TESIS Perbandingan Hasil Pemeriksaan Morfologi Spermatozoa ...repository.unair.ac.id/57255/9/57255.compressed.pdf · morfologi berpengaruh sejak proses maturasi spermatozoa hingga

TESIS

Perbandingan Hasil Pemeriksaan Morfologi Spermatozoa Manusia Menggunakan Metode

Pewarnaan Papanicolaou, Diff-Quik dan Safranin-Kristal Violet di RSUD dr. Soetomo

Surabaya

Oleh :

Hengki Lukas, dr

Program Pendidikan Dokter Spesialis Andrologi

Fakultas Kedokteran UNAIR - RSUD dr. SOETOMO SURABAYA

2016

ADLN - PERPUSTAKAAN UNIVERSITAS AIRLANGGA

TESIS PERBANDINGAN MORFOLOGI .... HENGKY LUKAS, dr

Perbandingan Hasil Pemeriksaan Morfologi Spermatozoa Manusia Menggunakan Metode

Pewarnaan Papanicolaou, Diff-Quik dan Safranin-Kristal Violet di RSUD dr. Soetomo

Surabaya

TESIS

Untuk memperoleh Gelar Dokter Spesialis Andrologi Dalam Program Studi Andrologi Fakultas Kedokteran Universitas Airlangga

dan dipertahankan di hadapan Panitia Ujian Akhir

Pada hari: Rabu Tanggal: 3 Agustus 2016 Pukul :10.00-12.00 WIB

Oleh :

Hengki Lukas, dr NIM. 011228216301

Program Pendidikan Dokter Spesialis Andrologi

Fakultas Kedokteran UNAIR - RSUD dr. SOETOMO SURABAYA

2016





PENETAPAN PANITIA PENGUJI

Telahdiujipada

Tanggal 2 Agustus 2016

PANITIA PENGUJI TESIS

Ketua : Prof. Dr. Alex Pangkahila, dr.,M.Sc.,Sp.And

Anggota : 1. Prof. Dr. F.X. Arif Adimoelja, dr.,M.Sc.,Sp.And

2. Aucky Hinting, dr., P.hD., Sp.And

3. Hamdani Lunardhi, dr.,M.Kes.,Sp.And

4. Judie Hartono, dr., MS.,Sp.And

5Supardi, dr.,Sp.And

Ditetapkandengan Surat Keputusan DekanFakultas Kedokteran UniversitasAirlangga

Nomor 255/url3.1.1/KD/2016 Tanggal : 15 Juli 2016



UCAPAN TERIMA KASIH

Atas kebesaran-Nya dan rasa nikmat syukur yang mendalam saya panjatkan kehadirat

Tuhan YME, karena berkat rahmat dan petunjuk-Nya lah sehingga saya dapat menyelesaikan

tugas akhir ini berkat bantuan berbagai pihak.

Untuk itu perkenankan saya mengucapkan rasa hormat dan terima kasih yang setulus-

tulusnya serta penghargaan yang setinggi-tingginya kepada selaku pembimbing utama

Hamdani Lunardhi, dr., M.Kes., Sp.And dan Supardi, dr., Sp.And selaku pembimbing

kedua, dimana walaupun beliau sangat sibuk dengan berbagai aktivitas, tetapi masih bisa

meluangkan waktunya untuk memberikan bimbingan, motivasi, kritik, dan saran, mulai dari

persiapan proposal, saat penelitian, hingga sampai selesainya penulisan tugas akhir ini.

Dengan selesainya tugas akhir ini, perkenankanlah saya mengucapkan terima kasih

yang sebesar-besarnya kepada :

Prof. Dr. Moh. Nasih, SE., MT., Ak., CMA. Selaku Rektor Universitas Airlangga

atas ijin serta kesempatan yang diberikan kepada saya untuk mengikuti dan menyelesaikan

Program Pendidikan Dokter Spesialis I Program studi Andrologi.

Dekan Fakultas Kedokteran Universitas Airlangga, Prof. Dr. Dr. Soetojo, Sp.U. dan

direktur RSUD dr Soetomo, Harsono, dr. yang telah memberikan ijin dan fasilitas, sehingga

saya dapat mengikuti dan menyelesaikan Program Pendidikan Dokter Spesialis I program

studi Andrologi.

Ketua Departemen Biologi Kedokteran Fakultas Kedokteran Universitas Airlangga

Dr Rina Yudiwati., dr., MS. yang telah memberikan ijin fasilitas,sehingga saya dapat

mengikuti dan menyelesaikan Program Pendidikan Dokter Spesialis I program studi

Andrologi.



Koordinator Program Studi Andrologi, Hamdani Lunardhi, dr., M.Kes., Sp.And

atas ijin serta kesempatan yang telah diberikan untuk dapat mengikuti dan menyelesaikan

Program Pendidikan Dokter Spesialis I program studi Andrologi, serta segala dorongan,

bimbingan secara intensif di sela-sela kesibukan beliau, nasehat dan bantuannya yang tak

ternilai selama program pendidikan, sehingga tugas akhir ini dapat terselesaikan.

Pembimbing tesis Hamdani Lunardhi, dr., M.Kes., Sp.And dan Supardi, dr.,

Sp.And atas segala bimbingan, nasehat, dan dorongan, serta bantuannya sehingga saya dapat

menyelesaikan tugas akhir ini.

Seluruh staff pengajar di program studi Andrologi serta Departemen biologi

kedokteran khususnya kepada Aucky Hinting, dr., Ph.D., Sp.And, H. Aswin, dr., MS,

(Alm). Onny Pieters Sono, dr., Sp.And, M.P. Budiyandini Dyah Pramesti, dr., M.Kes.,

Sp.And, Dr Reny I’tishom, Spi., M. Si., Sri Musta’ina Dra., M.Kes, Zakiyatul Faizah,

dr., M.Kes, Ninik Darsini, dr., Mbiomed, Agustinus, dr., Sp.And dan atas segala

bimbingan, nasehat, dan dorongan, serta bantuannya sehingga saya dapat menyelesiakan

tugas akhir ini.

Kepala SMF Andrologi RSUD dr Soetomo Tjahjo Djojo Tanojo, dr., MS., Sp.And.,

Kepala IRJ Andrologi RSUD dr Soetomo Judie Hartono, dr., MS., Sp.And, kepala bidang

penelitian dan preparasi spermatozoa Andrologi RSUD dr Soetomo Supardi, dr., Sp.And,

kepala laborataroium Andrologi RSUD dr Soetomo Pety Narulita, dr., Sp.And, dan staff

pengajar program studi Andrologi Susanto Suryatmaja, dr., MS., Sp.And atas segala

dorongan, bimbingan, dan kerjasamanya selama saya menjalani pendidikan Andrologi.

Atikah, S.Si. M.Kes atas segala nasehat, bimbingan dan bantuannya dalam penulisan

hingga analisa penelitian, sehingga saya dapat menyelesaikan tugas akhir ini.



Neneng Dewi Kurniati, dr., Sp.MK , Rachmawati Thamrin, dr., Sp.And, Yukhi

Kurniawan, dr., Sp.And, Lunardhi Susanto, dr.,M.Kes dan seluruh rekan-rekan yang

telah membantu dan memberi dukungan dalam penyelesaian tugas akhir ini.

Ibu Yayuk, Mbak Nanis, dan Bapak Budi Sumengkar selaku karyawan yang telah

membantu dalam mengumpulkan data, pemeriksaan laboratorium hingga penelitian ini dapat

berjalan dengan lancar dan sesuai dengan jadwal.

Seluruh Responden yang telah bersedia menjadi relawan dalam penelitian ini, tanpa

kesedian mereka tentu penelitian ini tidak akan bisa berlangsung.

Kepada siapapun yang telah membantu dalam penyelesaian dalam tugas akhir ini,

namun kekhilafan belum saya sebutkan, saya ucapkan terima kasih.

Kepada kedua orang tua saya Bapak Michael Surya Santoso dan Ibu Catharina

Tjandrawati, atas segala dukungan doa, pengertian dan pengorbanannya yang mendalam

walaupun telah terabaikan perhatian dan kasih sayangnya selama saya mengikuti program

pendidikan Andrologi.

Semoga Tuhan yang Maha Pengasih dan Penyayang selalu melimpahkan rahmat dan

karuniaNya kepada kita semua. Amin.

Saya menyadari bahwa tugas akhir ini jauh dari sempurna, oleh karena itu saran dan

kritik sangat diharapkan untuk penyempurnaan selanjutnya.

Surabaya, 2 Agustus 2016

Peneliti

Hengki Lukas, dr





RINGKASAN

PERBANDINGAN HASIL PEMERIKSAAN MORFOLOGI SPERMATOZOA MANUSIA MENGGUNAKAN METODE PEAWRNAAN PAPANICOLAOU, DIFF-

QUIK DAN SAFRANIN-KRISTAL VIOLET DI SRUD DR. SOETOMO SURABAYA Hengki Lukas

Semen analisis rutin adalah metode pemeriksaan pada infertilitas pria yang memiliki

parameter penting salah satunya adalah morfologi karena dapat menunjukkan potensi kesuburan selain dapat menunjukkan struktur spermatozoa. Dalam fungsinya untuk menunjukkan kesuksesan fertilisasi, kriteria Kruger pada tahun 1986 mengatakan bahwa morfologi berpengaruh sejak proses maturasi spermatozoa hingga fertilisasi. Untuk menilai morfologi tesebut ada beberapa macam metode pewarnaan antara lain Papanicoloau, Diff-Quik dan Safranin-Kristal Violet dimana masing-masing pewarnaan memiliki kekurangan dan kelebihan. Papanicolaou didalam prosedurnya terdiri dari 20 langkah pewarnaan dan 3 bahan pewarna utama yang menentukan baik buruknya interpretasi pada morfologi spermatozoa. Sedangkan Diff-Quik hanya memiliki 5 langkah sederhana dan 3 larutan utama yang menentukan interpretasi morfologi spermatozoa. Safranin Kristal Violet memiliki 2 larutan utama serta 3 langkah sederhana dalam menentukan nterpretasi morfologi spermatozoa dimana belum ada penelitian yang membedakan ketiga metode pewarnaan ini.

Tujuan Peneltian : menganalisis perbedaan hasil pewarnaan metode Papanicolaou, Diff-Quik, dan Safranin-Kristal Violet.

Metode Penelitian : merupakan penelitian observasional analytic laboratorium. Rancangan penelitian ini menggunakan metode Komparatif dengan menggunakan analysis of varian atau ANOVA. Subyek dilakukan untuk membandingkan metode Papanicolaou, metode Diff-Quik dan metode Safranin- Kristal Violet pada analisis morfologi spermatozoa. Sampel penelitian sebesar 90 sampel.

Hasil Penelitian : setelah melalui uji normalitas Kolmogorov-Smirnov, didapatkan ukuran panjang dan lebar kepala spermatozoa hasilnya p < 0.05 pada ketiga metode pewarnaaan setelah dilakukan uji Mann-Whitney dan Games-Howell. Pada bentukan amorph, vakuola dan akrosom hasilnya p<0.05 pada ketiga metode pewarnaan setelah diuji dengan Mann-Whitney. Pada hasil uji beda mid piece parameter ketebalan spermatozoa hasilnya p<0.05 setelah dilakukan uji menggunakan Games-Howell dan yang terakhir adalah perbedaan pada ERCdengan p<0.05 setelah menggunakan uji Mann-Whitney.

Kesimpulan : 1)Terdapat perbedaan pada hasil analisis morfologi kepala spermatozoa. Ukuran panjang dan lebar metode metode Diff-Quik lebih besar daripada metode Papanicolaou dan metode Safranin-Kristal Violet, Metode Safranin-Kristal violet mendekati nilai panjang dan lebar metode Papanicolaou. Terdapat perbedaan pada hasil analisis bentukan amorph, vakuola dan akrosom spermatozoa, metode pewarnaan Diff-Quik tidak dapat mewarnai dengan sempurna bentukan amorph, vakuola maupun akrosom, metode pewarnaan Safranin-Kristal violet sama dengan metode pewarnaan Papanicolaou sesuai standar yang telah ditetapkan. 2) Terdapat perbedaan pada hasil analisis morfologi terhadap parameter ketebalan mid piece, metode pewarnaan Safranin-Kristal Violet dapat mewarnai dengan sempurna ketebalan mid piece sesuai dengan standar yang telah ditetapkan. 3) Tidak terdapat perbedaan pada hasil analisis morfologi principal piece spermatozoa, ketiga pewarnaan dapat mewarnai dengan sempurna sesuai standar yang telah ditetapkan. 4) Terdapat perbedaan pada hasil analisis morfologi ERC , metode pewarnaan Diff-Quik tidak dapat mewarnai ERC dengan sempurna dibandingkan kedua metode yang lain. Sedangkan metode pewarnaan Safranin-Kristal Violet sama dengan metode pewarnaan Papanicolaou sesuai standar yang telah ditetapkan.



ABSTRACT

Comparison staining methods use Papanicolaou, Saffranin, and Diffquik of evaluating the morphology of human spermatozoa in Andrology Clinic, dr Soetomo hospital, Surabaya

Hengki Lukas

OBJECTIVE: The aim of this study was to analyzed the differences between the methods of Papanicolaou, Safranin-Crystal violet and Diff-Quik stain and to find the alternative of gold standard stain.

METHOD: The Design of research was obeservational analytic laboratory study, performed on patient who came to dr Soetomo hospital, Surabaya in the October 2015 – Februari 2016. Reasearch examined the morfologi spermatozoa and examined with three method: Papanicoloau, Safranin-Crystal violet, and Diff-Quik and then compare it.

RESULTS : The results, a total of human sperm who sperm morfologi examined with Papanicolaou, safranin-Crystal violet and Diff-Quik for five month at dr Soetomo hospital from October 2015 to February 2016 as many 90 taken his sperm and checking sperm morfologi with Papanicolaou, Safranin-Crystal violet, and Diff-Quik.

The results of statistical analysis found that there is significant between three method that we examine. In the category length and width there are significant different p < α between Diff-Quik, Safranin-Crystal Violet and Diff-Quik-Papanicolaou, whereas no significant different between Safranin-Crystal violet -Papanicolaou p > α. Similar result were shown by category vacuoles, acrossom, mid piece, and ERC. In the third method showed a significant different.

CONCLUSION : Safranin-Crystal Violet stained as good as gold standard for analyzing morphology human spermatozoa such as head size, head shape, vacuoles, acrosomes, mid piece , principal piece and Excess Residual Cytoplasm. Based on that, Safranin – Crystal Violet could be one of the alternatives in staining methods.

KEY WORD : Sperm morphology, Papanicolaou, Safranin-Crystal violet, Diff-Quik.



DAFTAR ISI

Halaman

Sampul depan................................................................................................................... i

Sampul belakang…………….………………………………………………………….

ii

Lembar Pengesahan...................................................................................................... iii

Penetapan Panitia Penguji............................................................................................ iv

Ucapan Terima Kasih …..…………………………………………………………….. v Lembar Pernyataan Orsinilitas………………………………………………………… viii Ringkasan……………………………………………………………………………… ix Abstract.......................................................................................................................... x

Daftar Isi........................................................................................................................ xi

Daftar Gambar............................................................................................................... xiv

Daftar Tabel................................................................................................................... xvii

Daftar Lampiran............................................................................................................ xix

BAB 1 PENDAHULUAN................................................................................... 1

1.1 Latar Belakang Masalah.......................................................................... 1

1.2 Rumusan Masalah.................................................................................... 3

1.3 Tujuan Penelitian...................................................................................... 3 1.3.1 Tujuan umum................................................................................ 3 1.3.2 Tujuan khusus............................................................................... 4

1.4 Manfaat Penelitian................................................................................... 4 1.4.1 Manfaat teoritis…………………………………………………. 4 1.4.2 Manfaat praktis…………………………………………………. 4

BAB 2 TINJAUAN PUSTAKA......................................................................... 5

2.1 Maturasi Spermatozoa.............................................................................. 6

2.2 Semen dan Plasma Semen........................................................................ 6

2.3 Analisis Semen Rutin............................................................................... 7



2.4 Makroskopis……………………………………………………………. 8

2.5 Mikroskopis…………………………………………………………….. 9

2.6 Morfologi.................................................................................................. 11 2.7 Struktur Spermatozoa............................................................................... 11 2.7.1 Kepala Spermatozoa…………………………………………... 11

2.7.2 Ekor Spermatozoa…………………………………………….. 12

2.8 Assesment Morfologi Spermatozoa…………………………….……… 14

2.9 Klasifikasi Morfologi Spermatozoa………………………………….. 14

2.10 Kriteria Kruger........................................................................................ 15

2.11 Perhitungan Morfologi Spermatozoa…………………………………... 16

2.12 Mekanisme pewarnaan............................................................................. 16

BAB 3 KERANGKA KONSEP......................................................................... 39

3.1 Kerangka Konseptual…………………………………………………... 39

3.2 Hipotesis.................................................................................................. 42

BAB 4 METODE PENELITIAN...................................................................... 43

4.1 Jenis dan Rancangan Penelitian............................................................... 43

4.2 Rancangan Penelitian............................................................................... 43

4.3 Tempat dan Waktu Penelitian................................................................. 44

4.4 Populasi Penelitian.................................................................................. 44

4.5 Sampel Penelitian dan besar Sampel Penelitian (n)................................. 44

4.6 Kriteria Inklusi dan Ekslusi..................................................................... 45

4.7 Teknik Pengambilan Sampel.................................................................... 45

4.8 Variabel Penelitian................................................................................... 45

4.9 Definisi Operasional Variabel................................................................. 46

4.10 Alat dan Bahan......................................................................................... 46

4.11 Prosedur Kerja.......................................................................................... 47



4.12 Alur Penelitian……................................................................................ 50

4.13 Pengolahan dan Analisis Data.................................................................. 50

BAB 5 HASIL PENELITIAN............................................................................ 52

5.1 Karakteristik Sampel................................................................................ 52

5.2 Data khusus ............................................................................................. 52

BAB 6 PEMBAHASAN...................................................................................... 77 BAB 7 KESIMPULAN DAN SARAN.............................................................. 81 DAFTAR PUSTAKA..................................................................................................... 83



DAFTAR GAMBAR

Gambar Halaman

2.1 Feathering technique...................................................................... 14

2.2 Ionisasi jaringan amino dan ikatan dengan eosin........................... 18

2.3 Ionisasi golongan sulfat pada jaringan dan turunannya yang mengikat pada methylane blue.......................................................................

19

2.4 Efek ion yang berlawanan................................................................ 20

2.5 Efek ion garam dimana methylane blue bisa mengikat carboxyl.......... 22

2.6 Ikatan Van der Waals....................................................................... 23

2.7 Konversi pada benzene untuk menjadi suatu zat pewarna dengan penambahan chromophores dan auxochromes...................................

24

2.8 Struktur Quininoid......................................................................... 25

2.9 Struktur Congo Red........................................................................ 25

2.10 Xanthene....................................................................................... 26

2.11 Thiazine......................................................................................... 26

2.12 Mordanting.................................................................................... 27

2.13 Methachromasia............................................................................. 29

2.14 Gambar bangun Haematoxylin......................................................... 30

2.15 Haematin........................................................................................ 31

3.1 Kerangka Konseptual....................................................................... 41

4.1 Rancangan Penelitian........................................................................ 43

4.2 Alur Penelitian………..................................................................... 50

5.1 Diagram hasil uji beda panjang rata-rata menggunakan Kruskal-Wallis (KW)…………………………………………………………..

53

5.2 Diagram hasil uji beda lebar rata-rata menggunakan Brown-Forsythe (BF)…………………………………………………………………..

54

5.3 Diagram hasil uji beda taperred menggunakan Kruskal-Wallis (KW)…………………………………………………………………..

56



5.4 Diagram hasil uji beda pyri menggunakan ANOVA…………………… 56

5.5 Diagram hasil uji beda round menggunakan Kruskal-Wallis (KW)….

57

5.6 Diagram hasil uji beda amorph menggunakan Kruskal-Wallis (KW)..

57

5.7 Diagram hasil uji beda vacuoles> 2 menggunakan Kruskal-Wallis (KW)…………………………………………………………………

58

5.8 Diagraml hasil uji beda vacuoles LNV menggunakan Kruskal-Wallis (KW)…………………………………………………………………..

58

5.9 Diagram hasil uji beda vacuolesPA menggunakan Kruskal-Wallis (KW)………………………………………………………………….

59

5.10 Diagram hasil uji beda akrosom < 40% menggunakan Kruskal-Wallis (KW)…………………………………………………………..

60

5.11 Diagram hasil uji beda akrosom> 70% menggunakan Kruskal-Wallis (KW)…………………………………………………………………..

60

5.12 Diagram hasil uji beda akrosom terwarnai sempurna menggunakan Kruskal-Wallis (KW)………………………………………………….

61

5.13 Diagram hasil uji beda akrosom terwarnai tidak sempurna menggunakan Kruskal-Wallis (KW)………………………………….

61

5.14 Diagram Hasil uji beda head terwarnai sempurna menggunakan Kruskal-Wallis (KW)………………………………………………….

62

5.15 Diagram hasil uji beda head terwarnai tidak sempurna menggunakan Kruskal-Wallis (KW)………………………………………………….

62

5.16 Diagram hasil uji beda mid piece insertion menggunakan Kruskal-Wallis (KW)…………………………………………………………..

64

5.17 Diagram hasil uji beda mid piece thick dilakukan uji Brown-Forsythe (BF)……………………………………………………………………

65

5.18 Diagram hasil uji beda mid piece thin menggunakan Kruskal-Wallis (KW)…………………………………………………………………..

65

5.19 Diagram hasil uji beda mid piece irregular menggunakan Kruskal-Wallis (KW)…………………………………………………………..

66

5.20 Diagram hasil uji beda mid piece bent menggunakan Kruskal-Wallis (KW)…………………………………………………………………..

66



5.21 Diagram hasil uji beda mid piece terwarnai sempurna menggunakan Kruskal-Wallis (KW)………………………………………………….

67

5.22 Diagram hasil uji beda mid piece terwarnai tidak sempurna menggunakan Kruskal-Wallis (KW)………………………………….

67

5.23 Diagram hasil uji beda short menggunakan Kruskal-Wallis (KW)….

69

5.24 Diagram hasil uji beda multiple menggunakan Kruskal-Wallis (KW)..

69

5.25 Diagram hasil uji beda broken menggunakan Kruskal-Wallis (KW)…

70

5.26 Diagram hasil uji beda bent menggunakan Kruskal-Wallis (KW)……

70

5.27 Diagram hasil uji beda irregular menggunakan Kruskal-Wallis (KW)

71

5.28 Diagram hasil uji beda looped menggunakan Kruskal-Wallis (KW)…

71

5.29 Diagram hasil uji beda coiled menggunakan Kruskal-Wallis (KW)….

72

5.30 Diagram hasil uji beda principal piece terwarnai sempurna menggunakan Kruskal-Wallis (KW)………………………………….

72

5.31 Diagram hasil uji beda principal piece terwarnai tidak sempurna menggunakan Kruskal-Wallis (KW)………………………………….

73

5.32 Diagram hasil uji beda ERC terwarnai sempurna menggunakan Kruskal-Wallis (KW)…………………………………………………

74

5.33 Diagram hasil uji beda ERC terwarnai tidak sempurna menggunakan Kruskal-Wallis (KW)………………………………………………….

75

5.34 Diagram hasil uji beda ERC normal menggunakan Kruskal-Wallis (KW)…………………………………………………………………..

75

5.35 Diagram hasil uji beda ERC tidak normal menggunakan Kruskal-Wallis (KW)………………..………………………………………….

76



DAFTAR TABEL

Tabel Halaman

2.1 Jenis Ikatan dan Ukuran Kekuatan............................................................. 17

2.2 Metachrome dan Rentang Pada Kepala Acidic............................................ 28

2.3 Mordant yang bisa digunakan bersama Haematoxylin................................. 33

5.1 Hasil uji menggunakan One-Sample Kolmogorov-Smirnov Test untuk ukuran kepala spermatozoa………………………………………………….

52

5.2 Hasil uji beda untuk ukuran kepala spermatozoa menggunakan Kruskal-Wallis (KW), Mann-Whitney (MW), Brown-Forsythe (BF) dan Games-Howell (GH)……………….………………………………………………………

52

5.2.1 Hasil uji beda terkecil panjang rata-rata menggunakan Mann-Whitney (MW)………………………………………………………

53

5.2.2 Hasil uji beda lebar rata-rata terkecil menggunakan Games-Howell (GH)…………………………………………………………….................

54

5.3 Hasil uji distribusi normal untuk bentuk kepala spermatozoa menggunakan One-Sample Kolmogorov-Smirnov Test………………………………………….

54

5.4 Hasil uji beda untuk bentuk kepala spermatozoa menggunakan ANOVA, Kruskal-Wallis (KW) dan Mann Whitney (MW)…………………………...

55

5.4.1 Hasil uji beda amorph menggunakan Mann-Whitney (MW)……………………………………………………………..

57

5.4.2 Hasil uji beda vacuoles > 2 menggunakan Mann-Whitney (MW)……………………………………………………..……….

58

5.4.3 Hasil uji beda vacuoles LNV menggunakan Mann-Whitney (MW)………………………………………………………………

59

5.4.4 Hasil uji beda vacuoles PA menggunakan Mann-Whitney (MW)…………………………………………………………….…..

59

5.4.5 Hasil uji beda akrosom terwarnai sempurna menggunakan Mann-Whitney (MW)………….…………………………………………...

61

5.4.6 Hasil uji beda akrosom terwarnai tidak sempurna menggunakan Mann-Whitney………………………………………………………

62

5.4.7 Hasil uji beda head terwarnai tidak sempurna menggunakan Mann-Whitney (MW)……………………………………………………………….

63

5.5 Hasil uji distribusi normal untuk bentuk mid piece spermatozoa menggunakan One-Sample Kolmogorov-Smirnov Test………………………...

63

5.6 Hasil uji beda untuk bentuk mid piece spermatozoa menggunakan Brown-Forsythe (BF), Games-Howell (GH), dan Kruskal-Wallis (KW)…………...

64

5.6.1 Hasil uji beda mid piece thick dilakukan uji Games-Howell (GH)……………………………………………………………...….

65



5.7 Hasil uji distribusi normal untuk bentuk principal piece spermatozoa menggunakan One-Sample Kolmogorov-Smirnov Test………………………...

68

5.8 Hasil uji beda untuk bentuk principal piece spermatozoa menggunakan Kruskal-Wallis (KW)………………………………………………………..

68

5.9 Hasil uji distribusi normal untuk bentuk ERC spermatozoa menggunakan One-Sample Kolmogorov-Smirnov Test………………………………………….

73

5.10 Hasil uji beda untuk bentuk ERC spermatozoa menggunakan Kruskal-Wallis (KW) dan Mann Whitney (MW)…………………………………….

74

5.10.1 Hasil uji beda ERC terwarnai sempurna menggunakan Mann-Whitney (MW)………………………………………………………………

75

5.10.2 Hasil uji beda ERC normal menggunakan Mann-Whitney (MW)……………………………………………………………..

75

5.10.3 Hasil uji beda ERC tidak normal menggunakan Mann-Whitney (MW)……………………………………………………………….

76



DAFTAR LAMPIRAN

Lampiran Halaman

1 Keterangan Kelaikan Etik................................................................. 84

2 Surat Persetujuan Ikut Penelitian...................................................... 85

3 Lembar Persetujuan Mengikuti Penelitian.......................................... 89

4 Data Dasar Hasil Penelitian Perbandingan Hasil Pemeriksaan Morfologi Spermatozoa Manusia Menggunakan Metode Pewarnaan Papanicolaou, Diff Quik dan Safranin-Kristal Violet di RSUD dr. Soetomo Surabaya...........................................................................

90

5 Gambar Alat................................................................................... 100

6 Gambar Hasil Pewarnaan.................................................................. 102

7 Hasil Analisis Statistik...................................................................... 107



BAB 1

PENDAHULUAN



BAB 1

PENDAHULUAN

1.1. Latar Belakang Masalah

Semen analisis rutin adalah metode pemeriksaan pada infertilitas pria, dimana

terdapat beberapa parameter penting seperti konsentrasi, motilitas dan morfologi.

Parameter ini dianggap paling berguna karena telah terbukti menunjukkan potensi

kesuburan. Dari semua parameter analisis semen rutin tersebut, morfologi

spermatozoa menjadi salah satu yang indikator paling kuat dari potensi kesuburan

seorang pria (Gravance et al., 1998, WHO 1999, Henkel et al., 2007, Van der Horst et

al., 2009).

Morfologi spermatozoa penting untuk mencapai kesuksesan fertilisasi (Kuster

et al., 2004). Kriteria Kruger pada tahun 1986 dan klasifikasi WHO bahwa morfologi

berpengaruh sejak spermatozoa mengalami maturasi hingga melaksanakan fungsinya

saat fertilisasi. Morfologi yang normal biasanya pada kepala spermatozoa

mengandung nucleus yang terdiri dari DNA dan RNA juga terdapat lipid,

mucoprotein, magnesium dan garam lainnya. Begitu pula pada leher serta ekor

spermatozoa yang memiliki komposisi lipid, garam kalium, kalsium dan garam

lainnya sebagai struktur penyusun spermatozoa (Moeloek,1983). Untuk menilai

normal atau tidaknya morfologi spermatozoa, pada laboratorium Andrologi

menggunakan beberapa metode pewarnaan.

Pewarnaan yang baik akan menghasilkan interpretasi morfologi yang baik

pula. Keakuratan penilaian morfologi sperma tergantung pada persiapan yang cermat,

fiksasi, dan pewarnaan sperma (GARCI'a-Herreros et al., 2006), karena prosedur ini



dapat mempengaruhi dimensi sperma secara signifikan (Meschede et al., 1993, Gago

dkk. 1998, Hidalgo et al., 2006, Lukaszewicz et al., 2008). Pada spermatozoa normal

strukturnya bagus, dengan komposisi seperti lipid, mucoprotein, garam-garam (Mg,

Fe, Cu, K dan fosfat) yang utuh (Van Dwye, 1954), akan memungkinkan dapat

terwarnai dengan sempurna daripada spermatozoa abnormal dimana terdapat

kemungkinan kerusakan pada bentuk spermatozoa yang mengakibatkan komposisi

tidak lengkap. Ada banyak metode pewarnaan antara lain Papanicolaou, Diff-Quik,

Safranin-Kristal Violet untuk pewarnaan spermatozoa manusia. Metode yang

digunakan dalam pewarnaan dapat menyebabkan sedikit perubahan dalam nilai-nilai

pengukuran spermatozoa misalnya proses fiksatif dapat menyebabkan sel menyusut

sedikit, metode pewarnaan Papanicolaou dengan pengukuran morfometer didapati

panjang 3-5 µm dan lebar 2-3 µm dianggap normal (WHO,1999). Nilai-nilai ini

berubah menjadi 5-6 µm (panjang) dan 2,5 µm - 3,5 µm (lebar) pada Metode

pewarnaan Diff-Quik. (Irez et al., 2007). Prosedur metode pewarnaan Papanicolaou

yang melibatkan pengolahan lebih dari 20 langkah dan lebih dari 12 larutan kimia

yang berbeda (WHO 1999). Prosedur pada metode pewarnaan Diff-Quik hanya

memerlukan kurang dari 5 langkah sederhana dan hanya melibatkan 3 larutan ,

sedangkan prosedur metode pewarnaan Safranin-Kristal Violet hanya memerlukan 4

larutan dengan 5 langkah sederhana. Pada metode poewarnaan Papanicolaou

didapatkan kombinasi pewarnaan haematoxilin untuk mewarnai inti sel dan

sitoplasma, bahan PTA (Phospotungsid Acid) pada eosin, light green dan orange G

(Papanicolaou 1942) yang memiliki keunggulan bisa membuat diferensiasi

pewarnaan jadi lebih bagus. (Ross 1953, Katz et al., 1986). Pada metode pewarnaan

Diff-Quik, mengandung fast green 0,002 g/l dalam methanol sebagai bahan fixatif,



eosin Y 1,22g/l dalam phospate buffer dengan pH 6,6 sebagai bahan pewarna yang

biasanya akan mewarnai sitoplasma dengan sempurna dan 0,1% sodium azide sebagai

preservative , thiazine dye 1,1g/l didalam phospate buffer pH 6,6 yang memiliki

kelebihan dimana lebih sederhana dan lebih cepat dalam proses pengerjaannya. Pada

metode pewarnaan Safranin-Kristal Violet , pewarna safranin digunakan sebagai

counterstain dan Kristal violet bereaksi dengan cara memisahkan ion dalam larutan

air ke dalam Ion CV + dan klorida (Cl- ). Ion ini menembus dinding sel dan membran

sel, ion CV + berinteraksi dengan komponen bermuatan negatif sehingga memberi

warna ungu pada sel tersebut. Counterstain, yang biasanya bermuatan positif

(safranin) akan memberikan decolorized pink.

Sampai saat ini, belum ada penelitian yang membandingkan hasil penilaian

morfologi spermatozoa manusia menggunakan metode pewarnaan Papanicolaou,

Diff-Quik, dan Safranin-Kristal Violet.

1.2. Rumusan Masalah

Apakah ada perbedaan pada hasil pemeriksaan morfologi spermatozoa manusia

antara metode pewarnaan Papanicolaou, Diff-Quik, dan Safranin-Kristal Violet

di RSUD dr Soetomo, Surabaya?

1.3. Tujuan Penelitian

1.3.1. Tujuan Umum :

Tujuan dari penelitian ini adalah untuk menganalisis perbedaan hasil pewarnaan

metode Papanicolaou, Diff-Quik, dan Safranin-Kristal Violet.



1.3.2. Tujuan Khusus :

1. Menganalisis hasil penilaian morfologi kepala spermatozoa manusia antara

metode pewarnaan Papanicolaou, Diff-Quik dan Safranin-Kristal Violet.

2. Menganalisis hasil penilaian morfologi mid piece spermatozoa manusia antara


3. Menganalisis hasil penilaian morfologi principal piece spermatozoa manusia

antara metode pewarnaan Papanicolaou, Diff-Quik dan Safranin-Kristal

Violet.

4. Menganalisis hasil penilaian morfologi ERC spermatozoa manusia antara


1.4. Manfaat Penelitian

1.4.1 Manfaat teoritis :

Dapat digunakan sebagai bahan rujukan untuk menentukan metode pewarnaan

standar baku baru.

1.4.2. Manfaat praktis :

Memberikan alternatif pilihan metode pewarnaan spermatozoa manusia diluar

standar baku WHO pada praktek klinik Andrologi.



BAB 2 TINJAUAN PUSTAKA



BAB 2

TINJAUAN PUSTAKA

2.1 Maturasi Spermatozoa

Maturasi atau pendewasaan spermatozoa mulai terjadi ketika spermatozoa lepas

dari epitel tubulus seminiferus testis menuju saluran reproduksi pria hingga saluran

reproduksi wanita dan berakhir pada saat reaksi akrosom. Spermatozoa yang

dihasilkan di tubulus seminiferus adalah spermatozoa yang immotil, yang dilepas di

cairan luminal (di lumen tubulus seminiferus) dan selanjutnya ditranspor ke epididimis,

sehingga nantinya akan mempunyai kemampuan untuk bergerak dan fertilisasi. (de

Kretser; Kerr, 1994).

Proses maturasi (pendewasaan) yang terjadi di epididimis tersebut sangat tergantung

pada testosterone, maturasi berakhir di tuba falopii (ampula oviduct). Selama proses

maturasi, banyak sekali perubahan pada spermatozoa, baik perubahan secara biofisik

(morfologi dan fisiologis) maupun biokimiawi (perubahan metabolik sel spermatozoa).

Perubahan tersebut tampak ketika proses spermatogenesis berakhir, spermatid berekor

(spermatid bentuk memanjang) lepas dari epitel tubulus seminiferus. Sel spermatid

tersebut kini disebut sel spermatozoa (sel spermatogenik yang bebas atau lepas dan

mempunyai ekor untuk gerak). Perubahan fisik (morfologi) spermatozoa yang tampak

diantaranya adalah berkurang atau tidak adanya sitoplasmik droplet yang ada di

permukaan membran spermatozoa, yang bergerak ke arah kaudal leher dan ekor

spermatozoa menuju ujung midpiece terus ke endpiece dan akhirnya menghilang.

Peristiwa ini disertai dengan penyerapan sisa-sisa cairan sitoplasma oleh sel Sertoli,



sedangkan perubahan biokimiawi tampak pada perubahan hasil metabolisme sel. (Hafez,

2000).

Spermatozoa yang telah dewasa akan menjadi aktif ketika akan mendatangi oosit

yang ada di saluran reproduksi wanita, aktivitas ini dikenal dengan aktivasi spermatozoa.

Aktivasi spermatozoa terjadi. Awal terjadinya perubahan dikenal dengan hiperaktivasi.

