TheDark Biochemistry

avagy a sötét szakasz…

A CO2 asszimilációja:

fixáció és redukció

Fotoszintézis III.

Dr. Horváth Ferenc

Ha nem fotoszintetikus úton előállított ATP-t és NADPH-t adunk sötétben lévő kloroplasztiszokhoz, akkor ugyanúgy megtörténik a CO2-fixáció, mintha megvilágítottuk volna őket.

2n H2O + n CO2 n (CH2O) + n H2O + n O2redukált termék

redukció

oxidáció

fény

• A C3-as (primer termék 3-szénatomos molekula) fotoszintetikus szénredukció (Calvin-ciklus)

• A C2-es fotorespirációs (karbon oxidációs, glikolát) ciklus• A CO2 fixáció C4-es útja (CO2 koncentráló mechanizmus)• A CO2 fixáció C4-es útja a CAM növényekben• A szacharóz és a keményítő szintézise

és szabályozási mechanizmusok a CO2 asszimilácójában

M. Calvin (1948-1953) tisztázta elsőként a CO2-fixáció folyamatát, azóta több alternatív utat is feltártak

Melvin Calvin,Nobel díj 1961.

1. A C3-as fotoszintetikus szénredukció (Calvin-ciklus)

Szénben jelzett hidrogénkarbonát ion, H14CO3- adagolásával a

széndioxid fixálás elsődleges termékei kimutathatók

5 másodperces megvilágítás után forró metanolban fixálva, és 2D papírkromatográfiaPGA- glicerinsav-3-foszfát

30 másodperces megvilágítás után forró metanolban fixálva, és 2D papírkromatográfia

Glicerinsav-3-foszfát

Glicerinaldehid-3-foszfát

Ribulóz-1,5-biszfoszfát

Szacharóz, keményítő

A Calvin-ciklus három fázisra tagolható

• A Calvin-ciklus folyamán a C3-as úton a széndioxid a ribulóz-1,5-biszfoszfáthoz kötődik és egy feltételezett hat szénatomos intermedier terméken keresztül két molekula glicerinsav-3-foszfáttá alakul át.

• A glicerinsav-3-foszfát a fotoszintetikus CO2-fixáció első stabil terméke

1. A sötétszakasz kezdete: karboxiláció

RUBISCO

• Ribulóz-1,5-biszfoszfát-karboxiláz-oxigenáz a reakciót katalizáló enzim

• Kettős enzimaktivitású – karboxiláz és oxigenáz (3:1)

• Kompetíció, ha mindkét szubsztrátum jelen van• A kloroplasztisz sztrómájában található

A RUBISCO SZERKEZETE

L8S8 alegységek (56 kDa, kloroplasztiszban szintetizálódik; 14

kDa, sejtmagban kódolt)

small (rbcS) and the large (rbcL) subunit of rubisco

A katalitikus hely a nagyobbik alegységen található

Rubisco: a levél összes fehérje tartalmának több, mint 50%-a

N-raktár, a Föld népességének minden tagjára 20 kg jut…

Évente 200 milliárd tonna CO2-t fixál

A fehér és szürke a nagy alegység dimereket, a narancs és kék a kis alegység dimereket mutatja.

A Rubisco aktiválása karbamilációval

Az aktiváció CO2 és Mg2+ megkötésével és proton felszabadításával jár, így a megvilágítás hatására bekövetkező sztróma pH emelkedés és a Mg2+ koncentráció növekedés serkenti az aktivációt.

A Rubisco-aktiváz működése

A Rubisco-aktiváz eltávolítja a kötött RuBP-ot az inaktív, dekarbamilált Rubisco-ról egy ATP-t igénylő reakcióban. A szabad Rubisco ezután CO2 és Mg2+ kötésével karbamilálódhat.A Rubisco-aktivázt a fény a tioredoxin-rendszeren keresztül aktiválja (később).

3-foszfoglicerát-kináz

Ha a glicerinsav-3-foszfát mennyisége nagyobb, mint a glicerinsav-1,3-biszfoszfáté, akkor a reakció a jelzett irányban játszódik le (glikolízisben fordítva)

Az ATP mennyiség 2/3-a itt használódik fel.

