J Korean Neurosurg Soc/Volume 27/March, 1998 299

KISEP Experimental Research J Korean Neurosurg Soc 27：：：：299-304, 1998

냉동 보관제의 농도 변화가 신경 세포 생존율에 미치는 영향

중앙길병원 신경외과

김영수·한기수·이 언·김영보·유영미 = Abstract =

The Influence of Different Concentrations of Cryoprotectants on Neuronal Cell Viability

Young Soo Kim, M.D., Ki Soo Han, M.D., Uhn Lee, M.D., Young Bo Kim, M.D., Young Mi Yoo, M.D.

Department of Neurosurgery, Ghil General Hospital, Inchon, Korea

promising technique for the treatment of Parkinson’s disease and other various neurodegenerative disorders is the transplantation of fetal neural tissue. There must, however, be a prompt and reliable source, and one solution is

cryopreservation, where tissue viability can maintained for prolonged periods. Fetal neural tissue is, however,

known to be susceptible to freeze-storage damage during cryopreservation. In this study, we examined the influence

of different concentrations of cryoprotectants upon the survival of rat fetal neurones. Fetal rat brain tissue was frozen

with 7-15% dimethyl sulfoxide(DMSO) and 10-50% fetal bovine serum(FBS) as cryoprotectants, then stored for a

period of 5 months. Post-storage neuronal cell viabilty was assessed by vital staining followed by determination of cell

density. Average total viability of frozen cells with 7% DMSO and 10-50% FBS was less than 50%. Cryopreserved

cells with 10-50% DMSO and 10-50% FBS showed almost the same viability(around 70%). The highest viability was

obtained with 15% DMSO+20% FBS combination(76%) and 10% DMSO+10% FBS combination(75%). Theoretically,

the higher the concentration of cryoprotectants, the higher the viability；however, the best result was achieved stated

above, when the combination of cryoprotectants was at the concentrations stated above. KEY WORDS：Rat fetal neural tissue·Cryopreservation·Cell viability·Cryoprotectant.

서 론

파킨슨씨병과 같은 여러 종류의 퇴행성 신경계 질환에서

치료의 한 방법으로 뇌조직 이식이 시도되고 있으며, 이식

원으로서 태자(fetus)의 뇌조직에 대한 관심이 증대되고 있

다2)8)9)13)32). 이식 수술의 성공을 위해서는 이식전의 세포 조

직의 생존율이 매우 중요하며, 가장 이상적인 것은 실험 및

치료 시에 이식술 바로 직전에 태아 조직을 용이하게 획득

하여 이용하는 것이다. 그러나 실제적으로 인간의 태아 조

직을 이용하는 것에는 윤리적, 법적, 임상적으로 많은 제약

이 있는 실정이다1)8)35). 또한 조직의 획득이 불규칙하므로

정규 수술 계획의 변경이나, 이식전에 병원성 미생물 검색

을 위한 시간이 요구되며 이를 위하여 조직의 저장과 생존

율의 유지를 위한 방법이 필요하다10). 또한 이식 수술의 성

공율을 높이기 위해서는 한번의 이식 수술에 3∼4개체의

태자가 필요하다고 한다. 그러나 제한된 시간 내에서 이러

한 제약에 하자가 없는 충분한 양의 태아를 얻기란 불가능

하다. 그러므로 태자의 중뇌 조직을 얻을 수 있을 때마다 보

관하였다가 사용할 수 있는 방법이 연구되어지고 있다. 태

자 중뇌 조직의 배양(tissue culture)이나 냉동 보관(cry-

opreservation)은 이러한 여러 문제점 들을 해결할 수 있

는 방법으로 제시되고 있다. 임상적으로 냉동 보관은 췌장

세포, 혈구 세포, 골수 세포, 정자등 포유류의 여러 조직 세

포의 장기간 보관을 위하여 널리 사용 되고 있다10)17). 그러

나 뇌조직은 다른 조직과 달리 일반적인 냉동 및 해동 조건

에서는 많은 양의 세포 소실이 일어난다3)4)33). 즉 서로 다른

세포에서는 일반적으로 사용되는 냉동 보관제(cryoprotec-

AAAA

냉동 보관제의 농도 변화가 신경 세포 생존율에 미치는 영향

J Korean Neurosurg Soc/Volume 27/March, 1998 300

tant)가 가지는 세포에 대한 독성이나 투과계수가 달라 지

게되며, 적정한 냉동 속도역시 달라진다는 것을 의미한다28).

