas en este extremo

(Lpez et al., 1998), en la replicacin y la posibilidad de que en su estructura

primaria se encuentren seales para el inicio del ensamblaje del virin (Gowda et

al., 2003b).

La regin del extremo 3-UTR de genomas virales de RNA de polaridad

positiva est implicada en el inicio de la replicacin del RNA viral, conteniendo los

motivos y estructuras implicados en distintas funciones relacionadas con la sntesis

de la cadena de polaridad negativa, tanto en su estructura primaria como secundaria

(Dreher, 1999). A diferencia de otros virus de plantas, en el extremo 3 de los

miembros de la familia Closteroviridae no se han identificado estructuras similares a

las presentes en RNA mensajeros eucariotas, como son las colas poliA o

plegamientos semejantes a los que adoptan los RNAs transferentes. En el caso de

CTV, esta regin est altamente conservada en todos los genotipos caracterizados

(Lpez et al., 1998) y se han identificado una serie de estructuras en horquilla

implicadas en la replicacin, algunas de las cuales forman parte integral de la seal

de replicacin mientras que otras no son esenciales para este proceso pero s parecen

contribuir a su mayor eficiencia (Satyanarayana et al., 2002a). En la mayora de los

crinivirus caracterizados se han descrito estructuras similares en el extremo 3-UTR

consistentes en cuatro estructuras en horquilla y uno o dos pseudonudos (Kreuze et

al., 2002; Livieratos et al., 2004, Lozano, 2007). Este extremo estara implicado,

adems de en el inicio de la sntesis de la cadena negativa, en la estabilidad del

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RNA, ensamblaje y regulacin de la sntesis del RNA y su traduccin (Dreher,

1999).

Mecanismos de expresin gnica

Los genomas virales constituidos por RNA de cadena sencilla, lineal y

polaridad positiva, poseen una doble funcin. Por una parte son utilizados

directamente como RNA mensajero y a su vez sirven como molde para la sntesis de

la cadena de polaridad negativa que se genera como intermediario durante la

replicacin del genoma viral. Los closterovirus utilizan varios mecanismos para

regular su expresin gnica: procesamiento proteoltico de la poliprotena codificada

por el ORF1a, deriva ribosomal en la expresin de la RdRp codificada por el ORF1b

y expresin de RNAs subgenmicos (sgRNAs) 3 co-terminales (Karasev, 2000;

Dolja, 2003; Dolja et al., 2006). Esta compleja combinacin de estrategias no se ha

descrito en ningn otro grupo de virus de plantas (Koonin y Dolja, 1993).

Los genes que se encuentran en la mitad 3 del genoma de closterovirus y

ampelovirus o en el RNA2 (y RNA3) de crinivirus se expresan mediante la sntesis

de sgRNAs 3 co-terminales con el RNA genmico, que actan como RNAs

mensajeros a partir de los cuales se traduce el gen que ocupa la posicin 5 terminal

(Hilf et al., 1995; Kreuze et al., 2002). En CTV se ha demostrado que la produccin

de los sgRNAs permite la regulacin de la expresin de cada gen de forma

independiente, tanto en tiempo como en cantidad (Navas-Castillo et al., 1997).

Aunque se han localizado las secuencias reguladoras de la expresin de los sgRNAs

en el extremo 5 (Karasev et al., 1997; Aylln et al., 2003), no se ha podido

determinar si se trata de secuencias promotoras o secuencias terminadoras, por lo

que se han denominado elementos controladores (Gowda et al., 2001, 2003a; Aylln

et al., 2004). Cada elemento controlador induce la formacin no slo de los sgRNAs

de polaridad positiva y negativa, sino tambin RNAs de polaridad positiva que se

16


extienden desde el extremo 5 del gRNA a los extremos 5 de los elementos

controladores (Gowda et al., 2001).

Las plantas infectadas con closterovirus a menudo acumulan RNAs

defectivos (dRNAs) que contienen los extremos 5 y 3 del gRNA pero carecen de

una porcin variable de la regin central. Estos dRNAs han sido descritos en CTV

(Mawassi et al., 1995a y b; Yang et al., 1997a y b; Aylln et al., 1999a) y en el

RNA2 de LIYV (Rubio et al., 2000). Se ha sugerido que muchos dRNAs de CTV

pueden ser el resultado de la recombinacin de un sgRNA con zonas distantes en el

extremo 5 de su genoma (Bar-Joseph et al., 1997). En PYVV se han descrito dos

dRNAs de estructura ms compleja formados por regiones procedentes de las tres

molculas de RNA (Eliasco et al., 2006). Adems, en CTV se han descrito dRNAs

de gran tamao anlogos al RNA1 y RNA2 del genoma de crinivirus,

respectivamente (Che et al., 2002, 2003).

En virus animales, combinaciones de estrategias de expresin similares se

han descrito en arterivirus y coronavirus, pero no parece existir relacin filogentica

entre stos y los closterovirus, por lo que dicha similitud podra deberse a

fenmenos de convergencia evolutiva (Agranosky et al., 1994).

