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TESTES USADOS EM DIAGNÓSTICO E TITULAÇÃO
VIRAL
Métodos de Detecção Viral
1) Buscar o Vírus
O vírus propriamente
Proteínas Virais
Efeitos virais in vitro
Genoma Viral
1 – Investigação Direta (buscar o vírus)
Microscopia Eletrônica morfologia viral
Detecção do vírus (antígeno) IFA, ELISA, AGLUTINAÇÃO, etc
Detecção do Genoma Viral Hibridização molecular
Amplificação gênica (PCR ou derivados)
Tecidos e/ou matrizes onde se pode buscar o vírus
Aspirato Nasofaringeal Vírus Respiratório sincicialInfluenza A and BParainfluenzaAdenovirus
Fezes RotavirusAdenovirus Astrovirus
Norovirus, etc
Fluidos Herpes SimplesHIV
Esfregaços HPV, HIV
Biópsias HIV, EBV, et
Microscopia Electrônica
106 partículas virais/mL são necessárias para visualização.
Exemplos:
Fezes ……………………Rotavirus, Adenovirus,
Norovírus
Astrovirus, Calicivirus
Mucosas ………………….Papilomavirus (HPV)
Eletromicrografias
Adenovirus
Rotavirus Herpes SimplesRaiva
Astrovírus
HIV
Imuno Microscopia Eletrônica (IME)
A sensibilidade e a especificidade da ME pode ser aumentada por associação a técnicas imunológicas.
Existem duas variantes: Microscopia Eletrônica Imune Clássica (MEI) - A amostra é tratada com anti-soros específicos antes de ser analisadas no ME. Partículas virais aglutinadas
Microscopia Eletrônica de Fase Sólida (MEIFS) - uma “grade” revestida com anticorpos específicos anti-soros é colocada em contato com a amostra. Partículas virais serão absorvidas na “grade” - pelo anticorpo.
Problemas com a Microscopia Eletrônica
Equipamentos e manutenção – custos elevados
Requer bastante experiência do observador
Passiva de falsos negativos/baixa sensibilidade
(depende da origem amostral)
BUSCAR AS PROTEÍNAS VIRAIS
Testes Imunológicos: ELISA, IMUNOHISTOQUÍMICA, IMUNOFLUORESCÊNCIACITOMETRIA DE FLUXORADIOIMUNOENSAIO
ELISA - Ensaio Imunoenzimático
O teste identifica e quantifica Ag ou Ac, utilizando um dos dois conjugados com enzimas.
O produto final corado surge por ação da enzima que converte um substrato incolor em um produto colorido (ou o substrato alterado pela enzima induz mudança de cor de uma substância indicadora).
A quantidade de Ag ou Ac produto final corado, é feito através de leitura em fotocolorímetro.
IMUNOHISTOQUÍMICA: detecção de células infectadas em cortes histológicos (EBV, HPV)
IMUNOFLUORESCÊNCIA DIRETA
IMUNOFLUORESCÊNCIA INDIRETA
Reagentes secundários:
Anticorpo secundário marcado com fluorocromoproteína A marcada com fluorocromo = porção Fc das IgGs
Célula infectada por Rotavírus Símio
Citometria de Fluxo
(Virology Laboratory, Yale-New Haven Hospital)
RADIOIMUNOENSAIO (RIA): triagem do vírus da hepatite B em doadores de sangue
Investigação Indireta (buscar o efeito do vírus; isolar o vírus; atenuar o vírus)
Cultura celular ou ovos embrionados: Efeito citopático (CPE) ou infecção do embrião
Uso de Animais: Estudo da doença e/ou morte
Como isolar vírus?- a partir dos tecidos infectados
(limitado) - células em cultura- ovos embrionados
CULTURA CELULAR
1. Cultivo celular primário (derivado do tecido)
2. Cultivo em linhagens celulares semi-contínuas (Ex: fibroblastos de rins de macaco)
3. Cultivo em linhagens celulares contínuas (tumorais) - HeLa, Vero, Hep2, A549…
Todos os vírus podem ser cultivados in vitro?