Hiperaktivasi disebabkan karena adanya perubahan motilitas spermatozoa. Gerakannya

menjadi sangat cepat dan ekornya bergerak menjadi sangat kuat. Terjadinya hiperaktivasi

disebabkan karena adanya influks ion kalsium ke dalam ekor dengan bantuan protein

spesifik (Catsper) membentuk ion channel. Proses selanjutnya dari aktivasi spermatozoa

adalah reaksi akrosom, penetrasi spermatozoa-zona pelusida hingga membentuk zigot.

(de Kretser; Kerr, 1994).

2.2 Semen dan plasma semen

Semen atau ejakulat terdiri dari cairan vas deferens, cairan vesikula seminalis,

kelenjar prostat, dan kelenjar mukosa khususnya kelenjar bulbourethralis. Cairan semen

yang utama terdiri dari cairan vesika seminalis (sekitar 60%). Pertama kali cairan yang

keluar dari ejakulat adalah kelenjar bulbourethalis dimana cairan ini mensekresikan

larutan yang bersifat alkali bersama glycoprotein untuk membersihkan serta melumasi

saluran sperma ketika keluar dari duktus ejakulatorius dan urethra. pH rata-rata semen

gabungan sekitar 7,5. Cairan yang bersifat alkali berfungsi menetralkan bagian semen

lain yang bersifat agak asam. Cairan kedua adalah cairan dari epididimis, duktus deferent

berkontraksi bersama mengeluarkan spermatozoa dan cairan prostat. Cairan prostat

memberikan bentuk semen hingga seperti susu, sedangkan cairan dari vesika seminalis



dan kelenjar bulbourethralis akan memberikan konsistensi seperti mucoid pada semen..

Enzim pembekuan dari cairan prostat menyebabkan fibrinogen cairan vesika seminalis

membentuk koagulum yang lemah, yang kemudian larut dalam 15-20 menit berikutnya

karena lisis oleh fibrinolisin yang dibentuk dari profibrinolisin prostat. Pada waktu

ejakulasi, seorang laki-laki dapat mengeluarkan 300 – 400 juta sel spermatozoa (Henkel

et al., 2007).

Pada menit-menit pertama setelah ejakulasi, sperma relatif tidak bergerak,

dikarenakan viskositas koagulum, akan tetapi setelah koagulum larut, sperma akan

menjadi sangat motil. Walaupun sperma dapat hidup berminggu-minggu pada saluran

genital pria, sekali diejakulasikan maka masa hidup maksimum hanya 24-72 jam pada

suhu tubuh, akan tetapi pada suhu yang lebih rendah, semen bisa disimpan selama

beberapa minggu (Henkel et al. 2007).

2.3 Analisis Semen Rutin

Analisis semen rutin menjadi langkah pertama dalam proses pengobatan

pasangan infertil yang diyakini dapat menentukan penyebab infertility. Analisis semen

mencakup evaluasi dari parameter makroskopik dan mikroskopik (Keel 2006). Untuk

alasan ini evaluasi semen rutin merupakan alat dalam diagnosis dan pengobatan faktor

infertilitas laki-laki. Sejak kemampuan fertilitas spermatozoa melibatkan banyak aspek

fungsional seperti motilitas dan reaksi akrosom, gangguan fungsi ini mungkin individual

menyebabkan kegagalan fertilisasi in vivo dan in vitro. Oleh karena itu, dalam penilaian

kesuburan pria, analisis semen rutin adalah prosedur standar untuk mengukur semen dan

parameter berbagai sperma . Meskipun banyak faktor yang mungkin berpengaruh atau



setidaknya menunjukkan potensi kesuburan yang secara rutin juga dinilai (termasuk pH

ejakulat, viskositas, warna dan bau), konsentrasi sperma, motilitas dan morfologi

umumnya dianggap tiga yang paling penting dan informatif parameter. Parameter ini

telah terbukti sangat berguna dalam diagnosis masalah kesuburan antara pasangan, serta

prediksi sukses nya ART. (Gravance et al., 1998, WHO 1999, Henkel et al., 2007, van

der Horst et al., 2009).

2.4 Makroskopis

Sifat makroskopik dari sampel semen meliputi volume, warna, pencairan, dan

viskositas. Volume (normal> 2 mL) dari ejakulasi merupakan indikator akurat dari

berbagai kelainan. Tidak adanya volume ejakulat setelah orgasme, diistilahkan aspermia

dimana kemungkinan terjadi pada pasien dengan neuropati diabetes, mengkonsumsi

asupan obat simpatolitik dan pernah mengalami prosedur bedah yang merusak pleksus

saraf simpatik atau reseksi prostat. Dalam beberapa kasus ini, mungkin ada aliran semen

retrograde ke dalam kandung kemih, sehingga pemeriksaan urin post ejaculatory harus

dilakukan. Hypospermia (ejakulat volume <0,5 ml), bisa karena hilangnya sebagian dari

ejakulasi selama pengumpulan, periode pantang (abstinensia) pendek atau orgasme tidak

lengkap. Hypospermia dengan pH kurang dari 7,4 mengindikasikan obstruksi duktus

ejakulasi sebagian / lengkap atau tidak ada vesikula seminalis. Jika hypospermia

dikaitkan dengan pH lebih dari 7,8, itu bisa menunjukkan penurunan fungsi kelenjar

aksesori seperti dalam kasus hipogonadisme, peradangan atau asupan narkotika . Warna

ejakulat menjadi pertanda bagi kondisi klinis yang terkait, seperti pada kondisi

berlebihan eritrosit, yaitu hematospermia (warna merah). Sampel ejakulat yang normal

biasanya menggumpal segera setelah ejakulasi dan kemudian mencair dalam waktu 15-30



menit. Kegagalan koagulasi menunjukkan kurangnya sekresi dari vesikula seminalis,

yang mungkin karena obstruksi atau tidak adanya vesikula seminalis. Pencairan

berkepanjangan menunjukkan prostat sedikit dalam sekresi seperti dalam kasus

peradangan. Viskositas adalah parameter lain yang dianggap abnormal jika panjang

melebihi 60 mm (Jarow et al., 1989).

2.5 Mikroskopis

Atribut mikroskopis semen analisis rutin meliputi konsentrasi sperma, motilitas,

viabilitas, morfologi serta komponen seluler nonsperm dalam bentuk konsentrasi leukosit

dan sel-sel germinal belum matang. Titik cut off dari 20 juta spermatozoa / mL

disarankan sebagai nilai normal untuk konsentrasi spermatozoa (WHO,1999).

Pengamatan konsentrasi sperma rendah, oligozoospermia, ditunjukkan ketika konsentrasi

spermatozoa di bawah 5-10 × 106 / mL. Ini mungkin disebabkan oleh hilangnya

sebagian dari ejakulat, obstruksi parsial saluran ejakulasi, obat atau kelainan genetik.

faktor lain termasuk obat seperti nitrofurantoin dan paparan panas yang berlebihan. Di

samping itu, azoospermia, mungkin karena obstruksi pada saluran yang berhubungan

dengan transportasi spermatozoa, hipogonadisme, dan penyebab iatrogenik , seperti

kemoterapi atau faktor idiopatik, yang paling mungkin berasal dari genetik jika

azoospermia terdeteksi, analisis semen harus diulang untuk mengkonfirmasi .

azoospermia adalah salah satu kondisi, di mana analisis kimia dari seminal plasma

mungkin penting. Fruktosa, biasanya hadir dalam seminal plasma , berasal terutama dari

vesikula seminalis. Tidak adanya fruktosa dalam pasien azoospermia mungkin

menunjukkan obstruksi saluran ejakulasi (Jarow et al., 1989).



Kehadiran spermatozoa dengan motilitas progresif dalam ejakulat sangat penting

untuk memastikan transportasi spermatozoa yang memadai. Kehadiran motilitas

spermatozoa yang rendah, asthenozoospermia, bisa terjadi sebagai akibat dari waktu yang

terlalu lama untuk mengumpulkan sampel. Kontainer sampel mungkin sebagai paparan

racun bagi spermatozoa, dan sampel yang suhu nya ekstrim atau sinar matahari dapat

menyebabkan menurun nya motilitas spermatozoa. Penyebab lain asthenozoospermia

termasuk kelainan pada axonemal sperma, leukosit yang berlebihan, dan idiopatik.

Asthenozoospermia juga paling sering terlihat dengan antibodi antisperma dari ovum.

Kegagalan fertilisasi salah satunya disebabkan oleh persentase rendahnya acrosomes.

Satu studi mengidentifikasi korelasi erat antara kelainan kepala sperma dan penurunan

respon terhadap reaksi akrosom. Dengan sederhana, evaluasi morfologi akrosom, dapat

memprediksi kemampuan fisiologis sperma untuk fertilisasi . Sejumlah investigasi telah

menemukan hubungan positif antara kelainan kepala sperma dan kelainan DNA. Sebuah

studi tertentu (Zini dkk., 2009), kepala sperma dibandingkan dengan kelainan DNA, dan

menemukan tingkat signifikan lebih tinggi dari gangguan genetik dipasien

teratozoospermia, menunjukkan bahwa kelainan kepala sperma mungkin sebagian

disebabkan oleh pengurangan kondensasi kromatin, itu dimungkinkan ada pengaruh

terhadap DNA oksidatif stres dan fluktuasi suhu yang berbahaya, sehingga akhirnya

menyebabkan kegagalan fertilisasi. Oleh karena itu, selama penilaian morfologi sperma

penting untuk memilih teknik pewarnaan yang paling akurat menunjukkan potensi

kesuburan pria (Jarow et al., 1989). Spermatozoa normal yang dicari dalam ejakulat

adalah spermatozoa yang secara biologis dipilih yang dimana mampu mencapai lendir

endoserviks , pada penelitian yang pernah ada, spermatozoa ini diperiksa dengan



pewarnaan metode papaniculaou dan kemudian diamati kelainan kepala atau ekor dan

didapati kesimpulan bahwa sebuah populasi yang normal morfologis spermatozoanya

adalah mereka yang erat terikat pada zona pelusida (Garrett et al., 1997).

2.6 Morfologi

Evaluasi morfologi dapat menunjukkan kemampuan sperma dalam proses

pembuahan, salah satunya adalah fungsi akrosom, dimana akrosom melepaskan enzim

hidrolitik dan membantu sperma melalui lapisan luar (Mehta et al., 2006).

2.7 Struktur Spermatozoa

2.7.1 Kepala Spermatozoa

Bagian kepala spermatozoa didominasi oleh inti sel yang mengandung materi

genetik (DNA dan RNA). Inti bersifat seperti gram positif, mengandung DNA,

RNA, lipid, mucoprotein, magnesium, ferum, Cu, K, fosfat dan vakuola yang

mengandung kalium. Inti spermatozoa bisa diwarnai oleh metil hijau, toluidin blue

dan brilian kresil blue. (Moeloek, 1983)

Bentuk kepala spermatozoa bermacam-macam, pada spermatozoa manusia

berbentuk oval, sedangkan leher sangat pendek yang berfungsi sebagai penghubung

bagian kepala dengan ekor. Dua pertiga bagian depan inti semua spermatozoa

ditutupi oleh akrosom. Akrosom terletak di bagian ujung kepala di antara membran

inti dan membran sel. Membran luar akrosom berhadapan dengan membran sel dan

membran dalam akrosom melapisi membran inti sel. Di antara kedua membran ini

terdapat matriks akrosom. Terbentuknya kompleks akrosom, berasal dari vesikel

yang ada di sitoplasma yang dibentuk oleh kompleks golgi, terakumulasi di tepi inti



dan bergabung membentuk vesikel pro-akrosom. Bentuk awal vesikel adalah pipih,

berkembang menjadi vesikel pro-akrosom berbentuk granula di bagian luar inti.

Vesikel akrosomal dibentuk dari korteks dan matriks elektronik. Mangkok sub-

akrosomal kemudian berkembang, melingkar dan merata. Di bagian atas inti dan

mangkok sub-akrosom terdapat daerah epinuklear. Perforatorium adalah bagian

kecil yang terdapat antara akrosom dan inti yang dikelilingi oleh mangkok sub-

akrosomal. Sebagian dari perforatorium dan vesikel akrosom diidentifikasikan

sebagai daerah sub-akrosomal. Bagian leher spermatozoa (connecting piece)

merupakan bagian yang menghubungkan kepala dengan ekor spermatozoa. Leher

terdiri dari susunan lipid, kalium, kalsium, besi, Cu, fosfat dan sulfhidril serta

disulfida dan kolesterol. (Van Dwye, 1954). Bagian ekor spermatozoa berasal dari

bagian sentriol dan struktur tambahan yang terletak pada selaput inti spermatid

(Escalier,2003)

2.7.2 Ekor Spermatozoa

Ekor spermatozoa terdiri atas bagian tengah (middle piece), bagian utama

(principle piece), dan bagian akhir (end piece). Pembagian tersebut berdasar letak,

struktur dan fungsinya, terdiri dari susunan lipid, kalium, kalsium, besi, Cu, fosfat

dan sulfhidril serta disulfida dan kolesterol. (Van Dwye, 1954).

Organel sel yang ada di ekor spermatozoa, selain mitokondria, serabut

(mikrofibril), juga sitoplasma tetapi jumlahnya sangat sedikit. Sebagian besar

sitoplasma penyusun spermatozoa telah diabsorpsi oleh sel sertoli di tubulus

seminiferus saat spermiogenesis. Ekor atau flagella spermatozoa bagian middle

piece tersusun oleh membran sel, mitokondria, dan serabut tebal penyusun



aksonema (9+2 mikrotubulus). Makna aksonema 9+2 adalah jumlah serabut

penyusunnya, yaitu 9 pasang mikrotubulus yang terletak di bagian tepi (perifer) dan

2 mikrotubulus yang terletak di bagian sentral. Mitokondria terletak pada bagian ini

tersusun secara spiral dan dilindungi dari bagian luar oleh membran sel. Mitokondria

merupakan tempat untuk sintesis energi (adenosine triphosphate, ATP) yang

digunakan untuk pergerakan spermatozoa. Pergerakan terjadi dengan mengubah

energi kimia menjadi energi kinetik (Alberts et al., 1994). Struktur spermatozoa

berturut-turut dari luar adalah membran sel, mitokondria, serabut tebal, dan serabut

halus (mikrotubulus). Setiap organel tersebut mempunyai peran dalam menjalankan

fungsi spermatozoa. Serabut tebal dan serabut halus merupakan organel penyusun

aksonema yang berperan sebagai motor penggerak terjadinya motilitas spermatozoa.

Struktur middle piece dapat dilihat lebih jelas melalui potongan membujurnya. dari

potongan tersebut tampak bahwa susunan mitokondria melingkari serabut tebal

yang ada di dalamnya. Aksonema yang terdapat di sepanjang ekor spermatozoa

membantu penggerak ekornya. (Escalier, 2003).

Bagian ini terdiri atas 9 pasang mikrotubulus bagian perifer serabut tebal

(peripheral dense fibers). Antara mikrotubulus satu dengan lainnya dihubungkan

oleh bagian yang disebut dynein arm dan radial spokes, serta satu pasang

mikrotubulus (2 mikrotubulus) terletak di bagian tengah atau sentral. Pada bagian

principle piece juga tersusun oleh aksonema (9+2 mikrotubulus), sedangkan bagian

end piece terdapat mikrotubulus dan aksonema yang berfungsi dalam pergerakan

spermatozoa (Escalier, 2003).



2.8 Assesment Morfologi Spermatozoa

Persiapan pewarnaan, setidaknya harus dibuat dua pewarnaan dari sampel

semen untuk duplikasi penilaian pewarnaan. (WHO,1999).

Slide pertama harus dibersihkan, dicuci dengan 70% etanol dan

dikeringkan, sebelum setetes semen (5 sampai 20µl) diteteskan ke slide,

'feathering' technique dapat digunakan untuk membuat hapusan (WHO,1999).

Dimana setelah semen diteteskan pada objek glass kemudian diratakan dan

digeser perlahan dan merata untuk mendapatkan hapusan yang bagus seperti pada

gambar 'feathering' technique dibawah ini.

Gambar 2.1: 'feathering' technique (sumber: WHO 1999)

2.9 Klasifikasi Morfologi Spermatozoa

Kepala spermatozoa manusia pada pewarnaan akan tampak sedikit lebih kecil

daripada kepala spermatozoa hidup di semen tanpa pewarnaan, meskipun tidak

signifikan berbeda (Katz et al., 1986). Sehingga memerlukan kriteria yang ketat harus

diterapkan ketika menilai normality morfologi dari spermatozoon Untuk spermatozoa

yang dipertimbangkan normal, Kepala harus oval. Mungkin tampak sedikit penyusutan



pada saat fiksasi ketika pewarnaan . Estimasi panjang dan lebar dari spermatozoa dapat

dibuat dengan mikrometer ocular. (Menlrveld et al., 1990).

2.10 Kriteria kruger

Salah satu metode untuk menilai morfologi didasarkan pada kriteria yang ketat

(Kruger et al., 1987). Deklarasi WHO 1999 menyatakan bahwa keberhasilan IVF telah

akan nyata berkurang saat morfologi sperma normal adalah <15%. Referensi nilai

morfologi sperma normal ditentukan oleh Kruger adalah> 14%. Kriteria morfologi

sperma yang didirikan oleh Kruger et al., mendefinisikan spermatozoa normal memiliki

konfigurasi oval dengan kontur halus. Kepala oval dengan panjang 4-5 µm, diameter

lebar adalah 2,5-3,5 µm diukur dengan mikrometer okuler dan mid peace tipis dan lebar

kurang dari 1µm dengan panjang 1,5x panjang kepala. Tetesan sitoplasma, bila ada tidak

boleh melebihi setengah dari lebar kepala. Ekor tipis, seragam dan tidak melingkar

dengan panjang sekitar 45 µm menurut klasifikasi ini, semua bentuk yang meragukan

dianggap abnormal. Akrosom yang didefinisikan dengan baik, terdiri 40-70% dari bagian

distal dari kepala. Setidaknya 100 spermatozoa tetapi sebaiknya 200 spermatozoa

dievaluasi. Adapun kelainan-kelainan morfologi yang terjadi antara lain kelainan

kepala. Macam-macam pada kelainan kepala adalah kepala besar, kepala kecil, tapered,

pyriform, round, dan kepala amorphous, kepala dengan vakuola ( dimana >20% area

kepala terisi oleh vakuola), kepala dengan akrosom kecil ( <40% dari area kepala ),

kepala ganda. Kelainan pada leher dan midpiece antara lain bent ( leher dan ekor

membentuk sudut > 90% terhadap aksis dari kepala), insersi asimetris pada midpiece

terhadap kepala, midpiece yang tidak teratur atau tebal, midpice yang tipis daan

abnormal ( biasa dijumpai pada bentukan tanpa selubung mitokondria). Kelainan ekor



antara lain ekor pendek, multiple, hairpin, broken tails , bent tails (>90◦ ), ekor irregular,

coiled tails. Kelainan pada Cytoplasmic droplets dimana ukurannya >1,5 ukuran kepala.

Droplets biasanya berada pada midpieces. Hanya spermatozoa dengan ekor yang bisa

dihitung pada morfologi. Sel imatur termasuk round spermatid tidak dihitung sebagai

spermatozoa. Beberapa spermatozoa mempunyai kelainan struktur seperti kegagalan

perkembangan akrosom yang menyebabkan small round-head defect atau biasa disebut

globozoospermia. Kegagalan basal plate untuk menempel pada nukleus ujung yang

seberang pada akrosom akan menyebabkan kepala dan ekor tidak menempel. Pada

kepala yang terabsobsi dan hanya ekor yang ditemukan dalam semen biasa disebut

sebagai pinhead. Pinhead tidak boleh dimasukkan pada kelainan kepala, harus dicatat

secara terpisah (WHO, 1999 ).

2.11 Penghitungan Morfologi Spermatozoa

Dengan mikroskop menggunakan perbesaran 100 X dengan minyak imersi untuk

tujuan melihat lebih terang dan setidaknya 10X lensa ocular harus digunakan. Evaluasi

morfologi harus dilakukan di beberapa daerah yang dipilih secara sistematis. Semua

spermatozoa normal dinilai dan spermatozoa abnormal juga dicatat, penting untuk

menggunakan mikrometer okuler untuk memperkirakan ukuran spermatozoa. Setidaknya

200 spermatozoa berturut-turut dihitung (WHO, 1999).

2.12 Mekanisme Pewarnaan

Ikatan pada pewarnaan terhadap jaringan tidak berbeda dengan ikatan kimia pada

jaringan dan mekanisme ikatan itu yang terjadi kurang lebih sama pada komponen ikatan

organik lainnya. Salah satu jenis komponen pewarnaan haruslah sama seperti



komponen jaringan, karena apabila tidak sama maka zat warna itu akan terbilas keluar

dari jaringan pada saat dicuci dengan zat kimia atau reagen yang lain. Masing-masing

ikatan memiliki karakteristik dan kekuatan. Jenis ikatan dan ukuran kekuatan bisa dilihat

pada tabel 2.1

Tabel 2.1. Jenis ikatan dan ukuran kekuatan (Kaushik. B, 2006)

Tipe Ikatan Kekuatan (kcal mole-1) Ikatan ion 40-110 Hydrogen bonds 2-7 Van der Waals forces 1—8 Covalent bonds 35-212 Hydrophobic interactions 48

Ikatan ion terjadi dengan melibatkan hubungan elektrostatik antara kutub ion

yang berlawanan. Salah satu ion adalah ion yang menetap pada bagian jaringan, dan ion

yang lain adalah yang menetap pada bagian pewarnaan. Anion (ion negatif) pada

pewarnaan akan berikatan dengan kation (ion positif) pada jaringan, dan ikatan kation

pada pewarnaan akan mengikat anion pada jaringan. Ikatan ion adalah salah satu

mekanisme yang penting pada pewarnaan histologi. Hampir semua pewarnaan sederhana

menggunakan mekanisme tarik menarik ion tersebut. (Kaushik. B, 2006)

Pada saat jaringan terwarnai oleh pewarna primer, maka jaringan akan mengikat

bahan pewarna dan akan mengalami proses dekolorisasi oleh alkohol pada langkah

selanjutnya, dekolorisasi akan menyebabkan jaringan dehidrasi dan akan menutup kanal

ion pada dinding sel dan menyimpan zat warna tersebut, sehingga zat pewarna tidak akan

terbilas keluar.

Eosin adalah contoh pada pewarnaan anion, dimana akan berikatan pada protein-

protein yang mengandung ion positif (kation) seperti contohnya golongan amino. Pada



Tissue protein Tissue protein

Tissue protein Tissue protein

mulanya kelompok amino akan terikat ion pada ion hidrogen, lalu ion-ion tersebut

berikatan dengan eosin, seperti pada gambar 2.2.

Gambar 2.2. Ionisasi jaringan amino dan ikatan dengan eosin.

(Kaushik. B, 2006)

Eosin biasanya terurai dalam bentuk garam seperti contohnya garam sodium

eosinate dimana bisa larut dalam air. Pewarnaan ion negatif (anionic) disebut juga

pewarnaan asam pada jenis pewarnaan histologi karena merupakan turunan pada zat

pewarna asam (asam eosin) dan bukan karena pH larutan. Semua yang bisa diwarnai

dengan zat warna asam disebut sebagai acidophilic dan semua yang bisa diwarnai dengan

eosin maka disebut eosinophilic. Contoh acidophilic adalah kolagen, sel darah merah dan

sitoplasma. Kontrol pH pada pewarnaan digunakan untuk differensiasi warna yang

dimana zat pewarna bisa dihapus atau dipertahankan pewarnaannya. Sensitifitas pada pH

digunakan untuk menyingkirkan pewarnaan. Pada umumnya juga penting untuk

menyingkirkan pewarnaan yang terkena kulit ataupun kain. Pewarnaan tersebut bisa

disingkirkan menggunakan asam (biasanya asam alkohol atau acid alcohol) sehingga

pewarnaan asam dengan mudah bisa dihilangkan dengan larutan amonia didalam alkohol.

Penggunaannya harus sangat hati-hati, karena larutan asam tersebut akan menyebabkan

iritasi pada kulit yang sensitif terutama pada sekitar area mata. Sangat disarankan untuk

menghindari larutan tersebut kontak langsung dengan kulit. Methylene blue adalah

contoh dari pewarnaan kation atau ion positif. Akan berikatan dengan ion negatif pada

NH2+H+ NH3+

NH3+ + Eosin- NH3

Eosin



Tissue proteglycan

Tissue proteglycan

Tissue proteglycan

Tissue proteglyca

n

jaringan seperti golongan asam carboxylac, asam sulfur, dan asam fosfor. Seperti pada

gambar 2.3 berikut ini.

Gambar 2.3. Ionisasi golongan sulfat pada jaringan dan turunannya yang mengikat pada methylane blue. (Kaushik. B, 2006).

Pewarnaan kation biasa disebut sebagai pewarnaan basal dan juga disebut sebagai

pewarnaan basophilic. Substansi yang terikat pada pewarnaan basal antara lain asam

nukleat dan asam musin. Pada normal protein terkandung acidic maupun basal asam

amino sehingga memungkinkan pada protein untuk mengambil kedua perangkat

pewarnaan tersebut. Pada kenyataan nya tidak terjadi hal tersebut, karena pada umumnya

pewarnaan akan terjadi pada keasaman yang netral. Pada keasaman yang netral tersebut

golongan carboxyl terutama asam amino tidak terikat oleh ion. Bagian zat warna hanya

mengikat pada jaringan, dimana jaringan tersebut terikat oleh ion. Apabila tidak bisa

mengikat pada ion maka tidak bisa terwarnai. Ikatan ion pada zat warna sangat sensitif

berpengaruh pada pH misalnya pada acidict pH. Konsentrasi yang tinggi pada ikatan

hidrogen akan mempengaruhi ionisasi pada kelompok amino. Dan hasilnya akan terjadi

pewarnaan yang kuat pada protein oleh eosin. Namun, level keasaman yang sama akan

berpengaruh sebaliknya pada pewarnaan oleh methylane blue. Selama tingkat keasaman

tersebut lemah seperti contohnya asam carboxyl yang terdapat pada protein akan

menghambat proses ikatan ion pada konsentrasi yang tinggi pada ikatan hidrogen. Pada

OSO3H OSO3- + H1

OSO3 + Methylene blue1 OSO3Methylene blue



tingkat keasaman yang tinggi seperti kelompok fosfat yang didapat pada asam nukleat

dan sulfat didalam musin akan sedikit menghambat dan masih bisa terionisasi pada pH

umumnya yang digunakan pada pewarnaan. Itu artinya pada keasaman pH pada

methylane blue akan menghasilkan pewarnaan yang berbeda-beda akan mewarnai

nukleus namun protein tetap tidak terwarnai. Perubahan pada pH bisa menghambat

pewarnaan dari proses ionisasi, tetapi hambatan total pada ionisasi pada garam

pewarnaan akan terjadi pada level pH yang ekstrim. Ionisasi pada pewarnaan bisa

dikatakan sebagai penyempurnaan pewarnaan pada level pH tertentu. Larutan alkalin

akan memberikan efek yang berlawanan. Kerusakan pada ion hidrogen akan

menyebabkan kelompok asam pada protein akan tampak lemah untuk mengikat ion. Dan

methylane blue akan tetap mewarnai sitoplasma maupun nukleus walau tidak sempurna.

Untuk mendapatkan hasil yang maksimal dengan methylane blue maka penggunaan

Loffler formula adalah yang terbaik, dimana menggunakan potasium hydroxide untuk

meningkatkan pH, sehingga methylane blue akan mewarnai semua komponen protein dan

asam nukleat dan akhirnya pada jaringan akan tampak biru. Eosin akan menurun

kualitasnya pada pH yang tinggi apabila kelompok amino melepaskan ionnya dan tidak

memiliki atraksi dan ikatan dengan eosin. Dengan pH yang selektif maka bisa dibuat

pewarnaan yang baik pada setiap komponen. Hal itu tampak pada pewarnaan musin,

dimana pH digunakan untuk mengontrol ikatan pada alcian blue terhadap carboxylide

acid dan sulfat. Interaksi ion adalah suatu bentuk gabungan dan bisa mengikat antara

jaringan dan zat pewarna pada jarak yang relatif lebar semasa ada dua kutub ion yang

berbeda mereka akan bisa berinteraksi dengan baik. Efek ion yang berlawanan bisa

dilihat pada gambar 2.4 dibawah ini .



Gambar 2.4. Efek ion yang berlawanan. Pada jaringan terdapat ion negatif golongan carboxyl yang bisa mengikat zat warna. Zat warna tidak bisa beratraksi dengan ion tersebut karena ada dua ion positif yang berdekatan. (Kaushik. B, 2006).

Ion pada permukaan protein bermuatan positif sehingga ion pada methylane blue

ditolak. Ikatan ion dapat dihambat dengan konsentrasi garam yang tinggi, walaupun

konsentrasi garam yang rendah dapat menyebakan peningkataan intensitas pada

pewarnaan. Efek paradoksikal tersebut dapat dilihat pada pengaruh mekanisme ion. Pada

konsentrasi garam yang tinggi maka akan terjadi kompetisi antara zat warna dan ion

garam sehingga pewarnaan akan dihambat. Mekanisme tersebut menyerupai efek asam

pada pewarnaan dasar dimana ion hidrogen berkompetisi untuk mengikat molekul zat

pewarna. Garam akan memberikan efek pada asam maupun pewarnaan basa. Konsentrasi

yang rendah pada garam akan memberikan hambatan yang rendah dimana pada zat warna

molekul yang lebih banyak daripada garam dan telah terikat. Maka ikatan pada pewarna

akan lebih kuat daripada ikatan pada garam. Garam akan mungkin meningkatakan

konsentrasinya ketika ion-ion itu beraksi. Sehingga zat warna akan mungkin mengikat

pada bagian yang sebelumnya tidak terikat pada ion garam. Ikatan hidrogen bekerja

dengan cara menggabungkan antara atom hidrogen pada satu molekul dan lain molekul

yang lebih tinggi muatan elektro negatif. Efek ion garam dimana methylane blue bisa

mengikat carboxyl bisa dilihat pada gambar 2.5.

NH3+

T I S S U E

NH3+

COO- Methylene blue+



Gambar 2.5. Efek ion garam dimana methylane blue bisa mengikat carboxyl semenjak terjadi pencabutan ion pada kelompok amino yang dimana bisa dinetralisir sementara oleh ion klorida. Ion yang berada di permukaan protein adalah ion negatif. (Kaushik. B, 2006)

Ikatan hidrogen memiliki rentang yang sangat terbatas dimana hanya melibatkan

interaksi antara dua kelompok. Ikatan hidrogen tidak dipengaruhi oleh pH atau

konsentrasi garam, namun dipengaruhi oleh ikatan hidrogen yang kuat termasuk urea dan

air. Hambatan pada ikatan ion bisa tercapai apabila menggunakan larutan non-aquos,

konsentrasi garam yang tinggi (dimana akan berkompetisi dengan zat warna untuk

mengikat jaringan), pH yang ekstrim akan menghambat ionisasi pada kelompok

jaringan. Pada pewarnaan elastin fiber, ikatan hidrogen lebih penting dari ikatan ion.

Ikatan Van der Waals memiliki rentang yang kecil. Hanya memiliki efek apabila dua

atom berukuran antara 0,12 dan 0,2 nm, kalau lebih dari itu maka tidak ada efek. Ikatan

ini terjadi pada dua atom dan tidak spesifik pada atom tertentu. Apabila bentuk

permukaan pada protein jaringan dan zat pewarna cocok maka akan terjadilah ikatan Van

der Waals seperti pada gambar dibawah ini.

T I S S U E

NH3+

COO-

NH3+

Cl-

Cl-

Methylene blue+



Gambar 2.6. Ikatan Van der Waals tertampak dimana bahwa antara zat warna dan jaringan memiliki bentuk yang sama sehingga bisa terjadi suatu ikatan. (Kaushik. B, 2006)

Ikatan Van der Waals akan mengikat zat warna yang lebih kuat pada zat warna

yang lebih besar daripada yang kecil walaupun memiliki kelompok ion yang sama

karena ikatan ini tidak dipengaruhi oleh pH ion dan hidrogen. Ikatan kovalen adalah

ikatan yang kuat dan tidak mudah pecah, seperti contoh pada ikatan zat warna dan

antibodi. Biasa disebut sebagai zat warna yang reaktif. Ikatan hydrophobic adalah ikatan

yang akan mengikat jaringan dengan cara mengeluarkan air pada daerah yang

hydrophobic. Pengeluaran air terjadi secara entropy. Interaksi hydrophobic memiliki

rentan yang kecil dan tidak dipengaruhi oleh ikatan hidrogen ataupun garam, pH

mungkin akan berubah dari hydrophilic menjadi hydrophobic dengan cara mengubah ion

sehingga akan mengubah pewarnaan dengan zat warna hydrophobic. Zat pewarna

hydrophobic ini sangat penting untuk mewarnai lipid. (Kaushik. B, 2006)

Zat warna terdiri komponen organik yang bisa secara selektif mengikat jaringan.

Pada umumnya dibuat dari molekul organik, biasanya benzene atau turunannya.

Komponen organik sederhana seperti akalin, benzene dan alkohol tidak bisa dilihat mata

manusia normal, namun bisa menyerap cahaya diluar spektrum pengihatan contohnya



seperti benzene bisa menyerap sinar ultra violet dan bisa memancarkan warna-warna

yang berguna pada zat pewarnaan. Semua yang dapat menghasilkan warna dari bahan

organik disebut Chromophores. Trinitrobenzene adalah bukan sautu zat warna, karena dia

tidak berikatan dengan jaringan walaupun dia bisa memberikan warna kuning pada

sebuah plastik namun akan mudah tercuci pada suatu larutan. Untuk bisa diwarnai maka

harus ditambahkan reaksi ion yang dimana bisa membantu untuk berikatan dengan

jaringan, contohnya adalah ion hidrogen. Konversi pada benzene dan Struktur Quininoid

bisa dilihat pada gambar dibawah ini.

Gambar 2.7. Konversi pada benzene untuk menjadi suatu zat pewarna dengan penambahan chromophores dan auxochromes. (Kaushik. B, 2006)

2NO NO2

NO2

chromophore

2NO NO2

NO2

Trinitrobenzene (yellow but not dye)

OH Auxochrome

Trinitrobenzene (picric acid, yellow dye)

Benzene (Colourless)



Gambar 2.8. Struktur Quininoid. Penting untuk chromophore karena membentuk cincin benzene dimana terdapat dua ikatan dobel pada cincin dan pada kedua sisinya sehingga akan menyerap pewarnaan secara kuat. (Kaushik. B, 2006)

Zat warna diproduksi oleh berbagai macam industri. Variasinya banyak sehingga

mempunyai rentan yang lebar pada warna. Seperti halnya eosin atau Congo Red,

berstruktur seperti gambar dibawah.

Gambar 2.9. Struktur Congo Red. (Kaushik. B, 2006)

Indeks warna biasanya disusun menurut struktur peawarnaan dan berdasarkan

grup chromophore. Seperti contohnya zat pewarna Azo memiliki -N=N- grup (azo)

sebagai chromophore contohnya Orange G. Contoh lain struktur quininoid adalah

xanthene , thiazine seperti gambar dibawah ini.

SO3Na

NH2

N N N N

NH2

SO3Na



Gambar 2.10. Xanthene. Gambar ini menunjukkan adanya cincin quininoid. Contoh yang bisa diambil adalah eosin. (Kaushik. B, 2006)

Gambar 2.11. Thiazine. Gambar ini mengandung zat warna metachromatic yang penting, contohnya toulidine blue, methylane blue, dan azure A. (Kaushik. B, 2006).

Klasifikasi histologi hanya untuk menunjukkan bagaimana zat warna ini bekerja

secara praktis. Pewarnaan basal adalah kation atau ion positif dimana ia akan mewarnai

ion negatif atau acidic material seperti carboxylat, sulfat, dan fosfat ( fosfat pada asam

nukleat). Pada umumnya digunakan untuk mewarnai inti sel dan sitoplasma. Substansi

acidic yang mewarnai pewarnaan basic disebut sebagai basophilic. Pewarnaan acidic

adalah anion atau ion negatif yang dimana akan mewarnai kation atau pewarnaan basic.