Ciclo de infeccin de los closterovirus

La mayora de los virus de esta familia son inoculados en las plantas

mediante insectos. Adems, pueden ser transmitidos por injerto y algunos de ellos

por transmisin mecnica (Karasev, 2000). El inicio del ciclo de replicacin requiere

la desencapsidacin de la partcula viral seguido de la traduccin del genoma viral,

que generar la poliprotena que suministrar los componentes proteasa y replicasa

que formarn los complejos de replicacin asociados a las membranas del retculo

endoplasmtico. A continuacin se sintetizar la cadena negativa del RNA

genmico que ser utilizada para la sntesis tanto de las cadenas positivas del

genoma como de los sgRNAs, que se exportarn al citosol. La traduccin de los

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genomas sintetizados generar la proliferacin de los complejos de replicacin y

simultneamente comenzar el ensamblaje de los viriones al acumularse las

protenas estructurales (Dolja et al., 2006).

Los viriones realizan el movimiento clula a clula a travs de los

plasmodesmos y un transporte sistmico a travs del floema. El movimiento de los

viriones dentro de la clula se realizara gracias a la capacidad de la protena

Hsp70h, presente en la cola, de interaccionar con los microfilamentos de actina y

transportar a los viriones hacia los plasmodesmos, de manera que este movimiento

sera direccional, quedando las colas insertadas en los canales de los plasmodesmos

(Medina et al., 1999; Prokhnevsky et al., 2005). Se ha postulado que los viriones se

desencapsidan al atravesar estos canales, lo que permite que los ribosomas se unan a

los extremos 5 desnudos al entrar en la nueva clula y as comenzar

inmediatamente el proceso de traduccin (Doja et al., 2006).

El ciclo de expresin gnica y replicacin, ensamblaje del virin y

movimiento clula a clula dura aproximadamente un da (Dolja et al., 2006) y se

repite hasta que la infeccin alcanza las clulas acompaantes que tienen conexin a

travs de los plasmodesmos con los elementos cribosos, lo que permite al virus ser

transportado gracias a la corriente del floema a largas distancias hasta llegar a los

rganos sumidero (tallos, hojas y races). Las protenas que intervienen en el

transporte sistmico son p20 y PRO en BYV (Peng et al., 2002; Prokhnevsky et al.,

2002). El establecimiento de la infeccin sistmica supone al menos dos semanas

para las especies que infectan plantas herbceas y hasta varios meses para las de

huspedes leosos (Dolja et al., 2006).

El secuestro masivo del retculo endoplasmtico suele causar citotoxicidad,

que se manifiesta como aclaramiento de las venas, amarilleo y enrollado de las hojas

y marchitamiento (Dolja et al., 2006). Los supresores de silenciamiento gnico

18


codificados por el genoma viral tambin contribuyen al fenotipo de la enfermedad al

interferir con procesos del desarrollo de la planta (Dolja et al., 2006).

Escenario evolutivo de la familia Closteroviridae

Dolja et al. (2006) han propuesto que la lnea monofiltica de los

closterovirus desciende de un virus de plantas perteneciente a la superfamilia de

virus cuyo genoma codificaba una protena con actividad replicasa tpica con los dominios MTR-HEL-RdRp, una pequea protena hidrofbica de movimiento y una

nica protena (CP) que constitua la cpsida filamentosa. Este progenitor dara lugar

al ltimo ancestro comn de los closterovirus al adquirir varios genes nuevos, como

el dominio PRO y la regin genmica situada entre los dominios MTR y HEL. A su

vez, la protena Hsp70h pudo ser incorporada mediante recombinacin con un RNA

mensajero celular y la protena p59 se originara por duplicacin del gen de la

protena CP. Este ancestro probablemente sera transmitido por insectos. Las tres

lneas actuales de closterovirus, correspondientes a los tres gneros aceptados,

evolucionaron por adaptacin a los distintos tipos de insectos vectores (Karasev,

2000). Las protenas CPm se originaron en este momento a partir de la duplicacin y

divergencia de la CP. Seguidamente, se incorporaron algunos genes adicionales

especficos y conservados dentro de cada gnero, como es el caso del gen que

codifica la protena p21 en el gnero Closterovirus y los genes que codifican las

protenas p9 y p27 en el gnero Crinivirus. De igual manera, algunas de las especies

virales adquirieron genes exclusivos.

Parece ser que la inusual plasticidad gentica de los closterovirus, frente a la

mayor conservacin del genoma de virus de RNA de menor tamao, est

condicionada por la expansin de su genoma, lo que les permite una mayor

capacidad de adaptacin a nuevos nichos ecolgicos, tanto huspedes y vectores

como condiciones medioambientales cambiantes (Dolja et al., 2006)

19


EL VIRUS DEL AMARILLEO DEL TOMATE (TOMATO CHLOROSIS

VIRUS, ToCV)

Organizacin genmica

Hasta la actualidad, se han secuenciado los genomas completos de tres

aislados de ToCV, de Florida (Wintermantel et al., 2005), Espaa (Lozano et al.,

2006b, 2007) y Grecia (Kataya et al., 2008), lo que ha permitido determinar su

organizacin genmica (Fig. 3). ToCV posee un genoma constituido por dos

molculas de RNA, lineales y de sentido positivo que se encapsidan por separado en

viriones largos y flexuosos, ambas necesarias para que el virus sea capaz de infectar

sistmicamente una planta. El RNA 1 est constituido por 8594-8595 nt y

fundamentalmente codifica protenas relacionadas con la replicacin viral, mientras

que el RNA 2, con 8242-8247 nt codifica protenas involucradas en la proteccin del

genoma, movimiento viral y otras funciones todava no identificadas.