(PGA)

Foszforilációs lépés

2. A redukciós fázis kezdete

Glicerinaldehid-3-foszfát dehidrogenáz

Redukciós lépés

A NADPH mennyisége limitálja a reakciót, az enzim aktivitását a fény növeli

G3P – DHAP izomer átalakulás

Trióz-foszfát izomeráz

DHAP:G3P = 22:1

Aldoláz

A regenerációs fázis kezdete

eritróz-4-foszfát xilulóz-5-foszfát

Transzketoláz

Fruktóz-1,6-biszfoszfatáz

szedoheptulóz-1,7-biszfoszfát

Aldoláz

Szedoheptulóz-1,7-biszfoszfatáz

Transzketoláz

ribóz-5-foszfát xilulóz-5-foszfát

Ribulóz-5-foszfát epimeráz

izomerizáció

Ribóz-foszfát-izomeráz

Foszforibulo-kináz v. ribulóz-5-foszfát kináz

- fény-aktivált enzim- a regeneráció zárólépése- az ATP 1/3-a itt használódik fel

A sötét szakasz legfontosabb biokémiai folyamatai

- karboxilációs fázis

ribulóz-1,5-bifoszfát + CO2 = 2 glicerinsav-3-foszfát

Katalizálja: a ribulóz-1,5-bifoszfát-karboxiláz, oxigenáz (RUBISCO)

- redukció szakaszafoszforiláció: az ATP 2/3 részének felhasználásaredukció: a redukált NADPH felhasználása a glicerinsav-3-

foszfát redukciójára

- regenerációa ribulóz-1,5-biszfoszfát-karboxiláz regenerálása:

6 glicerinsav-3-foszfát 3 ribulóz-1,5-biszfoszfát + 1 trióz-foszfát

Nyereség ciklusonként egy trióz-foszfát!

A Calvin-ciklus jelentősége

• Három pentóz-foszfátból 3 molekula széndioxid megkötésével 6 trióz-foszfát keletkezik

• A három pentóz-foszfát regenerálódik

• A 3 széndioxid molekulából a nettó eredmény 1 exportálódó trióz-foszfát

• Ez cukrok (szacharóz), zsírsavak, aminosavak szintézisére szolgál

• A folyamat során 9 ATP és 6 NADPH használódik fel

A Calvin-ciklus regulációja

A fotoszintetikus elektrontranszportlánc működését elsősorban a NADP+, az ADP és Pi mennyisége szabja meg.

Sötétben: a redukált NADPH mennyiség 5-20%, ATP/ADP arány 0,1-0,2; sztróma pH = 7

Fényen: a redukált NADPH mennyiség 40-50%, ATP/ADP arány 1-5, sztróma pH = 8-8,5 (enzim optimum)

Fényen, CO2 hiányában: a redukált NADPH mennyiség 90%

A Calvin-ciklus működését szabályozza:

1, A trióz-foszfát/ortofoszfát transzlokátor (később)

2, A fény

Fényre aktiválódó enzimek:Rubisco-aktiváz

NADP:gliceraldehid-3-foszfát dehidrogenáz

Fruktóz-1,6-biszfoszfát foszfatáz

Szedoheptulóz-1,7-biszfoszfát foszfatáz

Ribulóz-5-foszfát kináz (foszforibulo-kináz)

A Calvin-ciklus számos enzimét a fényfüggő ferredoxin-tioredoxin rendszer aktiválja

Fény PS I a célenzimek diszulfid-csoportjainak redukálása szulfhidrillé a redukált tioredoxin fehérje segítségével.

Így kerülnek a célenzimek aktív állapotba

2. A C2-es fotorespirációs (karbon oxidációs, glikolát) ciklus

A Rubisco kettős aktivitásának következménye…

Magas hőmérséklet oldott CO2/O2 arány csökken

2. A C2-es fotorespirációs (karbon oxidációs, glikolát) ciklus

- a Rubisco oxigenáz aktivitása következtében ("parazita")

- CO2/O2 koncentrációk, hőmérséklet-függő

- a kloroplasztisz, a peroxiszóma és a mitokondrium közreműködésével jön létre a ciklus

A) A kloroplasztiszban:

Ru-1,5-BP + O2 glikolsav-foszfát + glicerinsav-3-foszfát

glikolsav-foszfát + H2O glikolsav + Pi

B) A peroxiszómában (1):glikolsav + O2 glioxálsav + H2O2 (glikolsav oxidáz)(a glioxálsav visszajuthat a kloroplasztiszba, ahol NADPH felhasználásával újra glikolsavvá alakulhat, vagy

glioxálsav + glutaminsav glicin + α-ketoglutársav (transzamináció)