Biasanya untuk mewarnai protein pada sitoplasma dan jaringan konektif. Larutan yang

mewarnai pewarnaan accidic disebut acidophilic. Pewarnaan netral dimana akan

mewarnai kedua ion, contohnya adalah pewarnaan Romanowsky. Pewarnaan amphoteric

mewarnai ion anion dan kation pada golongan yang sama pada kondisi yang netral dan

sewajarnya. Pewarnaan alami atau natural terbuat dari bahan-bahan natural, contohnya

haematoxylin, carmin, orcein, dan litmus. Komponen diluar komponen pewarnaan yang

dapat meningkatkan kualitas pewarnaan antara lain adalah Mordant. Dimana akan

N

S

O



T I S S U E

M O R D A N T

DYE

meningkatkan interaksi pada jaringan. Zat warna dan mordant biasa disebut sebagai dye

lake. Biasanya mengandung oksigen atau nitrogen. Mordant akan memberikan kestabilan

pada pewarnaan yang dimana dia akan tidak terkikis oleh air, alkohol, ataupun asam

lemah dan akan membuat stabil pewarnaan yang akan digunakan setelahnya, contohnya

Harry’s haematoxylin. Differensiasi mordant bisa menggunakan strong acid, contohnya

asam hydrochloride, alkohol. Differensiasi bisa menggunakan zat pewarnaan yang tidak

dinginkan. Contohnya dapat dilihat pada gambar dibawah ini.

Gambar 2.12. Mordanting. Zat warna akan mengikat kuat pada jaringan apabila mordant berada diantaranya. (Kaushik. B, 2006)

Mekanisme trapping berbeda dengan mordant. Mekanisme ini selalu digunakan

setelah pewarnaan. Berbentuk padatan atau gerombolan yang besar pada zat warna dan

tampak sebagai precipitating (endapan pada jaringan). Endapan yang banyak akan sulit

disingkirkan, contohnya adalah iodine dimana iodine mentrapping pewarna violet pada

dinding bakteri gram positif. Contoh lainnya adalah accentuator, bahan yang

ditambahkan pada larutan pewarna untuk meningkatkan reaksi pewarnaan. Accentuator

biasanya digunakan untuk mengkontrol pH, misalnya pottasium hydroxide pada

Loaffler’s methylane blue dan phenol pada karbol fuchsin. Accelerator banyak dijumpai

pada teknik neurologi dan obat-obatan hypnotic seperti barbiturat atau chloral hydrate.



Zat pewarna metachromatic dan metachromasia, disebut metachromasia adalah

apabila digunakan pada zat pewarna dan mewarnai komponen pada jaringan dengan

warna yang berbeda dengan warna larutan pewarna. Contohnya toulidine blue adalah

pewarna basic kuat yang mewarnai nukleus dengan warna biru terang. Selain itu juga

mewarnai granula mast sel dengan warna pink. Perpindahan warna pada mast sel ini

disebut metachromasia, sedangkan warna birunya disebut orthochromasia. Untuk

metachromasia yng terbaik adalah golongan thiazine. Metachromasia adalah penting

untuk digunakan, dimana tingkat selektifnya tinggi, dan hanya mewarnai struktur

jaringan tertentu yang bersifat metachromatic. Jaringan yang bisa diwarnai

metachromatic disebut Chromotopes, contohnya mucins ( musin sulfat). Contoh

metakromasia bisa dilihat pada tabel 2.2 berikut ini.

Tabel 2.2. Metachrome dan rentang pada kepala acidic. (Kaushik. B, 2006)

Target Distance apart of acidi group

(nm)

Staining

Hyaluronic acid 1.03 Blue (orthochromatic) Pectic acid 0.5 Blue/purple ( weakly metachromatic) Mast cell granules < 0.4 Red (Strongly metachromatic

Perpindahan warna selalu dari warna biru atau violet ke warna kuning atau merah.

artinya penyerapan warna berpindah dari rentang panjang gelombang pendek menuju

lebih panjang. Semakin tinggi tingkat polimerisasi maka makin kuat metakromasia.

Metachromasia memerlukan air diantara molekul zat warna hingga bentuk polymer dan

tidak bisa bertahan pada kondisi dehidrasi seperti pada gambar dibawah



Gambar 2.13. Metachromasia. (Kaushik. B, 2006)

Jaringan pada gambar paling kiri akan mengalami metachromasia selama zat

warna berbentuk polymer. Jaringan pada gambar tengah tampak lemah susunan

polymernya. Jaringan pada gambar kanan tampak orthochrome dimana terhadap jarak

yang lebar.

Pewarnaan nukleus sangat penting pada pewarnaan histologi karena struktur

daripada nukleus sering berubah apabila terkena penyakit. Dengan pewarnaan ini, maka

mudah mengenali struktur jaringan apabila jaringan terwarnai dengan struktur lainnya

yang tidak terwarnai. Pewarnaan pada nukleus penting bukan hanya untuk mengevaluasi

struktur nukleus saja tetapi juga pada counterstain setiap teknik pewarnaan, contohnya

adalah blue haematoxylin.

Counterstain seharusnya menampilkan warna yang berbeda sehingga

memudahkan differensiasi pewarnaan. Warna biru atau ungu pada haematoxylin sering

T I

S

S

U

E

Dye

Dye

Dye

Dye

Dye

Dye

Dye

Dye

Dye

T I

S

S

U

E

Dye

Dye

Dye

Dye

Dye

Dye

Dye

T I

S

S

U

E

Dye

Dye

Dye

Dye



kali overlap dengan warna dasar teknik awalnya inilah mengapa counterstain dibutuhkan.

Haematoxylin adalah produk alami yang diekstrak dari jantung kayu pohon

Haematoxylum Camphecianum, yang dimana dinamai di kota Campeche, Mexico.

Diekstrasi dengan air panas lalu dimurnikan dengan urea. Bentukan bubuk biasanya

kandungannya murni (± 95%) namun tidak bisa untuk bahan pewarnaan. (Kaushik. B,

2006)

Haematoxylin biasanya larut didalam air maupun alcohol namun dapat terurai

didalam alkohol. Sehingga untuk penyimpanan larutan dilakukan mencampurkan bubuk

haematoxylin kedalam alcohol supaya terurai kemudian didilusi (dicairkan) pada larutan

alkohol. Gambar bangun haematoxylin bisa dilihat pada gambar dibawah ini (gambar

2.14).

Gambar 2.14. Gambar bangun haematoxylin adalah seperti ditunjukkan gambar diatas, dimana tidak nampak chromophore dan larutan haematoxylin tidak berwarna (intensitas warna tidak tinggi). (Kaushik. B, 2006)

OH

OH

HO

HO

O

OH



Walaupun haematoxyilin tersebut bukanlah suatu pewarnaan dan untuk membuatnya

menjadi suatu zat pewarna adalah dengan mengoksidasi menjadi Haematin.

Gambar 2.15. Haematin memiliki dua atom hidrogen terdekat dan susunan ulang yang tampak seperti ikatan pada cincin quininoid dan memiliki warna seperti pada gambar diatas. (Kaushik. B, 2006)

Haematin tidak bisa seberapa larut pada air dan alkohol (tidak seperti

haematoxylin). Namun haermatin larut dalam etylane glycol dan glycerol. Haermatin

adalah pewarna asam lemah, memberikan warna kuning pada jaringan, namun ketika

dikombinasikan dengan mordant yang cocok maka haermatin akan menjadi pewarna

nukleus. Larutan yang bekerja biasanya tidak teroksidasi sempurna haematoxylin, dan

pada bagian yang tidak teroksidasi secara bertahap akan menoksidasi menjadi haermatin

pada waktu yang bersamaan seperti pada waktu haermatin menjadi oxyhaermatin. Hal

tersebut melengkapi cara kerja larutan tersebut dan meningkatkan atau memperpanjang

masa hidup reagen meskipun akan terjadi penurunan kekuatan dan lama-lama tidak bisa

dipakai. Oksidasi akan terjadi lambat pada kondisi asam. Banyak larutan yang dibuat

dalam keadaan acidic. Dalam proses oksidasi alami, haematoxylin akan memproduksi

endapan (precipitate) yang bias dihilangkan dengan proses filtrasi sebelum larutan

digunakan. Proses oksidasi dalam haematoxylin menjadi haermatin dapat menyebabkan

terjadinya atmosphenic oxygen (disebut sebgai ripening) prosesnya terjadi perlahan

O

HO

HO

OH

O OH



memerukan waktu bebrapa bulan terutama pada kondisi dingin dan gelap. Ripening atau

pematangan ini membuat hidup lebih lama. Proses oksidasi bisa menggunakan proses

oksidatif seperti sodium iodate (200mg/gram haematoxylin), potassium permanganatec

(177 mg / gram haematoxylin), oxide mercury (500mg / gram haematoxylin).

Haematoxylin adalah pewarnaan yang sangat bagus yang bisa mengevaluasi perbedaan

komponen jaringan pada tingkat selektifitas yang tinggi. Jenis- jenis mordant berubah

sesuai dengan warna pada zat pewarna. Garam alumunium (haemalum) digunakan pada

larutan haematoxylin pada umumnya pada formula yang berbeda namun didapati hasil

yang sama. Tipe formula termasuk Harry’s, Mayyer’s, Erhlic’s, dan Gill’s

Haematoxyilin. Jenis mordant ini biasanya alumunium potasium sulphat atau alumunium

amonium sulphat. Pada larutan asam pewarnaan tersebut memiliki warna merah yang

kuat, pada kondisi basa pewarnaan tersebut memiliki warna biru. Haemalum tersebut

digunakan secara regresif dengan kontrol differensiasi asam alkohol (1% HCl pada 70%

alkohol). Garam ferum : iron hamatoxylin. Garam yang digunakan adalah feric chloride

atau feric amonium sulphat. Hasil yang didapat adalah hitam dan lebih tahan terhadap

counterstain acidic. Garam ferric adalah bahan oksidasi dan akan meningkatkan oksiasi

haematoxylin terhadap haematein dimana hasilnya berupa over oksidasi dan hilangnya

pengeccatan. Asam Carminic. Carmin adalah pewarnaan alami yang diektrasi dari

pigmen merah cochineal dimana digunakan untuk memasak. Asam carminic adalah

sebuah glikosida yang dapat larut pada air namun terurai pada garam alumunium.

Mordant yang bisa digunakan bersama haematoxylin bisa dilihat pada tabel 2.3.



Tabel 2.3. Mordant yang bisa digunakan bersama haematoxylin. (Kaushik. B, 2006)

Element Jaringan Mordant Nuclei Al atau Fe Myelin Cr atau Cu Elastyc fibres Fe Collagen Mo Neuroglia W Axis cylinders Pb Mucin Al ibrin W Mitochondaria Fe Heavy metals (Pb, Cu) dan Ca None

Safranin ( merah netral), biasa digunakan untuk counterstain pada pewarnaan biru

seperti contohnya metode pewarnaan Perl’s iron. Pewarnaan ini mudah larut pada air dan

alkohol. Safranin dapat digunakan sebagai pewarnaan vital apabila digunakan pada

konsentrasi cair (10-5). Saffranin dapat berguna sebagai indikator merubah warna pada

pH 6,8-7 (merubah warna kuning pada alkali). Safranin mewarnai nukleus dengan warna

merah dan sitoplasma dengan warna kuning. Methylane blue Kegunaanya sangat banyak

untuk mewarnai warna biru dimana tidak memerlukan mordant. Pewarnaan ini cepat dan

mudah untuk mewarnai nukelus dan counterstain pada pewarnaan primer yang merah.

Pewarnaan ini mudah larut dalam air dan alkohol. Pewarnaan ini merupaka komponen

dari Romanowsky. Biasanya digunakan untuk mewarnai darah dan sumsum tulang.

Pewarnaan polychrome menghasilkan rentang pada pewarnaan asli pada methylane blue,

contohnya adalah azure B. Pewarnaan Methyl Green ini berguna untuk mewarnai nukleus

(counterstain) dan juga unut membedakan antara DNA dan RNA. Namun sering

dikontaminasi methyl violet tapi dapat disingkirkan dengan pembilasan chloroform

Sering digunakan pewarnaan counterstain, namun sangat penting untuk identifikasi

komponen jaringan. Beberapa macam teknik bisa digunakan untuk membedakan antara



jaringan penghubung dan protein. Sifat dari pewarnaan ini adalah anion atau acidic

namun bisa dicampur untuk meningkatkan kontras antara beberapa komponen. Pada

pewarnaan eosin ini bukan merupakan pewarnaan tunggal tetapi merupakan variasi dari

beberapa pewarnaan. Komponennya berupa turunan dari flourescein, dimana berguna

untuk pewarnaan flourescein untuk mewarnai antibodi. Dengan menggabungkan halogen

atau nitro untuk sebuah hidrogen maka bisa didapatkan warna merah dari warna kuning,

misalanya eosin Y (yellowish) berubah menuju eosin B (bluish). Apabila komponen

bromin pada posisi 2 dan 7 maka akan dirubah menjadi nitro. Zat warna ini juga akan

berfluorisensi namun juga larut pada zat warna merah. Garam sodium yang terdapat pada

pewarnaan dapat secara bebas terlarut dalam air dan alkohol namun akan mengendap

seperti asam eosin bila pH sangat rendah. Penambahan asam akan meningkatkan

pewarnaan eosin. Eosin akan sangat bagus untuk pewarnaan sitoplasma dimana ia akan

memberikan kesan yang bagus untuk jaringan. Ethyl eosin adalah sebuah ester dan hanya

larut pada air, digunakan hanya apabila eosin dipisahkan dari alkohol. Eosin juga berguna

pada pewarnaan Romanowsky. Eosin akan memberikan warna merah pada sitoplasma

(counterstain). Pada methyl blue dan Aniline blue. Kedua pewarnaan ini larut dalam air

tetapi tidak larut dalam alkohol bagus dalam mewarnai dalam jarigan penghubung dan

meiliki struktur pewarnaan yang luas. Pada fast green dan light green adalah pewarnaan

anion dan biasanya digunakan sebagai counterstain pada warna merah. Fast green FCF

lebih mudah pudar daripada light green SCF. Pada Orange G, picric acid (trinitrophenol),

metanil yellow dan martius yellow adalah pewarnaan yang sangat pucat namun bagus

untuk background yang agak buram atau yang ada hubungan dengan pewarnaan asam



lainnya. Orange G larut dalam air dan sedikit pada alkohol dan biasa digunakan pada

metode pewarnaan papanicolaou. (Kaushik. B, 2006)

Metode pewarnaan Papanicolaou adalah metode pewarnaan polikromatis yang

merupakan kombinasi pewarnaan hematoxilin untuk mewarnai inti sel dan sitoplasma

pada bagian pewarna lainnya. Papanicolaou juga mencampurkan bahan PTA

(Phospotungsid Acid) pada eosin, light green dan orange G (Papanicolaou, 1942), dia

melarutkan pewarnaan ini pada etil alkohol 95% karena menurut papanicolaou

diferensiasi pewarnaan akan lebih bagus daripada menggunakan bahan pelarut air (

papanicolaou and traut, 1943) PTA bertsifat asam dan mudah larut dalam air juga

memiliki daya ikat yang baik pada jaringan ikat, fibrin dan kolagen. Pewarnaan

papanicolaou akan bekerja secara optimal bila sel terfiksasi alkohol, keterlambatan dalam

fiksasi harus dibuat seminimalis mungkin. Peningkatan intensitas pada orange G adalah

pada pH 1 . Orange G terutama bekerja pada sitoplasma (Galbraith et all., 1979) . Eosin

adalah komponen pada EA50 dimana akan mengikat warna merah muda hingga merah

pada monomer dan orange jika dimer (Marshall et all., 1981). Eosin adalah murni

pewarnaan asam dan terikat terutama pada protein. Intensitas akan meningkat bila pH

larutan sekitar 6 keatas. Molekul pewarna ini lebih besar daripada orange G dan lebih

kecil daripada light green.eosin akan memberi warna merah pada nucleoli (Boon et all.,

1988) Light green , akan tampak pada intensitas pH sekitar 2 , light green akan tampak

pada sitoplasma , sejumlah kecil akan terikat pada inti sel apabila inti sel tidak terikat

pada eosin, maka akan terwarnai hijau (Boon and Drijver, 1986) . Pada metode untuk

pewarnaan pada spermatozoa, Pewarna ini mengandung Harris's haematoxilin untuk

mewarnai inti sel agar berwarna biru, G-6 Orange stain untuk mewarnai sitoplasma dan



hasilnya biasanya berwarna merah muda, EA-50 Green stain untuk mewarnai sitoplasma

dan hasilnya biasanya berwarna merah muda, etanol (50%,80%,95%,100%) untuk fiksasi

dan membuat sel menjadi dehidrasi dan acid etanol untuk menyingkirkan pewarnaan

yang tidak dikehendaki namun masih melekat khususnya pada area sitoplasma, Dan air

untuk merehidrasi sel Pewarnaan multichromatic ini dianggap sebagai teknik yang

sangat handal . Pada spesimen memungkinkan untuk identifikasi akrosom dan daerah

pasca-akrosom kepala spermatozoa, tetesan sitoplasma, midpiece, dan ekor . Intinya

akan berwarna biru sedangkan sitoplasma menampilkan berbagai nuansa biru, oranye,

merah muda atau merah. Faktor yang mempengaruhi hasil pengecatan disamping faktor

larutan pewarna adalah waktu pengecatan, lama pencelupan, pembilasan dan perendaman

harus melalui standart yang telah ditetapkan (Papanicolaou, 1942).

Metode pewarnaan Diff-Quik adalah pewarnaan Romanowsky, yang biasa

digunakan dalam pewarnaan histologis dengan cepat bisa membedakan berbagai

bentukan, umumnya darah dan non-ginekologi , termasuk FNAB. Hal ini didasarkan

pada modifikasi dari pewarnaan Wright Giemsa dipelopori oleh Bernard Witlin pada

tahun 1970. Ini memiliki keunggulan dibandingkan dengan teknik pewarnaan Wright

Giemsa, karena mengurangi proses 4 menit dan memungkinkan untuk selektifitas antara

eosinophilic dan pewarnaan basofilik tergantung pada larutan pewarnaan. Penggunaan

utama dari pewarnaan Romanowsky ini adalah untuk detail sitoplasma. Pewarnaan Diff-

Quik untuk spermatozoa terdiri dari diff-quik fix (fast green 0,002 g/l) dalam methanol

Light green , akan tampak pada intensitas pH sekitar 2 , biasanya akan tampak pada

sitoplasma , sejumlah kecil akan terikat pada inti sel apabila inti sel tidak terikat pada

eosin, maka akan terwarnai hijau (Boon and Drijver 1986), Diff-Quik1 (eosin Y 1,22g/l)



dalam phospate buffer dengan pH 6,6 dan 0,1% sodium azide sebagai preservative . Diff-

Quik2 (thiazine dye 1,1g/l ) didalam phospate buffer pH 6,6. Eosin Y adalah bentuk

eosin. Hal ini paling sering digunakan sebagai pewarnaan untuk mengevaluasi materi

sitoplasma dalam sampel. Pada pewarnaan Diff-Quik akan tampak kepala sperma

berwarna biru pucat pada daerah akrosom, biru gelap pada daerah post akrosom,

midpeace akan terwarnai merah dan ekor akan terwarnai kebiruan agak gelap atau

terkadang merah gelap (Bernard Witlin; 1970).

Pewarnaan modifikasi gram, kombinasi safranin dan kristal violet adalah

pewarnaan yang digunakan di klinik Andrologi. Dimana pewarnaan tersebut memiliki

kandungan antara lain buffer fosfat 0,1M Ph6,8 (Na2HPO4 dan NaH2PO4) kemudian juga

memiliki komposisi Na2HPO412H2O dan komposisi yang terakhir adalah safranin-o dan

kristal violet juga methanol 99% sebagai fiksatif. Safranin (juga safranin O atau dasar

merah 2) adalah pewarnaan biologis yang digunakan dalam histologi dan sitologi.

Safranin digunakan sebagai counterstain dalam beberapa protokol pewarnaan, mewarnai

semua inti sel darah merah. Ini adalah counterstain klasik di kedua pewarnaan Gram, dan

pewarnaan endospora. Kristal violet (juga dikenal sebagai metil violet 10B atau

hexamethyl pararosaniline klorida) adalah pewarna triarylmethane digunakan sebagai

pewarna histologis dan dalam metode Gram dapat mengklasifikasi bakteri. Kristal violet

memiliki sifat anthelmintik antibakteri, antijamur, dan sebelumnya penting sebagai

antiseptik topikal. Pada pewarnaan akan tampak warna violet pada kepala sperma , pale

violet (acrosome), midpeace dan ekor (dark violet) latar belakang (pale pink). Kristal

violet (CV) memisahkan ion dalam larutan air ke dalam ion CV + dan klorida (Cl- ). Ion

ini menembus dinding sel dan membran sel, ion CV + berinteraksi dengan komponen



bermuatan negatif sehingga memberi warna ungu pada sel tersebut. Counterstain, yang

biasanya bermuatan positif (safranin) akan memberikan decolorized warna merah muda.

(Sono Onny Pieters, 1978).



BAB 3

KERANGKA KONSEPTUAL

3.1. Kerangka konseptual

Pada pemeriksaan laboratorium, terdiri dari pemeriksaan semen analisis rutin,

biokimia maupun hormonal. Pada pemeriksaan semen analisis rutin sebagai bagian

terpenting dalam penegakan diagnosis, terdiri dari pemeriksaan makroskopis dan

mikroskopis, dimana pada pemeriksaan mikroskopis terdapat pemeriksaan morfologi

yang bisa dilakukan dengan menggunakan berbagai macam metode pewarnaan, antara

lain Safranin-Kristal Violet, Papanicolau dan Diff-Quik. Masing- masing metode

pewarnaan memiliki larutan yang berbeda serta keunggulan dan kelemahan sehingga

hasil pewarnaan akan tampak berbeda pula. Metode pewarnaan Papanicolaou, untuk

mewarnai nukleus menggunakan harrys haematoxylin yang bersifat acidic dan mudah

larut dalam air dan alkohol serta memiliki beberapa ion garam seperti alumunium, besi,

dan krom ditambah bahan oxidatif . Untuk mewarnai sitoplasma terdapat eosin yang

dimana suatu polichromatis, sehingga differensiasi warna tampak bagus juga dibantu oleh

orange G yang dimana memiliki sifat chromophore yang bisa menguraikan warna dengan

sempurna ditambah lagi bahan peningkat kualitas pewarnaan seperti PTA, acidic etanol.

Agar pewarnaan yang tidak dinginkan tidak melekat pada jaringan maka digunakan

decolourizer seperti etil alkohol. Metode pewarnaan Safranin-Kristal Violet, untuk

mewarnai nukleus menggunakan kristal violet yang dapat mengendap dan larut pada air

serta safranin yang memiliki daya warna yang bagus walaupun tidak terdapat ion garam



stabilisator pH dan safranin sendiri sebagai indikator warna, sehingga diferensiasi warna

menjadi bagus. Agar pewarnaan yang tidak dinginkan tidak melekat pada jaringan

digunakan metil alkohol. Metode pewarnaan Diff-quik, untuk mewarnai nukleus

menggunakan thiazine yang mengandung methylen blue untuk memberikan hasil yang

bagus. Untuk mewarnai sitoplasma ,terdapat eosin yang dimana bisa berflouresensi

sehingga membuat differensiasi warna menjadi bagus. Agar pewarnaan yang tidak

dinginkan tidak melekat pada jaringan digunakan metanol light green pada metode

pewarnaan diff-quik. Semua keunggulan dan kelemahan pada masing-masing metode

tersebut akan menyebakan differensiasi warna yang berbeda dan intensitas warna yang

berbeda pula sehingga menyebabkan perbedaan pada hasil analisis morfologi

spermatozoa manusia.





Keterangan :

: Diteliti

: Tidak diteliti

3.2. Hipotesis

Ada perbedaan pada hasil pemeriksaan morfologi spermatozoa manusia antara

metode pewarnaan Papanicolaou, Diff-Quik, dan Safranin-Kristal Violet di RSUD dr

Soetomo, Surabaya.



BAB 3 KERANGKA KONSEPTUAL



BAB 4 METODE PENELITIAN



BAB 4

METODE PENELITIAN

4.1. Jenis dan rancangan penelitian

Jenis penelitian ini adalah penelitian observasional analytic laboratorium.

Rancangan penelitian ini menggunakan metode Komparatif dengan

menggunakan analysis of varian atau ANOVA. Subyek dilakukan untuk

membandingkan metode Papanicolaou, metode Diff-Quik dan metode Safranin-

Kristal Violet pada analisis morfologi spermatozoa.

4.2. Rancangan penelitian

Gambar 4.1 Rancangan Penelitian

Keterangan :

P = Populasi

P

S

O

X1 X2 X3



S = Sampel

X1 = Pewarnaan Papanicolaou

X2 = Pewarnaan Diff-Quik

X3 = Pewarnaan Safranin- Kristal Violet

O = Observasi hasil morfologi spermatozoa manusia

4.3. Tempat dan waktu penelitian

Penelitian dilakukan di unit rawat jalan Andrologi Rumah Sakit Umum

dr. Soetomo – Fakultas Kedokteran Universitas Airlangga, Surabaya periode

Oktober 2015 – Februari 2016.

4.4. Populasi penelitian

Populasi penelitian ini adalah seluruh pria di RSUD Dr Soetomo, Surabaya

periode Oktober 2015 – Februari 2016.

4.5. Sampel penelitian dan besar sampel penelitian (n)

Sampel penelitian adalah pria yang bersedia mengikuti penelitian serta

memenuhi kriteria yang ditetapkan di RSUD Dr Soetomo, Surabaya periode

Oktober 2015 – Februari 2016.

Besar sampel penelitian (n)

Menggunakan rumus hypothesis test for a population mean (two-sided test)

(Lemeshow, 1997)

n = δ2 (z1-α/2 + z1-ß/2)2

(µ0-µa)2

α= 0,05 (percent level of significant)



1-ß=90 (percent power of test)

δ= 15,04 (population standar deviasi)

δ2 = 226.2 (population variance)

µ0 =51.2 (test value of the population mean)

µa = 42.3 (anticipated population mean)

Zα/2 = 1,96 untuk α = 5%

Zß/2 = 1,28 untuk ß = 10%

n = 226.2(1,96+1,28)2 / (51.2-42.3)2 = 29.9779~ 30 untuk masing-masing

replikasi.

4.6. Kriteria inklusi dan eksklusi

Kriteria inklusi

1. Bersedia mengikuti penelitian dan menandatangani informed consent.

2. Usia produktif antara 21- 40 thn.

3. Pria dengan konsentrasi spermatozoa >5jt/ml

Kriteria eksklusi

1. Hasil analisis semen rutin azoospermia.

2. Sedang dalam masa pengobatan.

4. 7. Teknik pengambilan sampel

Sampel diambil secara konsekutif, seluruh pria di RSUD dr.Soetomo,

Surabaya, yang bersedia ikut penelitian dan memenuhi kriteria pemilihan

dimasukkan dalam penelitian sampai jumlah sampel yang diperlukan terpenuhi.



4.8. Variabel penelitian

Variabel terikat : morfologi spermatozoa

Variabel bebas : metode pewarnaan Papanicolaou , metode pewarnaan

Diff-Quik, metode pewarnaan Safranin-Kristal Violet.

4.9. Definisi operasional variabel

Morfologi spermatozoa adalah keseluruhan bentuk spermatozoa yang

dimana bentuk normalnya didasarkan pada kriteria kruger.

Pewarnaan Papanicolaou adalah pewarnaan komersial yang

mengandung haematoxyllin, eosin dan orange-G serta light green pada

pewarna utamanya untuk mewarnai spermatozoa manusia dengan

tambahan acidic etanol serta teknik fiksasi bertingkat untuk

penyempurnaan hasil pewarnaan.

Pewarnaan Diff-Quik adalah pewarnaan Romanowsky yang

mengandung diff-quik fix (fast green 0,002 g/l) dalam methanol, diff-

quik1 (eosin Y 1,22g/l) dalam buffer fosfat dengan pH 6,6 dan 0,1%

sodium azide sebagai preservative serta Diff-Quik2 (thiazine dye ).

Pewarnaan Safranin-kristal violet adalah pewarnaan modifikasi gram

yang mengandung buffer fosfat I pH6,8, Buffer fosfat II pH 6,8, Larutan

safranin O (dalam buffer fosfat Ph6.8), Larutan Kristal violet 0,25gr%

(buffer acetat Ph2,4) dan methanol 99% sebagai fiksatif.



4.10. Alat dan bahan

Alat Penelitian

Sarung tangan, Mikroskop Cahaya, Obyek glass, ocular

Mikrometer, Staining Jar

Bahan Penelitian

Papanicolaou

Terdiri dari: Harris Haematoxylin (1A)®MERCK, G-6 Orange

Stain®MERCK, EA-50 green stain®MERCK, Ethanol 50%, 80%,

95%, 100%, Acid ethanol, Air aquadest

Diff-Quik®Microptic

Terdiri dari :Diff-quik fix (fast green 0,002 g/l) dalam methanol,

Diff-quik1 (eosin Y 1,22g/l) dalam buffer fosfat dengan pH 6,6 dan

0,1% sodium azide sebagai preservative, Diff-Quik2 (thiazine dye

1,1g/l didalam buffer fosfat pH 6,6.

Safranin-kristal violet (Sono Onny Pieters, 1978)

Terdiri dari: buffer fosfat I pH6,8, Buffer fosfat II pH 6,8, Larutan

safranin O (dalam buffer fosfat Ph6.8), Larutan Kristal violet

0,25gr% (buffer acetat Ph2,4) methanol 99%

4.11. Prosedur kerja

Calon peserta mendapat penjelasan tujuan penelitian dan menyetujui ikut

serta penelitian dengan menandatangani surat pernyataan kesediaan yang telah

disetujui oleh komisi bioetik RSUD Dr Soetomo Fakultas Kedokteran Universitas

Airlangga (lampiran 1).



Sampel ejakulat (diperoleh dengan cara masturbasi setelah abstinensia 2-5

hari) yang ikut masuk sebagai sampel penelitian akan diperiksa analisis semen

rutin (sesuai kriteria inklusi dan eksklusi), kemudian hasil analisis semen akan

dilakukan pemeriksaan mikroskopis dengan cara dibuat hapusan dan diwarnai

dengan metode Papanicolaou, metode Diff-Quik maupun metode Safranin-kristal

violet , kemudian dievaluasi ukuran kepala, bentuk kepala, akrosom dan vakuola

pada kepala spermatozoa, bentuk pada mid peace bentuk pada principle peace dan

excess residual cytoplasm apakah normal atau tidak. Kemudian hasilnya

dibandingkan.

Prosedur Kerja Metode Papanicolaou (WHO,1999).

1. Buat hapusan sperma dengan meneteskan 5-20 µl semen pada objek

glass lalu geser dan keringkan.

2. Keringkan di udara sampai kering (posisi sandar) 5-15 menit

3. Celupkan hapusan ke dalam Ethanol 80% 10 celup



6. Celupkan hapusan ke dalam air destilasi10 celup

7. Celupkan hapusan ke dalam Harris’s haematoxylin 3 menit

8. Running cold tap water 3-5 menit

9. Celupkan hapusan ke dalam Acidic ethanol 2 celupan

10. Running cold tap water 3-5 menit

11. Celupkan hapusan ke dalam air destilasi1 celup


13. Celupkan hapusan ke dalam Ethanol 70% 10celup




15. Celupkan hapusan ke dalam Ethanol 90% 10celup

16. Celupkan hapusan ke dalam G-6 orange stain 1 menit



19. Celupkan hapusan ke dalam EA-50 green stain5 menit




23. Celupkan hapusan ke dalam Ethanol 100% 2menit

24. Kemudian diamati di bawah mikroskop dengan pembesaran 1000x

menggunakan minyak emersi

Prosedur Kerja Metode Diff-Quik®Microptic.



2. Keringkan di udara sampai kering (posisi sandar) 5- 15 menit.

3. Diff-Quik fix fast green 0,002 g/l methanol celup selama 20 detik.

4. Diff-Quik1 (eosin Y 1,22g/l) dalam phospate buffer dengan pH 6,6

dan 0,1% sodium azide sebagai preservative celup selama 40 detik.

5. Diff-Quik2 thiazine 1,1g/l buffer fosfat pH 6,6. Celup40 detik.

6. Bilas pada air bersih , keringkan.

7. Baca dengan perbesaaran 1000x menggunakan minyak emersi.



Prosedur Kerja Metode Safranin-Kristal Violet (Sono Onny Pieters, 1978).



2. Celupkan hapusan ke dalam methanol 99% untuk fiksasi selama 5

menit

3. Celupkan ke dalam safranin O (dalam buffer fosfat Ph6.8) selama 5

menit.

4. Celupkan ke buffer fosfat I pH 6,8 kemudian langsung angkat dan

celupkan ke buffer fosfat II pH 6,8 kemudian langsung angkat.

5. Celupkan ke Kristal violet 0,25 gr% buffer acetat pH 2,4 ( 5 menit).

6. Bilas, tunggu kering, amati dengan mikroskop ( 1000x) (oil

emertion).

4.12. Alur Penelitian

Gambar 4.2 Alur penelitian

Metode

Papanicolaou

kepala

ekor

K

o

m

p

a

r

a

s

i

midpiece

Pria di RSUD dr Soetomo

Analisis semen Rutin

Anamnesis

Pengambilan sampel

dengan mansturbasi

Metode

Diff-Quik

Metode Safranin -Kristal Violet

kepala

ekor

midpiece

kepala

ekor

midpiece



4.13. Pengolahan dan Analisis Data

Dicatat hasil pewarnaan Papanicolaou, Diff-Quik dan Safranin-Kristal

Violet. Data hasil percobaan kemudian diolah, disajikan dalam bentuk

tabel dan diagram serta dilakukan analisis hasil.

Dilakukan analisis statistik

Uji statistik meliputi Uji komparasi menggunakan uji Kolmogorov-

Smirnov sebagai uji normalitasnya, bila data berdistribusi normal dan

homogen maka diuji beda menggunakan analisis varian (ANOVA)

dengan uji beda terkecil menggunakan uji Least Significant Difference,

apabila heterogen maka dilakukan uji Brown-Forsythe dengan uji beda

terkecil Games-Howell. Bila data tidak berdistribusi normal maka

dilakukan uji Kruskal-Wallis dengan uji beda terkecil menggunakan

Mann-Whitney. Dikatakan signifikan jika p<0,05 dengan taraf

kepercayaan (CI) sebesar 95%.



BAB 5 HASIL PENELITIAN



BAB 5

HASIL PENELITIAN

5.1. Karakteristik Sampel

Sampel yang telah terkumpul mempunyai rentang umur antara 21 – 40 tahun.

Abstinensia minimal 2 dan maksimal 7 hari. Seluruh sampel sperma diperoleh secara

masturbasi dan lengkap dan didapatkan 90 sampel. Hasil analisis sampel sperma pasien

tersebut didapatkan konsentrasi sperma diatas 15 juta/ml.

5.2. Data khusus

Hasil uji One-Sample Kolmogorov-Smirnov Test panjang dan lebar kepala

spermatozoa dapat dilihat pada tabel dibawah ini.

Tabel 5.1 Hasil uji menggunakan One-Sample Kolmogorov-Smirnov Test untuk ukuran kepala spermatozoa.

Parameter Diff-Quik Papanicolaou Safranin- Kristal Violet

Panjang rata-rata 0.088 0.016 0.378

Lebar rata-rata 0.892 0.054 0.095

Pada hasil uji beda untuk ukuran kepala spermatozoa dalam kategori panjang rata-rata

dan lebar rata-rata, didapati hasil seperti pada tabel berikut.

Tabel 5.2. Hasil uji beda untuk ukuran kepala spermatozoa menggunakan Kruskal-Wallis (KW), Mann-Whitney (MW), Brown-Forsythe (BF) dan Games-Howell (GH).


Panjang rata-rata < 0.001 (KW)





(MW) (MW) (MW)

Lebar rata-rata

< 0.001 (BF)

(GH) (GH) (GH)

Pada panjang rata-rata, antara ketiga metode dilakukan uji analisis Kruskal-Wallis

(KW) dan hasilnya tidak berdistribusi normal p < 0,05, maka dilakukan uji lanjutan dengan

uji statistik Mann-Whitney (MW) dan didapati hasil seperti diagram dan tabel dibawah ini.

Diagram 5.1. Hasil uji beda panjang rata-rata menggunakan Kruskal-Wallis (KW).

Tabel 5.2.1. Hasil uji beda terkecil panjang rata-rata menggunakan Mann-Whitney (MW).

Metode n p Diff-Quik – Papanicolaou

90 < 0.001

Diff-Quik - Safranin- Kristal Violet 90 < 0.001

Papanicolaou - Safranin- Kristal Violet 90 < 0.001

Lebar rata-rata antara pada ketiga metode dilakukan uji analisis Brown-Forsythe (BF)

dan hasilnya tidak berdistribusi normal p < 0,05, maka dilakukan uji lanjutan dengan uji

statistik Games-Howell (GH) dan didapati hasil seperti pada diagram dan tabel dibawah ini.

4.87464.2165 4.5396

0

1

2

3

4

5

6

panjang rata rata

Diff-Quik

Papanicolaou

Safranin-

Kristal Violet



Diagram 5.2. Hasil uji beda lebar rata-rata menggunakan Brown-Forsythe (BF).

