Thermo Scientific LTQ Orbitrap™tools.thermofisher.com/content/sfs/brochures/LTQ orbitrap科学文献一览.pdfLTQOrbitrap_Literature.indd 1 2010-10-15 14:49:21. ... 定量蛋白质组学分析

Thermo Scientific LTQ Orbitrap™科学文献一览

Michaela Scigelova and David Kusel, Thermo Fisher Scientific

蛋白质组学

代谢组学

新陈代谢

脂类

药物控制

环境

LTQOrbitrap_Literature.indd 1 2010-10-15 14:49:21

目录页码

1. 前言 3

2. Orbitrap MS性能的主要表现 3

3. 应用于Orbitrap质谱分析器的分离技术 4

3.1 反相液相色谱 4

3.2 超高效液相色谱 4

3.3 多维液相色谱 4

3.4 气相分离技术 4

4. Orbitrap质量分析器在各领域中的应用 5

4.1 蛋白质组学研究 5-6

4.2 肽段组学 6

4.3 Top-Down蛋白质组学 6

4.4 蛋白质翻译后修饰 7-8

5. 定量蛋白质组学分析 9-10

6. 蛋白质组学数据处理 10-11

7. LTQ Orbitrap在代谢组学研究中的应用 12

8. 脂类物质分析 13

9. 代谢产物分析 14

10. 代谢产物鉴定过程中数据的处理 15

11. 药物监控 16

12. 环境、食品和饲料分析 17

13. DNA和RNA分析 18

14. Orbitrap技术在基础研究中的应用 18

15. 前沿技术的发展 18

15.1 离子迁移谱 18

15.2 新颖的解吸技术 18

15.3 基体辅助激光解吸/离子化 19

16. 结论 20

17. 致谢 20

18. 参考文献 20-28

科学文献综述


前言/Orbitrap MS性能的主要表现

1.前言

Orbitrap™自2000年上市以来，现在已经成为主流的质谱技

术1。首先，Orbitrap质谱仪特有的关键性能体现在容易操

作、日常分析可以达到超高分辨率（>100000）和高精度

质量数，再加上用户在任何时候不需要牺牲灵敏度就可以

达到这些性能。Orbitrap检测器与外部质谱分析器（如线性

离子阱）相结合能实现多级裂解（MSn），鉴定分析物的

结构，并且能与其它离子源相结合，如大气压化学电离源

（APCI），电喷雾电离源（ESI）和纳喷电离源（NSI），或

者与基体辅助激光解吸/离子化（MALDI）相结合。

Orbitrap质谱仪的优异分析性能使其得到了广泛的应用，应

用范围从常规化合物鉴定到复杂基体中痕量化合物分析，

如蛋白质组学、药物代谢、药物控制或者食品和饲料中的

污染物检测。文献综述了Orbitrap质谱仪在各领域中的主要

应用，一些文章还提出了对仪器设计和分析器操作原理

的看法2-21。最近还发表了一篇关于Orbitrap系列最新上市的

Thermo Scientific LTQ Orbitrap Velos仪器技术发展的介绍22。

本文的目的是对下文提到的各种应用领域中发表的文献进

行比较全面的总结。但是由于Orbitrap产品线的巨大成功，

应该注意的是，本文可能难免的遗漏一些非常重要的文

献。

2.Orbitrap MS性能的主要表现

Orbitrap质谱分析器的最大优势在于其极高的质量分辨率和

质量精度，这在分析很复杂的混合物时非常有用。在代谢

物和小分子化合物分析中，足够高的质量精度使其能测定

化合物的质量数，从而排除其他的可能，直接测定得到化

合物的分子式。高质量精度的另一个关键作用可以通过一

个所谓的质量亏损的工具实现，这在处理代谢组学数据时