C) A mitokondriumban:

glicin + NAD+ + H4-folát NADH + CO2 + NH4+ + metilén H4-folát

metilén H4-folát + H2O + glicin szerin + H4-folát

D) A szerin visszajut a peroxiszómába:

szerin + α-ketoglutársav hidroxi-piruvát + glutaminsav

hidroxi-piruvát + NADH + H+ glicerinsav + NAD+

E) A kloroplasztiszban:

glicerinsav + ATP glicerinsav-3-foszfát + ADP + H+

GOGAT

ATP

Összegezve:

Minden 2 molekula glikolsav-foszfát (2 x 2 = 4 C atom), mely a Calvin-ciklusból a RuBP oxigenálódása miatt vész el, 1 molekula glicerinsav-3-foszfáttá (C3) + 1 molekula CO2-dá alakul.

Más szóval, az oxigenálódás miatt elveszett szén 75%-át a fotorespirációs ciklus visszavezeti a Calvin-ciklusba.

A fotorespirációs ciklussal viszont a CO2 fixáció teljes energiaigénye megnő.

A C2-ciklusban 3 mól O2 felvétele 1 mól CO2 felszabadulást eredményez 2 mól ATP + 2 mól redukálószer felhasználása mellett.

2. A C2-es fotorespirációs (karbon oxidációs, glikolát) ciklus

A CO2 fixáció C4-es útja (CO2 koncentráló mechanizmus)

C4-es növények jellegzetességei:

1. A primer fixációs termékek 4 szénatomosak, pl. oxálecetsav, almasav és aszparaginsav

2. A CO2 fixáció fényen történik3. A négyszénatomos molekulákból 1 szénatom adódik a C3-as

ciklus felé4. Kétféle fotoszintetikus sejttípus van bennük (mezofill és

hüvelyparenchima sejtek)

Probléma: a hőmérséklet emelésével a CO2 és O2 oldhatósága megváltozik úgy, hogy a CO2/O2 arány csökken. Ezért a Rubisco oxigenáz aktivitása erősebbé válik.A sztómák is záródnak a vízvesztés megakadályozása miatt, így tovább csökken a rendelkezésre álló CO2 mennyisége. C4 stratégia

C3 és C4 levélszerkezet

• A C4-es növények anatómiája szembeszökően különbözik a C3-as növényekétől.

• Csak a C4-es növényekben található a hüvelyparenchima (bundle sheath) vagy Kranz sejtek.

• A széndioxid elsődleges kötését a PEP karboxiláz enzim katalizálja a mezofill sejtek citoplazmájában.

A kukoricalevél tipikus Kranz-anatómiája

C4 levél szerkezet és a C4 út

CO2

Mezofill sejt

Hüvely-parenchimasejt

Levélér(szállítószövet)

A C4 növény levélfotoszintetizálósejtek

Sztóma

Mezofillsejt

C4 levél felépítés

PEP karboxiláz

Oxálecetsav (4 C) PEP (3 C)

Almasav (4 C)

ADP

ATP

Hüvely-parenchimasejt CO2

Piruvát (3 C)

CALVINCIKLUS

Cukor

Szállítószövet

CO2

• primér fixációs termék C4 sav (oxálecetsav)

• foszfoenol-piruvát (PEP) karboxilálódik

• a C4-es és a C3 ciklus térben elválasztódik: speciális anatómia (mezofill és hüvelyparenchima)

• trópusi, szubtrópusi növényekben

A foszfoenol-piruvát karboxiláz (PEP)… rendkívül nagy affinitással végzi a karboxilációs

reakciót

A C4 alapciklus lépései:

1) PEP karboxiláció a MEZOFILL sejtek citoplazmájában

oxálecetsav malát, aszpartát

2) A C4 sav transzportja a HÜVELYPARENCHIMA-ba

3) A C4 sav (almasav, aszparaginsav) dekarboxilációja

a CO2 fixációja a C3-as ciklusban

4) A C3 sav (piruvát, alanin) transzportja MEZOFILL

NADP-almasav-enzim (NAPD-ME) típus

A CO2 koncentrálódása 8-10-szeres a C3-as levélhez képest.