Tabel 5.2.2. Hasil uji beda lebar rata-rata terkecil menggunakan Games-Howell (GH).

Metode n p

Diff-Quik Papanicolaou 90 < 0.001 Safranin- Kristal Violet 90 < 0.001

Papanicolaou Diff-Quik 90 < 0.001 Safranin- Kristal Violet 90 0.003

Safranin- KristalViolet

Diff-Quik 90 < 0,001

Papanicolaou 90 0.003

Pada bentuk kepala spermatozoa, sebelum dilakukan uji beda, maka terlebih dahulu

dilakukan uji distribusi normal One-Sample Kolmogorov-Smirnov Test seperti pada tabel

dibawah ini.

Tabel 5.3. Hasil uji distribusi normal untuk bentuk kepala spermatozoa menggunakan One-Sample Kolmogorov-Smirnov Test.

Parameter

Fertil

Diff-Quik Papanicolaou Safranin- Kristal Violet

Tapered 0.016 0.046 0.020

Pyi 0.336 0.238 0.404

Round 0.001 0.006 0.002

Amorph 0.015 <0.001 0.110

2.9672.5348 2.6971

0

0.5

1

1.5

2

2.5

3

3.5

4

lebar rata rata

Diff-Quik

Papanicolaou

Safranin-

Kristal Violet



Vacuoles->2 < 0.001 0.041 < 0.001

Vacuoles-LNV < 0.001 < 0.001 < 0.001

Vacuoles-PA < 0.001 < 0.001 < 0.001

Acrosom-<40% < 0.001 0.005 0.003

Acrosom->70% < 0.001 < 0.001 < 0.001

Acrosom-terwarnai sempurna 0.003 < 0.001 < 0.001

Acrosom-terwarnai tidak sempurna < 0.001 < 0.001 < 0.001

Head terwarnai sempurna < 0.001 < 0.001 < 0.001

Head terwarnai tidak sempurna

< 0.001 < 0.001 < 0.001

Pada hasil uji beda untuk bentuk kepala sperma menggunakan Anova, Kruskal-Wallis

(KW) dan Mann-Whitney (MW) didapatkan hasil seperti pada tabel berikut ini.

Tabel 5.4. Hasil uji beda untuk bentuk kepala spermatozoa menggunakan ANOVA, Kruskal-Wallis (KW) dan Mann-Whitney (MW)

Parameter

Fertil


Form-Tapered 0.736(KW)

- - -

Form-Pyri 0.077(ANOVA)

- - -

Form-Round 0.832 (KW)

- - -

Form-Amorph 0.012(KW)

(MW) (MW) (MW)

Vacuoles->2 < 0.001(KW)

(MW) (MW) (MW)

Vacuoles-LNV < 0.001(KW)

(MW) (MW) (MW)

Vacuoles-PA 0.011(KW) (MW) (MW) (MW)

Acrosom-<40% 0.847 (KW)



12.51 12.71 13.04

0

5

10

15

20

25

tappered

Diff-Quik

Papanicolaou

Safranin-Kristal

Violet

- - -

Acrosom->70% 0.074(KW) - - -

Acrosom-terwarnai sempurna

< 0.001(KW) (MW) (MW) (MW)

Acrosom-terwarnai tidak sempurna

< 0.001 (KW)

(MW) (MW) (MW)

Head-terwarnai sempurna 0.241(KW) - - -

Head-terwarnai tidak sempurna

0.032(KW) (MW) (MW) (MW)

Pada taperred diuji dengan Kruskal-Wallis (KW) dan tidak didapatkan perbedaan (p

> 0,05), hasilnya seperti pada diagram dibawah ini.

Diagram 5.3. Hasil uji beda taperred menggunakan Kruskal Wallis (KW).

Pada pyri dilakukan uji ANOVA dan tidak didapatkan perbedaan (p > 0,05) seperti

disajikan pada diagram dibawah ini.

Diagram 5.4. Hasil uji beda pyri menggunakan ANOVA

14.29

12.813.04

0

5

10

15

20

25

pyri

Diff-Quik

Papanicolaou

Safranin-Kristal

Violet



Pada round dilakukan uji Kruskal-Wallis (KW) dan tidak didapatkan perbedaan (p >

0,05), hasilnya seperti pada diagram dibawah ini.

Diagram 5.5. Hasil uji beda round menggunakan Kruskal-Wallis (KW).

Pada amorph dilakukan uji Kruskal-Wallis (KW) dan didapatkan perbedaan (p <

0,05), lalu dilakukan uji beda Mann-Whitney (MW). Uji beda disajikan pada diagram dan

tabel dibawah ini.

Diagram 5.6. Hasil uji beda amorph menggunakan Kruskal-Wallis (KW).

Tabel 5.4.1. Hasil uji beda amorph menggunakan Mann-Whitney (MW).

Metode n p

Diff-Quik – Papanicolaou 90 0.893 Diff-Quik – Safranin-Kristal

Violet 90 0.010

Papanicolaou - Safranin-Kristal Violet 90 0.010

4.64

4.91

4.31

0

2

4

6

8

10

12

round

Diff-Quik

Papanicolaou

Safranin-Kristal

Violet

8.369.31

11.58

0

5

10

15

20

25

amorph

Diff-Quik

Papanicolaou

Safranin-Kristal

Violet



Pada vaculoes> 2 dilakukan uji Kruskal-Wallis (KW) dan didapatkan perbedaan (p <

0,05), lalu dilakukan uji beda Mann-Whitney (MW). Uji beda disajikan pada diagram dan

tabel dibawah ini.

Diagram 5.7. Hasil uji beda vacuoles> 2 menggunakan Kruskal-Wallis (KW).

Tabel 5.4.2. Hasil uji beda vacuoles > 2 menggunakan Mann-Whitney (MW).

Metode n p

Diff-Quik - Papanicolaou 90 < 0.001 Diff-Quik - Safranin-Kristal

Violet 90 0.163

Papanicolaou - Safranin-Kristal Violet 90 < 0.001

Pada Vaculoes LNV dilakukan uji Kruskal-Wallis (KW) dan didapatkan perbedaan

(p < 0,05), lalu dilakukan uji beda Mann-Whitney (MW). Uji beda disajikan pada diagram

dan tabel dibawah ini.

Diagraml 5.8.Hasil uji beda vacuoles LNV menggunakan Kruskal-Wallis (KW).

0.22

2.04

0.60

1

2

3

4

5

6

7

vacuoles LNV

Diff-Quik

Papanicolaou

Safranin-Kristal

Violet

2.18

9.58

3.84

0

5

10

15

20

vacuoles > 2

Diff-Quik

Papanicolaou

Safranin-Kristal

Violet



Tabel 5.4.3. Hasil uji beda vacuoles LNV menggunakan Mann-Whitney (MW).

Metode n p


Violet 90 0.046 Papanicolaou - Safranin-Kristal

Violet 90 0.010

Pada vaculoes PA dilakukan uji Kruskal-Wallis (KW) dan didapatkan perbedaan (p

<0,05), lalu dilakukan uji beda Mann-Whitney (MW), hasilnya seperti pada diagram dan

tabel dibawah ini.

Diagram 5.9. Hasil uji beda vacuolesPA menggunakan Kruskal-Wallis (KW).

Tabel 5.4.4. Hasil uji beda vacuoles PA menggunakan Mann-Whitney (MW).

Metode n p

Diff-Quik - Papanicolaou 90 0.008 Diff-Quik - Safranin-Kristal


Violet 90 0.021

0.62

2

0.490

1

2

3

4

5

6

7

8

vacuoles PA

Diff-Quik

Papanicolaou

Safranin-Kristal

Violet



Pada akrosom< 40 % dilakukan uji Kruskal-Wallis (KW) dan tidak didapatkan

perbedaan (p > 0,05) hasilnya seperti pada diagram dibawah ini.

Diagram 5.10. Hasil uji beda akrosom < 40% menggunakan Kruskal-Wallis (KW).

Pada akrosom> 70% dilakukan uji Kruskal-Wallis (KW) dan tidak didapatkan

perbedaan ( p > 0,05), hasilnya seperti pada diagram dibawah ini.

Diagram 5.11. Hasil uji beda akrosom> 70% menggunakan Kruskal-Wallis (KW).

15.9312.71

14.51

0

5

10

15

20

25

30

35

40

akrosom < 40%

Diff-Quik

Papanicolaou

Safranin-

Kristal Violet

1.8

2.96 2.47

0

2

4

6

8

10

akrosom > 70%

Diff-Quik

Papanicolaou

Safranin-Kristal

Violet



Pada akrosom terwarnai sempurna dilakukan uji Kruskal-Wallis (KW) dan

didapatkan perbedaan ( p < 0,05), lalu dilanjutkan dengan uji Mann-Whitney (MW) hasilnya

seperti pada diagram dan tabel dibawah ini.

Diagram 5.12. Hasil uji beda akrosom terwarnai sempurna menggunakan Kruskal-Wallis (KW).

Tabel 5.4.5. Hasil uji beda akrosom terwarnai sempurna menggunakan Mann-Whitney (MW).

Metode n p


Violet 90 < 0.001 Papanicolaou - Safranin-Kristal

Violet 90 0.453

Pada akrosom terwarnai tidak sempurna dilakukan uji Kruskal-Wallis (KW) dan

didapatkan perbedaan (p < 0,05), lalu dilakukan uji beda Mann-Whitney (MW). Uji beda

disajikan pada diagram dan tabel dibawah ini.

Diagram 5.13. Hasil uji beda akrosom terwarnai tidak sempurna menggunakan Kruskal-Wallis (KW).

65.89

79.6 77.69

0

20

40

60

80

100

120

140

akrosom terwarnai sempurna

Diff-Quik

Papanicolaou

Safranin-

Kristal Violet

18.38

3.71 5.11

0

10

20

30

40

akrosom terwarnai tidak sempurna

Diff-Quik

Papanicolaou

Safranin-

Kristal Violet



Tabel 5.4.6. Hasil uji beda akrosom terwarnai tidak sempurna menggunakan Mann-Whitney (MW).

Metode n p



Violet 90 0.157

Pada head terwarnai sempurna dilakukan uji Kruskal-Wallis (KW) dan tidak

didapatkan perbedaan (p > 0,05), hasilnya seperti pada diagram dibawah ini.

Diagram 5.14. Hasil uji beda head terwarnai sempurna menggunakan Kruskal-Wallis (KW).

Pada head terwarnai tidak sempurna dilakukan uji Kruskal-Wallis (KW) dan

didapatkan perbedaan ( p < 0,05)lalu dilakukan uji beda Mann-Whitney (MW). Uji beda

disajikan pada diagram dan tabel dibawah ini.

Diagram 5.15. Hasil uji beda head terwarnai tidak sempurna menggunakan Kruskal-Wallis (KW).

63.4 65.42 65.04

0

20

40

60

80

100

120

head terwarnai sempurna

Diff-Quik

Papanicolaou

Safranin-

Kristal Violet

1.6

0.36 0.470

2

4

6

8

head terwarnai tidak sempurna

Diff-Quik

Papanicolaou

Safranin-

Kristal Violet



Tabel 5.4.7. Hasil uji beda head terwarnai tidak sempurna menggunakan Mann-Whitney (MW).

Metode n p



Violet 90 0.354

Pada Hasil uji distribusi normal untuk mid piece spermatozoa menggunakan One-

Sample Kolmogorov-Smirnov Test setelah diuji normal maka didapati hasil seperti pada tabel.

Tabel 5.5. Hasil uji distribusi normal untuk bentuk mid piece spermatozoa menggunakan One-Sample Kolmogorov-Smirnov Test.

Parameter

Fertil


Insertion < 0.001 < 0,001 0,002

Thick 0.013 0.003 0.017

Thin < 0.001 < 0.001 < 0.001

Irregular < 0.001 < 0.001 < 0.001

Bent < 0.001 < 0.001 0.002

Terwarnai Sempurna < 0.001 < 0.001 < 0.001

Terwarnai tidak sempurna < 0.001 < 0.001 < 0.001

Pada hasil uji beda untuk bentuk mid piece sperma menggunakan Brown-Forsythe

(BF), Games-Howell (GH), dan Kruskal-Wallis (KW) didapatkan data seperti pada tabel

berikut.



Tabel 5.6. Hasil uji beda untuk bentuk mid piece spermatozoa menggunakan Brown-Forsythe (BF), Games-Howell (GH), dan Kruskal-Wallis (KW).


Insertion 0.154(KW)

Thick 0.013(BF)

(GH) (GH) (GH)

Thin 0.856(KW)

Irregular 0.831(KW)

Bent 0.359(KW)

Terwarnai Sempurna 0.979(KW)

Terwarnai Tidak Sempurna 0.885(KW)

Pada mid piece insertion dilakukan uji Kruskal-Wallis (KW) dan tidak didapatkan

perbedaan, hasilnya seperti pada diagram dibawah ini.

Diagram 5.16. Hasil uji beda mid piece insertion menggunakan Kruskal-Wallis (KW).

3.09 3.13

3.76

0

2

4

6

8

10

insertion

Diff-Quik

Papanicolaou

Safranin-Kristal

Violet



Pada mid piece thick dilakukan uji Brown-Forsythe (BF) dan didapatkan perbedaan,

lalu dilakukan uji beda Games-Howell (GH). Uji beda disajikan pada diagram dan tabel

dibawah ini.

Diagram 5.17. Hasil uji beda mid piece thick dilakukan uji Brown-Forsythe (BF).

Tabel 5.6.1 Hasil uji beda mid piece thick dilakukan uji Games-Howell (GH).

Metode n p



Violet 90 0.002

Pada mid piece thin dilakukan uji Kruskal-Wallis (KW) dan tidak didapatkan


Diagram 5.18. Hasil uji beda mid piece thin menggunakan Kruskal-Wallis (KW).

10.849.04

12.98

0

5

10

15

20

25

30

Thick

Diff-Quik

Papanicolaou

Safranin-Kristal

Violet

1.070.87 0.67

0

1

2

3

4

5

Thin

Diff-Quik

Papanicolaou

Safranin-Kristal

Violet



Pada mid piece irregular dilakukan uji Kruskal-Wallis (KW) dan tidak didapatkan


Diagram 5.19. Hasil uji beda mid piece irregular menggunakan Kruskal-Wallis (KW).

Pada mid piece bent dilakukan uji Kruskal-Wallis (KW) dan tidak didapatkan


Diagram 5.20. Hasil uji beda mid piece bent menggunakan Kruskal-Wallis (KW).

4.67 5.164.98

0

2

4

6

8

10

12

14

16

Irregular

Diff-Quik

Papanicolaou

Safranin-Kristal

Violet

3.38

4.36 4.24

0

2

4

6

8

10

12

bent

Diff-Quik

Papanicolaou

Safranin-

Kristal Violet



Pada mid piece terwarnai sempurna dilakukan uji Kruskal-Wallis (KW) dan tidak

didapatkan perbedaan, hasilnya seperti pada diagram dibawah ini.

Diagram 5.21. Hasil uji beda mid piece terwarnai sempurna menggunakan Kruskal-Wallis (KW)

Pada mid piece terwarnai tidak sempurna dilakukan uji Kruskal-Wallis (KW) dan

tidak didapatkan perbedaan, hasilnya seperti pada diagram dibawah ini.

Diagram 5.22. Hasil uji beda mid piece terwarnai tidak sempurna menggunakan Kruskal-Wallis (KW)

79.07 79.6 79.29

0

20

40

60

80

100

120

140

terwarnai sempurna

Diff-Quik

Papanicolaou

Safranin-

Kristal Violet

3.18

22.42

0

2

4

6

8

10

12

14

terwarnai tidak sempurna

Diff-Quik

Papanicolaou

Safranin-

Kristal Violet



Pada hasil uji distribusi normal untuk bentuk principal piece spermatozoa

menggunakan One-Sample Kolmogorov-Smirnov Test didapati hasil seperti pada tabel.

Tabel 5.7. Hasil uji distribusi normal untuk bentuk principal piece spermatozoa menggunakan One-Sample Kolmogorov-Smirnov Test.

Parameter

Fertil


Short < 0.001 < 0.001 < 0.001

Multiple < 0.001 < 0.001 < 0.001

Broken < 0.001 < 0.001 < 0.001

Bent < 0.001 < 0.001 < 0.001

Irregular < 0.001 < 0.001 < 0.001

Looped < 0.001 < 0.001 < 0.001

Coiled 0.001 0,013 0.004

Terwarnai Sempurna < 0.001 < 0.001 < 0.001

Terwarnai tidak sempurna < 0.001 < 0.001 < 0.001

Pada hasil uji beda untuk bentuk principal piece sperma menggunakan Kruskal-

Wallis (KW) hasilnya seperti pada tabel dibawah ini.

Tabel 5.8. Hasil uji beda untuk bentuk principal piece spermatozoa menggunakan Kruskal-Wallis (KW).


Short 0.918(KW)

Multiple 0.088(KW)

Broken 0.229(KW)

Bent 0.688(KW)

Irregular 0.960(KW)



Looped 0.749(KW)

Coiled 0.124(KW)

Terwarnai Sempurna 0.918(KW)


Pada bentukan short dilakukan uji Kruskal-Wallis (KW) dan tidak didapatkan


Diagram 5.23. Hasil uji beda short menggunakan Kruskal-Wallis (KW).

Pada multiple dilakukan uji Kruskal-Wallis (KW) dan tidak didapatkan perbedaan,

hasilnya seperti pada diaagram dibawah ini.

Diagram 5.24. Hasil uji beda multiple menggunakan Kruskal-Wallis (KW).

0.24 0.09 0.130

0.5

1

1.5

2

short

Diff-Quik

Papanicolaou

Safranin-

Kristal Violet

0.11

0.33 0.4

0

0.2

0.4

0.6

0.8

1

1.2

1.4

1.6

multiple

Diff-Quik

Papanicolaou

Safranin-

Kristal Violet



Pada broken dilakukan uji Kruskal-Wallis (KW) dan tidak didapatkan perbedaan,

hasilnya seperti pada diagram dibawah ini.

Diagram 5.25. Hasil uji beda broken menggunakan Kruskal-Wallis (KW).

Pada bent dilakukan uji Kruskal-Wallis (KW) dan tidak didapatkan

perbedaan,hasilnya seperti pada diagram dibawah ini.

Diagram 5.26. Hasil uji beda bent menggunakan Kruskal-Wallis (KW).

1.090.87 0.73

0

0.5

1

1.5

2

2.5

3

3.5

broken

Diff-Quik

Papanicolaou

Safranin-

Kristal Violet

2.29 2.112.56

0

1

2

3

4

5

6

7

bent

Diff-Quik

Papanicolaou

Safranin-

Kristal Violet



Pada irregular dilakukan uji Kruskal-Wallis (KW) dan tidak didapatkan


Diagram 5.27. Hasil uji beda irregular menggunakan Kruskal-Wallis (KW).

Pada looped dilakukan uji Kruskal-Wallis (KW) dan tidak didapatkan


Diagram 5.28. Hasil uji beda looped menggunakan Kruskal-Wallis (KW).

0.49

0.64

0.56

0

0.5

1

1.5

2

2.5

irregular

Diff-Quik

Papanicolaou

Safranin-

Kristal Violet

3.6 3.162.84

0

2

4

6

8

10

looped

Diff-Quik

Papanicolaou

Safranin-

Kristal Violet



Pada coiled dilakukan uji Kruskal-Wallis (KW) dan tidak didapatkan


Diagram 5.29. Hasil uji beda coiled menggunakan Kruskal-Wallis (KW)

Pada principal piece terwarnai sempurna dilakukan uji Kruskal-Wallis (KW) dan

tidak didapatkan perbedaan,hasilnya seperti pada diagram dibawah ini.

Diagram 5.30. Hasil uji beda principal piece terwarnai sempurna menggunakan Kruskal-Wallis (KW)

5.27 6

4.09

0

2

4

6

8

10

12

14

coiled

Diff-Quik

Papanicolaou

Safranin-Kristal

Violet

78.6 80.69 80.91

0

20

40

60

80

100

120

140

terwarnai sempurna

Diff-Quik

Papanicolaou

Safranin-

Kristal Violet



Pada principal piece terwarnai tidak sempurna dilakukan uji Kruskal-Wallis (KW)

dan tidak didapatkan perbedaan, hasilnya seperti pada diagram dibawah ini.

Diagram 5.31. Hasil uji beda principal piece terwarnai tidak sempurna menggunakan Kruskal-Wallis (KW).

Pada hasil uji distribusi normal untuk bentuk ERC spermatozoa menggunakan One-

Sample Kolmogorov-Smirnov Test didapati hasil seperti tabel dibawah.

Tabel 5.9. Hasil uji distribusi normal untuk bentuk ERC spermatozoa menggunakan One-Sample Kolmogorov-Smirnov Test.


Terwarnai sempurna < 0.001 < 0.001 < 0.001

Terwarnai tidak sem-purna

< 0.001 < 0.001 < 0.001

Normal < 0.001 < 0.001 < 0.001

Tidak Normal < 0.001 0.077 0.131

1.821.16

0.910

1

2

3

4

5

6

7

8


Diff-Quik

Papanicolaou

Safranin-Kristal

Violet



Pada hasil uji beda untuk bentuk ERC sperma menggunakan Kruskal-Wallis (KW)

dan Mann Whitney (MW), didapatkan data seperti pada tabel dibawah ini.

Tabel 5.10. Hasil uji beda untuk bentuk ERC spermatozoa menggunakan Kruskal-Wallis (KW) dan Mann Whitney (MW).


Terwarnai Sempurna < 0.001(KW)

(MW) (MW) (MW)


- - -

Normal < 0.001(KW)

(MW) (MW) (MW)

Tidak Normal < 0.001(KW)

(MW) (MW) (MW)

Pada ERC terwarnai sempurna dilakukan uji Kruskal-Wallis (KW) dan didapatkan

perbedaan, lalu dilakukan uji beda Mann-Whitney (MW). Uji beda disajikan pada diagram

dan tabel dibawah ini.

Diagram 5.32. Hasil uji beda ERC terwarnai sempurna menggunakan Kruskal-Wallis (KW).

11.44

69.33 66.84

0

20

40

60

80

100

120

140

terwarnai sempurna

Diff-Quik

Papanicolaou

Safranin-

Kristal Violet



Tabel 5.10.1.Hasil uji beda ERC terwarnai sempurna menggunakan Mann-Whitney (MW).

Metode n p

Diff-Quik - Papanicolaou 90

< 0.001 Diff-Quik - Safranin-Kristal

Violet 90 < 0.001

Papanicolaou - Safranin-Kristal Violet 90 0.632

Pada ERC terwarnai tidak sempurna dilakukan uji Kruskal-Wallis (KW) dan tidak

didapatkan perbedaan. Uji beda disajikan pada tabel dibawah ini.

Diagram 5.33. Hasil uji beda ERC terwarnai tidak sempurna menggunakan Kruskal-Wallis (KW).

Pada ERC normal dilakukan uji Kruskal-Wallis (KW) dan didapatkan perbedaan, lalu

dilakukan uji beda Mann-Whitney (MW). Uji beda disajikan pada diagram dan tabel dibawah

ini.

Diagram 5.34. Hasil uji beda ERC normal menggunakan Kruskal-Wallis (KW).

0.09 0.090.04

0

0.1

0.2

0.3

0.4

0.5

0.6

0.7


Diff-Quik

Papanicolaou

Safranin-Kristal

Violet

5.31

10.2711.56

0

5

10

15

20

25

tidak normal

Diff-Quik

Papanicolaou

Safranin-Kristal

Violet



Tabel 5.10.2. Hasil uji beda ERC normal menggunakan Mann-Whitney (MW).

Metode n p



Violet 90 0.106

Pada ERC tidak normal dilakukan uji Kruskal-Wallis (KW) didapatkan

perbedaan.Uji beda disajikan pada tabel dibawah ini.

Diagram 5.35. Hasil uji beda ERC tidak normal menggunakan Kruskal-Wallis (KW).

Tabel 5.10.3. Hasil uji beda ERC tidak normal menggunakan Mann-Whitney (MW).

Metode n p



Violet 90 0.193

5.31

10.2711.56

0

5

10

15

20

25

tidak normal

Diff-Quik

Papanicolaou

Safranin-

Kristal Violet



BAB 6

PEMBAHASAN



BAB 6

PEMBAHASAN

Analisis spermatozoa terutama pada evaluasi morfologi dengan menggunakan ketiga

metode pewarnaan yang berbeda ternyata menghasilkan ukuran panjang dan lebar yang

berbeda (p<0,05) namun perbedaan tersebut tidak terlalu mencolok. Seperti kita ketahui

menurut kriteria Kruger panjang kepala spermatozoa normal adalah 4-5 µm dan lebar 2,5-3,5

µm. (Kruger et al., 1987).

Pada uji beda pada penelitian ini didapati ukuran panjang maupun lebar kepala

spermatozoa yang berbeda pada ketiga metode pewarnaan seperti pada tabel 5.2, 5.2.1, 5.2.2,

dan diagram 5.1 juga 5.2 dijelaskan bahwa metode pewarnaan Safranin-Kristal Violet

memiliki panjang yang mendekati ukuran metode pewarnaan Papanicolaou, metode

pewarnaan Papanicolaou memiliki hasil ukuran panjang dan lebar yang paling kecil diantara

metode pewarnaan lainnya, hal ini mungkin disebabkan oleh teknik fiksasi yang bertingkat

dimana tidak dimiliki oleh metode pewarnaan lainnya. Sedangkan pada metode pewarnaan

Diff-Quik memiliki ukuran panjang dan lebar yang lebih besar daripada kedua metode

pewarnaan lainnya seperti pada tabel 5.2, 5.2.1, 5.2.2, dan diagram 5.1 juga 5.2. Ternyata hal

ini juga sesuai dengan penelitian sebelumnya ( James and Collegues 1996 ). Mungkin

disebabkan karena metode pewarnaan Diff-Quik memiliki teknik pewarnaan yang sederhana

dan tidak melalui mekanisme fiksasi bertingkat, pada komposisi Diff-Quik didapati bahwa

pewarna utama langsung dicampur dengan buffer juga tidak ada proses yang melewati buffer

sebagai proses tunggal seperti metode pewarnaan Safranin-Kristal Violet sehingga proses

decolourisasi tidak berjalan dengan sempurna, lain halnya dengan kedua metode pewarnaan

yang lain. Artinya dengan ukuran kepala yang pada umumnya lebih besar menjadikan Diff-

Quik banyak ditemui ukuran kepala yang lebih besar dari ukuran kepala standart normal,



sehingga apabila kita menggunakan metode pewarnaan Diff-Quik akan banyak menemui

ukuran kepala yang besar atau disebut makro. Pada metode pewarnaan Safranin-Kristal

Violet bentuk kepala normal tampak sesuai dengan kriteria kruger yang disebabkan karena

mekanisme pewarnaan melalui tahapan fiksasi yang cukup adekuat. Sehingga pada saat

melakukan pemeriksaan morfologi spermatozoa akan didapati ukuran yang semestinya.

(WHO, 1999).

Pada uji beda bentuk kepala spermatozoa didapati hasil bahwa ada beda pada

bentukan amorph, dimana ketiga metode pewarnaan berbeda, pada bentukan ini didapati

bentuk kepala yang tidak normal namun masih bisa untuk ditembus zat pewarna. Pada

metode pewarna Safranin-Kristal Violet terdapat pewarna Kristal Violet yang memiliki sifat

dapat mewarnai semua jaringan yang sifatnya gram positif, pada kepala spermatozoa

memiliki sifat serupa gram positif sehingga memungkinkan untuk menembus kanal ion

jaringan walaupun bentuk anatomisnya abnormal, sehingga metode pewarna Safranin-Kristal

violet bisa mewarnai bentukan amorph dengan sempurna. Seperti ditunjukkan pada tabel

5.4.1 dan diagram 5.6. Ini berarti pada metode pewarnaan Safranin-Kristal Violet dapat

menganalisis bentukan amorph secara tepat sehingga memilki dampak klinis pada

penghitungan persentase amorph yang lebih tinggi diantara kedua pewarnaan lainnya.

berbeda pula pada metode pewarnaan Diff-Quik yang tidak memiliki sifat gram positif pada

kepala spermatozoa, sehingga mungkin zat pewarna akan lebih sulit untuk menmasuki pori

jaringan, tampak bahwa Diff-Quik kurang mampu menganalisis bentukan ini. (Khausik,

2006).

Pada bentukan vakuola terdapat perbedaan pada ketiga metode dimana metode

pewarnaan Papanicolaou lebih bagus dalam menganalisis bentukan vakuola seperti tampak

pada tabel 5.4.1, 5.4.2, 5.4.3 dan diagram 5.7, 5.8, 5.9. Begitu pula pada bentukan akrosom

seperti pada diagram 5.10, 5.11, 5.12, dan 5.13 serta pada tabel 5.4.5 dan 5.4.6 metode



pewarnaan Diff-Quik tampak kurang dapat menganalisis dengan baik, berbeda dengan

metode pewarnaan Safranin-Kristal Violet dan metode pewarnaan Papanicolaou. Hal ini

mungkin disebabkan walaupun didadapati Fast Green dan Thiazine pada Diff-Quik yang

dimana bagus untuk mewarnai nukleus namun pewarna utama tersebut tidak dipisahkan

dengan buffernya, sehingga kurang dapat menganalisis vakuola dan akrosom. Itu artinya

untuk menganalisis vakuola dan akrosom lebih bagus menggunakan metode pewarnaan

Safranin-Kristal Violet dan metode pewarnaan Papanicolaou. Dampak klinis pada analisis

vakuola dan akrosom dengan menggunakan metode pewarnaan Papanicolaou maupun

Safranin-Kristal violet akan memberikan persentase jumlah bentukan vakuola dan akrosom

lebih akurat daripada metode Diff-Quik. Sedangkan pada metode pewarnann Safranin-Kristal

Violet akan memberikan hasil yang sama dengan metode pewarnaan Papanicolaou.

Pada uji beda bentuk mid piece, ketiga metode rata-rata tidak didapati perbedaan

kecuali pada bentukan thick. Seperti pada diagram 5.17 dan tabel 5.6.1. Pada metode

pewarnaan Safranin-Kristal Violet dapat menembus kanal ion sitoplasma pada leher

spermatozoa yang tebal, dikarenakan zat warna Safranin yang selektif dalam mewarnai

sitoplasma dengan bantuan buffer fosfat untuk menyeimbangkan kadar keasaman pada

sitoplasma leher spermatozoa selain fungsi utamanya untuk membuat ikatan ion makin kuat.

Pada bentukan thick mungkin unsur ion penyusun tidak sebagus bentukan normal karena

terjadi penebalan, struktur membran sitoplasma juga tidak sempurna seperti pada yang

normal, sehingga tidak bisa mengikat ion dengan sempurna, sehingga kedua pewarna lainnya

kurang baik dalam mewarnai leher spermatozoa yang tebal ini. Itu artinya pada metode

pewarnaan Safranin-Kristal Violet lebih baik dalam menganalisis bentukan thick secara

tepat, sehingga memilki dampak klinis pada penghitungan thick yang berbeda dari kedua

metode pewarnaan lainnya. Sedangkan pada uji beda bentuk principal piece, ketiga metode

tidak didapati perbedaan pada ketiga metode pewarnaan, seperti pada tabel 5.8.



Pada uji beda bentuk ERC didapati hasil bahwa metode pewarnaan Papanicolaou

lebih bagus didalam mewarnai ERC dengan rata-rata dan simpangan baku seperti pada

diagram 5.32, 5.33, 5.34 dan tabel 5.10.1, 5.10.2, 5.10.3 dan metode pewarnaan Safranin-

Kristal violet dengan rata-rata dan simpangan baku yang mendekati metode pewarnaan

Papanicolaou. Metode pewarnaan Diff-Quik tampak kurang bagus dalam menganalisis ERC

.Hal ini dikarenakan pada metode Diff-Quik kurang selektif dalam mewarnai sitoplasma yang

banyak mengandung hidroksida, sedangkan pada metode pewarnaan Papanicolaou mewarnai

sitoplasma menggunakan eosin yang telah dikombinasi dengan bahan pospotungsic acid.

(Papanicolaou, 1986). Dan juga haematin yang peka terhadap reaksi oksidasi. Begitu pula

dengan metode pewarnaan Safranin-Kristal Violet dimana pewarna Safranin memang

digunakan khusus untuk mewarnai sitoplasma yang dibantu oleh buffer fosfat dengan pH 6,8

yang menjadikannya mudah terionisasi. Artinya metode pewarnaan Diff-Quik tidak dapat

meanganalisis ERC dengan sempurna sehingga secara klinis tidak bisa menentukan

persentase secara tepat kelainan pada ERC dibandingkan kedua pewarnaan yang lainnya.



BAB 7 KESIMPULAN DAN SARAN



BAB 7

KESIMPULAN DAN SARAN

7.1. Kesimpulan

Penelitian ini menunjukkan bahwa:

1. Terdapat perbedaan pada hasil analisis morfologi kepala spermatozoa. Ukuran

panjang dan lebar metode metode Diff-Quik lebih besar daripada metode

Papanicolaou dan metode Safranin-Kristal Violet, Metode Safranin-Kristal

violet mendekati nilai panjang dan lebar metode Papanicolaou. Terdapat

perbedaan pada hasil analisis bentukan amorph, vakuola dan akrosom

spermatozoa, metode pewarnaan Diff-Quik tidak dapat mewarnai dengan

sempurna bentukan amorph, vakuola maupun akrosom, metode pewarnaan

Safranin-Kristal violet sama dengan metode pewarnaan Papanicolaou sesuai

standar yang telah ditetapkan.

2. Terdapat perbedaan pada hasil analisis morfologi terhadap parameter

ketebalan mid piece, metode pewarnaan Safranin-Kristal Violet dapat

mewarnai dengan sempurna ketebalan mid piece sesuai dengan standar yang

telah ditetapkan.

3. Tidak terdapat perbedaan pada hasil analisis morfologi principal piece

spermatozoa, ketiga pewarnaan dapat mewarnai dengan sempurna sesuai

standar yang telah ditetapkan.

4. Terdapat perbedaan pada hasil analisis morfologi ERC , metode pewarnaan

Diff-Quik tidak dapat mewarnai ERC dengan sempurna dibandingkan kedua



metode yang lain. Sedangkan metode pewarnaan Safranin-Kristal Violet sama

dengan metode pewarnaan Papanicolaou sesuai standar yang telah ditetapkan.

5. Tidak terdapat perbedaan pada hasil pewarnaan Safranin-Kristal Violet dan

Papanicolaou, pewarnaan Safranin-Kristal Violet dapat mewarnai dengan

sempurna sesuai standar yang telah ditetapkan.

7.2. Saran:

1. Berdasarkan uraian diatas, maka metode pewarnaan Safranin-Kristal Violet

dapat digunakan sebagai metode pewarnaan alternatif lain karena hasilnya

sama seperti standar baku yang telah ditetapkan.

2. Dapat dilakukan penelitian lebih lanjut untuk membandingkan kelompok

pasien pria infertil dan kelompok pria fertil dengan metode pewarnaan

Papanicolaou, Safranin-Kristal Violet dan Diff-Quik.



Daftar Pustaka

Anonim, 2009. Penilaian morfologi sperma menurut kriteria WHO dan kriteria strict. Available at: https://www.scribd.com/doc/277057140/Penilaian-Morfologi- Sperma-Menurut-Kriteria-WHO-Dan-Strict

Anonim, 2010. Clinical significance of the low normal sperm morphology value as proposed in the fifth edition of the WHO Laboratory Manual for the Examination and Processing of Human Semen. Available at: http://www.asiaandro.com/news/upload/20130621-aja200914a.pdf

Anonim,1996. Journal of Clinical Microbiology.Volume 34 No10;[1 screen].Available at:http//www.ncbi.nlm.nih.gov>articles>pdf

Assessment of Spermatozoa Morphology under Light Microscopy with Different Histologic Stains and Comparison of Morphometric Measurements. Available at:http// www.scielo.cl/pdf/ijmorphol/v30n4/art45.pdf

Barroso G, Mercan R, Ozgur K, Morshedi M, Kolm P, Coetzee K, et al., Intra- and inter- laboratory variability in the assessment of sperm morphology by strict criteria: impact of semen preparation, staining techniques and manual versus computerized analysis. Hum Reprod 1999;14:2036-40.

Henkel R, Schreiber G, Sturmhoefel A, Hipler UC, Zermann DH, Menkveld R. Comparison of three staining methods for the morphological evaluation of human spermatozoa. Fertil Steril 2008;89:449-55.

Kaushik. B, 2006. Staining Theory.pdf., pp 68-91. Alvailable at: http//www.scribt.com>mobile>doc

Kruger TF, Acosta AA, Simmons KF, Swanson RJ, Matta JF, Oehringer S. Predictive value of abnormal sperm morphology in in vitro fertilization. Fertil Steril 1988;49:112-7.