냉동 보관 후에 신경세포의 회복에 영향을 미치는 중요한 요

소로는 냉동 및 해동 속도, 냉동 보관제의 선택과 그 농도, 냉

동 보관 온도, 보관 배양액의 이온조성및 pH등이 있다10)13).

이런 조건들이 잘 맞추어져야 해동한 후의 뇌조직이 이식후

에도 생존할 수 있고 세포의 분화와 생존율 유지가 가능해

진다. 그러나 신경 세포의 냉동 보관 에서는 이러한 여러 조

건들에 대해 많은 부분이 확립되지 않은 상태이다. 본 연구

자들은 냉동 보관시의 여러 변수중의 하나인 냉동 보관제의

농도를 다르게 할 경우 세포의 생존율의 변화가 있는지를

알아보고자 실험을 계획하였다.

재료 및 방법

1. 공여 태자 조직의 획득

임신 14∼15일된 흰쥐(Sprague-Dawley rat, 평균 체중

240g)에 chloral hydrate(400mg/kg)를 복강내로 주사하

여 마취시킨 후, 복부를 70% 에탄올로 소독한 다음 제왕절

개를 시행하였다. 임신된 백서 한마리 당 평균 11개(8∼14

개)의 자궁내 태자가 있었다. 각각의 자궁을 절개하여 태자

를 꺼낸 다음 CRL(Crown-Rump Length)을 측정하여

11∼14mm의 태자를 취하였다. 태자 뇌조직의 중뇌 굴곡

(mesencephalic flexure)부에서 복측 중뇌 조직을 무균적

조건하에서 잘라내어 1.0∼1.5mm3 크기로 절단하여 조직

절편을 만들었다(Fig. 1).

2. 실험군과 조건 설정

모든 실험에 기본적으로 사용한 냉동보관 배양액은 DM-

EM Ham’s F-12(1：1) nutrient medium(GIBCO)이고,

냉동보관제로는 Dimethyl sulfoxide(DMSO)와 Fetal Bovine

Serum(FBS)을 사용하였고, 각각의 농도를 다르게 조합하

여 9개의 실험군을 설정하였다.

Group A 7% DMSO+ 10% FBS

Group B 7% DMSO+ 20% FBS

Group C 7% DMSO+ 50% FBS

Group D 10% DMSO+ 10% FBS

Group E 10% DMSO+ 20% FBS

Group F 10% DMSO+ 50% FBS

Group G 15% DMSO+ 10% FBS

Group H 15% DMSO+ 20% FBS

Group I 15% DMSO+ 50% FBS

각각의 실험군(n＝10)에서 DMSO와 FBS의 농도만 달리

하고 얼리거나 녹이는 방법은 동일하게 수행하였다.

3. 조직의 냉동보관

절단된 신경 조직 절편을 Modified Houle & Das method

에 의해 얼린다6)15)16). 각 조직 절편을 서로 다른 농도의 냉

Fig. 1. Removal of the brain from a 14mm(E15) rat embryo.

김영수 · 한기수 · 이 언 · 김영보 · 유영미

J Korean Neurosurg Soc/Volume 27/March, 1998 301

동보관제 DMSO와 FBS가 첨가된 영양배양액이 들어있는

미세 시험관에 넣은 후 CRYOMED 냉동기(Model 1010,

Forma Scientific)로 옮겨 0.3℃/min의 냉동속도로 -80℃

까지 냉동시킨 후 액화 질소에 옮겨서 -196℃로 5개월간

보존하였다.

4. 조직 해동

조직 절편이 들어 있는 미세 시험관은 37℃의 온수조에

2분간 두어서 녹이는 급속 해동을 시행하였다. 이 때의 해

동 속도는 70∼75℃/min이 되었다.

5. 세포 현탁액 조성

얼렸다가 녹인 조직들을 80% DMEM/F-12와 열처리로

비활성화시킨 20% FBS로 조성된 영양배양액으로 옮긴다.