El RNA1 est formado por cuatro potenciales ORFs flanqueados por dos

UTRs situados en los extremos 5 y 3 de la molcula (Fig. 3). El ORF1a codifica

una protena que contiene los dominios PRO, MTR y HEL conservados entre las

protenas asociadas con la replicacin viral en todos los miembros de la familia

Costeroviridae (Karasev, 2000). El ORF1b codifica la protena RdRp, que se

traduce por desplazamiento del ribosoma en un nucletido durante la traduccin (+1

frameshift). El ORF2 codifica una protena de 22 KDa, que se ha descrito como un

fuerte supresor de silenciamiento gnico (Caizares et al., 2008). El ORF3 codifica

un pptido con un posible dominio transmembrana similar a otras protenas situadas

en el extremo 3 de los crinivirus, cuya funcin es desconocida.

El RNA 2 de ToCV codifica nueve ORFs flanqueados por dos UTRs situados

en los extremos 5 y 3 de la molcula (Fig. 3). Esta molcula incluye el bloque de

cinco genes caractersticos de la familia Closteroviridae que estaran implicados en

la proteccin del genoma, movimiento viral e interaccin con el vector. Este bloque

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de genes est formado por el ORF4 que codifica la protena p4, rica en residuos

hidrofbicos, el ORF5 que codifica una protena Hsp70h, el ORF7 que codifica la

protena p59, y el ORF9 y ORF10 que codifican las protenas CP y CPm,

respectivamente. Se ha descrito la actividad supresora de silenciamiento gnico de

las dos ltimas protenas (Caizares et al., 2008). El ORF6 de ToCV codifica la

protena p8, con tamao, posicin genmica y secuencia similar a protenas de otros

miembros de este gnero (Livieratos et al., 2004; Orlio y Navas-Castillo, 2009). El

ORF8 codifica la protena p9, que se encuentra nicamente en los miembros del

gnero Crinivirus y hasta el momento se desconoce su funcin. El ORF 11 codifica

la protena p27, que no posee ORFs homlogos en los otros dos gneros de la

familia, por lo que podra ser exclusivo de crinivirus (Dolja et al., 2006). Por ltimo,

el ORF12 codifica la protena p7, que no presenta similitud significativa con

ninguna protena codificada por los genomas de otros crinivirus, por lo que podra

ser exclusiva de ToCV (Wintermantel et al., 2005; Lozano et al., 2006b).

Cada uno de los extremos 5-UTR del RNA1 y RNA2 est constituido por

301 y 238 nucletidos respectivamente, con una identidad nucleotdica del 33%

entre ambos. Los primeros nucletidos son idnticos en el RNA1 y RNA2,

fenmeno caracterstico tanto del gnero Crinivirus como de otros grupos de virus

con genomas segmentados. La secuencia nucleotdica de los extremos 3-UTR del

RNA1 y RNA2 presenta un alto grado de conservacin, como sucede en el resto de

crinivirus (Wintermantel et al., 2005; Lozano et al., 2006b, 2007), a excepcin de

LIYV, en el que se ha propuesto que sus extremos tengan alguna funcin distinta a

la del resto de virus de este gnero (Aguilar et al., 2003).

21


ORF1a ORF2

35

Figura 3. Representacin esquemtica de la organizacin genmica de la secuencia nucleotdica del RNA1 y RNA2 de tomato chlorosis virus. Los marcos abiertos de lectura (ORFs) se muestran como cajas que aparecen encima, debajo o sobre la lnea que representa el RNA genmico, dependiendo del marco de lectura en el que se encuentren. PRO, motivo proteasa; MTR, motivo metiltransferasa; HEL, motivo helicasa; RdRp, RNA polimerasa dependiente de RNA; Hsp70h, protena homloga de la familia Hsp70; CP, protena de la cpsida; CPm, protena menor de la cpsida.

Transmisin de ToCV por vectores

ToCV se transmite en la naturaleza de manera semipersistente por las

especies de mosca blanca B. tabaci, T. vaporariorum y T. abutilonea (Wisler et al,

1998b), de las cuales slo las dos primeras se encuentran en Europa (Jones, 2003)

(Fig. 4). Este tipo de transmisin, en el que la adquisicin e inoculacin viral

normalmente ocurre en el floema de la planta, es no circulativa, es decir, el virus no

necesita ser translocado dentro de rganos internos del vector para ser transmitido,

aunque el periodo de adquisicin es mayor que en la transmisin no persistente (Ng

y Falk, 2006b). En un estudio de Wintermantel y Wisler (2006) se ha demostrado

que la eficiencia de la transmisin de ToCV as como la persistencia del virus en el

RdRp

ORF3

p22

p6

ORF1b

MTRPRO HEL

RNA1

RNA2

5 CP

p59 CPm

ORF5 ORF6

Hsp70h p8

ORF8ORF7 ORF9 ORF10 ORF11

p9p27p4

ORF4 ORF12

p73

22


vector es variable entre las diferentes especies de mosca blanca que lo transmiten.