Vírus que podem ser facilmente cultiváveis
Vírus difíceis de cultivar Vírus Fastidiosos
Herpes Simples Varicella-Zoster Norovirus
Vírus das Hepatites
Adenovírus Entéricos
Rotavírus
Citomegalovirus Sarampo
Adenovirus (exceçãos entéricos) Rubeola
Poliovirus Rinovirus
Coxsackie B virus Coxsackie A viruses
Ecovirus
Influenza
Parainfluenza
Caxumba
Virus Respiratório Sincicial
Linhagens Celulares – Visualização de Efeito Citopático
Controle Celular
Controle Viral (PV)Amostra ambiental
Positiva para Enterovírus (7 dias)
Amostra ambiental
Positiva para Enterovírus (4 dias)
Efeitos citopáticos clássicos
ATENUAÇÃO DE VÍRUS PARA PRODUÇÃO DE VACINAS
Ensaio de Formação de Placa de Lise (Contagem em PFU)
1- Diluições Seriadas
2- Infecção Celular
Quantificação Viral em cultura celular
Ensaio de Formação de Placa de Lise (Contagem em PFU)
1- Diluições Seriadas
2- Infecção Celular
Quantificação Viral em cultura celular
Desafios em Cultivos Celulares
Às vezes requerem longos períodos e mais de uma passagem para obter resultados
A matriz de onde provém a fonte viral pode ser um obstáculo (sangue, amostras ambientais, mucosas, fezes…)
Suceptível a contaminações bacterianas e fúngicas Suceptível a substâncias tóxicas presentes na amostra Muitos vírus não são adaptados ao cutivo celular in vitro (hepatites,
diarréias, papilomavírus…)
Cultivo de Vírus em Ovos Embrionados
Isolamento Viral – Inoculações em Ovos Embrionados
Cultivo Celular para Isolamento e Viabilidade Viral - Vírus da Bronquite Aviária
Passagem 1 Passagem 2
Passagem 3
Passagem 4
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Teste rápido, fácil e barato
Pode ser utilizado para detectar anticorpos para o vírus ou inibição da hemaglutinação
Mede quantidade total de vírus (não somente vírus infecciosos)
Testes de Hemaglutinação
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Testes de Hemaglutinação
Alguns vírus, ou antígenos derivados de vírus, se adsorvem às hemácias através de receptores existentes na membrana destas.
Como resultado, as hemácias aglutinam, sendo este fenômeno denominado de hemaglutinação. •Vírus de influenza: aglutina hemácias de galinha, cobaia, carneiro e humanas do grupo O. •Vírus do Sarampo: Aglutinam hemácias de macaco. •Vírus do Dengue: Aglutinam hemácias de ganso
As hemaglutininas de vírus respiratórios são antigênicas e, quando um vírus infecta o organismo humano ou animal, além de anticorpos neutralizantes, há a produção de anticorpos específicos contra as hemaglutininas virais. Esses anticorpos presentes no soro são capazes de se combinar com o vírus in vitro, inibindo assim a hemaglutinação. Este é o princípio da reação de inibição da hemaglutinação, que tem grande utilidade no diagnóstico dessas infecções virais.
TESTES DE INIBIÇÃO DA HEMAGLUTINAÇÃO
Buscar o genoma viral
Utiliza técnicas que identificam e/ou quantificam o genoma viral
•AMPLIFICAÇÃO GÊNICA•HIBRIDIZAÇÕES MOLECULARES
Métodos Moleculares
Métodos baseados na detecção de genoma viral, conhecido como moleculares, são muito utilizados.