조직을 0.1% trypsin용액에 넣고 37℃에서 20분간 배양시

킨 후 상층액을 버리고 0.1% trypsin inhibitor와 0.05%

BSA(Bovine serum albumine)용액을 넣는다. 그 후 45

Gaus g에서 5분간 원심분리하여 상층액을 버리고 침전물에

20% FBS-DMEM/F-12를 첨가하여 세포 현탁액을 만든

다. 이 용액에 실리콘 처리된 파스퇴르 피펫을 사용하여 반

복적인 pipetting으로 기계적인 분쇄를 하여 최종적으로 단

일 세포 현탁액(single cell suspension)을 만들었다.

6. 세포 생존율 측정

신경 세포 생존율을 관찰하는 방법으로는 생체 염색법을 이

용하였다. 첫 번째로는 acridine orange와 ethidium bromide

혼합액 10μl에 세포 현탁액 10μl를 혼합하여 haemocy-

tometer에 옮긴후 현광현미경으로 관찰하면 살아있는 세포들

은 녹색 형광을 나타내고, 죽은 세포들은 오렌지색 형광을 보

인다(Fig. 3). 이중에서 살아있는 세포수를 계산하여 백분율을

구하였다. 두 번째로 0.4% trypan blue 10μl와 세포 현탁액

10μl를 혼합한 후 haemocytometer에 옮겨서 역전위 위상

차 현미경하에서 보면 살아있는 세포는 동그란 모양에 투명하

고, 죽은 세포 trypan blue에 의해서 파랗게 염색되어진다

(Fig. 4). 역시 생존한 세포수를 계산하여 백분율을 구하였다.

7. 통계 처리

3회씩 반복 수행한 전체의 실험과정을 각 군간의 비교 및

Fig. 2. Fluoresence photomicrograph of cryopreserved cells, showing A；viable(gree) cells and B；non-viable(orange) cells.

냉동 보관제의 농도 변화가 신경 세포 생존율에 미치는 영향

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통계학적인 분석을 위하여 t-test를 시행하였다.

결 과

백서 태자의 복측 중뇌 조직의 냉동 보관에서 각기 다른 농

도의 냉동 보관제를 사용하여 세포의 생존율을 관찰하였다.

DMSO 7%군에서는 FBS 10%(group A)일 경우 47%, FBS

20%(group B)일 경우는 32%, FBS 50%(group C)일 경

우에는 40%의 평균 세포 생존율을 나타내었다. 이군들은

50%이하의 생존율을 보였다. DMSO 10%군에서는 FBS

10%(group D)일 때 75%, FBS 20%(group E)일 때 71%,

FBS 50%(group F)일 때 66%의 평균 세포 생존율을 보

였다. 이 군들은 앞의 A, B, C군에 비해서 세포 생존율이 높

았으며(p<0.05), FBS 농도가 증가할수록 생존율은 낮아지

는 것을 보였다. DMSO 15%군에서는 FBS 10%(group G)

일 때 70%, FBS 20%(group H)일 때 76%, FBS 50% (group I)일 때 71%의 평균 생존율을 보였다(Table 1 및

Fig. 4). 이 군들 역시 A, B, C에 비해서 생존율이 높았으며

(p<0.05), FBS농도가 중간값 일 때 생존율이 높음을 알 수

있었다. 본 실험에서 냉동 보관후 해동된 신경세포의 생존율

이 가장 높았던 경우는 group H(15% DMSO+20% FBS)

의 76%와 groupD(10% DMSO+10% FBS)의 75%였으

며, 통계으로 유의하였다(p<0.05). 다음으로는 group E, G,

I, F에서 세포의 생존율이 각각 71%, 70%, 71%, 66%의

순으로 높았으며, 역시 통계적으로 유의하였다(p<0.05). 또

한 전체 실험군 중에서 DMSO 농도가 7%인 A, B, C군은

다른 6개의 군과 비교하여 상대적으로 저조한 세포생존율

을 나타내었다(Fig. 4).