Moeloek, N.1983, Standarisasi Analisis Semen Manusia;Per.Biok.Ind.Jakarta. 1983.

Sono Onny Pieters, 1978,Kuliah Analysa Sperma Universitas Airlangga.pp13

World Health Organization. WHO Laboratory Manual for the Examination of Human Semen and Semen-Cervical Mucus Interaction. 4th edition. Cambridge: Cambridge University Press; 1999.

World Health Organization. WHO Laboratory Manual for the Examination of Human Semen and Semen-Cervical Mucus Interaction. 5th edition. Cambridge: Cambridge University Press; 2010.



https://www.scribd.com/doc/277057140/Penilaian-Morfologi-

https://www.scribd.com/doc/277057140/Penilaian-Morfologi-

Lampiran 1



Lampiran 2

SURAT PERSETUJUAN IKUT PENELITIAN

Judul Penelitian: Perbandingan Hasil Pemeriksaan Morfologi Spermatozoa Manusia

Menggunakan Metode Pewarnaan Papanicolaou,Diff Quik dan

Safranin-Kristal Violet di RSUD dr. Soetomo Surabaya

Peneliti: Hamdani Lunardi, dr, MKes, SpAnd

Supardi, dr, Sp.And

Hengki Lukas, dr

Latar belakang penelitian

Semen analisis rutin adalah metode pemeriksaan pada infertilitas pria, dimana

terdapat beberapa parameter penting seperti konsentrasi, motilitas dan morfologi yang pada

umumnya diakui sebagai tiga parameter penting yang akan dinilai disamping parameter

lainnya. Parameter ini dianggap paling berguna karena telah terbukti menunjukkan potensi

kesuburan. Dari semua parameter analisis semen rutin tersebut , morfologi spermatozoa

menjadi salah satu yang indikator paling kuat dari potensi kesuburan seorang pria (Gravance

et al., 1998, WHO 1999, Henkel et al., 2007, van der Horst et al., 2009).

Morfologi spermatozoa penting untuk mencapai kesuksesan fertilisasi atau kesuburan

(Kuster et al., 2004). Untuk menilai baik tidaknya morfologi spermatozoa, pada laboratorium

Andrologi menggunakan beberapa metode pewarnaan. Pewarnaan yang baik akan

menghasilkan interpretasi morfologi yang baik pula. Keakuratan penilaian morfologi sperma

tergantung pada persiapan yang cermat, fiksasi, dan pewarnaan sperma (GARCI'a-Herreros et

al. 2006), karena prosedur ini dapat mempengaruhi dimensi sperma secara signifikan

(Meschede et al., 1993, Gago dkk. 1998, Hidalgo et al., 2006, Lukaszewicz et al., 2008). Ada



banyak metode pewarnaan antara lain Papanicolaou, Diff-Quik, Safranin-Kristal Violet untuk

pewarnaan spermatozoa. Fitur morfologis spermatozoa disajikan dalam nilai numerik

Namun akan tetapi, hingga saat ini, belum ada penelitian yang membandingkan

morfologi sperma yang dinilai menggunakan kriteria ketat dari pria fertil dibandingkan

dengan pria infertil menggunakan metode pewarnaan Papanicolaou, metode Diff-Quik, dan

metode pewarnaan Safranin-Kristal Violet.

Tujuan Penelitian

Tujuan Umum

Menganalisis perbedaan hasil metode pewarnaan Papanicolaou, metode pewarnaan

Diff-Quik, dan metode pewarnaan Safranin-Kristal Violet.

Tujuan Khusus

Menganalisis hasil penilaian morfologi kepala spermatozoa, mid piece, principal

piece, dan ERC spermatozoa manusia antara metode pewarnaan Papanicolaou, Diff-

Quik, dan Safranin Kristal-Violet.

Hasil penelitian :

Adalah berupa persentasi nilai normal maupun abnormal morfologi pada kelompok

infertil maupun fertil.

Prosedur Penelitian

Bila setuju ikut berpartisipasi dalam penelitian, maka anda akan mengikuti dua

macam pemeriksaan yaitu anamnesis dan masturbasi untuk mengumpulkan sampel semen

yang pengambilan sampel ejakulatnya akan dilakukan di Klinik Andrologi IRJ RSUD

dr.Soetomo, Surabaya.



Risiko :

Ringan berupa iritasi atau rasa tidak nyaman di kemaluan akibat masturbasi. Tidak

diperlukan pengobatan khusus untuk kejadian ini.

Kerahasiaan :

Segala hasil dari pemeriksaan atas diri anda akan dibicarakan dengan anda. Segala

informasi mengenai anda yang didapatkan dari penelitian ini akan diperlakukan secara

rahasia (konfidensial) dan hanya akan dipakai untuk tujuan-tujuan penelitian. Jati diri anda

akan tetap dirahasiakan sepanjang hal ini diperkenankan secara hukum.

Manfaat bagi peserta :

Peserta bisa mengetahui status morfologi fertilitas dengan menggunakan ketiga

metode pewarnaan yang digunakan.

Hal-hal yang perlu diketahui :

Sisa sampel semen peserta akan dibuang sebagai limbah dan tidak digunakan untuk

kepentingan yang lain.

Pertanyaan-Pertanyaan :

Peneliti telah mendiskusikan informasi ini dengan anda dan telah menawarkan untuk

memberikan jawaban atas pertanyaan-pertanyaan yang anda ajukan. Apabila masih ada

pertanyaan-pertanyaan, anda dapat menghubungi :

dr. Hengki Lukas pada telepon 081230976208



Hak untuk menolak atau mengundurkan diri :

Keikutsertaan anda dalam penelitian ini adalah semata-mata secara sukarela, dan anda

bebas untuk ikut serta atau menolak untuk ikut dalam penelitian setiap saat tanpa akan

mempengaruhi atau mengganggu penanganan medik anda dimasa yang akan datang.

Anda setuju untuk ikut serta dalam penelitian ini, anda telah diberikan salinan isian

ini dan telah berkesempatan untuk membacanya.

Surabaya,.....................2015

Subjek penelitian yang memberi penjelasan

(…………………..) (........................................)

Saksi – saksi

1. ........................................... (..............................)

2. .......................................... (...............................)

* coret yang tidak perlu



Lampiran 3

LEMBAR PERSETUJUAN MENGIKUTI PENELITIAN

Saya yang bertanda tangan di bawah ini,

Nama : ........................................................................................

Umur : .............. tahun. Jenis kelamin : laki-laki / perempuan )*

Alamat : .........................................................................................

untuk diri sendiri / anak / suami / istri / ayah / ibu )* dari penderita :

Nama : .........................................................................................

Umur : .............. tahun. Jenis kelamin : laki-laki / perempuan )*

Alamat : ....................................................................................

dengan ini menyatakan bersedia mengikuti penelitian ” Perbandingan Hasil Pemeriksaan

Morfologi Spermatozoa Manusia Menggunakan Metode Pewarnaan Papanicolaou, Diff-Quik

dan Safranin-Kristal Violet di RSUD dr. Soetomo Surabaya ” di Departemen/SMF Biologi

Medik/Andrologi Fakultas Kedokteran Universitas Airlangga-RSUD dr. Soetomo Surabaya,

setelah mendapat penjelasan tentang manfaat, tujuan dan prosedur dari penelitian ini.

Surabaya, ..........................2015

Peneliti, Pembuat pernyataan,

dr. Hengki Lukas ...........................................

Saksi – saksi

1. ........................................... (..............................)

2. .......................................... (...............................)

* coret yang tidak perlu



Lampiran 4 Dff-Quik

3,5 x 3 4 x 2,5 5x2 ヴ,ヵ×2,ヵ 3 x 2,5 5 x 4 4 x 2,5 6,5 x 3 5 x 2,5 5 x 4 4 x 2,5 4 x 2 6x3,5 5 x 3 5 x 3

6 x 5 4 x 2 ヶ×2,ヵヵ×2 5 x 2,5 4 x 3 4 x 3 5,5 x 3 5 x 3,5 4 x 3 4 x 3 5 x 3 5x3 5 x 4,5 5 x 2,5

5 x 3 3,5 x 2 ヴ,ヵ×2,ヵ 4 x 3 5 x 2,5 4 x 3 4 x 3 4,5 x 3 5 x 3,5 4 x 3 4 x 3 4x 3 3x3.5 5,5 x 2,5 6 x 5

3 x 2,5 5 x 3,5 5x2 4 x 2,5 5 x 2,5 4 x 3 4 x 3 5 x 3,5 5 x 3 4 x 3 4 x 3 5 x 3 6x3 4,5 x 3 5 x 2,5

4,5 x 3 5 x 2,5 5x2 5 x 3 3 x 2,5 4 x 2,5 3 x 3,5 5 x 2,5 5 x 2 4 x 2,5 3 x 3,5 5 x 4 3,5x3 5,5 x 2,5 5 x 5,5

5,5 x 4 4,5 x 3 ヴ,ヵ×2 4 x 3 4 x 2,5 5 x 4 3 x 1,5 5 x 2,5 5 x 2,5 5 x 4 3 x 1,5 5 x 3,5 6,5x2,5 5 x 2,5 6 x 2,5

5 x 3 4,5 x 2,5 5x2,5 4 x 3 4,5 x 3 5 x 4 3,5 x 1 5 x 3 5 x 2,5 5 x 4 3,5 x 1 4,5 x 3,5 4,5x3 5,5 x 2,5 6 x 3,5

5 x 2,5 3,5 x 2,5 ヵ,ヵ×2,ヵ 4 x 2 6x3,5 5 x 3 5 x 3 6 x 2,5 6 x 1,5 5 x 3 5 x 3 4 x 3 5x2,5 5 x 2,5 5 x 3,5

5,5 x 3 4 x 2,5 ヵ,ヵ×2 5 x 3 5x3 5 x 4,5 5 x 2,5 5,5 x 2 5 x 2 5 x 4,5 5 x 2,5 3,5 x 3 6x3 5,5 x 2,5 4 x 5,5

5 x 3 4,5 x2,5 5x2,5 4x 3 3x3.5 5,5 x 2,5 6 x 5 6 x 2,5 5 x 2 5,5 x 2,5 6 x 5 5 x 3 6x3 5 x 2,5 5 x 2,5

4 x 3,5 4 x 2,5 ヴ,ヵ×2,ヵ 5 x 3 6x3 4,5 x 3 5 x 2,5 6 x 3 5 x 2,5 4,5 x 3 5 x 2,5 4 x 3 5x2,5 5,5 x 2,5 6 x 3

6 x 5 4 x 2 5x2 5 x 4 3x3,5 5,5 x 2,5 5 x 5,5 6 x 4,5 5 x 2,5 5,5 x 2,5 5 x 5,5 4,5 x 3 7,5x 5 4,5 x 2,5 6 x 4,5

5,5 x 8 4 x 2,5 5x2,5 5 x 3,5 6,5x2,5 5 x 2,5 6 x 2,5 6 x 2,5 5 x 2 6 x 5 4 x 3,5 3 x 3.5 5x2,5 4,5 x 2,5 5 x 2,5

5 x 3 5 x 2,5 5x2,5 4,5 x 3,5 4,5x3 5,5 x 2,5 6 x 3,5 5 x 3 6 x 3 4 x 4 6 x 4,5 3 x 3.5 5x3 5 x 2,5 5 x 3

4 x 3 4 x 2,5 5x2 4 x 3 5x2,5 5 x 2,5 5 x 3,5 5 x 3,5 5 x 1,5 6 x 2 5 x 5,5 4 x 3 5x3 4,5 x 2 5 x 3,5

5 x 2,5 4,5 x 3 ヴ,ヵ×2 3,5 x 3 6x3 5,5 x 2,5 4 x 5,5 5 x 2,5 4,5 x 2 4 x 3 4 x 3,5 4 x 3 5,5x3 6 x 3,5 6 x 2,5

7 x 4 3,5 x 2 ヴ,ヵ×2 5 x 3 6x3 5 x 2,5 5 x 2,5 5 x 2,5 5 x 2,5 4 x 3 6 x 5 3 x 3.5 2x2.5 4 x 3 6 x 2

4,5 x 3 6 x 3 5x2 4 x 3 5x2,5 5,5 x 2,5 6 x 3 5 x 3 4,5 x 2,5 5 x 4 6 x 5,5 6 x 2,5 5,5x3 4 x 3 6 x 2,5

5 x 2,5 5 x 3 ヵ,ヵ×2,ヵ 4,5 x 3 7,5x7 4,5 x 2,5 6 x 4,5 5 x 3,5 4,5 x 2 3 x 3.5 5 x 4,5 5 x 4,5 5,5 x 3 5 x 2,5 5 x 2,5

6 x 3 3,5 x 2 5x2,5 3 x 3,5 5x2,5 4,5 x 2,5 5 x 2,5 4,5 x 3,5 4 x 2 6 x 4 4,5 x 3 4,5 x 3 5 x 3,5 5 x 2,5 5 x 3,5

5 x 3 3,5 x 2,5 3x1,5 3 x 3,5 5x3 5 x 2,5 5 x 3 5,5 x 2,5 4 x 2 5 x 4 4 x 3,5 4 x 3,5 5,5 x 3,5 5 x 2 5 x 2,5

5 x 4 4 x 2,5 ヴ,ヵ×2,ヵ 4 x 3 5x3 4,5 x 2 5 x 3,5 5 x 2,5 4,5 x 2,5 6 x 4 4 x 2,5 4 x 2,5 5 x 2 5 x 2 5 x 3,5

4,5 x 3 3 x 2,5 ヵ×2 4 x 3 5,5x3 6 x 3,5 6 x 2,5 4 x 3,5 4,5 x 2,5 4 x 3 4 x 3,5 4 x 3,5 5 x 2,5 5 x 2,5 5 x 3

5 x 3 4 x 2,5 ヴ,ヵ×2 3 x 3,5 2x2.5 4 x 3 6 x 2 4,5 x 3,5 4 x 2,5 5 x 4 5 x 4,5 5 x 4,5 6 x 5,5 5 x 2 4,5 x 3

5 x 3 4 x 3 ヴ,ヵ×2 6 x 2,5 5,5x3 4 x 3 6 x 2,5 7 x 2,5 5 x 2.5 6 x 4 5,5 x 4 5,5 x 4 6 x 5,5 5 x 2,5 6 x 2,5

5,5 x 6 4 x 2,5 5x2,5 4 x 3 6x3 6 x 5 6 x 4 5,5 x 2,5 4 x 2,5 4 x 3 6,5 x 2,5 6,5 x 2,5 4 x 3,5 5 x 2,5 5,5 x 2,5

4 x 3 4 x 2,5 ヵ×2,ヵ 3,5 x 3 5x2,5 5 x 5 6 x 5 4,5 x 3,5 4 x 1,5 4 x 3 6,5 x 5 6,5 x 5 4,5 x 4 5 x 2,5 6 x 2,5

5,5 x 3 3,5 x 3 ヵ,ヵ×2 4 x 3 5x2,5 5 x 3,5 4 x 2,5 5 x 3,5 5 x 2 4 x 3 4,5 x 3,5 4,5 x 3,5 5 x 3,5 5,5 x 2 4,5 x 3

6 x 3 3 x 3,5 5x2 4 x 3 4,5x3 5 x 3,5 5 x 2,5 5 x 4 5 x 2 6 x 5 4,5 x 3,5 4,5 x 3,5 5 x 4 5,5 x 2 5,5 x 3

5 x 3 4,5 x 3 5 x 3 3 x 3,5 6x3,5 4x 3 5 x 2,5 4 x 3 5 x 2,5 5 x 4 5 x 5,5 5 x 5,5 5 x 4 5 x 2 6 x 3

5 x 3 5 x 3 6 x 4 4,5 x 2 5x3 5 x 3 5 x 2,5 5 x 3,5 4 x 1,5 4 x 3 4 x 3,5 4 x 3,5 5 x 4,5 5 x 2 5 x 2,5

6 x 4 4 x 2,5 6 x 4 5 x 3 5x2,5 4,5 x 3 5,5 x 2 4,5 x 3,5 5,5 x 1,5 4 x 3 4 x 3,5 4 x 3,5 5 x 3,5 5 x 2 5 x 2,5

5 x 3 3,5 x 2 7x 4 4 x 4,5 6x2 4 x 3 4,5 x 2 4 x 3,5 5 x 2,5 4 x 2,5 6,5 x 5 6,5 x 5 5,5 x 4,5 5 x 2,5 5,5 x 2

5 x 2,5 3,5 x 2,5 6 x 3 5 x 3 6x3 5 x 3 5 x 2,5 5 x 3,5 5 x 2 4 x 3 6 x 5 6 x 5 4,5 x 3,5 5 x 2 5 x 2,5

4,5 x 3 3 x 2 7 x 3,5 4,5 x 4 4 x 3 6 x 4 5 x 2 5 x 4 4 x 2 5 x 4 5 x 2,5 5 x 2,5 6,5 x 5 5 x 2 5 x 2,5

4 x 3,5 6 x 3 7,5 x 6 4,5 x 3 5 x 4 6 x 3,5 6 x 3,5 5 x 3 5 x 2 5 x 4 5 x 4 5 x 4 4 x 3 5 x 2,5 5,5 x 2,5

4 x 3 4,5 x 3 8 x 6 5 x 2,5 5 x 4 4 x 3 5 x 2 4,5 x 3 5 x 1,5 6 x 2 5 x 4,5 5 x 4,5 5 x 4 5 x 3 5 x 2,5

4 x 3 2,5 x 2,5 6 x 5 2,5 x 2 6 x 4,5 4 x 3 5 x 2,5 2,5 x 3,5 5 x 2,5 6 x 5 5 x 6,5 5 x 6,5 4 x 3,5 5 x 3,5 4,5 x 2

4 x 3 7 x 4 6 x 4 3,5 x 3 6 x 5 4x 3 5 x 3,5 4,5 x 3 5 x 2,5 4 x 3 4 x 3 4 x 3 5 x 4,5 5 x 2,5 5,5 x 2,5

4,5 x 2,5 5 x 3 7 x 5 5 x 2,5 4,5 x 4 4 x 3 5 x 3 5 x 3 5 x 2,5 4 x 3 5 x 4 5 x 4 4,5 x 5 5 x 1,5 5 x 2,5

4,5 x 2,5 3 x 2 4 x 3 5 x 3,5 6 x 4 6,5 x 4,5 5 x 2,5 4,5 x 3 4,5 x 2,5 6 x 5,5 5 x 4,5 5 x 4,5 5 x 4,5 6 x 2 5,5 x 2,5

5 x 2,5 4,5 x 3 6 x 5 4,5 x 3 4 x 5 4 x 3 4,5 x 2 5 x 2,5 5 x 2,5 5 x 4,5 4 x 3 4 x 3 6,5 x 5 5 x 3 5,5 x 2

4 x 5 4 x 2,5 5 x 3,5 4,5 x 2,5 5 x 4 5 x 3 5 x 2 5 x 3,5 3,5 x 2,5 4,5 x 2,5 4 x 3,5 4 x 3,5 5 x 4,5 5 x 2,5 5 x 2,5

3 x 2,5 4,5 x 3 6 x 4 3 x 2,5 5 x 3 4 x 3 5 x 3 4 x 3 5 x 2 6,5 x 4,5 5 x 2,5 5 x 2,5 4 x 3,5 5 x 2,5 6 x 2

5 x 2,5 5 x 4 4 x 5 3 x 3.5 5 x 3,5 4,5 x 3 5 x 2,5 5 x 4 6 x 3,5 6 x 3,5 5 x 4,5 5 x 4,5 4,5 x 3,5 4,5 x 2 5 x 2

4,5 x 3 5 x 3,5 5 x 2,5 5 x 3 6 x 4 5 x 4 5 x 2 5 x 4 4 x 3 5 x 2 5,5 x 3 5,5 x 3 4 x 3,5 5 x 2,5 5 x 2

3,5 x 2,5 4,5 x 2,5 6 x 5 4 x 2,5 4 x 3 4 x 3 5 x 2,5 6 x 4,5 4 x 3 5 x 2,5 5 x 4,5 5 x 4,5 6 x 5,5 5 x 2,5 5 x 2,5

4,5 x 3 5 x 2,5 4 x 2 5 x 3 7 x 4 4 x 3 5 x 3 6 x 5 4x 3 5 x 3,5 4,5 x 3,5 4,5 x 3,5 6 x 5 4,5 x 2 5 x 2,5

4 x 3 5,5x 2,5 5 x 3,5 4 x 2,5 6 x 4 4 x 3 6x3,5 4,5 x 4 4 x 3 5 x 3 6 x 1,5 6 x 5,5 4,5 x4 5 x 4 6 x 3,5

7 x 3,5 5,5 x 2,5 4 x 3 4,5 x 3 5 x 2,5 4 x 2,5 5x3 6 x 4 6,5 x 4,5 5 x 2,5 5 x 2 6 x 5 5 x 5,5 5 x 4 4 x 3

5 x 3 4 x 2,5 4 x 3 4 x 2,5 6 x 3 5 x 4 3x3.5 5,5 x 2,5 6 x 5 6 x 2,5 5 x 2 5 x 5,5 5 x 4,5 6 x 4,5 4 x 3

4 x 2,5 4 x 3,5 6 x 2 2,5 x 2 6 x 3 5 x 4 6x3 4,5 x 3 5 x 2,5 6 x 3 5 x 2,5 4 x 3 5 x 4,5 6 x 5 4x 3

4 x 2,5 5x2,5 4 x 3 3 x 2,5 6 x 4,5 4,5 x 3 3,5x3 5,5 x 2,5 5 x 5,5 6 x 4,5 5 x 2,5 7 x 3 5 x 4,5 4,5 x 4 4 x 3

5 x 3 5x2,5 4 x 3 4 x 2 4 x 3 4 x 3 6,5x2,5 5 x 2,5 6 x 2,5 6 x 2,5 5 x 2 6 x 5 4 x 3,5 6 x 4 6,5 x 4,5



4,5 x 2,5 ヴ,ヵ×2 4 x 2 5 x 2,5 6 x 3 3 x 3.5 4,5x3 5,5 x 2,5 6 x 3,5 5 x 3 6 x 3 4 x 4,5 6 x 4,5 ヵ×2 4 x 3

4 x 2,5 5x2,5 5 x3 6 x 5 5 x 4 4 x 3 5x2,5 5 x 2,5 5 x 3,5 5 x 3,5 5 x 1,5 6 x 2 5 x 5,5 ヴ,ヵ×2 3 x 3.5

3,5 x 3 ヴ,ヵ×2 2,5 x 2 5 x 2,5 5 x 3 4 x 3,5 6x3 5,5 x 2,5 4 x 5,5 5 x 2,5 4,5 x 2 4 x 3 4 x 3,5 ヴ,ヵ×2 6 x 2,5

3,5 x 2,5 ヴ,ヵ×2,ヵ 4x 3 7,5 x 2,5 4 x 3 3,5 x 2,5 6x3 5 x 2,5 5 x 2,5 5 x 2,5 5 x 2,5 4 x 3 6 x 5 5x2,5 4 x 3

5 x 4 6 x 3,5 6 x 3,5 5 x 3 5 x 2 5 x 4 5 x 4 5 x 4 4 x 3 5 x 2,5 5,5 x 2,5 5 x 4 6 x 5,5 ヵ×2,ヵ 3,5 x 3

5 x 4 4 x 3 5 x 2 4,5 x 3 5 x 1,5 6 x 2 5 x 4,5 5 x 4,5 5 x 4 5 x 3 5 x 2,5 3 x 3.5 5 x 4,5 ヵ,ヵ×2 4 x 3

6 x 4,5 4 x 3 5 x 2,5 2,5 x 3,5 5 x 2,5 6 x 5 5 x 6,5 5 x 6,5 4 x 3,5 5 x 3,5 4,5 x 2 4 x 3 4,5x3 5 x 3,5 5 x 2,5

6 x 5 4x 3 5 x 3,5 4,5 x 3 5 x 2,5 4 x 3 4 x 3 4 x 3 5 x 4,5 5 x 2,5 5,5 x 2,5 3 x 3,5 6x3,5 4x 3 5 x 2,5

4,5 x 4 4 x 3 5 x 3 5 x 3 5 x 2,5 4 x 3 5 x 4 5 x 4 4,5 x 5 5 x 1,5 5 x 2,5 4,5 x 2 5x3 5 x 3 5 x 2,5

6 x 4 6,5 x 4,5 5 x 2,5 4,5 x 3 4,5 x 2,5 6 x 5,5 5 x 4,5 5 x 4,5 5 x 4,5 6 x 2 5,5 x 2,5 5 x 3 5x2,5 4,5 x 3 5,5 x 2

4 x 5 4 x 3 4,5 x 2 5 x 2,5 5 x 2,5 5 x 4,5 4 x 3 4 x 3 6,5 x 5 5 x 3 5,5 x 2 4 x 4.5 6x2 4 x 3 4,5 x 2

5 x 4 5 x 3 5 x 2 5 x 3,5 3,5 x 2,5 4,5 x 2,5 4 x 3,5 4 x 3,5 5 x 4,5 5 x 2,5 5 x 2,5 5 x 3 6x3 5 x 3 5 x 2,5

5 x 3 4 x 3 5 x 3 4 x 3 5 x 2 6,5 x 4,5 5 x 2,5 5 x 2,5 4 x 3,5 5 x 2,5 6 x 2 4,5 x 4 4 x 3 6 x 4 5 x 2

5 x 3,5 4,5 x 3 5 x 2,5 ヵ,ヵ×2 5 x 2,5 5,5 x 2 5 x 4,5 5 x 4,5 4,5 x 3,5 4,5 x 2 5 x 2 4,5 x 3 5 x 4 6 x 3,5 6 x 3,5

6 x 4 5 x 4 5 x 2 5x2 5 x 2,5 5,5 x 3,5 5,5 x 3 5,5 x 3 4 x 3,5 5 x 2,5 5 x 2 5 x 2,5 5 x 4 4 x 3 5 x 2

4 x 3 4 x 3 5 x 2,5 5 x 3 4,5 x 2 5 x 3,5 5 x 4,5 5 x 4,5 6 x 5,5 5 x 2,5 5 x 2,5 2,5 x 2 6 x 4,5 4 x 3 5 x 2,5

7 x 4 4 x 3 5 x 3 6 x 4 5 x 2,5 3 x 1,5 4,5 x 3,5 4,5 x 3,5 6 x 5 4,5 x 2 5 x 2,5 3,5 x 3 6 x 5 4x 3 5 x 3,5

6 x 4 4 x 3 6x3,5 6 x 4 5 x 3 6 x 2,5 6 x 1,5 6 x 5,5 4,5 x4 6 x 3,5 6 x 2,5 5 x 2,5 4,5 x 4 4 x 3 5 x 3

5 x 2,5 4 x 2,5 5x3 5 x 4,5 5 x 2,5 5,5 x 2 5 x 2 6 x 5 5 x 5,5 4 x 3 6 x 2 5 x 3,5 6 x 4 6,5 x 4,5 5 x 2,5

6 x 3 5 x 4 3x3.5 5,5 x 2,5 6 x 5 6 x 2,5 5 x 2 5 x 5.5 5 x 4,5 4 x 3 6 x 2,5 4,5 x 3 4 x 5 4 x 3 4,5 x 2

6 x 3 5 x 4 6x3 4,5 x 3 5 x 2,5 6 x 3 5 x 2,5 4 x 3 5 x 4,5 6 x 5 6 x 4 4,5 x 2,5 5 x 4 5 x 3 5 x 2

6 x 4,5 4,5 x 3 3,5 x 3 5,5 x 2,5 5 x 5,5 6 x 4,5 5 x 2,5 7 x 3 5 x 4,5 5 x 5 6 x 5 6 x 3,5 6 x 2,5 6 x 3,5 6 x 2,5

4 x 3 4 x 3 6,5x2,5 5 x 2,5 6 x 2,5 6 x 2,5 5 x 2 6 x 5 4 x 3,5 5 x 3,5 4 x 2,5 4 x 3 6 x 2 4 x 3 6 x 2

6 x 3,5 6 x 2,5 5 x 4 4 x 2 5 x 4 5 x 2,5 5 x 2,5 6,5 x 5 5 x 2 5 x 2,5 5 x 4,5 4 x 3 6 x 2,5 4 x 3 6 x 2,5

4 x 3 6 x 2 5 x 3 5 x 2 5 x 4 5 x 4 5 x 4 4 x 3 5 x 2,5 5,5 x 2,5 6 x 2,5 6 x 5 6 x 4 6 x 5 6 x 4

4 x 3 6 x 2,5 4,5 x 3 5 x 1,5 6 x 2 5 x 4,5 5 x 4,5 5 x 4 5 x 3 5 x 2,5 5 x 2,5 5 x 5 6 x 5 5 x 5 6 x 5

6 x 5 6 x 4 2,5 x 3,5 5 x 2,5 6 x 5 5 x 6,5 5 x 6,5 4 x 3,5 5 x 3,5 4,5 x 2 5 x 2 5 x 3,5 4 x 2,5 5 x 3,5 4 x 2,5

5 x 5 6 x 5 4,5 x 3 5 x 2,5 4 x 3 4 x 3 4 x 3 5 x 4,5 5 x 2,5 5,5 x 2,5 5 x 3 5 x 3,5 5 x 2,5 5 x 3,5 5 x 2,5

5 x 3,5 4 x 2,5 5 x 3 5 x 2,5 4 x 3 5 x 4 5 x 4 4,5 x 5 5 x 1,5 5 x 2,5 5 x 3,5 4x 3 5 x 2,5 4x 3 5 x 2,5

5 x 3,5 5 x 2,5 4,5 x 3 4,5 x 2,5 6 x 5,5 5 x 4,5 5 x 4,5 5 x 4,5 6 x 2 5,5 x 2,5 6 x 3,5 5 x 3 5 x 2,5 5 x 3 5 x 2,5

4x 3 5 x 2,5 5 x 2,5 5 x 2,5 5 x 4,5 4 x 3 4 x 3 6,5 x 5 5 x 3 5,5 x 2 5 x 2,5 4,5 x 3 5,5 x 2 4,5 x 3 5,5 x 2

5 x 3 5 x 2,5 5 x 3,5 3,5 x 2,5 4,5 x 2,5 4 x 3,5 4 x 3,5 5 x 4,5 5 x 2,5 5 x 2,5 5 x 3,5 6,5 x 5 5 x 3 5,5 x 2 5 x 2,5

4,5 x 3 5,5 x 2 4 x 3 5 x 2 6,5 x 4,5 5 x 2,5 5 x 2,5 4 x 3,5 5 x 2,5 6 x 2 5 x 2,5 5 x 4,5 5 x 2,5 5 x 2,5 3,5 x 2,5

4,5 x 3 4,5 x 3 5 x 4 6 x 3,5 6 x 3,5 5 x 4,5 5 x 4,5 4,5 x 3,5 4,5 x 2 5 x 2 5,5 x 3 4 x 3,5 5 x 2,5 6 x 2 5 x 2

5 x 3 6 x 2,5 5 x 4 4 x 3 5 x 2 5,5 x 3 5,5 x 3 4 x 3,5 5 x 2,5 5 x 2 6.5 x 3 4,5 x 3,5 4,5 x 2 5 x 2 5 x 2,5

5 x 2,5 5 x 2,5 6 x 4,5 4 x 3 5 x 2,5 5 x 4,5 5 x 4,5 6 x 5,5 5 x 2,5 5 x 2,5 5 x 3 4 x 3,5 5 x 2,5 5 x 2 5 x 2,5

5,5 x 2 5 x 2 6 x 5 4x 3 5 x 3,5 4,5 x 3,5 4,5 x 3,5 6 x 5 4,5 x 2 5 x 2,5 5 x 3,5 6 x 5,5 5 x 2,5 5 x 2,5 4,5 x 2

5,5 x 1,5 6,5 x 3 4,5 x 4 4 x 3 5 x 3 6 x 1,5 6 x 5,5 4,5 x4 5 x 4 6 x 3,5 6 x 3,5 6 x 5 4,5 x 2 5 x 2,5 5 x 2,5

5 x 1,5 6 x 5 6 x 4 6,5 x 4,5 5 x 2,5 5 x 2 6 x 5 5 x 5,5 5 x 4 4 x 3 5 x 2 4,5 x4 6 x 3,5 6 x 2,5 5 x 36 x 3 5 x 5,5 5,5 x 2,5 6 x 5 6 x 2,5 5 x 2 5 x 5 5 x 4,5 6 x 4,5 4 x 3 5 x 2,5 5 x 5,5 4 x 3 6 x 2 5 x 2,55,5 x 3 4 x 3 4,5 x 3 5 x 2,5 6 x 3 5 x 2,5 4 x 3 5 x 4,5 6 x 5 4x 3 5 x 3,5 5 x 4,5 4 x 3 6 x 2,5 6 x 55 x 2,5 7 x 3 5,5 x 2,5 5 x 5,5 6 x 4,5 5 x 2,5 7 x 3 5 x 4,5 4,5 x 4 4 x 3 5 x 3 5 x 4,5 6 x 5 6 x 4 5 x 2,53 x 2 6 x 5 5 x 2,5 6 x 2,5 6 x 2,5 5 x 2 6 x 5 4 x 3,5 6 x 4 6,5 x 4,5 5 x 2,5 5 x 4,5 5 x 5 6 x 5 5 x 5,55 x 3 4 x 4.5 5,5 x 2,5 6 x 3,5 5 x 3 6 x 3 4 x 4.5 6 x 4,5 ヵ×2 4 x 3 5,5x3 4 x 3,5 5 x 3,5 4 x 2,5 6 x 2,54 x 2 6 x 2 5 x 2,5 5 x 3,5 5 x 3,5 5 x 1,5 6 x 2 5 x 5,5 ヴ,ヵ×2 3 x 3,5 2x2.5 5 x 2 5 x 2,5 5 x 4,5 5 x 4

5 x 2,5 4 x 3 5,5 x 2,5 4 x 5,5 5 x 2,5 4,5 x 2 4 x 3 4 x 3,5 ヴ,ヵ×2 6 x 2,5 5,5x3 5 x 2,5 5,5 x 2,5 6 x 2,5 5 x 4

5 x 3 4 x 3 5 x 2,5 5 x 2,5 5 x 2,5 5 x 2,5 4 x 3 6 x 5 5x2,5 4 x 3 6x3 5 x 3 5 x 2,5 5 x 2,5 6 x 2

5 x 2,5 5 x 4 5 x 4 4 x 3 5 x 2,5 5,5 x 2,5 5 x 4 6 x 5,5 ヵ×2,ヵ 3,5 x 3 5x2,5 5 x 3,5 4,5 x 2 5 x 2 6 x 5

4 x 2 5 x 3 4 x 2,5 4 x 2 6x3,5 5 x 3 5 x 3 5x2 6 x 5 3 x 3,5 2x2.5 5 x 2,5 5,5 x 2,5 5 x 3 4 x 3

4x 3 5 x 2,5 4 x 3 5 x 3 5x3 5 x 4,5 5 x 2,5 5 x 3 6 x 5,5 6 x 2,5 5,5x3 5 x 1,5 5 x 2,5 5 x 3,5 4 x 3

6 x 3,5 6 x 5 4 x 3 4x 3 3x3 5,5 x 2,5 6 x 5 6 x 4 5 x 4,5 5 x 4,5 5,5 x 3 6 x 2 5,5 x 2,5 6 x 3,5 6 x 5,5

5 x 3 5 x 2,5 4 x 3 5 x 3 6x3 4,5 x 3 5 x 2,5 6 x 4 4,5 x 3 4,5 x 3 5 x 3,5 5 x 3 5,5 x 2 5 x 2,5 5 x 4,5

6,5 x 3 5 x 5,5 3 x 3,5 5 x 4 3,5x3 5,5 x 2,5 5 x 5,5 7x 4 4 x 3,5 4 x 3,5 5,5 x 3,5 5 x 2 5 x 2,5 4,5 x 2,5 4,5 x 2,5

5 x 3 6 x 2,5 3 x 1,5 5 x 3,5 6,5x2,5 5 x 2,5 6 x 2,5 6 x 3 4 x 2,5 4 x 2,5 5 x 2 5 x 2 5 x 3,5 6 x 2 6,5 x 4,5

5,5 x 3 6 x 3,5 3,5 x 1 4,5 x 3,5 4,5x3 5,5 x 2,5 6 x 3,5 7 x 3,5 4 x 3,5 4 x 3,5 5 x 2,5 5 x 2,5 5 x 3 5,5 x 3 6 x 3,55,5 x 3,5 5 x 3,5 5 x 3 4 x 3 5x2,5 5 x 2,5 5 x 3,5 7,5 x 6 5 x 4,5 5 x 4,5 6 x 5,5 5 x 2 4,5 x 3 5 x 2,5 5 x 26,5 x 2,5 4 x 5,5 5 x 2,5 3,5 x 3 6x3 5,5 x 2,5 4 x 5,5 8 x 6 5,5 x 4 5,5 x 4 6 x 5,5 5 x 2,5 6 x 2,5 5 x 1,5