En este trabajo se observ que B. tabaci biotipo B y T. abutilonea presentan mayor

eficiencia de transmisin que B. tabaci biotipo A y T. vaporariorum. ToCV se

mantiene hasta 5 das en T. abutilonea, 2 das en B. tabaci biotipo B y slo un da en

B. tabaci biotipo A y T. vaporariorum. Se ha comparado la eficiencia de transmisin

de ToCV y TICV mediante T. vaporariorum en infecciones simples y mixtas, no

encontrndose diferencias significativas (Dalmon et al., 2009). Adems, se ha

comprobado que la coinfeccin de ambos virus altera el patrn de acumulacin de

cada uno de ellos de una manera especfica de husped y la eficiencia de transmisin

depende de la concentracin viral en la planta utilizada como fuente de inculo

(Wintermantel et al., 2008).

CBA

Figura 4. Individuos adultos de Bemisia tabaci (A), Trialeurodes vaporariorum (B) y T. abutilonea (C).

Desde el ltimo cuarto del siglo pasado las poblaciones de B. tabaci han

aumentado de manera significativa en muchas zonas del mundo, especialmente en

las regiones con clima tropical, subtropical, rido y mediterrneo (Morales, 2007).

No se conocen las causas de este incremento aunque se especula sobre una

combinacin de factores como son el uso abusivo de insecticidas orgnicos

sintticos que provoca la aparicin de poblaciones resistentes, la intensificacin de

las prcticas agrcolas de tipo monocultivo, el transporte de material vegetal

infestado entre pases e incluso el cambio climtico global (Lacasa et al., 1998;

Wisler et al., 1998a). Desde la dcada de 1990, las poblaciones de T. vaporariorum

23


parecen estar siendo desplazadas progresivamente por las de B. tabaci en distintas

zonas del mundo (Clix et al., 1996; Berdiales et al., 1999).

En la especie B. tabaci existen variantes denominadas biotipos,

indistinguibles morfolgicamente, pero con caractersticas biolgicas diferenciales

que incluyen la gama de plantas husped (Brown et al., 1995; Guirao et al., 1997).

Se ha sugerido que la rpida y reciente dispersin de B. tabaci en todo el mundo

podra deberse al desplazamiento de algunos de los biotipos autctonos por el

biotipo B, con mejor capacidad de adaptacin (Bedford et al., 1994). En nuestro

pas, a diferencia de lo que se ha descrito en otros, el biotipo mayoritario no es el B

sino un biotipo que es probablemente autctono de la regin mediterrnea, el biotipo

Q (Banks et al., 1998; Simn et al., 2001). En Norte Amrica, por ejemplo, s ha

tenido lugar el desplazamiento del biotipo A preexistente por el B (Wisler et al.,

1998a).

Existe poca informacin acerca de los determinantes virales de los miembros

de la familia Closteroviridae implicados en la transmisin por vectores. Los trabajos

desarrollados hasta el momento indican que la protena CPm de closterovirus est

implicada en el proceso de transmisin (Tian et al., 1999) y que las diferencias

encontradas en la secuencia y el tamao de esta protena pudieran estar implicadas

en la especificidad de estos virus por la especie de mosca blanca (Livieratos et al.,

2001). Se ha sugerido que las protenas CPm de BYV y CTV tambin estaran

implicadas en la transmisin por los vectores, en este caso pulgones (Agranovsky et

al., 1995; Febres et al., 1996).

Sntomas en tomate

Los sntomas producidos por ToCV en tomate consisten en manchas

clorticas irregulares que evolucionan hacia una clorosis internervial que aparece

inicialmente en las hojas inferiores y que posteriormente se extiende hacia la parte

superior de la planta. A veces aparecen manchas de color prpura y necrosis. Las

24


hojas viejas se enrollan longitudinalmente y adquieren textura quebradiza (Fig. 5).

Estos sntomas son similares a los producidos por TICV en tomate (Duffus et al.,

1996; Wisler et al., 1998a).

A

B

Figura 5. Sntomas de amarilleo en plantas de tomate causados por la infeccin por tomato chlorosis virus. A: Amarilleo internervial en hojas adultas de una planta infectada (derecha) junto a una planta asintomtica (izquierda). B: Planta de tomate totalmente afectada por amarilleo (derecha) junto a una planta asintomtica (izquierda).

La produccin puede verse disminuida debido a la reduccin de la capacidad

fotosinttica de las plantas afectadas. En ocasiones se observa una reduccin en el

nmero y tamao de los frutos (Wisler et al., 1998a), as como aborto floral y falta

de cuajado de frutos o retraso en la maduracin y falta de coloracin adecuada de los

mismos (Lozano et al., 2006a). El sndrome de amarilleo causado por ToCV puede

ser confundido con desrdenes fisiolgicos o nutricionales e incluso con

fitotoxicidad por pesticidas (Wisler et al., 1998b).