고 찰

여러 조직의 냉동 보관이 임상적으로 이용된 것은 오래 되

었으며, 현재 널리 사용되고 있다. 그러나 신경조직의 냉동

보관은 비교적 최근의 일이다3)14). 1953년 Luyet과 Gonzales

가 닭의 뇌조직을 -196℃에서 저장하여도 생존하는 것을

처음으로 관찰하였으며, 1980년 Houle과 Das등은 포유류

의 태자의 뇌피질 조직이 -96℃에서 1∼18주간 생존이 가

능함을 보고하였다15)16)17). 1983년 Das등은 태자의 뇌피질

뿐만 아니라 뇌간조직도 -90℃에서 9주까지도 생존하는 것

을 보고하였다. 1988년 Vincenzo Silani등은 인간의 뇌세

포를 냉동보관한 후 세포배양을 하여 세포 생존율을 측정하

였으며, 신선뇌조직의 평균 생존율은 약 90% 이상이라고 하

였고, 냉동보관된 조직의 평균 세포 생존율은 약 60% 전후

라고 하였다32). 그는 또 냉동보관 기간이 세포 회복과 생존

율 곡선에 영향을 미치지 않는 것을 보고 하였고, 신경 세포

조직은 생존율의 소실없이 -196℃에서 370일간 냉동보관

이 가능하다고 하였다. 과거 본 저자들이 행한 일련의 백서

신경 세포 냉동보관 실험에서는 냉동하지 않은 신선한 뇌조

직의 세포 생존율은 대략 92%였으며, 냉동보관한 조직은 기

간에 상관없이 65%정도의 생존율을 나타내었으며, 다른 연

Table 1. Cell viability according to different concentration of cryoprotectant

Sample No. A B C D E F G H I

1 60 34 35 80 69 68 75 83 65 2 34 33 45 70 69 61 67 73 73 3 48 30 40 75 71 66 70 72 77

MEAN(%) 47 32 40 75* 71* 66 70* 76* 71* Cell viability expressed as percentage of viable cell. *：p<0.05

Fig. 3. Phase contrast photomicrograph of frozen rat brain cellsshowing viable(clear) cells and non-viable(blue) cells.Percentage of viable cells was calculated.

Fig. 4. Changes of cell viability of neural tissue freeze-stored un-der various condition of cryoprotectant concentration.

김영수 · 한기수 · 이 언 · 김영보 · 유영미

J Korean Neurosurg Soc/Volume 27/March, 1998 303

구자들의 결과와 동일함을 알 수 있었다5)11)18)30).

냉동 보관된 신경세포의 성공적인 회복을 위한 요소로는

냉동 및 해동속도, 냉동 보관제 선택 및 그 농도, 저장온도,

저장배양액의 이온조성과 pH등이 있다10)17). 세포 조직은

냉동 보관 및 해동 과정에서 상당한 세포의 손실이 발생하

는 것으로 알려져 있다. 그리하여 세포 생존율의 손실이 적

은 보관방법을 찾기 위한 많은 연구들이 행해졌으며, 이런

연구들로부터 세포손실은 진행적이며 불가피한 것이고, 저장

상태에 의존한다는 것들이 알려졌다26)28)34)36). 세포사(cell

death)는 세포막 손상으로 발생되며 여러 원인이 있다. 조

직의 준비 조작과정에서는 무산소성(anoxic)또는 허혈성

(ischemic)상태가 세포손실을 악화시킬 수 있다고 한다10).

실온에서 보관시에는 무산소성 대사에서 발생되는 대사산물

에 의한 손상이 세포사의 주 원인이라고 하며, 4℃로 냉각

시킬 경우 대사속도가 저하되어 이런 손상을 최소화 할 수

있어서 생존율이 높다고 한다30)33).

냉동 과정시에 세포에 영향을 미치는 가장 위험한 2가지

손상은 세포내 얼음 결정의 생성과 용액효과 손상이다10)17)19)22).

이것은 세포막에 기계적인 스트레스와 삼투압 스트레스를 가

해 세포막 손상을 야기시켜 세포사를 일으키는 것으로 알려

져 있다. 이들 손상은 냉동 속도를 1분당 1℃로 일정하게 유

지하면 최소화 할 수 있다25)27).

냉동저장온도가 충분히 낮지 않을 경우 세포내외에서 얼

음의 재결정화가 일어나 세포에 손상을주어 치명적인 것으

로 알려져 있다19)22)24). 장기간 보관을 할 때는 -100℃이

하로 보관하는 것이 이상적이라 한다. 본 연구에서 저자들은

-196℃의 액화 질소에 조직을 저장하여 세포 손상을 방지

하였다. 해동 속도는 냉동 과정 못지 않게 중요하며 현재 해

동에는 실온 상태에 조직을 10분간 방치하는 느린 해동(slow

thawing)과 37℃의 온수에 2분간 재빨리 담그는 빠른 해동

(fast thawing) 방법이 쓰인다7)12). 느린 해동시에는 작은 얼

음 결정들이 재결정화되어 세포 손상을 일으키므로 빠른 해

동이 더 좋을 것으로 생각된다15)32). 이 때 빠른 해동 속도는

70∼75℃/min이다.