4,5 x 3,5 5 x 2,5 6 x 5 5 x 3 6x3 5 x 2,5 5 x 2,5 6 x 5 4 x 3 5 x 2,5 5,5 x 2,5 5 x 4 6 x 5,5 ヵ×2,ヵ4 x 3,5 6 x 3 5 x 2,5 4 x 3 5x2,5 5,5 x 2,5 6 x 3 6 x 4 4 x 2 6x3,5 5 x 3 5 x 3 5x2 6 x 5

6 x 2,5 6 x 4,5 5 x 5,5 4,5 x 3 7,5x 5 4,5 x 2,5 6 x 4,5 7 x 5 5 x 3 5x3 5 x 4,5 5 x 2,5 5 x 3 6 x 5,5

5 x 2,5 5 x 2,5 4 x 3,5 3 x 3.5 5x2,5 4,5 x 2,5 5 x 2,5 4 x 3 4x 3 3x3.5 5,5 x 2,5 6 x 5 6 x 4 5 x 4,5

5 x 2 5 x 3 6 x 4,5 3 x 3.5 5x3 5 x 2,5 5 x 3 6 x 5 5 x 3 6x3 4,5 x 3 5 x 2,5 6 x 4 4,5 x 3

5 x 3 5 x 3,5 5 x 5,5 4 x 3 5x3 4,5 x 2 5 x 3,5 5 x 3,5 5 x 4 3,5x3,5 5,5 x 2,5 5 x 5,5 7x 4 4 x 3,5

5 x 3,5 6 x 2,5 4 x 3,5 4 x 3 5,5x3 6 x 3,5 6 x 2,5 4,5 x 4 5 x 3,5 6,5x2,5 5 x 2,5 6 x 2,5 6 x 3 4 x 2,5

5x2 5 x 2,5 4 x 3 4 x 3 5 x 3,5 5,5x3 5 x 3 5 x 5.5 6 x 3,5 6 x 5 6 x 2,5 5 x 2,5 4,5 x 3,5 5 x 2

5 x 3 6 x 3 4,5 x 2,5 5 x 4 6 x 3,5 6x3 5 x 2,5 4 x 3 5 x 2 6 x 4 5,5 x 2 6 x 2 6 x 1,5 5 x 2,5

6 x 4 6 x 4,5 6 x 2 5 x 4,5 5 x 2,5 5x2,5 6 x 5 7 x 3 5 x 2,5 7 x 5 6 x 2,5 6 x 5 5 x 2 3,5 x 3

6 x 4 5 x 2,5 5,5 x 3 4 x 3 5 x 3,5 5x2,5 5 x 2,5 6 x 5 5 x 3,5 4 x 3 6 x 3 5 x 2,5 5 x 1,5 3 x 3,5

7x 4 5 x 3 5 x 2,5 4 x 3,5 5 x 2,5 4,5x3 5 x 5,5 4 x 4,5 5 x 3 6 x 5 6 x 4,5 5 x 2,5 6 x 2 6 x 2,5

6 x 3 5 x 3,5 5 x 1,5 5 x 2,5 5,5 x 3 6x3,5 6 x 2,5 6 x 2 5 x 2,5 5 x 3,5 6 x 2,5 5 x 4,5 5 x 3 5 x 4,5

7 x 3,5 6 x 2,5 3 x 2,5 5 x 4,5 6.5 x 3 5x3 6 x 3,5 4 x 3 5,5x3 4,5 x 4 5 x 2,5 5 x 4,5 5 x 2 4,5 x 3

7,5 x 6 5 x 3,5 3 x 1,5 5,5 x 3 5 x 3 5x2,5 5 x 3,5 4 x 3 2x2.5 4 x 5 5 x 4 6 x 2,5 5 x 3 4 x 3,5

8 x 6 3 x 1,5 4,5 x 1,5 5 x 4,5 5 x 3,5 6 x 5 4 x 5,5 5 x 4 4 x 3 7 x 2,5 5 x 4,5 5 x 2,5 5 x 6,5 4 x 2,5



Lampiran 4 Papanicolaou

4 x 2,5 2,5 x 2 3 x 2,5 4,5×2 3 x 2,5 4,5x2 4 x 2 3 x 1 3 x 2,5 5 x 3,5 4,5 x 2,5 5 x 3 5 x 2,5 5 x 2,5 5 x 4

3,5 x 3 3 x 2 2,5 x 2 5 x 2,5 3 x 2,5 5x2,5 4 x 2 3 x 1,5 3,5 x 4,5 5 x 3,5 4,5 x 2,5 5 x 3 5,5 x 2,5 5 x 2 4,5 x 2,5

5 x 3,5 4 x 3 3,5 x 2 3,5 x 2 4 x 3 3,5x2 4 x 2,5 3 x 2,5 5 x 3 5 x 2,5 4,5 x 2,5 5 x 4 5 x 2,5 5 x 2,5 5 x 2

4,5 x 3 4 x 2,5 4,5 x 3 5 x 3 3 x 2 4x2,5 4 x 2,5 5 x 2,5 5 x 3,5 5 x 2,5 5 x 2,5 5 x 4,5 3 x 2,5 5 x 3,5 3 x 2

5 x 2,5 4,5 x 2,5 4,5 x 2 3 x 1,5 3 x 2 3,5x2,5 3 x 2 5 x 3 3,5 x 2 3 x 1,5 5 x 2,5 5 x 4,5 3 x 1,5 5 x 5,5 3 x 2,5

4 x2,5 3 x 2 4 x 2,5 5 x 3 2 x 2,5 4x2,5 3 x 2 5 x 3 4,5 x 2 3 x 3,5 5 x 2,5 5 x 2,5 3,5 x 2,5 5 x 2 5 x 2,5

4,5 x 3 3 x 2,5 4,5 x 2,5 3,5 x 3 3 x 2 4x2,5 3,5 x 2 5,5 x 3 3 x 2,5 5 x 2,5 4,5 x 2 3 x 2 3,5 x 1,5 3 x 2,5 5 x 2,5

5 x 2,5 3,5 x 2,5 4 x 2,5 3 x 2 3,5 x 2 4,5x2,5 3 x 2 4,5 x 1,5 3 x 1,5 5 x 3 4,5 x 2 3 x 2,5 3,5 x 2,5 3 x 1,5 4 x 2,5

4 x 3 3,5 x 2,5 4,5 x 2 4,5 x 3 3,5 x 2 4x2,5 3,5 x 2 4 x 1,5 3,5 x 2 5 x 3,5 3 x 1,5 4 x 2,5 3,5 x 1,5 3 x 2,5 5 x 2,5

5,5 x 2 5 x 2,5 4 x 2,5 6 x 3 3,5 x 2 3,5x2 4 x 3 3 x 1,5 3 x 2,5 5,5 x 2,5 5 x 2,5 2 x 1,5 5 x 1,5 5 x 3,5 5 x 3

5 x 3 4 x 2,5 4,5 x2 4 x 2,5 3,5 x 3 4x2 3 x 2,5 3,5 x 3 3 x 2,5 5 x 2,5 5 x 4 5 x 4 5 x 3,5 5 x 2,5 5 x ,5

5 x 3 5 x 2,5 5 x 2 8 x 2 3,5 x 2 3,5x2,5 3 x 2,5 4 x 2,5 3,5 x 2,5 5 x 2 4,5 x 2,5 4 x 2 5 x 2,5 3,5 x 2 4 x 2

3 x 3.5 4 x 2,5 3,5 x 2,5 4 x 2 4,5 x 3,5 4,5x3 4 x 2,5 4 x 5 3,5 x 2 5 x 2,5 5 x 2 3 x 2,5 5 x 3 4 x 2 5 x 2,5

3 x2 3 x 2,5 4,5 x 2,5 4 x 2 3 x 2 3,5x3 4 x 2,5 4,5 x 2,5 3 x 2,5 5 x 3,5 3 x 2 2 x 2,5 2,5 x2,5 4,5 x 2 5 x 4,5

3 x 2 4 x 2,5 5 x 2 4 x 3 3 x 2 4,5x3 4,5 x 2 4 x 3,5 3 x 2,5 5 x 5,5 3 x 2,5 4 x 2,5 5 x 3 4 x 2 10 x 7

3,5 x 2 3,5 x 2 5 x 2,5 4 x 3 4 x 3 4x2,5 4,5 x 3 4 x 3,5 3 x 1,5 5 x 2 5 x 2,5 4 x 3,5 5 x 2,5 5 x 2 5 x 4

3 x 2 4 x 2,5 4,5 x 2 4 x 3 3,5 x 2,5 3,5x2 4,5 x 2 5 x 2,5 4 x 3 3 x 2,5 5 x 2,5 5 x 4 5 x 2,5 5 x 2 4 x 3

4 x 3 3,5 x 2,5 4,5 x 2 4 x 2 4 x 3 4x2,5 2,5 x 1,5 5 x 3 5 x 3,5 3 x 1,5 4 x 2,5 7 x 5 5 x 2,5 5 x 2,5 4 x 3

4 x 2 3 x 2,5 4,5 x 2,5 4 x 2 3 x 2 4x3 3 x 2,5 5 x 3,5 5 x 2,5 3 x 2,5 5 x 2,5 7 x 5 4,5 x 2,5 4 x 1,5 4 x 2

4 x 3 3,5 x 2,5 4,5 x 2,5 4 x 3 3,5 x 2 4x3 6 x 2,5 5 x 2,5 5 x 2,5 5 x 3,5 5 x 3 10 x 7 5 x 2,5 5 x 2 4 x 3

3 x 2 2,5 x 2 5×3 4 x 3 3,5 x 2,5 4x2,5 4 x 3 5 x 3 5 x 2,5 5 x 2,5 5 x 3,5 5 x 4 5 x 2,5 4 x 2,5 3,5 x 2,5

6 x 4 3,5 x 2,5 5x3,5 5,5 x 2 3 x 2,5 4x2,5 4,5 x 2 5 x 2,5 5 x 2 3,5 x 2 4 x 2 4 x 3 5 x 2 3 x 1,5 2 x 1,5

4,5 x 2 4,5 x 2 4x2 2,5 x 2 3,5 x 2,5 3 x 2,5 4 x 2,5 5 x 2,5 5 x 2,5 4 x 2 5 x 2,5 4 x 3 5 x 3 3,5 x 1,5 3 x 2

3,5 x 2,5 3,5 x 2,5 4x2,5 3,5 x 3 3 x 2 3,5 x 2,5 3 x 2 5 x 3,5 5 x 3 4,5 x 2 5 x 4,5 4 x 3 4 x 3,5 3 x 2 3 x 2

3 x 2,5 3 x 2,5 4,5×2 4 x 2 3,5 x 2 3,5 x 2 3 x 2 5 x 3 3 x 1,5 4 x 2 10 x 7 4 x 3 4,5 x 3,5 3 x 2 3,5 x 2

4,5 x 3 3,5 x 2,5 4,5x2 4 x 3 3 x 2,5 3 x 2 3 x 2 5 x 2,5 3 x 3,5 5 x 2 5 x 4 5 x 4 5 x 3 6 x 3 3,5 x 2,5

4 x 2,5 3 x2 4,5×2 3,5 x 2 3,5 x 2,5 3 x 1,5 3,5 x 2,5 5 x 3,5 5 x 2,5 5 x 2 4 x 3 5 x 3 5 x 2,5 4 x 2,5 3 x 2,5

4 x 2 4 x 3 4x2,5 6 x 4 3 x 2 3,5 x 2,5 3 x 2 5 x 3,5 5 x 2,5 5 x 2,5 4 x 3 5 x 4 5 x 3,5 3 x 3 4,5 x 3

3 x 2 3 x 2,5 4,5x2 3 x 2 3 x 3.5 3 x 2,5 3 x 2 5 x 3,5 5 x 2,5 4 x 1,5 4 x 2 4 x 3 4,5 x 2 3,5 x 2,5 3 x 2,5

3 x 2 5 x 3,5 4x2,5 4,5 x 3 3 x 2,5 3 x 2 3, 5 x 2,5 5 x 2,5 5 x 2,5 5 x 2 4 x 3 4 x 3 4,5 x 2,5 3 x 2 3,5 x 2

3 x 2 2,5 x 2 3,5×2,5 5 x 3 3 x 2 3,5 x 2 4 x 2,5 5 x 2,5 5 x 2,5 5 x 1,5 4 x 3 5 x 3 4 x 2,5 3 x 2,5 3 x 2

3,5 x 3 3,5 x 2 5x2,5 3,5 x 2 3 x 2,5 3 x 2,5 3,5 x 2,5 5 x 3,5 5 x 5,5 5 x 2,5 5 x 4 6 x 3,5 5,5 x 3 2,5 x 2 3 x 2

3,5 x 2 3,5 x 2, 5 4,5×2,5 3 x 2 4 x 2,5 3,5 x 2,5 3 x 2,5 5 x 3,5 5 x 3 4 x 2 5 x 4 6 x 5 5,5 x 3 3 x 2,5 2,5 x 2,5

4,5 x 3 4,5 x 2,5 5x2,5 4 x 2 3 x 1,5 2 x 1,5 3,5 x 2,5 5 x 2,5 4 x 2 4 x 1,5 2 x 2,5 4 x 2 5,5 x 2 3 x 5 3,5 x 2,5

3,5 x 2 3,5 x 3 2,5×5,5 6 x 3 3,5 x 1,5 3 x 2 3 x 2 5 x 2,5 4 x 3 4 x 1,5 4 x 3 4 x 3 5 x 3,5 3 x 2,5 3 x 2

2 x 2,5 3 x 2 5,5×2 3 x 2 3 x 2 3 x 2 3 x 2 5 x 3 4 x 2,5 4 x 2 5 x 4 4 x 3 4,5 x 3 5 x 3 3 x 2

2,5 x 2 5 x 3 5x2,5 4 x 3 3 x 2 3,5 x 2 2,5 x2 5 x 2,5 4 x 2,5 5 x 2,5 5 x 3,5 5 x 4 4 x 3,5 3 x 2 3 x 2

4 x 3 3,5 x 2 5x2 3 x 2,5 6 x 3 3,5 x 2,5 3,5 x 2,5 5 x 3 4 x 2,5 4 x 2 6 x 5 5 x 4 5 x 3,5 3 x 2 3 x 2

4 x 3 3 x 2 5x2,5 2,5 x 2 4 x 2,5 3 x 2,5 3,5 x 2 5 x 3 4 x 2,5 5 x 2 4 x 2 3 x 3,5 5,5 x 2 3 x 2,5 4,5x24 x 3 3,5 x 2 4,5x2 3,5 x 2 3 x 3.5 4,5 x 3 3 x 1,5 5 x 2,5 4 x 2,5 4,5 x 2 4 x 3 5 x 4 5 x 2,5 5 x 3,5 4x2,53 x 2,5 4 x 2 5x2,5 4 x 3 3,5 x 2,5 3 x 2,5 3,5 x 2,5 5 x 2,5 4 x 2,5 5 x 2 5 x 4 5 x 2,5 5 x 3 2,5 x 2 3,5×2,53 x 2,5 4 x 2,5 2x3,5 3,5 x 2 3 x 2 3,5 x 2 3 x 2 5 x 3 4,5 x 2,5 5 x 1,5 5 x 4 4,5 x 3,5 5 x 2,5 3,5 x 2 5x2,54 x 3 4 x2 4,5×2 4 x 3 3 x 2,5 3 x 2 3 x 3.5 5,5 x 3 4 x 3,5 4,5 x 2,5 3 x 3,5 5 x 3,5 5 x 3 3,5 x 2, 5 4,5×2,56 x 3 3 x 2,5 4,5×2,5 4 x 3 2,5 x 2 3 x 2 2 x 1,5 5 x 2,5 4 x 3,5 4,5 x 2,5 4 x 3 5 x 2,5 4 x 3 4,5 x 2,5 5x2,52 x 2,5 3 x 2,5 5x2,5 4 x 2 3 x 2,5 2,5 x 2 2,5 x 2 4,5 x 2,5 5 x 2,5 4 x 2 5 x 4 5 x 3,5 4 x 2 3,5 x 3 2,5×5,53,5 x 3 4 x 2 5x2 4 x 3 3 x 5 3,5 x 2,5 3 x 2,5 3 x 2,5 5 x 3 5 x 2,5 4 x 3,5 3,5 x 4,5 4 x 1,5 3 x 2 5,5×25 x 2,5 3 x 2 4x2 5,5 x 3 3 x 2,5 3 x 2 3 x 2 3,5 x 2,5 5 x 3,5 5 x 4 4 x 2,5 3,5 x 4,5 4,5 x 2 5 x 3 5x2,54 x 3 3 x 1,5 4x2 3,5 x 3 5 x 3 3 x 2 3,5 x 2,5 3,5 x 2 5 x 2,5 5 x 4 4 x 3,5 3 x 4,5 4 x 2,5 3,5 x 2 5x24 x 2,5 3 x 2,5 5x2 4 x 5 3 x 2 3 x 2 4 x 2,5 3,5 x 2,5 5 x 3 3 x 2,5 4 x 3,5 3 x 1,5 5 x 2 3 x 2 5x2,54 x 3 2 x 2,5 4,5×1,5 4 x 3 3 x 2 3 x 2 3 x 2,5 3 x 1,5 5 x 2,5 4 x 3 5 x 2,5 3 x 2,5 5 x 3 3,5 x 2 4,5x22,5 x 2 3 x 2 5×1,5 4 x 3 2,5 x 5 3 x 2 3 x 2 4,5 x 3,5 5 x 2,5 3,5 x 2,5 5 x 3 5 x 2 4 x 3 4 x 2 5x2,52,5 x 2 4,5 x 2,5 4,5×2 4 x 3,5 3 x 2 3 x 2 3,5 x 2 3 x 2,5 5 x 3,5 5 x 4 4 x 2,5 4,5 x 3 3,5 x 2 4 x 2,5 2x3,53 x 2 2,5 x 1,5 5×2,5 4 x 3 2,5 x 2 3,5 x 2 3,5 x 2 3 x 1,5 5 x 3 4 x 3 5 x 4 5 x 3,5 4 x 3,5 4 x2 4,5×25 x 3 3 x 2 4,5×2 2,5 x 2 2 x 2,5 4 x 2,5 6 x 3 4 x 3,5 5 x 2,5 4 x 2,5 5 x 5,5 5 x 3,5 3 x 1,5 3 x 2,5 4,5×2,5



4 x 3 4,5 x 2,5 4,5×2 2,5 x 3 3,5 x 3 3,5 x 2,5 3 x 2 2 x 1,5 5 x 3,5 4 x 2,5 5 x 2 5 x 2,5 3 x 2,5 3 x 2,5 5x2,55 x 3,5 3 x 2,5 4,5×2,5 4 x 2 3 x 2,5 4,5 x 2,5 4 x 3 2 x 1,5 5 x 3,5 5 x 2,5 5 x 2,5 5 x 3 5 x 2 4 x 3 5 x 4

5 x 3 4,5 x 2,5 3,5 x 2,5 3 x 3 4 x 3 3 x 2 3 x 2,5 4 x 3,5 5 x 3,5 5 x 4 5 x 2 5 x 3,5 4,5 x 3 4 x 2,5 5 x 5,5

4,5 x 2,5 4 x 2,5 3 x 4 3 x 1,5 3,5 x 2 4 x 3 2,5 x 2 3 x 2,5 5 x 2,5 5 x 4,5 5 x 2,5 5 x 4 5 x 3,5 4 x 2,5 5 x 2

4 x 3 4,5 x 2,5 4 x 2 3,5 x 2 4 x 2 4 x 3 3,5 x 2 3,5 x 3 5 x 2,5 4 x 3,5 5,5 x 3 3 x 2 3 x 4,5 5 x 2,5 5 x 2,5

4 x 3 3 x 2,5 3 x 2 3 x 2 5 x 2,5 3 x 3,5 5 x 2 5 x 4 3,5 x 2 5 x 3 4 x 2,5 5 x 2 5 x 3,5 5 x 2,5 4 x 1,5

3,5 x 2 3,5 x 2,5 3 x 1,5 3,5 x 2,5 5 x 3,5 5 x 2,5 5 x 2 4 x 3 3 x 1,5 5 x 2,5 4 x 2,5 4,5 x 2 5 x 2,5 5 x 2,5 5 x 2

6 x 4 3 x 2 3,5 x 2,5 3 x 2 5 x 3,5 5 x 2,5 5 x 2,5 4 x 3 3,5 x 2,5 5 x 2,5 4 x 2,5 5 x 2 5 x 2,5 5 x 2,5 5 x 1,5

3 x 2 3 x 3.5 3 x 2,5 3 x 2 5 x 3,5 5 x 2,5 4 x 1,5 4 x 2 3 x 2 5 x 3 4,5 x 2,5 5 x 1,5 5 x 3,5 5 x 5,5 5 x 2,5

4,5 x 3 3 x 2,5 3 x 2 3, 5 x 2,5 5 x 2,5 5 x 2,5 5 x 2 4 x 3 3 x 3.5 5,5 x 3 4 x 3,5 4,5 x 2,5 5 x 3,5 5 x 3 4 x 2

5 x 3 3 x 2 3,5 x 2 4 x 2,5 5 x 2,5 5 x 2,5 5 x 1,5 4 x 3 2 x 1,5 5 x 2,5 4 x 3,5 4,5 x 2,5 5 x 2,5 4 x 2 4 x 1,5

3,5 x 2 3 x 2,5 3 x 2,5 3,5 x 2,5 5 x 3,5 5 x 5,5 5 x 2,5 5 x 4 2,5 x 2 4,5 x 2,5 5 x 2,5 4 x 2 5 x 2,5 4 x 3 4 x 1,5

3 x 2 4 x 2,5 3,5 x 2,5 3 x 2,5 5 x 3,5 5 x 3 4 x 2 5 x 4 3 x 2,5 3 x 2,5 5 x 3 5 x 2,5 5 x 3 4 x 2,5 4 x 2

4 x 2 3 x 1,5 4 x 3,5 3,5 x 2,5 5 x 2,5 4 x 2 4 x 1,5 2 x 2,5 3 x 2 3,5 x 2,5 5 x 3,5 5 x 4 5 x 2,5 4 x 2,5 5 x 2,5

6 x 3 3,5 x 1,5 2 x 1,5 3 x 2 5 x 2,5 4 x 3 4 x 1,5 4 x 3 3,5 x 2,5 3,5 x 2 5 x 2,5 5 x 4 5 x 3 4 x 2,5 4 x 2

3 x 2 3 x 2 2 x 1,5 3 x 2 5 x 3 4 x 2,5 4 x 2 5 x 4 4 x 2,5 3,5 x 2,5 5 x 3 3 x 2,5 5 x 3 4 x 2,5 5 x 2

4 x 3 3 x 2 4 x 3,5 2,5 x2 5 x 2,5 4 x 2,5 5 x 2,5 5 x 3,5 3 x 2,5 3 x 1,5 5 x 2,5 4 x 3 5 x 2,5 4 x 2,5 4,5 x 2

3 x 2,5 6 x 3 3,5 x 2,5 3,5 x 2,5 5 x 3 4 x 2,5 4 x 2 6 x 5 3 x 2 4,5 x 3,5 5 x 2,5 3,5 x 2,5 5 x 2,5 4 x 2,5 5 x 2

2,5 x 2 4 x 2,5 3 x 2,5 3,5 x 2 5 x 3 4 x 2,5 5 x 2 4 x 2 3,5 x 2 3 x 2,5 5 x 3,5 5 x 4 5 x 3 4,5 x 2,5 5 x 1,5

3,5 x 2 3 x 3,5 4,5 x 3 3 x 1,5 5 x 2,5 4 x 2,5 4,5 x 2 4 x 3 3,5 x 2 3 x 1,5 5 x 3 4 x 3 5,5 x 3 4 x 3,5 4,5 x 2,5

4 x 3 3,5 x 2,5 3 x 2,5 3,5 x 2,5 5 x 2,5 4 x 2,5 5 x 2 5 x 4 6 x 3 4 x 3,5 5 x 2,5 4 x 2,5 5 x 2,5 4 x 3,5 4,5 x 2,5

3,5 x 2 3 x 2 3,5 x 2 3 x 2 5 x 3 4,5 x 2,5 5 x 1,5 5 x 4 3 x 2 2 x 1,5 5 x 3,5 4 x 2,5 4,5 x 2,5 5 x 2,5 4 x 2

4 x 3 3 x 2,5 3 x 2 3 x 3.5 5,5 x 3 4 x 3,5 4,5 x 2,5 3 x 3,5 4 x 3 2 x 1,5 5 x 3,5 5 x 2,5 3 x 2,5 5 x 3 5 x 2,5

4 x 3 2,5 x 2 3 x 2 2 x 1,5 5 x 2,5 4 x 3,5 4,5 x 2,5 4 x 3 3 x 2,5 4 x 3,5 5 x 3,5 5 x 4 3,5 x 2,5 5 x 3,5 5 x 4

4 x 2 3 x 2,5 2,5 x 2 2,5 x 2 4,5 x 2,5 5 x 2,5 4 x 2 5 x 4 2,5 x 2 3 x 2,5 5 x 2,5 5 x 4,5 3,5 x 2 5 x 2,5 5 x 4

4 x 3 3 x 5 3,5 x 2,5 3 x 2,5 3 x 2,5 5 x 3 5 x 2,5 4 x 3,5 3,5 x 2 3,5 x 3 5 x 2,5 4 x 3,5 3,5 x 2,5 5 x 3 3 x 2,5

5,5 x 3 3 x 2,5 3 x 2 3 x 2 3,5 x 2,5 5 x 3,5 5 x 4 4 x 2,5 4 x 3,5 3,5 x 2,5 5 x 2,5 4 x 2 3 x 1,5 5 x 2,5 4 x 3

3,5 x 3,5 5 x 3 3 x 2 3,5 x 2,5 3,5 x 2 5 x 2,5 5 x 4 4 x 3,5 2 x 1,5 3 x 2 5 x 2,5 4 x 3 4,5 x 3,5 5 x 2,5 3,5 x 2,5

4 x 5 3 x 2 3 x 2 4 x 2,5 3,5 x 2,5 5 x 3 3 x 2,5 4 x 3,5 2 x 1,5 3 x 2 5 x 3 4 x 2,5 3 x 2,5 5 x 3,5 5 x 4

4 x 3 3 x 2 3 x 2 3 x 2,5 3 x 1,5 5 x 2,5 4 x 3 5 x 2,5 4 x 3,5 2,5 x2 5 x 2,5 4 x 2,5 3 x 1,5 5 x 3 3,5 x 2

4 x 3 2,5 x 5 3 x 2 3 x 2 4,5 x 3,5 5 x 2,5 3,5 x 2,5 5 x 3 3,5 x 2,5 3,5 x 2,5 5 x 3 4 x 2,5 4 x 2 3 x 2 4 x 2,5

4 x 3,5 3 x 2 3 x 2 3,5 x 2 3 x 2,5 5 x 3,5 5 x 4 4 x 2,5 3 x 2,5 3,5 x 2 5 x 3 4 x 2,5 5 x 2 3 x 2 3,5 x 2,5

4 x 3 2,5 x 2 3,5 x 2 3,5 x 2 3 x 1,5 5 x 3 4 x 3 5 x 4 4,5 x 3 3 x 1,5 5 x 2,5 4 x 2,5 4,5 x 2 3 x 2 4,5 x 2,5

2,5 x 2 2 x 2,5 4 x 2,5 6 x 3 4 x 3,5 5 x 2,5 4 x 2,5 5 x 5,5 3 x 2,5 3,5 x 2,5 5 x 2,5 4 x 2,5 5 x 2 3 x 2 3 x 2

2,5 x 3 3,5 x 3 3,5 x 2,5 3 x 2 2 x 1,5 5 x 3,5 4 x 2,5 5 x 2 3,5 x 2 3 x 2 5 x 3 4,5 x 2,5 5 x 1,5 3,5 x 2 4 x 3

4 x 2 3 x 2,5 4,5 x 2,5 4 x 3 2 x 1,5 5 x 3,5 5 x 2,5 5 x 2,5 3 x 2 3 x 3.5 5,5 x 3 4 x 3,5 4,5 x 2,5 3 x 2 4 x 3

3 x 3.5 4 x 3 3 x 2 3 x 2,5 4 x 3,5 5 x 3,5 5 x 4 5 x 2 3 x 2 2 x 1,5 5 x 2,5 4 x 3,5 4,5 x 2,5 2,5 x 2 3,5 x 2

3 x 1,5 3,5 x 2 4 x 3 2,5 x 2 3 x 2,5 5 x 2,5 5 x 4,5 5 x 2,5 2,5 x 2 2,5 x 2 4,5 x 2,5 5 x 2,5 4 x 2 2 x 2,5 3 x 2

3,5 x 2 4 x 2 4 x 3 3,5 x 2 3,5 x 3 5 x 2,5 4 x 3,5 5,5 x 3 3,5 x 2,5 3 x 2,5 3 x 2,5 5 x 3 5 x 2,5 3,5 x 3 3 x 2

3,5 x 2 5 x 3 4 x 2,5 5 x 2 3 x 2,5 3,5 x 2,5 3 x 2,5 3,5 x 2,5 3 x 2 3 x 2 3,5 x 2,5 5 x 3,5 5 x 4 3 x 2,5 2,5 x 2

3 x 1,5 5 x 2,5 4 x 2,5 4,5 x 2 3,5 x 2 3 x 2 3,5 x 2 3 x 2 3 x 2 3,5 x 2,5 3,5 x 2 5 x 2,5 5 x 4 4 x 3 3,5 x 2,5

3,5 x 2,5 5 x 2,5 4 x 2,5 5 x 2 3 x 2 3 x 3.5 3 x 2 3 x 3.5 3 x 2 4 x 2,5 3,5 x 2,5 5 x 3 3 x 2,5 3,5 x 2 5 x 2,5

3 x 2 5 x 3 4,5 x 2,5 5 x 1,5 3 x 2 2 x 1,5 3 x 2 2 x 1,5 3 x 2 3 x 2,5 3 x 1,5 5 x 2,5 4 x 3 4 x 2 5 x 3

3 x 3.5 5,5 x 3 4 x 3,5 4,5 x 2,5 2,5 x 2 2,5 x 2 2,5 x 3 2,5 x 2 3 x 2 3 x 2 4,5 x 3,5 5 x 2,5 3,5 x 2,5 5 x 3 5 x 3,5

2 x 1,5 5 x 2,5 4 x 3,5 4,5 x 2,5 3,5 x 2,5 3 x 2,5 3,5 x 2,5 3 x 2,5 3 x 2 3,5 x 2 3 x 2,5 5 x 3,5 5 x 4 5 x 2,5 4 x 3

2,5 x 2 4,5 x 2,5 5 x 2,5 4 x 2 3 x 2 3 x 2 3 x 2 3 x 2 3,5 x 2 3,5 x 2 3 x 1,5 5 x 3 4 x 3 5 x 2,5 2 x 1,5

3 x 2,5 3 x 2,5 5 x 3 5 x 2,5 3 x 2 3,5 x 2,5 3 x 2 3,5 x 2,5 4 x 2,5 6 x 3 4 x 3,5 5 x 2,5 4 x 2,5 5 x 3 4 x 3,5

3 x 2 3,5 x 2,5 5 x 3,5 5 x 4 3 x 2 4 x 2,5 3 x 2 4 x 2,5 3,5 x 2,5 3 x 2 2 x 1,5 5 x 3,5 4 x 2,5 5,5 x 3 4 x 3,5

3,5 x 2,5 3,5 x 2 5 x 2,5 5 x 4 3 x 2 3 x 2,5 3 x 2 3 x 2,5 4,5 x 2,5 4 x 3 2 x 1,5 5 x 3,5 5 x 2,5 5 x 2,5 4 x 3,5

4 x 2,5 3,5 x 2,5 5 x 3 3 x 2,5 3 x 2 3 x 2 3 x 2 3 x 2 3 x 2 3 x 2,5 4 x 3,5 5 x 3,5 5 x 4 4,5 x 2,5 5 x 2,5

3 x 2,5 3 x 1,5 5 x 2,5 4 x 3 3 x 2 3,5 x 2 3 x 2 3,5 x 2 4 x 3 2,5 x 2 3 x 2,5 5 x 2,5 5 x 4,5 3 x 2,5 5 x 3

3 x 2 4,5 x 3,5 5 x 2,5 3,5 x 2,5 3,5 x 2 3,5 x 2 3,5 x 2 3,5 x 2 4 x 3 3,5 x 2 3,5 x 3 5 x 2,5 4 x 3,5 3,5 x 2,5 5 x 3,5

3,5 x 2 3 x 2,5 5 x 3,5 5 x 4 4 x 2,5 6 x 3 4 x 2,5 6 x 3 3,5 x 2 3 x 2 3 x 2 3,5 x 2,5 3,5 x 2 5 x 2,5 5 x 4

3,5 x 2 3 x 1,5 5 x 3 4 x 3 3,5 x 2,5 3 x 2 3,5 x 2,5 3 x 2 3 x 2 3 x 3.5 3 x 2 4 x 2,5 3,5 x 2,5 5 x 3 3 x 2,5

6 x 3 4 x 3,5 5 x 2,5 4 x 2,5 4,5 x 2,5 4 x 3 4,5 x 2,5 4 x 3 3 x 2 2 x 1,5 3 x 2 3 x 2,5 3 x 1,5 5 x 2,5 4 x 3

3 x 2 2 x 1,5 5 x 3,5 4 x 2,5 3 x 2 3 x 2,5 3 x 2 3 x 2,5 2,5 x 2 2,5 x 2 3 x 2 3 x 2 4,5 x 3,5 5 x 2,5 3,5 x 2,5

4 x 3 2 x 1,5 5 x 3,5 5 x 2,5 4 x 3 2,5 x 2 4 x 3 2,5 x 2 3,5 x 2,5 3 x 2,5 3 x 2 3,5 x 2 3 x 2,5 5 x 3,5 5 x 4



3 x 2,5 4 x 3,5 5 x 3,5 5 x 4 4 x 3 3,5 x 2 4 x 3 3,5 x 2 3 x 2 3 x 2 3,5 x 2 3,5 x 2 3 x 1,5 5 x 3 4 x 3

2,5 x 2 3 x 2,5 5 x 2,5 5 x 4,5 3 x 2,5 3 x 2 3 x 2,5 3 x 2 3 x 2 3,5 x 2,5 4 x 2,5 6 x 3 4 x 3,5 5 x 2,5 4 x 2,5

3,5 x 2 3,5 x 3 5 x 2,5 4 x 3,5 3 x 2 3 x 2 3 x 2 3,5 x 2,5 3 x 2 4 x 2,5 3,5 x 2,5 3 x 2 2 x 1,5 5 x 3,5 4 x 2,5

4 x 3,5 4 x 2,5 6 x 3 4 x 3,5 3,5 x 2 3 x 2 3,5 x 2 4 x 2,5 3 x 2 3 x 2,5 4,5 x 2,5 4 x 3 2 x 1,5 5 x 3,5 5 x 2,5

2 x 1,5 3,5 x 2,5 3 x 2 2 x 1,5 3,5 x 2 3,5 x 2 3,5 x 2 3 x 2,5 3 x 1,5 5 x 2,5 4 x 3 4 x 3 4 x 3 4 x 3 4 x 3

2 x 1,5 4,5 x 2,5 4 x 3 2 x 1,5 6 x 3 4 x 2,5 6 x 3 5 x 2,5 5 x 4 3 x 2 3 x 2,5 3 x 2 3 x 2,5 4,5 x 2,5 4 x 3

4 x 3,5 3 x 2 3 x 2,5 4 x 3,5 3 x 2 3,5 x 2,5 3 x 2 5 x 3 3 x 2,5 3 x 2 3 x 2 3 x 2 3 x 2 3 x 2 3 x 2,5

5 x 4 3 x 2,5 3,5 x 2,5 5 x 3,5 5 x 5,5 5 x 2,5 5 x 4 2,5 x 2 4,5 x 2,5 3 x 2,5 4 x 2,5 5 x 2,5 5 x 3,5 3 x 2,5 3 x 1,5

4 x 2 3 x 2 3 x 2,5 5 x 3,5 5 x 3 4 x 2 5 x 4 3 x 2,5 3 x 2,5 5 x 3,5 4 x 2,5 4 x 2 6 x 5 3 x 2 4,5 x 3,5

3 x 2,5 3,5 x 2,5 3,5 x 2,5 5 x 2,5 4 x 2 4 x 1,5 2 x 2,5 3 x 2 3,5 x 2,5 4 x 1,5 4 x 2,5 5 x 2 4 x 2 3,5 x 2 3 x 2,5