25


Gama de huspedes

Adems de tomate, ToCV infecta de manera natural otras especies de la

familia Solanaceae, as como algunas de las familias Chenopodiaceae y Compositae

(Tabla 1). La gama de huspedes experimentales de ToCV es ms amplia,

comprendiendo al menos 25 especies pertenecientes a ocho familias, e incluye

algunos cultivos importantes, plantas ornamentales y malas hierbas (Tabla 2). Los

sntomas producidos por ToCV varan dependiendo del husped pero normalmente

consisten en un amarilleo internervial y sntomas similares a los producidos en

tomate (Wintermantel y Wisler, 2006). Estos huspedes, al actuar como reservorios

naturales del virus, podran influir en la epidemiologa de la enfermedad en tomate u

otros cultivos.

Tabla 1. Huspedes naturales de ToCV (Wisler et al., 1998b; Louro et al., 2000b; Font et al., 2004; Lozano et al., 2004; Tsai et al., 2004; Trenado et al., 2007).

Familia Especies susceptibles Chenopodiaceae Chenopodium album L.

C. murale L. Compositae Zinnia elegans Jacp.

Solanaceae Solanum lycopersicum L. S. nigrum L. Capsicum annuum L. Datura stramonium L. Physalis ixocarpa Brot. P. peruviana L.

26


Tabla 2. Huspedes experimentales de ToCV (Morris et al., 2006; Wintermantel y Wisler, 2006; Trenado et al., 2007).

Familia Especies susceptibles Aizoaceae Tetragonia expans Murr. Amaranthaceae Gomphrena globosa L. Apocynaceae Vinca rosea L. Chenopodiaceae Beta macrocarpa Guss.

Chenopodium capitatum (L.) Asch. C. murale L. Spinacia oleracea L.

Compositae Callistephus chinensis (L.) Nees Calendula officinalis L.

Plumbaginaceae Limonium latifolium (J.E. Sm.) Kuntze Solanaceae Solanum lycopersicum L.

S. nigrum L. S. acaule Bitter Nicotiana benthamiana Domin. N. clevelandii Gray N. edwardsonii Christie & D.W. Hall N. glutinosa L. N. megalosiphon Huerch & Muell. N. tabacum L. Petunia hybrida Vilm. Physalis alkekengi L. P. ixocarpa Brot. P. peruviana L. P. wrightii Gray Cyphomandra betacea (Cav.) Sendt

Umbelliferae Anthriscus cereifolium (L.) Hoffm.

En el ao 1999 se observaron por primera vez plantas de pimiento cultivadas

en invernadero en la provincia de Almera con sntomas de amarilleo internervial en

hojas adultas que recordaban a los ocasionados por crinivirus en otros cultivos.

Adems, estas plantas presentaban abarquillado de las hojas, acortamiento de los

entrenudos, reduccin de la altura, falta de vigor y aborto floral (Fig. 6). En estos

cultivos tambin eran frecuentes fuertes infestaciones de la mosca blanca B. tabaci,

27


lo que unido a la sintomatologa observada y a la presencia en zonas prximas de

cultivos de tomate con altas incidencias de amarilleo, hizo sospechar de la posible

infeccin por ToCV de las plantas sintomticas. El anlisis molecular confirm la

presencia de ToCV en las plantas de pimiento que presentaban el sndrome

anteriormente descrito, siendo sta la primera descripcin mundial de pimiento

como husped natural de este virus (Lozano et al., 2004).

AB

Figura 6. Sntomas observados en plantas de pimiento cultivadas en invernadero asociados a las primeras infecciones por ToCV detectadas en Espaa en la provincia de Almera. A: Manchas clorticas internerviales en hojas y abarquillado hacia el haz. B: Reduccin del crecimiento de las plantas. La flecha indica una planta sintomtica.

Distribucin geogrfica

ToCV fue detectado por primera vez en 1989 en cultivos de tomate de Florida

que mostraban un sndrome que se denomin desorden de la hoja amarilla (yellow

leaf disorder) o amarilleo, y se ha identificado en otras zonas de Estados Unidos

como Colorado y Louisiana (Wisler et al., 1998b). Posteriormente, este virus se

detect en Espaa (Navas-Castillo et al., 2000), Portugal (Louro et al., 2000a), Italia

28


(Accotto et al., 2001), Grecia (Dovas et al., 2002), Puerto Rico (Wintermantel et al.,

2001), Marruecos (Hanafi, 2002), Taiwn (Tsai et al., 2004), Israel (Segev et al.,

2004), Francia (Dalmon et al., 2005), Chipre (Papayiannis et al., 2006), Lbano

(Abou-Jawdah et al., 2006), Islas Reunin (Delatte et al., 2006), Sudfrica (EPPO,

2006), Mxico (Alvarez-Ruiz et al., 2007), Islas Mayotte (Mass et al., 2008),

Turqua (evik y Erki, 2008), Brasil (Barbosa et al., 2008), Cuba (Martnez-Zubiaur et al., 2008), Islas Mauricio (Lett et al., 2009), Costa Rica (Castro et al.,

2009) y Japn (Hirota et al., 2010) (Fig. 7).

Figura 7. Distribucin mundial de ToCV.