Energiamérleg: ellentétben a C3-as növényekkel, nem 3 ATP és 2 NADPH, hanem 5 ATP és 2 NADPH / 1 CO2

a CO2 koncentráláshoz több energia szükséges, melynek nyeresége, hogy nincs fotorespiráció

Fény-regulált kulcsenzimek:PEP karboxilázNADP-almasav dehidrogenáz (tioredoxin)Piruvát-ortofoszfát-dikináz

A CO2 fixáció C4-es útja (CO2 koncentráló mechanizmus)

A dekarboxilációs mechanizmus alapján 3 típus

i) NADP-almasav enzim típus(NADP-ME, kloroplasztisz)

ii) Foszfoenol-piruvát-karboxikináz típus (PEP-CK, citoplazma)

iii) NAD-almasav enzim típus (NAD-ME, mitokondrium)

A kloroplasztiszok szerkezete és elhelyezkedése a különböző fixációs típusú hüvelyparenchima sejtekben

Klp centrifugálisan, nincsenek gránumok (nincs lineáris e-trp), mert az almasav a CO2-on kívül redukáló erőt (NADPH-t) is biztosít

Az ATP előállításához elegendő a ciklikus fotofoszforilációs aktivitás

Pl. Zea mays - kukorica

Vannak gránumok, klp centripetálisan

Pl. Amaranthus retroflexus – szőrös disznóparéj, Panicum miliaceum - köles

Vannak gránumok, klp centrifugálisan

Pl. Panicum maximum - pázsitkóró

4. A CO2 fixáció C4-es útja a CAM növényekben

CAM =

Crassulacean Acid Metabolism

Crassulaceae

Cactaceae

Euphorbiaceae

Liliaceae

Bromeliaceae…

A CAM útvonal hasonló a C4 úthoz

A lépések térbeli elkülönülése. A C4 növényekben, a szén fixálása és a Calvin ciklus eltérő sejtekben zajlik.

(a) A lépések időbeli elkülönülése. A CAM növényekben, a szén fixálása és a Calvin ciklus ugyanabban a sejtben de eltérő időben zajlik.

(b)

AnanászCukornád

Hüvelyparenchima sejt

Mezofill sejt

Szerves sav

CALVINCIKLUS

Cukor

CO2 CO2

Szerves sav

CALVINCIKLUS

Cukor

C4 CAM

CO2 négy szénatomos savakba épül(szén fixálás)

Éjszaka

Nappal

1

2 A szerves savak-ból CO2 szabadulfel a Calvin ciklus számára

4. A CO2 fixáció C4-es útja a CAM növényekben

karboxiláció /dekarboxiláció időben elválasztva- sivatagi növények

Éjjel:sztómák nyitvaPEP + CO2 oxálecetsav almasav vakuólum

("sötét savanyodás")Nappal:

zárt sztómákdekarboxiláció, CO2 Calvin ciklusC3 savak trióz-P keményítő, szacharóz

CAM növényekben a PEP-karboxiláz kettős funkciójúéjjel: karboxiláz (foszforilált forma)nappal: dekarboxiláz (defoszforilált, almasav-gátolt)

A CO2 fixáció C4-es útja a CAM növényekben

A PEP-karboxiláz nappali inaktív, és éjszakai aktív formája

5. A szaharóz és a keményítő szintézise

Fr2,6-biszfoszfát gátlás

5. A szaharóz és a keményítő szintézise

- keményítő: a kloroplasztiszban- szaharóz: a citoplazmában

közös lépések a trióz-P-tól a glukóz-1-P-igizoenzimek: pl. fruktóz-1,6-biszfoszfát foszfatáz

kloroplasztiszban: tioredoxincitoszolban: fruktóz-2,6-biszfoszfát

keményítő: ADP-glükózszaharóz: UDP-glükóz

Trióz-P megoszlás: trióz-P/Pi transzlokátor (antiport)Pi reguláló szerep

Regulátor a citoszolban: fruktóz-2,6-biszfoszfátFr-1,6-BP Fr-6-P átalakulásnál (, inhibitor; , aktivátor)

A szaharóz és a keményítő szintézise egymással versengő folyamatok

A cukorszintézis regulátora:a fruktóz-2,6-biszfoszfát