PCR Dot-blot Southern blot
A especificidade depende das condições da reação (otimização)
Mais utilizada!Busca PubMed: 20.163 publicados
(últimos 8 nos) http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?termpcrdiagnosisviral (Acesso em 12.03.2012)
Reação em Cadeia da Polimerase (PCR)
Amplifica a sequência alvo de DNA/cDNA, permitindo detectar o genoma viral
buscado.
É baseada em uma reação enzimática com uso de oligonucleotídeos que flanqueiam a
sequência alvo que será aplificada pela ação da enzima DNA Polimerase.
Graças a Taq Polimerase, enzima termoestável, a reação é possivel em um único MIX
de reagentes;
Ciclos repetidos (usualmente 25 – 40 ciclos) de desnaturação do DNA (94oC),
anelamento dos oligos / primers (50oC – 65°C) e extensão dos primers (72oC)
resultam em uma produção exponencial do fragmento expecífico;
Atualmente a qPCR está sendo amplamente utilizada – Permite
quantificar em cópias genômicas o fragmento detectável.
Esquema de PCR
pcr Vídeo.exe
VÍDEO PCR
Os iniciadores procuram o molde na molécula de DNA, sequências que lhes são complementares
Os iniciadores procuram o molde na molécula de DNA, sequências que lhes são complementares
O pareamento dos iniciadores com a sequência que lhe é complementar já está bem facilitada, pois já existem várias cópias das sequências alvos.
O pareamento dos iniciadores com a sequência que lhe é complementar já está bem facilitada, pois já existem várias cópias das sequências alvos.
A amplificação já é sub-ótima devido à limitação dos reagentes - competição dos produtos gerados com os iniciadores
A amplificação já é sub-ótima devido à limitação dos reagentes - competição dos produtos gerados com os iniciadores
Cinética da Cinética da PCRPCR
Reação em Cadeia da Polimerase
Vantagens da PCR- Altamente sensível (pequena quantidade de material genético é requerido)
- Rápida
Desvantagens of PCR– Passiva de contaminações
– Alto treinamento do manipulador
– Se PCR qualitativa (Resultado não quantifica)
– Não acessa a infecciosidade viral
– Relativamente custosa (25 Reais/reação)
qPCR
HIBRIDIZAÇÕES MOLECULARES
Detecção de EBV em corte histológico de
linfonodo com doença linfoproliferativa
pós-transplante.
Detecção de EBV em corte histológico de
linfonodo com linfoma de Hodgkin.
Detecção de HPV por FISH (HIBRIDIZAÇÃO FLUORESCENTE)
Métodos de Detecção Viral
2) Buscar a resposta ao vírus
Investigação sorológica (buscar a resposta imune ao vírus)
Detecção de de anticorpos presentes no soro
nas fases aguda (IgM) e/ou convalescente da infecção (IgG ou IgA).
•ELISA•WESTERN BLOT•CITOMETRIA DE FLUXO• IMUNOFLUORESCÊNCIA
Sorologia
Diagnosticando Infecções Primárias:- Pelo aumento de IgG e/ou IgA (dependendo do alvo do vírus) - Presença de IgM no soro indicando infecção primária- Soroconversão
Diagnosticando Reinfecções ou Infecções secundárias
-IgG ou IgA (dependendo do alvo do vírus) no soro e/ou fluidos corpóreos
Perfil Sorológico das Infecções Virais
ELISA – Ex: Teste para HIV
Western Blot
Eletroforese de proteínas.
Identifica antígenos ou anticorpos.
Western Blot
HIV-1 Western Blot Linha 1: Controle Positivo Linha 2: Controle Negativo A: Negativo B: Indeterminado C: Positivo
Utilidade dos Resultados por Sorologia
Resposta específica ao vírus.
Em caso de doenças assintomáticas a detecção sorológica (IgM e IgG) indica doença.
Existem vírus que produzem efeitos clínicos após soroconversão (HIV, RAIVA).
Problemas com Sorologia
Requer longos períodos para diagnosticar a infecção.
Possibilidades de resultados falsos positivos (imunocomprometidos).