En 1997 se observaron de forma espordica en los cultivos de tomate bajo

plstico de las provincias de Almera y Mlaga sntomas inusuales y similares a los

descritos para las infecciones de ToCV y TICV (Duffus et al., 1996; Wisler et al.,

1998b). En aos posteriores el nmero de plantas afectadas por este sndrome

aument de manera notable en muchos invernaderos. Los sntomas observados,

junto con su distribucin en campo y asociacin con la presencia de la mosca blanca

B. tabaci, hizo sospechar de la implicacin de algn virus transmitido por este

29


insecto. Anlisis llevados a cabo mediante tcnicas moleculares confirmaron que

ToCV era el agente causal de esta sintomatologa (Navas-Castillo et al., 2000).

Desde entonces, se han sucedido epidemias anuales de amarilleo en el sur y sudeste

peninsular e Islas Canarias, con incidencias cada vez mayores, alcanzndose con

frecuencia infecciones del 100% (Lozano et al., 2006a). Hasta el momento se ha

encontrado ToCV en las provincias de Barcelona, Castelln, Valencia, Alicante,

Murcia, Almera, Granada, Cdiz, Mlaga, Sevilla, Islas Baleares, Santa Cruz de

Tenerife y Gran Canaria (Font et al., 2003, 2004; Lozano et al., 2006a).

ToCV tambin ha sido detectado puntualmente en Espaa y Portugal

infectando poblaciones naturales de las malas hierbas Solanum nigrum y Datura

stramonium (Louro et al., 2000b; Font et al., 2004).

Diagnstico

Los sntomas que ToCV y TICV producen en tomate son muy similares y

prcticamente indistinguibles, pero puede diferenciarse entre ambos utilizando

plantas indicadoras. As, Nicotiana benthamiana y N. clevelandii presentan

amarilleos internerviales cuando estn infectadas por TICV o ToCV, pero

nicamente TICV induce manchas necrticas (Wisler et al., 1998b). Este

diagnstico biolgico, que implica la transmisin mediante insectos vectores, no

slo es tedioso sino que requiere varias semanas para obtener los resultados y no es

prctico para el anlisis de un gran nmero de muestras.

Para el diagnstico rutinario de numerosos virus de plantas se han aplicado

con xito mtodos serolgicos como la tcnica inmunoenzimtica ELISA. Se han

producido antisueros policlonales frente a TICV (Duffus et al. 1996, Wisler et al.,

1998b) y frente a la protena de la cpsida de ToCV (Jacquemond et al., 2008), que

se han utilizado para el diagnstico de muestras de tomate infectadas de forma

natural y experimental. No obstante, se han encontrado problemas de diversa

naturaleza en la produccin de los antisueros y en el desarrollo del test ELISA: i) las

30


protenas de la cpsida de ToCV y TICV parecen tener escasas propiedades

inmunognicas, ii) son termosensibles y iii) se obtuvieron regularmente falsos

negativos, particularmente con ToCV. Esto hace que el test ELISA no sea

plenamente fiable para el diagnstico rutinario de estos virus (Jacquemond et al.,

2008).

Una alternativa a los mtodos serolgicos y que se ha aplicado con xito para

el diagnstico de virus de plantas es la hibridacin molecular con sondas marcadas

con digoxigenina. En el caso de ToCV se ha descrito la produccin de sondas

especficas de los genes Hsp70h y CP para el diagnstico en dot-blot o en improntas

de secciones transversales de peciolo de hoja (Louro et al., 2000a; Lozano et al.,

2006a).

Tambin se han desarrollado mtodos de deteccin de ToCV mediante

transcripcin reversa del RNA viral y posterior amplificacin mediante PCR. Se han

diseado iniciadores degenerados del gen Hsp70h que amplifican los genomas de

ToCV y TICV (Navas-Castillo et al., 2000) e iniciadores especficos de este gen y el

de la protena CP de ToCV (Louro et al., 2000a, Trenado et al., 2007). Dovas et al.

(2002) desarrollaron un mtodo basado en RT-PCR mltiple para la deteccin

simultnea de ambos virus; el proceso se realiza en dos pasos, RT-PCR usando

iniciadores degenerados para amplificar una regin del gen Hsp70h de ambos virus,

seguido de PCR nested mediante iniciadores especficos de cada uno de ellos.

Jacquemond et al. (2008) han desarrollado una RT-PCR mltiple con iniciadores del

gen CP para la deteccin de ToCV y TICV en un nico anlisis, permitiendo as la

deteccin de infecciones mixtas.

GENERACIN DE CLONES INFECTIVOS DE VIRUS DE RNA

La disponibilidad de clones infectivos de virus de RNA constituye una

herramienta muy valiosa para el estudio de distintos aspectos de su biologa. De

hecho, ha facilitado especialmente el estudio de aquellos virus que se encuentran en

31


la planta a ttulos muy bajos o cuya purificacin resulta muy complicada, adems de

presentar una ventaja para el estudio y manejo de aquellos virus transmitidos por

vectores. Esta herramienta permite manipular el genoma viral mediante mutaciones,

deleciones, inserciones y llevar a cabo experimentos de complementacin que

proporcionan informacin relevante sobre la biologa del virus (expresin gnica,

replicacin y movimiento) y sobre la interaccin virus-planta (Boyer y Haenni,

1994).

Los clones infectivos de virus de plantas de RNA de polaridad positiva

consisten tpicamente en un cDNA complementario al RNA genmico del virus y

una secuencia promotora de la transcripcin fusionada a su extremo 5 en un

plsmido bacteriano que acta como vector de clonacin.