2 x 2,5 4 x 2,5 3 x 2 5 x 2,5 4 x 3 4 x 1,5 4 x 3 3,5 x 2,5 3,5 x 2 4 x 2 4 x 2,5 4,5 x 2 4 x 3 3,5 x 2 3 x 1,5

4 x 2,5 5 x 4 3 x 2 5 x 3 4 x 2,5 4 x 2 5 x 4 4 x 2,5 3,5 x 2,5 5 x 2,5 4 x 2,5 5 x 2 5 x 4 6 x 3 4 x 3,5

4 x 3,5 5 x 4 2,5 x2 5 x 2,5 4 x 2,5 5 x 2,5 5 x 3,5 3 x 2,5 3 x 1,5 4 x 2 4,5 x 2,5 5 x 1,5 5 x 4 3 x 2 2 x 1,5

5 x 4 2 x 2,5 3,5 x 2,5 5 x 3 4 x 2,5 4 x 2 6 x 5 3 x 2 4,5 x 3,5 5 x 2 4 x 3,5 4,5 x 2,5 3 x 3,5 4 x 3 2 x 1,5

7 x 5 4 x 3 3,5 x 2 5 x 3 4 x 2,5 5 x 2 4 x 2 3,5 x 2 3 x 2,5 4,5 x 2 4 x 3,5 4,5 x 2,5 4 x 3 3 x 2,5 4 x 3,5

7 x 5 5 x 4 3 x 1,5 5 x 2,5 4 x 2,5 4,5 x 2 4 x 3 3,5 x 2 3 x 1,5 5 x 2 5 x 2,5 4 x 2 5 x 4 2,5 x 2 3 x 2,5

10 x 7 5 x 3,5 3,5 x 2,5 5 x 2,5 4 x 2,5 5 x 2 5 x 4 6 x 3 4 x 3,5 5 x 1,5 5 x 3 5 x 2,5 4 x 3,5 3,5 x 2 3,5 x 3

5 x 4 6 x 5 3 x 2 5 x 3 4,5 x 2,5 5 x 1,5 5 x 4 3 x 2 2 x 1,5 4,5 x 2,5 5 x 3,5 5 x 4 4 x 2,5 4 x 3,5 3,5 x 2,54 x 3 4 x 2 3 x 3.5 5,5 x 3 4 x 3,5 4,5 x 2,5 3 x 3,5 4 x 3 2 x 1,5 4,5 x 2,5 5 x 2,5 5 x 4 4 x 3,5 2 x 1,5 3 x 24 x 3 4 x 3 2 x 1,5 5 x 2,5 4 x 3,5 4,5 x 2,5 4 x 3 3 x 2,5 4 x 3,5 4 x 2 5 x 3 3 x 2,5 4 x 3,5 2 x 1,5 3 x 24 x 3 5 x 4 2,5 x 2 4,5 x 2,5 5 x 2,5 4 x 2 5 x 4 2,5 x 2 3 x 2,5 5 x 2,5 5 x 2,5 4 x 3 5 x 2,5 4 x 3,5 2,5 x24 x 3 5 x 4 3 x 2,5 3 x 2,5 5 x 3 5 x 2,5 4 x 3,5 3,5 x 2 3,5 x 3 5 x 4 5 x 2,5 3,5 x 2,5 5 x 3 3,5 x 2,5 3,5 x 2,55 x 4 4 x 2,5 3 x 2 3,5 x 2,5 5 x 3,5 5 x 4 4 x 2,5 4 x 3,5 3,5 x 2,5 5 x 4 5 x 3,5 5 x 4 4 x 2,5 3 x 2,5 3,5 x 25 x 3 4 x 2,5 3,5 x 2,5 3,5 x 2 5 x 2,5 5 x 4 4 x 3,5 2 x 1,5 3 x 2 3 x 2,5 4 x 2 3,5 x 2,5 4 x 2 3 x 2,5 4,5 x 2

5 x 4 4 x 2,5 4 x 2,5 3,5 x 2,5 5 x 3 3 x 2,5 4 x 3,5 2 x 1,5 3 x 2 4 x 3 5 x 2 4 x 2,5 5 x 2 3 x 1,5 5 x 2

4 x 3 4 x 2,5 3 x 2,5 3 x 1,5 5 x 2,5 4 x 3 5 x 2,5 4 x 3,5 2,5 x2 3,5 x 2,5 4,5 x 2 3 x 2,5 4,5 x 2 4 x 3,5 5 x 1,5

4 x 3 4 x 2,5 3 x 2 4,5 x 3,5 5 x 2,5 3,5 x 2,5 5 x 3 3,5 x 2,5 3,5 x 2,5 5 x 4 5 x 2 4 x 2,5 5 x 2 3,5 x 2 2,5 x 2

3 x 2,5 4,5 x 2,5 3,5 x 2 3 x 2,5 5 x 3,5 5 x 4 4 x 2,5 3 x 2,5 3,5 x 2 4 x 3 5 x 1,5 3,5 x 2,5 5 x 1,5 3,5 x 2 3,5 x 2,5

3,5 x 2,5 4 x 3,5 3,5 x 2 3 x 1,5 5 x 3 4 x 3 5 x 4 4,5 x 3 3 x 1,5 4 x 2,5 4,5 x 2,5 3 x 2,5 4,5 x 2,5 6 x 3 3 x 2

3 x 2 4 x 3,5 6 x 3 4 x 3,5 5 x 2,5 4 x 2,5 5 x 5,5 3 x 2,5 3,5 x 2,5 4 x 2,5 4,5 x 2,5 3,5 x 2,5 4,5 x 2,5 4 x 2 3 x 2

3 x 2 5 x 2,5 4 x 3 2 x 1,5 6 x 3 4 x 2,5 6 x 3 5 x 2,5 5 x 4 3 x 2 4 x 2 3 x 2 4 x 2 4 x 3 3 x 2

2,5 x2 5 x 3 3 x 2,5 4 x 3,5 3 x 2 3,5 x 2,5 3 x 2 5 x 3 3 x 2,5 3 x 2 5 x 2,5 3 x 2 5 x 2,5 5 x 4 3 x 2

3,5 x 2,5 3 x 2,5 3,5 x 2,5 5 x 3,5 5 x 5,5 5 x 2,5 5 x 4 2,5 x 2 4,5 x 2,5 3 x 2,5 5 x 4 2,5 x2 5 x 4 5 x 2 3 x 2

3,5 x 2 3 x 2 3 x 2,5 5 x 3,5 5 x 3 4 x 2 5 x 4 3 x 2,5 3 x 2,5 5 x 3,5 5 x 4 3,5 x 2,5 5 x 4 4,5 x 2 3 x 2

3 x 1,5 3,5 x 2,5 3,5 x 2,5 5 x 2,5 4 x 2 4 x 1,5 2 x 2,5 3 x 2 3,5 x 2,5 4 x 1,5 3 x 2,5 3,5 x 2 3 x 2,5 5 x 2 4 x 2,5

3,5 x 2,5 4 x 2,5 3 x 2 5 x 2,5 4 x 3 4 x 1,5 4 x 3 3,5 x 2,5 3,5 x 2 4 x 2 4 x 3 3 x 1,5 4 x 3 4 x 2,5 4 x 2,5

3 x 2 5 x 4 3 x 2 5 x 3 4 x 2,5 4 x 2 5 x 4 4 x 2,5 3,5 x 2,5 5 x 2,5 3,5 x 2,5 3,5 x 2,5 3,5 x 2,5 2 x 1,5 4 x 2,5

3 x 3,5 5 x 4 2,5 x2 5 x 2,5 4 x 2,5 5 x 2,5 5 x 3,5 3 x 2,5 3 x 1,5 4 x 2 5 x 4 3 x 2 5 x 4 2,5 x 2

2 x 1,5 2 x 2,5 3,5 x 2,5 5 x 3 4 x 2,5 4 x 2 6 x 5 3 x 2 4,5 x 3,5 5 x 2 4 x 3 3 x 3,5 4 x 3 5 x 2,5



Lampiran 4 Safranin Kristal-Violet

4 x 3 5,5 x 2 4 x 3 4,5 x 4 ヵ,ヵ×ン 4 x 2,5 5 x 2 6 x 3 3,5 x 3 5 x 2 4,5 x 3,5 5 x 4 4 x 2,5 5 x 4,5 5 x 2,5

6 x 3 5 x 3,5 4 x 2 3 x 3.5 2,ヵ×2 6 x 3 4,5 x 2 6 x 5 3 x 1,5 5 x 2,5 5,5 x 4 5 x 4,5 5 x 2,5 3,5 x 3 5,5 x 2

6 x 3 3 x 2,5 4 x 2,5 5 x 3 4,5 x 2,5 4,5 x 3 4 x 2,5 5 x 2 5,5 x 1,5 5 x 3 5 x 4 5 x 4,5 5 x 2,5 5 x 4 5 x 2,5

3 x 1 5 x 3 3,5 x 2,5 6 x 3 5 x 3 4 x 2,5 5 x 2,5 5 x 3 5,5 x 2 3 x 2 4 x 3 4,5 x 3,5 4,5 x 2 5 x 2 5,5 x 2,5

5 x 4 4 x 3 5 x 2,5 5 x 3 4,5 x 2,5 4 x 3 5 x 2,5 5 x 2,5 3 x 1,5 4 x 2 5 x 4 4 x 3 4,5 x 3 5 x 2,5 5,5 x 2,5

5,5 x 3 5 x 3 4 x 2,5 6 x 3 5 x 2,5 3 x 2,5 4,5 x 2 4,5 x 3,5 4 x 3,5 5 x 5,5 4,5 x 3,5 4 x 3 4,5 x 3,5 5 x 3,5 5 x 3

3 x 3,5 5 x 3,5 4,5 x 2,5 4 x 3,5 3 x 3,5 5 x 3 5,5 x 2,5 4 x 2,5 4 x 2,5 1,5 x 3 4 x 3 5 x 3 4 x 3,5 4 x 2,5 5 x 2,5

4,5 x 2,5 3,5 x 2,5 3,5 x 2 3 x 3.5 4 x 2,5 5,5 x 3,5 5 x 2,5 5 x 2,5 5 x 5,5 5 x 2 5 x 4 6 x 5 5 x 3,5 5 x 4 5 x 2,5

6 x4 4 x 3,5 5,5x2,5 4 x 3 3,5 x 2,5 4 x 1,5 5 x 2,5 5 x 2,5 5 x 2 5,5 x 2 4 x 3 4 x 1,5 5 x 2,5 5 x 4,5 4,5 x 2

5 x 2,5 3,5 x 2,5 6x2,5 5 x 3 4 x 2,5 4,5 x 1,5 5 x 3 5 x 3 3 x 2,5 5 x 2,5 5 x 3,5 3 x 1,5 5 x 3,5 4 x 3 5,5 x 2,5

3 x 2,5 4,5 x 3 ヵ×2,ヵ 5 x 3 4 x 2,5 4 x 1,5 5 x 3,5 5 x 2,5 3 x 2,5 4 x 1,5 4 x 3 5 x 4 5 x 2,5 4,5 x 3 5 x 2

6 x 3 4 x 2,5 ヴ,ヵ×2 5 x 3 5 x5,5 3,5 x 1,5 5 x 2,5 5 x 3,5 5 x 2,5 4 x 1,5 4 x 3 4 x 2 4 x 2,5 4,5 x 3 4,5 x 2

3 x 3,5 4,5 x 3 5x2,5 5 x 3 5 x 2,5 3 x 2,5 5 x 3,5 5 x 2,5 3 x 1,5 3 x 1,5 5 x 5 5 x 4 4,5 x 3,5 5 x 2 4,5 x 2

7,5 x 4 4,5 x 2,5 5x2 3,5 x 2 5 x3 3,5 x 2,5 5 x 2,5 5 x 2,5 3,5 x 2,5 5 x 2,5 4 x 3 4 x 2 5 x 3 5 x 3 5 x 2,5

5,5 x 5 5 x 3 ヵ,ヵ×2,ヵ 4 x 3 4,5 x 2,5 5,5 x 2,5 5 x 3 5 x 2,5 5 x 2,5 5 x 2,5 4 x 3,5 4 x 2 5 x 3,5 5 x 4 4,5 x 2,5

6x4 5 x 2,5 5x2,5 5 x 3 3,5 x 2,5 5 x 2,5 5 x 2 6 x 3 3,5 x 3 5 x 2 4,5 x 3,5 5 x 4 4 x 2,5 5 x 4,5 5 x 2,5

2,ヵ×ヱ,ヵ 4,5 x 3 ヴ,ヵ×2 5 x 1,5 4,5 x 2,5 5 x 1,5 4,5 x 2 6 x 5 3 x 1,5 5 x 2,5 5,5 x 4 5 x 4,5 5 x 2,5 3,5 x 3 5,5 x 2

6x5 3,5 x 2,5 ヴ,ヵ×2 4,5 x 3 3,5 x 2,5 5,5 x 1,5 4 x 2,5 5 x 2 5,5 x 1,5 5 x 3 5 x 4 5 x 4,5 5 x 2,5 5 x 4 5 x 2,5

ヴ,ヵ×2,ヵ 5 x 2,5 5x2,5 6 x 3 4 x 2,5 4,5 x 2,5 5 x 2,5 5 x 3 5,5 x 2 3 x 2 4 x 3 4,5 x 3,5 4,5 x 2 5 x 2 5,5 x 2,5

3x2,5 5 x 3,5 ヴ,ヵ×2,ヵ 3 x 3,5 4,5 x 2,5 4 x 1,5 5 x 2,5 5 x 2,5 3 x 1,5 4 x 2 5 x 4 4 x 3 4,5 x 3 5 x 2,5 5,5 x 2,5

5x2,5 4 x 3,5 ヴ,ヵ×2 6 x 3 5 x 3 5 x 3 4,5 x 2 4,5 x 2,5 5 x 1,5 4 x 1,5 5 x 4 4,5 x 2,5 5 x 2,5 5 x 2 5 x 2,5

4x3 3,5 x 3 5x2,5 4 x 3 5 x 3 5,5 x 3,5 5 x 2 4 x 2,5 5 x 1,5 5 x 2 3 x 3,5 4,5 x 3,5 5 x 3 5 x 2 5 x 2

5x3 4,5 x 4 ヵ,ヵ×2,ヵ 4 x 3 6 x 2,5 5 x 2,5 5 x 2,5 4 x 2 5 x 2,5 5 x 2,5 5 x 3,5 4 x 3,5 4,5 x 3 5 x 2,5 4 x 2

5x3 4 x 2,5 5x2,5 4,5 x 3 5 x 3 5,5 x 3,5 5 x 2 3 x 2 3,5 x 2,5 5 x 2 5 x 2,5 5 x 2 4 x 3,5 5 x 3 5 x 2

4x2,5 3,5 x 2,5 5x2 5 x 4 4 x 2 5 x 2,5 5 x 2,5 4,5 x 2 3,5 x 1,5 5 x 1,5 5 x 2,5 5 x 3,5 4,5 x 3,5 5 x 2,5 5 x 2

4x3 4,5 x 2,5 5x2 4 x 2,5 5 x 2,5 5 x 2,5 5 x 2 5 x 2,5 3 x 1,5 5 x 2,5 5 x 2,5 5 x 4,5 5 x 3 5 x 4,5 5,5 x 2

5x4 4 x 3,5 ヵ,ヵ×2,ヵ 6 x 3,5 6 x 2,5 5 x 2,5 5 x 2,5 3,5 x 2 5 x 4 5 x 2,5 4 x 3 5 x 3,5 4 x 3 5 x 4,5 4 x 2,5

5x2,5 4 x 2,5 5x2 6 x 3,5 6 x 3 4 x 2,5 5 x 3,5 4,5 x 2,5 5 x 2,5 5 x 2,5 5 x 4 5 x 4 4,5 x 3,5 5 x 3 5 x 2,5

5x3 4 x 3 5x2 4 x 3 5 x 3 3 x 2,5 5 x 2 3,5 x 2,5 5,5 x 3 5 x 2 5 x 3,5 5 x 2,5 5,5 x 2,5 5 x 2,5 5 x 2,5

5x4 4 x 3 ヴ,ヵ×2 4,5 x 3,5 3 x 2,5 3,5 x 2 5 x 2 4 x 2,5 5 x 2,5 5 x 2,5 3 x 2,5 5 x 2 5 x 2,5 5 x 2 4 x 2,5

4x2,5 4,5 x 2,5 5x2,5 4x 3 3 x 2 3,5 x 2 5 x 2,5 3 x 3,5 5 x 3,5 5 x 2,5 4 x 4,5 3 x 1,5 4,5 x 2,5 5 x 3,5 5 x 2,5

4x3 4 x 3 ヵ×2 3,5 x 3 3 x 2 5 x 2,5 5 x 3,5 5 x 2,5 5 x 2,5 5 x 2 6 x 5,5 5 x 2,5 5 x 2,5 5 x 2 5 x 2

4x3 3,5 x 2 5x2,5 4 x 3 5 x 2,5 6 x 2,5 5 x 2 5 x 2 4 x 2,5 5 x 2,5 3 x 3,5 3,5 x 1,5 5 x 1,5 5 x 2,5 5 x 22,5

5x2 4,5 x 3 5x2 4,5 x 2,5 5 x 2,5 5,5 x 2,5 5 x 2 3,5 x 2,5 4,5 x 1,5 4 x 2 5 x 4,5 3,5 x 1,5 5,5 x 2,5 5 x 2,5 5 x 2,5

3,5x2,5 4 x 3 5x2,5 4,5 x 2 3 x 2,5 3,5 x 2,5 5 x 2,5 3 x 2,5 4,5 x 1,5 5 x 2 4 x 2,5 3,5 x 1,5 5 x 2,5 5 x 2,5 5 x 2,5

3x2,5 3,5 x 3 ヵ,ヵ×2,ヵ 4 x 2 4 x 6 5,5 x 2,5 5 x 3 5 x 2 5 x 2,5 5 x 2 5 x 4,5 3,5 x 1,5 5,5 x 2 5 x 2 5 x 2

ヴ×ン 4 x 2,5 5x2 3 x 2 3 x 2,5 5 x 3,5 5 x 2,5 5,5 x 2 5 x 3 5 x 1,5 5 x 2,5 3,5 x 1,5 3,5 x 2 5 x 2 4 x 2,5

3,5 x 2,5 2,5 x 3 5x2 4 x 2 3 x 2 5 x 3 5 x 3 4 x 3,5 5 x 3,5 5 x 3 4 x 2,5 5 x 3 3 x 2,5 5 x 2 4 x 1,5

4 x 3,5 4,5 x 3 ヵ,ヵ×2 5 x 3 6 x 3 5 x 2 4,5 x 2 5 x 2,5 5 x 2 3 x 2,5 4 x 2,5 5 x 1,5 3 x 1,5 5 x 2 5 x 2,5

4,5 x 3 3,5 x 2,5 5x2,5 4 x 3 5 x 2,5 5 x 2,5 5 x 2 5,5 x 4,5 5 x 2 3 x 2 5 x 5,5 5 x 2,5 3 x 2 5 x 5,5 5 x 4

4 x 2,5 4,5 x 2 4,5 x 2,5 3 x 2 6 x 3,5 5 x 3 5 x 3 3 x 2,5 5 x 3,5 4 x 2 4 x 3 5 x 3 4,5 x 2 5 x 2 5 x 3,5

5 x 3 3,5 x 3 4 x 2,5 6 x 3 4 x 2,5 5 x 2,5 5 x 3,5 4,5 x 2 3,5 x 2 4,5 x 1,5 4 x 3 5,5 x 1,5 4 x 2,5 5,5 x 2,5 5 x 4,5

3,5 x 2,5 4 x 3,5 4,5 x 3 3,5 x 2,5 6 x 3 5,5 x 2,5 5 x 2,5 4 x 3,5 3 x 2,5 4 x 1,5 5 x 4 3 x 1,5 5 x 2,5 5 x 2 4,5 x 2,5

4 x 2 4,5 x 2 4,5 x 3 5,5 x 3 4 x 2,5 5,5 x 3 5 x 3 4,5 x 3,5 4,5 x 2 5 x 2,5 5 x 4 3 x 2,5 4,5 x 3 5 x 2 5,5 x 4,5

4,5 x 2,5 4 x 3,5 4,5 x 2,5 3,5 x 2 4,5 x 2,5 5 x 3,5 5 x 2 4,5 x 2 3 x 2 5 x 4 5 x 4 3 x 1,5 4,5 x 3 6 x 2 4,5 x 3,5

5 x 2,5 4 x 2,5 5,5 x 2 5 x 2,5 6,5 x 3 4 x 2,5 4 x 2,5 4 x 2,5 4,5 x 2 5 x 3,5 5 x 2 3 x 2 5 x 3 5 x 2,5 5,5 x 4

2,5 x 2 4,5 x 2,5 4 x 2,5 3,5 x 3 3 x 2,5 4,5 x 2,5 4,5 x 2,5 3 x 2,5 5 x 2,5 5 x 4,5 5 x 4 4 x 2,5 5 x 2,5 5 x 2,5 5 x 4

4 x 3,5 3 x 2,5 6 x 3 3 x 3,5 5 x 3 4 x 3 4 x 3 5,5 x 2 4,5 x 2,5 4,5 x 2,5 5 x 4 4 x 2,5 5 x 4,5 5 x 5,5 4 x 3

3 x 2 4 x 3,5 4 x 3 4,5 x 2 6 x 3 5 x 2,5 5 x 2,5 3 x 2,5 2 x 2,5 5,5 x 4,5 6 x 5 4 x 3,5 5 x 4,5 6 x 2 5 x 4

4,5 x 3,5 4,5 x 2,5 6 x 3,5 4 x 3 4,5 x 2,5 5 x 2 6 x 3 3,5 x 3 5 x 2 4,5 x 3,5 5 x 4 4 x 2,5 5 x 4,5 5 x 2,5 4,5 x 3,5

4,5 x 2 3,5 x 2,5 6,5 x 3,5 4 x 3 5 x 3 4,5 x 2 6 x 5 3 x 1,5 5 x 2,5 5,5 x 4 5 x 4,5 5 x 2,5 3,5 x 3 5,5 x 2 5,5 x 4

5 x 2,5 3,5 x 2 4,5 x 2 5x3,5 4 x 3 4 x 2,5 5 x 2 5,5 x 1,5 5 x 3 5 x 4 5 x 4,5 5 x 2,5 5 x 4 5 x 2,5 5 x 4

4,5 x 2 3 x 2,5 6 x 3,5 2x4,5 3 x 3,5 5 x 2,5 5 x 3 5,5 x 2 3 x 2 4 x 3 4,5 x 3,5 4,5 x 2 5 x 2 5,5 x 2,5 4 x 3

4 x 2,5 4 x 3 4,5 x 3 3x5,5 6,5 x 2 5 x 2,5 5 x 2,5 3 x 1,5 4 x 2 5 x 4 4 x 3 4,5 x 3 5 x 2,5 5,5 x 2,5 5 x 4



4,5 x 3 4 x 3 3,5 x 2,5 3x4 4 x 3 5 x 2 6 x 3 3,5 x 3 5 x 2 4,5 x 3,5 5 x 4 4 x 2,5 5 x 4,5 5 x 2,5 5,5 x 1,5

3,5 x 2 5 x 4 4 x 2 3x4 4 x 2,5 4,5 x 2 6 x 5 3 x 1,5 5 x 2,5 5,5 x 4 3,5 x 2 3,5 x 3 5 x 3 4,5 x 2 3 x 1,5

5 x 3 3,5 x 2,5 4 x 2 2,5x5 6 x 3 4 x 2,5 5 x 2 5,5 x 1,5 5 x 3 5 x 4 3 x 2,5 5 x 4 5 x 1,5 4 x 2,5 5 x 4,5

4 x 3 5 x 2,5 5 x 2,5 3x5 4 x 3 5 x 2,5 5 x 3 5,5 x 2 3 x 2 4 x 3 3 x 1,5 5 x 2 5 x 2,5 5 x 2,5 5 x 2

4,5 x 2,5 5 x 2,5 4 x 3 ン,ヵ×ヵ 4,5 x 3 5 x 2,5 5 x 2,5 3 x 1,5 4 x 2 5 x 4 3 x 2 5 x 2,5 5 x 3 4,5 x 3 5 x 2

5x2 4 x 3 5 x 3 3 x 2,5 5 x 2 3,5 x 2,5 5,5 x 3 5 x 2 5 x 3,5 5 x 2,5 5,5 x 2,5 5 x 2,5 6 x 3 5 x 2,5 5 x 2,5

ヴ,ヵ×2 4,5 x 3,5 3 x 2,5 3,5 x 2 5 x 2 4 x 2,5 5 x 2,5 5 x 2,5 3 x 2,5 5 x 2 5 x 2,5 5 x 2 4,5 x 2,5 5 x 2 6 x 3

5x2,5 4x 3 3 x 2 3,5 x 2 5 x 2,5 3 x 3,5 5 x 3,5 5 x 2,5 4 x 4,5 3 x 1,5 4,5 x 2,5 5 x 3,5 5 x 3 4,5 x 2 6 x 5

ヵ×2 3,5 x 3 3 x 2 5 x 2,5 5 x 3,5 5 x 2,5 5 x 2,5 5 x 2 6 x 5,5 5 x 2,5 5 x 2,5 5 x 2 4 x 3 4 x 2,5 5 x 2

5x2,5 4 x 3 5 x 2,5 6 x 2,5 5 x 2 5 x 2 4 x 2,5 5 x 2,5 3 x 3,5 3,5 x 1,5 5 x 1,5 5 x 2,5 3 x 3,5 5 x 2,5 5 x 3

5x2 4,5 x 2,5 5 x 2,5 5,5 x 2,5 5 x 2 3,5 x 2,5 4,5 x 1,5 4 x 2 5 x 4,5 3,5 x 1,5 5,5 x 2,5 5 x 2,5 6,5 x 2 5 x 2,5 5 x 2,5

5x2,5 4,5 x 2 3 x 2,5 3,5 x 2,5 5 x 2,5 3 x 2,5 4,5 x 1,5 5 x 2 4 x 2,5 3,5 x 1,5 5 x 2,5 5 x 2,5 4 x 3 5 x 2 6 x 3

ヵ,ヵ×2,ヵ 4 x 2 4 x 6 5,5 x 2,5 5 x 3 5 x 2 5 x 2,5 5 x 2 5 x 4,5 3,5 x 1,5 5,5 x 2 5 x 2 4 x 2,5 4,5 x 2 6 x 5

5x2 3 x 2 3 x 2,5 5 x 3,5 5 x 2,5 5,5 x 2 5 x 3 5 x 1,5 5 x 2,5 3,5 x 1,5 3,5 x 2 5 x 2 6 x 3 4 x 2,5 5 x 2

5x2 4 x 2 3 x 2 5 x 3 5 x 3 4 x 3,5 5 x 3,5 5 x 3 4 x 2,5 5 x 3 3 x 2,5 5 x 2 4 x 3 5 x 2,5 5 x 3

ヵ,ヵ×2 5 x 3 6 x 3 5 x 2 4,5 x 2 5 x 2,5 5 x 2 3 x 2,5 4 x 2,5 5 x 1,5 3 x 1,5 5 x 2 4,5 x 3 5 x 2,5 5 x 2,5

5x2,5 4 x 3 5 x 2,5 5 x 2,5 5 x 2 5,5 x 4,5 5 x 2 3 x 2 5 x 5,5 5 x 2,5 3 x 2 5 x 5,5 5 x 2 3,5 x 2,5 5,5 x 3

4,5 x 2,5 3 x 2 6 x 3,5 5 x 3 5 x 3 3 x 2,5 5 x 3,5 4 x 2 4 x 3 5 x 3 4,5 x 2 5 x 2 5 x 2 4 x 2,5 5 x 2,5

4 x 2,5 6 x 3 4 x 2,5 5 x 2,5 5 x 3,5 4,5 x 2 3,5 x 2 4,5 x 1,5 4 x 3 5,5 x 1,5 4 x 2,5 5,5 x 2,5 5 x 2,5 3 x 3,5 5 x 3,5

4,5 x 3 3,5 x 2,5 6 x 3 5,5 x 2,5 5 x 2,5 4 x 3,5 3 x 2,5 4 x 1,5 5 x 4 3 x 1,5 5 x 2,5 5 x 2 5 x 3,5 5 x 2,5 5 x 2,5

4,5 x 3 5,5 x 3 4 x 2,5 5,5 x 3 5 x 3 4,5 x 3,5 4,5 x 2 5 x 2,5 5 x 4 3 x 2,5 4,5 x 3 5 x 2 5 x 2 5 x 2 4 x 2,5

4,5 x 2,5 3,5 x 2 4,5 x 2,5 5 x 3,5 5 x 2 4,5 x 2 3 x 2 5 x 4 5 x 4 3 x 1,5 4,5 x 3 6 x 2 5 x 2 3,5 x 2,5 4,5 x 1,5

5,5 x 2 5 x 2,5 6,5 x 3 4 x 2,5 4 x 2,5 4 x 2,5 4,5 x 2 5 x 3,5 5 x 2 3 x 2 5 x 3 5 x 2,5 5 x 2,5 3 x 2,5 4,5 x 1,5

4 x 2,5 3,5 x 3 3 x 2,5 4,5 x 2,5 4,5 x 2,5 3 x 2,5 5 x 2,5 5 x 4,5 5 x 4 4 x 2,5 5 x 2,5 5 x 2,5 5 x 3 5 x 2 5 x 2,5

6 x 3 3 x 3,5 5 x 3 4 x 3 4 x 3 5,5 x 2 4,5 x 2,5 4,5 x 2,5 5 x 4 4 x 2,5 5 x 4,5 5 x 5,5 5 x 2,5 5,5 x 2 5 x 3

4 x 3 4,5 x 2 6 x 3 5 x 2,5 5 x 2,5 3 x 2,5 2 x 2,5 5,5 x 4,5 6 x 5 4 x 3,5 5 x 4,5 6 x 2 5 x 3 4 x 3,5 5 x 3,5

6 x 3,5 4 x 3 4,5 x 2,5 5 x 2 6 x 3 3,5 x 3 5 x 2 4,5 x 3,5 5 x 4 4 x 2,5 5 x 4,5 5 x 2,5 4,5 x 2 5 x 2,5 5 x 2

6,5 x 3,5 4 x 3 5 x 3 4,5 x 2 6 x 5 3 x 1,5 5 x 2,5 5,5 x 4 5 x 4,5 5 x 2,5 3,5 x 3 5,5 x 2 5 x 2 5,5 x 4,5 5 x 2

4,5 x 2 5x3,5 4 x 3 4 x 2,5 5 x 2 5,5 x 1,5 5 x 3 5 x 4 5 x 4,5 5 x 2,5 5 x 4 5 x 2,5 5 x 3 3 x 2,5 5 x 3,5

6 x 3,5 2x4,5 3 x 3,5 5 x 2,5 5 x 3 5,5 x 2 3 x 2 4 x 3 4,5 x 3,5 4,5 x 2 5 x 2 5,5 x 2,5 5 x 3,5 4,5 x 2 3,5 x 2

4,5 x 3 3x5,5 6,5 x 2 5 x 2,5 5 x 2,5 3 x 1,5 4 x 2 5 x 4 4 x 3 4,5 x 3 5 x 2,5 5,5 x 2,5 5 x 2,5 4 x 3,5 3 x 2,5

3,5 x 2,5 3x4 4 x 3 5 x 2 6 x 3 3,5 x 3 5 x 2 4,5 x 3,5 5 x 4 4 x 2,5 5 x 4,5 5 x 2,5 5 x 3 4,5 x 3,5 4,5 x 2

4 x 2 3x4 4 x 2,5 4,5 x 2 6 x 5 3 x 1,5 5 x 2,5 5,5 x 4 3,5 x 2 3,5 x 3 5 x 3 4,5 x 2 5 x 2 4,5 x 2 3 x 2

5 x 2,5 5 x 2 5,5 x 4,5 5 x 2 3 x 2 5 x 5,5 5 x 2,5 3 x 2 3 x 2 5 x 2,5 5 x 2 6 x 5,5 4 x 2,5 4 x 2,5 4,5 x 2

5 x 3 5 x 3 3 x 2,5 5 x 3,5 4 x 2 4 x 3 5 x 3 4,5 x 2 4,5 x 2 4 x 2,5 5 x 2,5 3 x 3,5 4,5 x 2,5 3 x 2,5 5 x 2,5

5 x 2,5 5 x 3,5 4,5 x 2 3,5 x 2 4,5 x 1,5 4 x 3 5,5 x 1,5 4 x 2,5 4 x 2,5 4,5 x 1,5 4 x 2 5 x 4,5 3,5 x 1,5 5 x 5,5 5 x 2,5

5,5 x 2,5 5 x 2,5 4 x 3,5 3 x 2,5 4 x 1,5 5 x 4 3 x 1,5 5 x 2,5 5 x 2,5 4,5 x 1,5 5 x 2 4 x 2,5 3,5 x 1,5 4 x 3 5 x 3

5,5 x 3 5 x 3 4,5 x 3,5 4,5 x 2 5 x 2,5 5 x 4 3 x 2,5 4,5 x 3 4,5 x 3 5 x 2,5 5 x 2 5 x 4,5 3,5 x 1,5 4 x 3 5,5 x 1,5

5 x 3,5 5 x 2 4,5 x 2 3 x 2 5 x 4 5 x 4 3 x 1,5 4,5 x 3 4,5 x 3 5 x 3 5 x 1,5 5 x 2,5 3,5 x 1,5 5 x 4 3 x 1,5

4 x 2,5 4 x 2,5 4 x 2,5 4,5 x 2 5 x 3,5 5 x 2 3 x 2 5 x 3 5 x 3 5 x 3,5 5 x 3 4 x 2,5 5 x 3 5 x 4 3 x 2,5

4,5 x 2,5 4,5 x 2,5 3 x 2,5 5 x 2,5 5 x 4,5 5 x 4 4 x 2,5 5 x 2,5 5 x 2,5 5 x 2 3 x 2,5 4 x 2,5 5 x 1,5 5 x 4 3 x 1,5

4 x 3 4 x 3 5,5 x 2 4,5 x 2,5 4,5 x 2,5 5 x 4 4 x 2,5 5 x 4,5 5 x 4,5 5 x 2 3 x 2 5 x 5,5 5 x 2,5 5 x 2 3 x 2

5 x 2,5 5 x 2,5 3 x 2,5 2 x 2,5 5,5 x 4,5 6 x 5 4 x 3,5 5 x 4,5 5 x 4,5 5 x 3,5 4 x 2 4 x 3 5 x 3 5 x 4 4 x 2,5

5 x 2 6 x 3 3,5 x 3 5 x 2 4,5 x 3,5 5 x 4 4 x 2,5 5 x 4,5 5 x 4,5 3,5 x 2 4,5 x 1,5 4 x 3 5,5 x 1,5 5 x 4 4 x 2,5

4,5 x 2 6 x 5 3 x 1,5 5 x 2,5 5,5 x 4 5 x 4,5 5 x 2,5 3,5 x 3 3,5 x 3 3 x 2,5 4 x 1,5 5 x 4 3 x 1,5 6 x 5 4 x 3,5

4 x 2,5 5 x 2 5,5 x 1,5 5 x 3 5 x 4 5 x 4,5 5 x 2,5 5 x 4 5 x 4 4,5 x 2 5 x 2,5 5 x 4 3 x 2,5 5,5 x 1,5 4 x 2,5

5 x 2,5 5 x 3 5,5 x 2 3 x 2 4 x 3 4,5 x 3,5 4,5 x 2 5 x 2 5 x 2 3 x 2 5 x 4 5 x 4 3 x 1,5 3 x 1,5 5 x 2,5

5 x 2,5 5 x 2,5 3 x 1,5 4 x 2 5 x 4 4 x 3 4,5 x 3 5 x 2,5 5 x 2,5 4,5 x 2 5 x 3,5 5 x 2 3 x 2 5 x 5,5 5 x 2,5

5 x 2 6 x 3 3,5 x 3 5 x 2 4,5 x 3,5 5 x 4 4 x 2,5 5 x 4,5 5 x 4,5 5 x 2,5 5 x 4,5 5 x 4 4 x 2,5 4 x 3 5 x 3

6 x 3 3,5 x 3 5 x 2 4,5 x 3,5 4,5 x 1,5 4 x 3 5,5 x 1,5 4 x 2,5 5,5 x 2,5 4,5 x 2,5 4,5 x 2,5 5 x 4 4 x 2,5 4 x 3 5,5 x 1,5

6 x 5 3 x 1,5 5 x 2,5 5,5 x 4 4 x 1,5 5 x 4 3 x 1,5 5 x 2,5 5 x 2 2 x 2,5 5,5 x 4,5 6 x 5 4 x 3,5 5 x 4 3 x 1,5

5 x 2 5,5 x 1,5 5 x 3 5 x 4 5 x 2,5 5 x 4 3 x 2,5 4,5 x 3 5 x 2 5 x 3 4,5 x 3,5 4,5 x 2 5 x 2,5 5 x 4 3 x 2,5