냉동 보관시에 세포들은 냉동보관제라는 화학적 첨가물이

있어야만 생존하는 것으로 알려져 있다10)17). 냉동보관제의

작용기전은 아직까지는 정확하게 밝혀져 있지는 않으며 그

자체는 온도 의존성 세포 독성을 나타내어 온도가 높을수록

세포 독성이 높다고 한다21)29)31). 이런 냉동 보관제는 세포

내 작용제와 세포외 작용제로 나누어진다. 세포내 작용제는

세포내 대사 과정에 관여하며 glycerol과 DMSO가 이에 해

당된다. 세포외 작용제는 polyvinyl pyrrolidone(PVP)와

dextran이 있으며 세포막을 보호한다고 한다. Dong등은 FBS

가 DMSO의 효과와 대등한 세포보호 역할을 한다고 하며,

DMSO를 대치할 수도 있을 것이라고 한다9)10). FBS는 혈

청내의 단백질과 지질 성분이 손상된 세포막의 보수 및 재

생을 도와주고, 화학첨가제의 독성을 제거시키는 역할을 한

다고 생각된다.

Silani 등은 DMSO의 농도를 2%에서 20%까지 변화시키

면서 냉동보관제 농도에 따른 세포 생존율의 변화를 측정하

였다. 그의 실험은 DMSO의 농도만 변화시켰고, FBS의 농

도는 20%로 고정시킨 실험이었다. 그의 결과에서는 DMSO

의 농도가 7%와 10%일 때 53%의 총 세포 생존율을 보여

가장 높은 생존율을 보였고, 15%나 20%의 농도의 DMSO

보다는 7%와10%의 농도에서 더 좋은 결과를 보이는 것을

알 수 있었다 32. 그 기전은 더 연구가 필요할 것으로 생각

되며, 아마도 냉동 보관제 자체의 세포독성이 해동 후의 세

포 손상을 일으키기 때문에 가장 높은 농도보다는 세포 보

호와 손상을 가장 적절히 유지시킬 때의 농도가 결과적으로

더 좋은 것으로 생각되어진다20)23).

본 저자들은 DMSO와 FBS 농도 모두를 변화시키면서 세

포의 생존율을 측정하였다. group H(15%DMSO+20%FBS)

와 group D(10%DMSO+10%FBS)에서 각각 76%, 75%

의 생존율을 보여 가장 좋은 결과를 얻을 수 있었다. 이론적

으로는 냉동보관제의 농도가 높을수록 세포 생존율이 높은

것으로 예상이 되지만 저자들의 결과에서는 group F나 group

I 보다는 groupD와 groupH에서 가장 높은 생존율을 보였

다. 이것은 냉동 보관제의 농도가 서로 가장 적절한 조합일

경우에 가장 좋은 결과를 나타내는 것으로 생각된다.

결 론

백서 중뇌 조직의 냉동보관 실험에서 냉동보관제의 농도

를 변화시켜 세포 생존율을 측정하였고 다음과 같은 결론을

얻었다.

1) 냉동 보관제의 농도가 DMSO가 10∼15%일 때 FBS

가 10∼50%인 경우 서로 비슷하게 70% 이상의 세포 생

존율을 보였다.

2) 통계적으로 유의한 가장 높은 세포 생존율울 보인 것

은 group H(76%)와 group D(75%) 였 다.

3) 냉동 보관제의 농도가 가장 높은 것보다는, 적절한 농

도의 조합일 때 가장 좋은 세포 생존율을 얻을 수 있었다.

4) 냉동 및 해동의 조건을 잘 맞추어주고, 적절한 냉동 보

관제를 사용할 경우에 냉동 보관 기법은 미성숙 뇌 조직의

보관및 저장에 실제적으로 유용한 방법으로 사료된다.

냉동 보관제의 농도 변화가 신경 세포 생존율에 미치는 영향

J Korean Neurosurg Soc/Volume 27/March, 1998 304

• 논문접수일：1997년 12월 1일 • 심사완료일：1997년 12월 20일 • 교신저자：김 영 수

405-760 인천광역시 남동구 구월동 1198번지

중앙길병원 신경외과 전화：032) 460-3308, 전송：032) 460-3899

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