Los principales pasos a seguir para la obtencin de un clon infectivo as como

algunas de las limitaciones ms comunes encontradas durante su desarrollo se

describen brevemente a continuacin. El primer paso consiste en la sntesis de un

cDNA complementario a la longitud total del genoma viral. La forma ms habitual

de obtenerlo es mediante una reaccin de transcripcin reversa sobre una

preparacin de virus purificado o extraccin de RNA total de planta infectada

utilizando un iniciador especfico del extremo 3 del genoma viral. La existencia de

estructuras secundarias en el molde de RNA viral puede complicar la obtencin de

la cadena sencilla de cDNA (Boyer y Haenni, 1994). Una vez obtenida, la primera

cadena de cDNA se convierte mediante PCR en cadena doble, iniciando la sntesis

con un segundo iniciador complementario al extremo 5 del RNA viral. Para facilitar

pasos posteriores, en los extremos de los iniciadores se suelen situar dianas de

restriccin para permitir realizar clonacin dirigida del cDNA en un vector adecuado

(Boyer y Haenni, 1994). La obtencin de un clon infectivo a partir de un genoma de

RNA de gran tamao presenta dificultad ya que la fidelidad de las transcriptasas

reversas y las DNA polimerasas decrece proporcionalmente con la longitud del

RNA (Lai, 2000). Existen alternativas como generar varios cDNAs con regiones

32


solapantes que unidos cubran la longitud total del genoma (Dawson et al., 1986).

Factores como el empleo de polimerasas termoestables de alta fidelidad y altamente

procesivas o incluso la cepa de virus con la que se trabaja puede en ocasiones influir

directamente en la infectividad del cDNA generado. Adems, una vez obtenido el

cDNA pueden surgir problemas de distinta naturaleza en los pasos posteriores que

dificulten la clonacin en s, como problemas de toxicidad en E. coli del cDNA

clonado (Boyer y Haenni, 1994) y la falta de vectores de clonacin adecuados para

genomas de gran tamao (Lai, 2000). Algunos de estos problemas se han resuelto

mediante la introduccin de intrones de planta (Yamshchikov et al., 2001),

utilizando vectores de bajo nmero de copia (Gritsun y Gould, 1998) o vectores

BAC (cromosomas artificiales bacterianos) (Almazn et al., 2000). Otro problema a

evitar es la presencia de nucletidos no virales en los extremos 5 y 3 del transcrito

que pueden reducir la infectividad (Boyer y Haenni, 1994).

En cuanto al promotor de transcripcin, un aspecto crtico en el desarrollo de

un clon infectivo es decidir si el cDNA va a ser expresado en un sistema in vitro o in

vivo. Si la expresin del cDNA va a realizarse in vitro, la seleccin del promotor

(procedente en la mayora de los casos de bacterifagos) ser muy importante ya que

puede afectar directamente al rendimiento de la transcripcin y a la secuencia de los

extremos terminales de los transcritos (Boyer y Haenni, 1994). Los promotores ms

utilizados son los de las RNA polimerasas de los bacterifagos T7, SP6 y T3. La

estrategia ms utilizada, por su simplicidad y eficacia, es la fusin del promotor al

cDNA viral por medio de PCR, introduciendo su secuencia en el iniciador del

extremo 5 precediendo a la secuencia del virus. Por otro lado, en el extremo 3 de la

secuencia viral se suele situar una diana de restriccin, para digerir el plsmido y

establecer la finalizacin de la transcripcin. Una vez obtenido el transcrito, ste

podr ser utilizado para la inoculacin de plantas (mediante inoculacin mecnica) o

de protoplastos (mediante electroporacin o mtodos qumicos como la utilizacin

de polietilenglicol). Varios parmetros pueden influir en la infectividad de los

33


transcritos: i) la heterogeneidad de la poblacin generada, ii) la presencia de

mutaciones y iii) la secuencia de los extremos 5 y 3 (presencia de nucletidos no

virales, necesidad de una estructura cap en el extremo 5 o una cola poli-A en el

extremo 3).

Para introducir el cDNA en la planta y lograr su transcripcin in vivo existen

dos alternativas principales, la infeccin mediante Agrobacterium tumefaciens

(agroinoculacin) y el bombardeo de partculas (biolstica). En la agroinoculacin

(Grimsley et al., 1986), el cDNA se sita bajo el control de un promotor de

transcripcin constitutivo (normalmente el promotor del RNA 35S de cauliflower

mosaic virus) y una seal de terminacin (como el terminador nos del gen de la

nopalina sintetasa de A. tumefaciens). La construccin resultante se introduce en un

vector binario que posee la secuencia repetida de los bordes izquierdo (left border,

LB) y derecho (right border, RB) del T-DNA. Durante la infeccin provocada por

A. tumefaciens, una copia de la regin del T-DNA situada entre LB y RB es

transferida al ncleo de la clula. Una vez all, acta la maquinaria de transcripcin

y, en su caso, de poliadenilacin y finalmente el RNA viral es trasladado al

citoplasma donde se inicia la infeccin viral.