5 x 3 5,5 x 2 3 x 2 4 x 3 5 x 4 5 x 4 3 x 1,5 4,5 x 3 6 x 2 5 x 2 4,5 x 2 3 x 2 5 x 4 5 x 4 3 x 1,5

5 x 2,5 3 x 1,5 4 x 2 5 x 4 5 x 3,5 5 x 2 3 x 2 5 x 3 5 x 2,5 4 x 2,5 4 x 2,5 4,5 x 2 5 x 3,5 5 x 2 3 x 2

6 x 3 3,5 x 3 5 x 2 4,5 x 3,5 5 x 4,5 5 x 4 4 x 2,5 5 x 2,5 5 x 2,5 4,5 x 2,5 3 x 2,5 5 x 2,5 5 x 4,5 5 x 4 4 x 2,5

6 x 5 3 x 1,5 5 x 2,5 5,5 x 4 4,5 x 2,5 5 x 4 4 x 2,5 5 x 4,5 5 x 5,5 4 x 3 5,5 x 2 4,5 x 2,5 4,5 x 2,5 5 x 4 4 x 2,5

3 x 2 5 x 5,5 5 x 2,5 3 x 2 5,5 x 4,5 6 x 5 4 x 3,5 5 x 4,5 6 x 2 5 x 2,5 3 x 2,5 2 x 2,5 5,5 x 4,5 6 x 5 4 x 3,5



4 x 2 4 x 3 5 x 3 4,5 x 2 4,5 x 3,5 5 x 4 4 x 2,5 5 x 4,5 5 x 2,5 6 x 3 3,5 x 3 5 x 2 4,5 x 3,5 5 x 4 4 x 2,5

4,5 x 1,5 4 x 3 5,5 x 1,5 4 x 2,5 5,5 x 4 5 x 4,5 5 x 2,5 3,5 x 3 5,5 x 2 6 x 5 3 x 1,5 5 x 2,5 5,5 x 4 5 x 4,5 5 x 2,5

4 x 1,5 5 x 4 3 x 1,5 5 x 2,5 5 x 2 4,5 x 3,5 4,5 x 1,5 4 x 3 5,5 x 1,5 5 x 2 5,5 x 1,5 5 x 3 5 x 4 5 x 4,5 5 x 2,5

5 x 2,5 5 x 4 3 x 2,5 4,5 x 3 5 x 2,5 5,5 x 4 4 x 1,5 5 x 4 3 x 1,5 5 x 3 5,5 x 2 3 x 2 4 x 3 4,5 x 3,5 4,5 x 2

5 x 4 5 x 4 3 x 1,5 4,5 x 3 5 x 3 5 x 4 5 x 2,5 5 x 4 3 x 2,5 5 x 2,5 3 x 1,5 4 x 2 5 x 4 4 x 3 4,5 x 3

5 x 3,5 5 x 2 3 x 2 5 x 3 3 x 2 4 x 3 5 x 4 5 x 4 3 x 1,5 6 x 3 3,5 x 3 5 x 2 4,5 x 3,5 5 x 4 4 x 2,5

5 x 4,5 5 x 4 4 x 2,5 5 x 2,5 6 x 5 3 x 1,5 5 x 2,5 5,5 x 4 4,5 x 2,5 5 x 4 4 x 2,5 5 x 4,5 5 x 5,5 4 x 3 5,5 x 2

4 x 1,5 3 x 2,5 5 x 2,5 5 x 3 4,5 x 3,5 4 x 2 3,5 x 2 4,5 x 2 4,5 x 3,5 4,5 x 3,5 5 x 2 4,5 x 3 5 x 1,5 5 x 2,5 5 x 5,5

3 x 1,5 3 x 2 5 x 2 5 x 2,5 4 x 3 4 x 1,5 5,5x2,5 4 x 2,5 4 x 3 5,5 x 4 5 x 2,5 4,5 x 3 5 x 3 5 x 3 4 x 3

5 x 2,5 4 x 2 5 x 2,5 5 x 4,5 5 x 4 5 x 2 6x2,5 5 x 2,5 5 x 4 3 x 2 5 x 2,5 5 x 2,5 5 x 4,5 3 x 2 4 x 3

5 x 2,5 4,5 x 1,5 4 x 2 5 x 4 5 x 4 5 x 2,5 ヵ×2,ヵ 4,5 x 3 4,5 x 3,5 5 x 2 5 x 4 5 x 4 5 x 1,5 5x2,5 5 x 4

5 x 2 3,5 x 2,5 5 x 2 6 x 5 6 x 5 5 x 2 ヴ,ヵ×2 4,5 x 3 5,5 x 4 5 x 4,5 5 x 4,5 5 x 2,5 5x2 5 x 2,5 5 x 4

5 x 4 5 x 4,5 5 x 4,5 5 x 2,5 4 x 2,5 5 x 4,5 5 x 4 4 x 3 5 x 3 4,5 x 2,5 4 x 2,5 5 x 2,5 5,5 x 2 5x2 4,5 x 1,5

4,5 x 2 3 x 2 5 x 4 5 x 4 3 x 1,5 4,5 x 3 4,5 x 3 5 x 3 5 x 1,5 5 x 2,5 5 x 2,5 5 x 2 5,5 x 4,5 5 x 2 3 x 2

4 x 2,5 4,5 x 2 5 x 3,5 5 x 2 3 x 2 5 x 3 5 x 3 5 x 3,5 5 x 3 4 x 2,5 5 x 3 5 x 3 3 x 2,5 5 x 3,5 4 x 2

3 x 2,5 5 x 2,5 5 x 4,5 5 x 4 4 x 2,5 5 x 2,5 5 x 2,5 5 x 2 3 x 2,5 4 x 2,5 5 x 2,5 5 x 3,5 4,5 x 2 3,5 x 2 4,5 x 1,5

5,5 x 2 4,5 x 2,5 4,5 x 2,5 5 x 4 4 x 2,5 5 x 4,5 5 x 4,5 5 x 2 3 x 2 5 x 5,5 5,5 x 2,5 5 x 2,5 4 x 3,5 3 x 2,5 4 x 1,5

3 x 2,5 2 x 2,5 5,5 x 4,5 6 x 5 4 x 3,5 5 x 4,5 5 x 4,5 5 x 3,5 4 x 2 4 x 3 5,5 x 3 5 x 3 4,5 x 3,5 4,5 x 2 5 x 2,5

3,5 x 3 5 x 2 4,5 x 3,5 5 x 4 4 x 2,5 5 x 4,5 5 x 4,5 3,5 x 2 4,5 x 1,5 4 x 3 5 x 3,5 5 x 2 4,5 x 2 3 x 2 5 x 4

3 x 1,5 5 x 2,5 5,5 x 4 5 x 4,5 5 x 2,5 3,5 x 3 3,5 x 3 3 x 2,5 4 x 1,5 5 x 4 4 x 2,5 4 x 2,5 4 x 2,5 4,5 x 2 5 x 3,5

5,5 x 1,5 5 x 3 5 x 4 5 x 4,5 5 x 2,5 5 x 4 5 x 4 4,5 x 2 5 x 2,5 5 x 4 4,5 x 2,5 4,5 x 2,5 3 x 2,5 5 x 2,5 5 x 4,5

5,5 x 2 3 x 2 4 x 3 4,5 x 3,5 4,5 x 2 5 x 2 5 x 2 3 x 2 5 x 4 5 x 4 4 x 3 4 x 3 5,5 x 2 4,5 x 2,5 4,5 x 2,5

3 x 1,5 4 x 2 5 x 4 4 x 3 4,5 x 3 5 x 2,5 5 x 2,5 4,5 x 2 5 x 3,5 5 x 2 5 x 2,5 5 x 2,5 3 x 2,5 2 x 2,5 5,5 x 4,5

3,5 x 3 5 x 2 4,5 x 3,5 5 x 4 4 x 2,5 5 x 4,5 5 x 4,5 5 x 2,5 5 x 4,5 5 x 4 5 x 2 6 x 3 3,5 x 3 5 x 2 4,5 x 3,5

5 x 2 4,5 x 3,5 4,5 x 1,5 4 x 3 5,5 x 1,5 4 x 2,5 5,5 x 2,5 4,5 x 2,5 4,5 x 2,5 5 x 4 4,5 x 2 6 x 5 3 x 1,5 5 x 2,5 5,5 x 4

5 x 2,5 5,5 x 4 4 x 1,5 5 x 4 3 x 1,5 5 x 2,5 5 x 2 2 x 2,5 5,5 x 4,5 6 x 5 4 x 2,5 5 x 2 5,5 x 1,5 5 x 3 5 x 4

5 x 3 5 x 4 5 x 2,5 5 x 4 3 x 2,5 4,5 x 3 5 x 2 5 x 3 4,5 x 3,5 4,5 x 2 5 x 2,5 5 x 3 5,5 x 2 3 x 2 4 x 3

3 x 2 4 x 3 5 x 4 5 x 4 3 x 1,5 4,5 x 3 6 x 2 5 x 2 4,5 x 2 3 x 2 5 x 2,5 5 x 2,5 3 x 1,5 4 x 2 5 x 4

4 x 2 5 x 4 5 x 3,5 5 x 2 3 x 2 5 x 3 5 x 2,5 4 x 2,5 4 x 2,5 4,5 x 2 5 x 2 6 x 3 3,5 x 3 5 x 2 4,5 x 3,5

5 x 2 4,5 x 3,5 5 x 4,5 5 x 4 4 x 2,5 5 x 2,5 5 x 2,5 4,5 x 2,5 3 x 2,5 5 x 2,5 4,5 x 2 6 x 5 3 x 1,5 5 x 2,5 5,5 x 4

5 x 2,5 5,5 x 4 4,5 x 2,5 5 x 4 4 x 2,5 5 x 4,5 5 x 5,5 4 x 3 5,5 x 2 4,5 x 2,5 5 x 2 3 x 2 5 x 5,5 5 x 2,5 3 x 2

5 x 2,5 3 x 2,5 4,5 x 1,5 5 x 2 4 x 2,5 3,5 x 1,5 5 x 2,5 5 x 2,5 5,5 x 4,5 6 x 5 5 x 3,5 4 x 2 4 x 3 5 x 3 4,5 x 2

5 x 3 5 x 2 5 x 2,5 5 x 2 5 x 4,5 3,5 x 1,5 5,5 x 2 5 x 2 4,5 x 3,5 4,5 x 2 3,5 x 2 4,5 x 1,5 4 x 3 5,5 x 1,5 4 x 2,5

5 x 2,5 5,5 x 2 5 x 3 5 x 1,5 5 x 2,5 3,5 x 1,5 3,5 x 2 5 x 2 5 x 5,5 5 x 2,5 3 x 2 5 x 5,5 5 x 2 3,5 x 2,5 5 x 5,5

5 x 3 4 x 3,5 5 x 3,5 5 x 3 4 x 2,5 5 x 3 3 x 2,5 5 x 2 4 x 3 5 x 3 4,5 x 2 5 x 2 5 x 2 4 x 2,5 4 x 3

4,5 x 2 5 x 2,5 5 x 2 3 x 2,5 4 x 2,5 5 x 1,5 3 x 1,5 5 x 2 4 x 3 5,5 x 1,5 4 x 2,5 5,5 x 2,5 5 x 2,5 3 x 3,5 4 x 3

5 x 2 5,5 x 4,5 5 x 2 3 x 2 5 x 5,5 5 x 2,5 3 x 2 5 x 5,5 5 x 4 3 x 1,5 5 x 2,5 5 x 2 5 x 3,5 5 x 2,5 5 x 4

5 x 3 3 x 2,5 5 x 3,5 4 x 2 4 x 3 5 x 3 4,5 x 2 5 x 2 5 x 4 3 x 2,5 4,5 x 3 5 x 2 5 x 2 5 x 2 5 x 4

5 x 3,5 4,5 x 2 3,5 x 2 4,5 x 1,5 4 x 3 5,5 x 1,5 4 x 2,5 5,5 x 2,5 5 x 4 3 x 1,5 4,5 x 3 6 x 2 5 x 2 3,5 x 2,5 5 x 4

5 x 2,5 4 x 3,5 3 x 2,5 4 x 1,5 5 x 4 3 x 1,5 5 x 2,5 5 x 2 5 x 2 3 x 2 5 x 3 5 x 2,5 5 x 2,5 3 x 2,5 5 x 2

5 x 3 4,5 x 3,5 4,5 x 2 5 x 2,5 5 x 4 3 x 2,5 4,5 x 3 5 x 2 5 x 4 4 x 2,5 5 x 2,5 5 x 2,5 5 x 3 5 x 2 5 x 4

5 x 2 4,5 x 2 3 x 2 5 x 4 5 x 4 3 x 1,5 4,5 x 3 6 x 2 5 x 4 4 x 2,5 5 x 4,5 5 x 5,5 5 x 2,5 5,5 x 2 5 x 4

4 x 2,5 4 x 2,5 4,5 x 2 5 x 3,5 5 x 2 3 x 2 5 x 3 5 x 2,5 6 x 5 4 x 3,5 5 x 4,5 6 x 2 5 x 3 4 x 3,5 5 x 5,5

4,5 x 2,5 3 x 2,5 5 x 2,5 5 x 4,5 5 x 4 4 x 2,5 5 x 2,5 5 x 2,5 5 x 4 4 x 2,5 5 x 4,5 5 x 2,5 4,5 x 2 5 x 2,5 3 x 1,5

4 x 3 5,5 x 2 4,5 x 2,5 4,5 x 2,5 5 x 4 4 x 2,5 5 x 4,5 5 x 5,5 5 x 4,5 5 x 2,5 3,5 x 3 5,5 x 2 5 x 2 5,5 x 4,5 3,5 x 3

5 x 2,5 3 x 2,5 2 x 2,5 5,5 x 4,5 6 x 5 4 x 3,5 5 x 4,5 6 x 2 5 x 4,5 5 x 2,5 5 x 4 5 x 2,5 5 x 3 3 x 2,5 3 x 1,5

6 x 3 3,5 x 3 5 x 2 4,5 x 3,5 5 x 4 4 x 2,5 5 x 4,5 5 x 2,5 4,5 x 3,5 4,5 x 2 5 x 2 5,5 x 2,5 5 x 3,5 4,5 x 2 5 x 5,5

6 x 5 3 x 1,5 5 x 2,5 5,5 x 4 5 x 4,5 5 x 2,5 3,5 x 3 5,5 x 2 4 x 3 4,5 x 3 5 x 2,5 5,5 x 2,5 5 x 2,5 4 x 3,5 4 x 3

5 x 2 5,5 x 1,5 5 x 3 5 x 4 5 x 4,5 5 x 2,5 5 x 4 5 x 2,5 5 x 4 4 x 2,5 5 x 4,5 5 x 2,5 5 x 3 4,5 x 3,5 4 x 3

5 x 3 5,5 x 2 3 x 2 4 x 3 4,5 x 3,5 4,5 x 2 5 x 2 5,5 x 2,5 3,5 x 2 3,5 x 3 5 x 3 4,5 x 2 5 x 2 4,5 x 2 5 x 2

5 x 2,5 3 x 1,5 4 x 2 5 x 4 4 x 3 4,5 x 3 5 x 2,5 5,5 x 2,5 3 x 2 5 x 2,5 5 x 2 6 x 5,5 4 x 2,5 4 x 2,5 5 x 2

6 x 3 3,5 x 3 5 x 2 4,5 x 3,5 5 x 4 4 x 2,5 5 x 4,5 5 x 2,5 4,5 x 2 4 x 2,5 5 x 2,5 3 x 3,5 4,5 x 2,5 3 x 2,5 5 x 2,5

6 x 5 3 x 1,5 5 x 2,5 5,5 x 4 3,5 x 2 3,5 x 3 5 x 3 4,5 x 2 4 x 2,5 4,5 x 1,5 4 x 2 5 x 4,5 3,5 x 1,5 5 x 5,5 5 x 3,5

3 x 2 5 x 5,5 5 x 2,5 3 x 2 3 x 2 5 x 2,5 5 x 2 6 x 5,5 4,5 x 3,5 5 x 4 4 x 2,5 5 x 4,5 5 x 2,5 4,5 x 3,5 5 x 4,5

4 x 2 4 x 3 5 x 3 4,5 x 2 4,5 x 2 4 x 2,5 5 x 2,5 3 x 3,5 5,5 x 4 5 x 4,5 5 x 2,5 3,5 x 3 5,5 x 2 4 x 3 4,5 x 3

4,5 x 1,5 4 x 3 5,5 x 1,5 4 x 2,5 4 x 2,5 4,5 x 1,5 4 x 2 5 x 4,5 5 x 4 5 x 4,5 5 x 2,5 5 x 4 5 x 2,5 5 x 4 4 x 2,5

4 x 1,5 5 x 4 3 x 1,5 5 x 2,5 5 x 2,5 4,5 x 1,5 5 x 2 4 x 2,5 4 x 3 4,5 x 3,5 4,5 x 2 5 x 2 5,5 x 2,5 3,5 x 2 3,5 x 3



5 x 2,5 5 x 4 3 x 2,5 4,5 x 3 4,5 x 3 5 x 2,5 5 x 2 5 x 4,5 5 x 2 4 x 3 3,5 x 3 4 x 3 5 x 5,5 5 x 2,5 5 x 2

5 x 4 5 x 4 3 x 1,5 4,5 x 3 4,5 x 3 5 x 3 5 x 1,5 5 x 2,5 3 x 1,5 4 x 3 3 x 1,5 5 x 2 4 x 3 5 x 3,5

3,5 x 3 5 x 2 4,5 x 3,5 5 x 4 4 x 2,5 5 x 4,5 5 x 2,5 4,5 x 3,5 4,5 x 2 5 x 2 5,5 x 2,5 5 x 3,5 4,5 x 2 5 x 5,5



Lampiran 5

GAMBAR ALAT

Gambar 1. Saffranin Kristal Violet

Gambar 2 Papanicolaou



Gambar 3 Diffquik

Gambar 4 Mikrometer Okular



Lampiran 6

GAMBAR HASIL PEWARNAAN



\









NPar Tests Kruskal-Wallis Test

Ranks

Metode pewarnaan N Mean Rank

Panjang rata-rata Diffquick 90 191.71


Safranin 90 129.76

Total 270

Test Statisticsa,b

Panjang rata-rata

Chi-Square 84.741

df 2

Asymp. Sig. .000

a. Kruskal Wallis Test

b. Grouping Variable: Metode pewarnaan

NPar Tests Mann-Whitney Test

Ranks

Metode pewarnaan N Mean Rank Sum of Ranks

Panjang rata-rata Diffquick 90 122.89 11060.50

Papanicolaou 90 58.11 5229.50

Total 180

Test Statisticsa

Panjang rata-rata

Mann-Whitney U 1134.500

Wilcoxon W 5229.500

Z -8.342

Asymp. Sig. (2-tailed) .000

a. Grouping Variable: Metode pewarnaan


Ranks


Panjang rata-rata Diffquick 90 114.32 10288.50

Safranin 90 66.68 6001.50

Total 180

Test Statisticsa

Panjang rata-rata




Wilcoxon W 6001.500

Z -6.133




Ranks


Panjang rata-rata Papanicolaou 90 72.42 6518.00

Safranin 90 108.58 9772.00

Total 180

Test Statisticsa

Panjang rata-rata


Wilcoxon W 6518.000

Z -4.656



Oneway

Descriptives

Lebar rata-rata

N Mean Std.

Deviation Std. Error

95% Confidence Interval for Mean

Minimum Maximum Lower

Bound Upper Bound

Diffquick 90 2.9670 .40620 .04282 2.8820 3.0521 2.13 4.19

Papanicolaou 90 2.5348 .30688 .03235 2.4706 2.5991 1.97 3.48

Safranin 90 2.6971 .34872 .03676 2.6241 2.7702 2.10 3.76

Total 270 2.7330 .39734 .02418 2.6854 2.7806 1.97 4.19

Test of Homogeneity of Variances

Lebar rata-rata

Levene Statistic df1 df2 Sig.

4.487 2 267 .012

ANOVA

Lebar rata-rata

Sum of Squares df Mean Square F Sig.

Between Groups 8.580 2 4.290 33.801 .000

Within Groups 33.889 267 .127

Total 42.470 269

Robust Tests of Equality of Means



Lebar rata-rata

Statistica df1 df2 Sig.

Brown-Forsythe 33.801 2 253.618 .000

a. Asymptotically F distributed.

Post Hoc Tests

Multiple Comparisons

Lebar rata-rata Games-Howell

(I) Metode pewarnaan

(J) Metode pewarnaan

Mean Difference (I-J) Std. Error Sig.

95% Confidence Interval

Lower Bound Upper Bound

Diffquick Papanicolaou .43222* .05366 .000 .3053 .5591

Safranin .26991* .05643 .000 .1365 .4033

Papanicolaou Diffquick -.43222* .05366 .000 -.5591 -.3053

Safranin -.16231* .04897 .003 -.2781 -.0466

Safranin Diffquick -.26991* .05643 .000 -.4033 -.1365

Papanicolaou .16231* .04897 .003 .0466 .2781

*. The mean difference is significant at the 0.05 level.


Ranks


% Panjang normal Diffquick 90 103.04


Safranin 90 154.99

Total 270

% Lebar normal Diffquick 90 148.52


Safranin 90 146.01

Total 270

% Normal Diffquick 90 119.06


Safranin 90 157.31

Total 270

Test Statisticsa,b

% Panjang normal % Lebar normal % Normal

Chi-Square 23.675 12.322 11.455

df 2 2 2

Asymp. Sig. .000 .002 .003




Ranks




% Panjang normal Diffquick 90 77.69 6992.00


Total 180

% Lebar normal Diffquick 90 103.28 9295.50


Total 180

% Normal Diffquick 90 87.75 7897.50


Total 180

Test Statisticsa


Mann-Whitney U 2897.000 2899.500 3802.500

Wilcoxon W 6992.000 6994.500 7897.500

Z -3.301 -3.295 -.709

Asymp. Sig. (2-tailed) .001 .001 .478



Ranks


% Panjang normal Diffquick 90 70.85 6376.50

Safranin 90 110.15 9913.50

Total 180

% Lebar normal Diffquick 90 90.73 8166.00

Safranin 90 90.27 8124.00

Total 180

% Normal Diffquick 90 76.81 6912.50

Safranin 90 104.19 9377.50

Total 180

Test Statisticsa


Mann-Whitney U 2281.500 4029.000 2817.500

Wilcoxon W 6376.500 8124.000 6912.500

Z -5.065 -.060 -3.530

Asymp. Sig. (2-tailed) .000 .952 .000



Ranks




% Panjang normal Papanicolaou 90 90.66 8159.00

Safranin 90 90.34 8131.00

Total 180

% Lebar normal Papanicolaou 90 79.76 7178.00

Safranin 90 101.24 9112.00

Total 180

% Normal Papanicolaou 90 82.39 7415.00

Safranin 90 98.61 8875.00

Total 180

Test Statisticsa


Mann-Whitney U 4036.000 3083.000 3320.000

Wilcoxon W 8131.000 7178.000 7415.000

Z -.040 -2.769 -2.091

Asymp. Sig. (2-tailed) .968 .006 .037



Ranks


Form-Tapered (%) Diffquick 90 131.08


Safranin 90 140.16

Total 270

Form-Round (%) Diffquick 90 134.78


Safranin 90 132.47

Total 270

Form-Amorph (%) Diffquick 90 126.02


Safranin 90 155.41

Total 270

Test Statisticsa,b

Form-Tapered (%) Form-Round (%) Form-Amorph (%)

Chi-Square .613 .368 8.878

df 2 2 2

Asymp. Sig. .736 .832 .012






Ranks


Form-Amorph (%) Diffquick 90 91.02 8191.50


Total 180

Test Statisticsa

Form-Amorph (%)


Wilcoxon W 8098.500

Z -.134




Ranks


Form-Amorph (%) Diffquick 90 80.50 7245.00

Safranin 90 100.50 9045.00

Total 180

Test Statisticsa

Form-Amorph (%)


Wilcoxon W 7245.000

Z -2.588




Ranks


Form-Amorph (%) Papanicolaou 90 80.59 7253.50

Safranin 90 100.41 9036.50

Total 180

Test Statisticsa

Form-Amorph (%)


Wilcoxon W 7253.500

Z -2.563





Oneway

Descriptives

Form-Pyri (%)

N Mean Std.

Deviation Std. Error

95% Confidence Interval for Mean

Minimum Maximum Lower

Bound Upper Bound

Diffquick 90 14.29 8.247 .869 12.56 16.02 0 42

Papanicolaou 90 12.80 8.735 .921 10.97 14.63 0 36

Safranin 90 15.64 8.192 .864 13.93 17.36 0 40

Total 270 14.24 8.444 .514 13.23 15.26 0 42

Test of Homogeneity of Variances

Form-Pyri (%)

Levene Statistic df1 df2 Sig.

.453 2 267 .636

ANOVA

Form-Pyri (%)

Sum of Squares df Mean Square F Sig.

Between Groups 364.356 2 182.178 2.585 .077

Within Groups 18815.511 267 70.470

Total 19179.867 269


Ranks


Vacuoles > 2 (%) Diffquick 90 103.79


Safranin 90 118.86

Total 270

Vacuoles LNV (%) Diffquick 90 119.01


Safranin 90 132.39

Total 270

Vacuoles PA (%) Diffquick 90 126.56


Safranin 90 129.98

Total 270

Test Statisticsa,b



Vacuoles > 2 (%)

Vacuoles LNV (%) Vacuoles PA (%)

Chi-Square 57.659 19.891 9.042

df 2 2 2

Asymp. Sig. .000 .000 .011




Ranks


Vacuoles > 2 (%) Diffquick 90 63.76 5738.50

Papanicolaou 90 117.24 10551.50

Total 180

Vacuoles LNV (%) Diffquick 90 78.67 7080.00


Total 180

Vacuoles PA (%) Diffquick 90 82.87 7458.00


Total 180

Test Statisticsa

Vacuoles > 2 (%)


Mann-Whitney U 1643.500 2985.000 3363.000

Wilcoxon W 5738.500 7080.000 7458.000

Z -7.081 -4.274 -2.655

Asymp. Sig. (2-tailed) .000 .000 .008



Ranks


Vacuoles > 2 (%) Diffquick 90 85.53 7697.50

Safranin 90 95.47 8592.50

Total 180

Vacuoles LNV (%) Diffquick 90 85.84 7725.50

Safranin 90 95.16 8564.50

Total 180

Vacuoles PA (%) Diffquick 90 89.19 8027.50

Safranin 90 91.81 8262.50

Total 180

Test Statisticsa



Vacuoles > 2 (%)


Mann-Whitney U 3602.500 3630.500 3932.500

Wilcoxon W 7697.500 7725.500 8027.500

Z -1.395 -1.999 -.512

Asymp. Sig. (2-tailed) .163 .046 .609



Ranks


Vacuoles > 2 (%) Papanicolaou 90 112.11 10090.00

Safranin 90 68.89 6200.00

Total 180

Vacuoles LNV (%) Papanicolaou 90 98.27 8844.00

Safranin 90 82.73 7446.00

Total 180

Vacuoles PA (%) Papanicolaou 90 97.32 8759.00

Safranin 90 83.68 7531.00

Total 180

Test Statisticsa

Vacuoles > 2 (%)


Mann-Whitney U 2105.000 3351.000 3436.000

Wilcoxon W 6200.000 7446.000 7531.000

Z -5.678 -2.593 -2.314

Asymp. Sig. (2-tailed) .000 .010 .021



Ranks


Acrosom <40% (%) Diffquick 90 137.12


Safranin 90 137.70

Total 270

Acrosom >70% (%) Diffquick 90 122.22


Safranin 90 139.28

Total 270

Acrosom terwarnai sempurna (%)

Diffquick 90 95.76


Safranin 90 151.48



Total 270

Acrosom terwarnai tidak sempurna (%)

Diffquick 90 185.48


Safranin 90 116.58

Total 270

Test Statisticsa,b

Acrosom <40%

(%) Acrosom >70%

(%)

Acrosom terwarnai

sempurna (%)


Chi-Square .332 5.196 37.567 67.292

df 2 2 2 2

Asymp. Sig. .847 .074 .000 .000




Ranks



Diffquick 90 69.42 6247.50

Papanicolaou 90 111.58 10042.50

Total 180


Diffquick 90 117.13 10542.00


Total 180

Test Statisticsa

Acrosom terwarnai

sempurna (%)


Mann-Whitney U 2152.500 1653.000

Wilcoxon W 6247.500 5748.000

Z -5.527 -7.300

Asymp. Sig. (2-tailed) .000 .000



Ranks



Diffquick 90 71.84 6465.50

Safranin 90 109.16 9824.50

Total 180


Diffquick 90 113.85 10246.50

Safranin 90 67.15 6043.50



Ranks



Diffquick 90 71.84 6465.50

Safranin 90 109.16 9824.50

Total 180


Diffquick 90 113.85 10246.50

Safranin 90 67.15 6043.50

Total 180

Test Statisticsa

Acrosom terwarnai

sempurna (%)


Mann-Whitney U 2370.500 1948.500

Wilcoxon W 6465.500 6043.500

Z -4.869 -6.287




Ranks




Safranin 90 87.82 7904.00

Total 180



Safranin 90 94.93 8543.50

Total 180

Test Statisticsa

Acrosom terwarnai

sempurna (%)


Mann-Whitney U 3809.000 3651.500

Wilcoxon W 7904.000 7746.500

Z -.750 -1.416




Ranks


Num (%) Diffquick 90 135.00




Safranin 90 135.00

Total 270

Other (%) Diffquick 90 135.50


Safranin 90 135.50

Total 270

Head terwarnai sempurna (%) Diffquick 90 125.20


Safranin 90 139.33

Total 270

Head terwarnai tidak sempurna (%)

Diffquick 90 145.53


Safranin 90 133.27

Total 270

Test Statisticsa,b

Num (%) Other (%) Head terwarnai sempurna (%)


(%)

Chi-Square 2.000 .000 2.845 6.884

df 2 2 2 2

Asymp. Sig. .368 1.000 .241 .032




Ranks



Diffquick 90 96.43 8678.50


Total 180

Test Statisticsa


(%)


Wilcoxon W 7611.500

Z -2.498




Ranks





Diffquick 90 94.61 8514.50

Safranin 90 86.39 7775.50

Total 180

Test Statisticsa


(%)


Wilcoxon W 7775.500

Z -1.630




Ranks




Safranin 90 92.37 8313.50

Total 180

Test Statisticsa


(%)


Wilcoxon W 7976.500

Z -.926




Ranks


Mid piece - Insertion (%) Diffquick 90 128.86


Safranin 90 147.79

Total 270

Mid piece - Thick (%) Diffquick 90 132.72


Safranin 90 153.74

Total 270

Mid piece - Thin (%) Diffquick 90 133.69




Safranin 90 137.94

Total 270

Mid piece - Irregular (%) Diffquick 90 133.94


Safranin 90 133.46

Total 270

Test Statisticsa,b

Mid piece - Insertion (%)

Mid piece - Thick (%)

Mid piece - Thin (%)

Mid piece - Irregular (%)

Chi-Square 3.748 8.653 .311 .371

df 2 2 2 2

Asymp. Sig. .154 .013 .856 .831




Ranks


Mid piece - Bent (%) Diffquick 90 126.41


Safranin 90 142.00

Total 270

Mid piece - Terwarnai sempurna (%)

Diffquick 90 135.24


Safranin 90 136.65

Total 270

Mid piece - Terwarnai tidak sempurna (%)

Diffquick 90 137.28


Safranin 90 135.44

Total 270

Test Statisticsa,b

Mid piece - Bent

(%)

Mid piece - Terwarnai

sempurna (%)

Mid piece - Terwarnai tidak sempurna (%)

Chi-Square 2.047 .043 .244

df 2 2 2

Asymp. Sig. .359 .979 .885






Ranks


Mid piece - Thick (%) Diffquick 90 94.25 8482.50


Total 180

Test Statisticsa



Wilcoxon W 7807.500

Z -.974




Ranks


Mid piece - Thick (%) Diffquick 90 83.97 7557.50

Safranin 90 97.03 8732.50

Total 180

Test Statisticsa



Wilcoxon W 7557.500

Z -1.688




Ranks


Mid piece - Thick (%) Papanicolaou 90 78.78 7090.50

Safranin 90 102.22 9199.50

Total 180

Test Statisticsa





Wilcoxon W 7090.500

Z -3.031




Ranks


Principal piece - Short (%) Diffquick 90 136.04


Safranin 90 134.55

Total 270

Principal piece - Multiple (%) Diffquick 90 127.83


Safranin 90 141.53

Total 270

Principal piece - Broken (%) Diffquick 90 140.85


Safranin 90 127.12

Total 270

Principal piece - Bent (%) Diffquick 90 133.42


Safranin 90 140.86

Total 270

Test Statisticsa,b

Principal piece - Short (%)

Principal piece - Multiple (%)

Principal piece - Broken (%)

Principal piece - Bent (%)

Chi-Square .171 4.863 2.948 .748

df 2 2 2 2

Asymp. Sig. .918 .088 .229 .688




Ranks


Principal piece - Irregular (%) Diffquick 90 136.46


Safranin 90 134.26

Total 270

Principal piece - Looped (%) Diffquick 90 138.57




Safranin 90 130.69

Total 270

Principal piece - Coiled (%) Diffquick 90 138.21


Safranin 90 122.66

Total 270

Principal piece - Terwarnai sempurna (%)

Diffquick 90 134.14


Safranin 90 137.85

Total 270

Principal piece - Terwarnai tidak sempurna (%)

Diffquick 90 136.13


Safranin 90 135.06

Total 270

Test Statisticsa,b

Principal piece -

Irregular (%) Principal piece -

Looped (%) Principal piece -

Coiled (%)

Principal piece - Terwarnai

sempurna (%)

Principal piece - Terwarnai tidak sempurna (%)

Chi-Square .081 .577 4.181 .171 .027

df 2 2 2 2 2

Asymp. Sig. .960 .749 .124 .918 .987




Ranks


ERC - Terwarnai sempurna (%)

Diffquick 90 80.33


Safranin 90 160.70

Total 270

ERC - Terwarnai tidak sempurna (%)

Diffquick 90 136.01


Safranin 90 134.48

Total 270

ERC Normal (%) Diffquick 90 81.12


Safranin 90 155.14

Total 270

ERC Tidak normal (%) Diffquick 90 93.82


Safranin 90 163.55

Total 270

Test Statisticsa,b



ERC - Terwarnai

sempurna (%)

ERC - Terwarnai tidak sempurna

(%) ERC Normal (%) ERC Tidak normal (%)

Chi-Square 81.780 .268 68.115 40.542

df 2 2 2 2

Asymp. Sig. .000 .875 .000 .000




Ranks



Diffquick 90 62.13 5591.50

Papanicolaou 90 118.87 10698.50

Total 180

ERC Normal (%) Diffquick 90 62.02 5581.50

Papanicolaou 90 118.98 10708.50

Total 180

ERC Tidak normal (%) Diffquick 90 71.83 6465.00


Total 180

Test Statisticsa

ERC - Terwarnai sempurna (%) ERC Normal (%)

ERC Tidak normal (%)

Mann-Whitney U 1496.500 1486.500 2370.000

Wilcoxon W 5591.500 5581.500 6465.000

Z -8.126 -7.462 -4.862

Asymp. Sig. (2-tailed) .000 .000 .000



Ranks



Diffquick 90 63.70 5733.00

Safranin 90 117.30 10557.00

Total 180

ERC Normal (%) Diffquick 90 64.60 5814.00

Safranin 90 116.40 10476.00

Total 180

ERC Tidak normal (%) Diffquick 90 67.49 6074.00

Safranin 90 113.51 10216.00

Total 180



Test Statisticsa



Mann-Whitney U 1638.000 1719.000 1979.000

Wilcoxon W 5733.000 5814.000 6074.000

Z -7.709 -6.796 -5.982

Asymp. Sig. (2-tailed) .000 .000 .000



Ranks




Safranin 90 88.90 8001.00

Total 180

ERC Normal (%) Papanicolaou 90 96.76 8708.00

Safranin 90 84.24 7582.00

Total 180

ERC Tidak normal (%) Papanicolaou 90 85.46 7691.50

Safranin 90 95.54 8598.50

Total 180

Test Statisticsa



Mann-Whitney U 3906.000 3487.000 3596.500

Wilcoxon W 8001.000 7582.000 7691.500

Z -.479 -1.616 -1.303

Asymp. Sig. (2-tailed) .632 .106 .193




Documents

TESIS Perbandingan Hasil Pemeriksaan Morfologi Spermatozoa ...repository.unair.ac.id/57255/9/57255.compressed.pdf · morfologi berpengaruh sejak proses maturasi spermatozoa hingga