Por otro lado, en la metodologa basada en la biolstica, que se ha utilizado

para la infeccin de plantas con RNA viral (Klein et al., 1987) y cDNA (Gal-On et

al., 1995), la inoculacin se lleva a cabo mediante el disparo de microproyectiles de

oro o tungsteno que van recubiertos de DNA, que se introducen directamente en el

ncleo de la clula. En este caso, el cDNA tambin se sita bajo el control de un

promotor de transcripcin y contiene una seal de terminacin.

Clones infectivos de virus de la familia Closteroviridae

Los miembros de la familia Closteroviridae poseen los genomas de RNA de

mayor tamao entre los virus de plantas. Esto determina que la obtencin de clones

34


infectivos de estos virus sea un proceso especialmente dificultoso debido a la

concatenacin de algunos de los problemas mencionados en el apartado anterior.

Hasta el momento, se ha logrado la construccin de clones de cDNA

completos e infectivos de slo cuatro especies de esta familia, tres del gnero

Closterovirus, BYV (Peremyslov et al., 1998), CTV (Satyanarayana et al., 1999) y

GLRaV-2 (Liu et al., 2009), y uno del gnero Crinivirus, LIYV (Klaassen et al.,

1996). En el caso de CTV, BYV y LIYV, la infectividad se logr en primer lugar

mediante la inoculacin de transcritos generados in vitro a partir de promotores de

RNA polimerasas de bacterifagos (SP6, T3) en protoplastos de N. benthamiana o

N. tabacum. La disponibilidad de estos clones ha permitido determinar las funciones

de algunos de los mltiples genes que conforman el genoma de estos virus.

Mediante la inoculacin de transcritos obtenidos in vitro de clones infectivos

de BYV en protoplastos de N. tabacum y anlisis mutacionales se ha identificado

que los genes ORF1a y ORF1b son esenciales para la replicacin del RNA y que la

protena p21 funciona como un intensificador de este proceso (Peremyslov et al.,

1998). Utilizando modificaciones de estos clones que incluan el gen GUS (-glucuronidasa) fusionado a diversos genes virales, se ha determinado la cintica de

transcripcin de los genes Hsp70h, CPm, CP, p64, p21 y p20 de este virus

(Hagiwara et al., 1999). Utilizando diversos mutantes se ha determinado que la

protena CP es esencial en la encapsidacin del cuerpo del virin (Alzhanova et al.,

2001) y las protenas CPm, Hsp70 y p64 en la encapsidacin de la cola (Alzhanova

et al., 2001; Napuli et al., 2003). Mediante la inoculacin mecnica de transcritos

obtenidos in vitro a partir de construcciones con GFP (green fluorescent protein) de

mutantes de BYV en Claytonia perfoliata o N. benthamiana se observ que las

protenas CP, CPm Hsp70h, p64 y p6 son esenciales para el movimiento intercelular

del virus (Peremyslov et al., 1999; Alzhanova et al., 2000; Napuli et al., 2003).

35


En el caso de CTV, mediante la delecin de los 10 genes del extremo 3, se

obtuvo un clon infectivo eficiente y ms fcilmente manipulable (Satyanarayana et

al., 1999), y por tanto se determin que estos genes no son esenciales para la

replicacin viral. Mediante anlisis mutacionales en el extremo 3-UTR se

determin que esta regin est implicada en una correcta replicacin del virus

(Satyanarayana et al., 2002a). La obtencin y manipulacin de diversos

minireplicones en los que se suprimieron o mutaron distintas regiones genmicas

codificantes tambin ha permitido avanzar en el conocimiento de la regulacin

gnica. Se han caracterizado los elementos controladores de los sgRNAs de los

genes CP y CPm y se ha determinado que cada elemento produce tres sgRNAs, uno

de polaridad positiva 5 terminal y dos de polaridad positiva y negativa 3 terminales

(Gowda et al., 2001). Adems, se ha localizado un elemento controlador en el

extremo 5 del genoma de CTV que produce sgRNAs 5 y 3 terminales (Gowda et

al., 2003a). Deleciones en el gen que codifica la protena p23 pusieron de manifiesto

su influencia en la acumulacin asimtrica del las cadenas de RNA positivas y

negativas de CTV as como la regin implicada en ello (Satyanarayana et al.,

2002b). Mediante la utilizacin del sistema gentico de CTV tambin se han

determinado las protenas implicadas en un eficiente ensamblaje del virin, como

son la CP, CPm, Hsp70h y p61 (Satyanarayana et al., 2000) as como el extremo 5-

UTR (Gowda et al., 2003b). Se ha observado la encapsidacin del virus por parte de

la CPm en ausencia de la CP, mientras que en presencia de Hsp70h y p61 se

restringe la encapsidacin a unos 630 nt del extremo 5 (Satyanarayana et al., 2004).

A pesar de que tanto los niveles de replicacin como la cantidad de viriones

formados en protoplastos de N. benthamiana es muy baja, la amplificacin mediante

pases sucesivos a nuevos lotes de protoplastos se ha utilizado para la obtencin de

cantidades suficientes de viriones para la posterior inoculacin mecnica en plantas

de ctricos (Satyanarayana et al., 2001). Esto ha permitido poner de manifiesto que

las protenas p33, p18 y p13 no estn implicados en el movimiento, mientras que

mutaciones en los genes que codifican las protenas p6 o p20 impidieron la infe

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Tesis Isabel Fortes