可以作为一个强大的过滤器23。另外，高分辨率和质量精度

可以同时实现定性和定量，并能保证定性和定量的准确性

24。

在下文的蛋白质组学研究中，母离子质量是数据库检索的

一个限制条件，因此质量精度是一个至关重要的参数。不

确定或者错误的质量数测定结果会导致鉴定结果范围太宽

（如果质量精度窗口设置太宽），更糟糕的是可能得不到

鉴定结果（假阴性，如果质量精度窗口设置太窄）25。在生

物标记物开发研究中，高质量精度可以实现阵列优化和通

过谱图定量26。

获得高质量精度的肽串联质谱（MS/MS）谱图是除经典数

据采集外的另一个有趣的选择，经典数据采集是通过较低

质量精度和线性离子阱或者三重四极杆的单位分辨率检测

碎片离子。Orbitrap检测器采集碎片谱图时，鉴定的特异性

可以补偿数量较少的质谱图和较高的检测限（与线性离子

阱测定碎片谱图相比）带来的影响。也就是说，假阳性概

率一定的情况下，快速的单位分辨率离子阱和较慢但是分

辨率高的Orbitrap能检测出相近数量的蛋白质。获得（数量

较少的）高质量精度的串联质谱图与获得（数量相对较多

的）较低质量精度的串联质谱图相比，在鉴定肽时通过一

些修改能显著提高置信度27。

Orbitrap检测器可以得到在1ppm以内的质量精度16，28-31。使用

内部校正时还能得到更高的质量精度。使用空气中已知的

背景离子被证明是常规获得可靠的低于ppm级质量精度的一

种聪明有效的方法28。另外一种方法依赖特定的背景离子，

这种离子几乎存在于所有的扫描中。这些特点使很多测定

方法能得到非常精密的质量数估计值，为矫正和校准多个

文件提供强有力的手段26。近期报道了一种质量数比例的非

线性重校准方法，这种方法所测每个肽质量数的偏差一般

在100ppb以内，并且不需要在样品中加入内标（锁定离子

质量数）。这样的结果一般限定了单一的肽的成分，因此

代表了最高可用精度25。

前言

/Orbitrap M

S性能的主要表现


3.1. 反相液相色谱

大多数应用领域都存在复杂的混合物，很多样品在进入质

谱分析器前都需要分离纯化。液相色谱（LC）就是其中一

种使用非常普遍的方法，由于它能与电喷雾和纳喷雾离子

化技术无缝对接，因此能实现高度自动化和高通量分析。

反相（RP）液相色谱与Orbitrap仪器联用是使用非常普遍的

技术。在蛋白质组学研究中，通常是在凝胶电泳分离蛋白

质后进行消化，或在样品消化后利用等电聚焦或其他色谱

分析技术（如强阳离子交换SCX）分离复杂的肽混合物后，

采用RP液相色谱与Orbitrap联用技术进行蛋白质鉴定。需要

注意的是一维SDS，一般不需要翻译凝胶电泳分离完整蛋

白质和等电聚焦分离酶消解样品这两种预处理方法，其对

比显示两种方法在任何级别的功能性蛋白的分离上都能得

到可比的结果，没有明显的优劣之分32。C18柱能用于肽分

析，而C8和C4柱通常更适合用于较大的肽和蛋白质33。在小

分子分析领域，反相液相色谱同样应用广泛。有详细的研

究比较了各种反相分离色谱填料，为基于LC/MS的代谢轮廓

研究开发有效稳定的方法34。

应用于Orbitrap质谱分析器的分离技术

3.2. 超高效液相色谱

超高效液相色谱（U-HPLC）与Orbitrap检测器联用在肽和小

分子分析中的应用特别令人感兴趣。必须要有快速的采集

速度才能在很窄的色谱峰范围内得到足够的数据点35。文献

综述了Orbitrap质量分析器与U-HPLC联用技术在很多领域的

应用，如血清磷脂、药物代谢、农药、兽药残留和激素24，

36-39。

0.4s的瞬间采集时间在m/z为400（在基线上宽度为10s的峰

有25个数据点）时能达到30000的质量分辨率38。平行扫描

线性离子阱或分辨率7500，扫描时间为0.1s的Orbitrap质量分

析器（如完成分辨率为30000的全扫描后进行分辨率为7500

的二级质谱扫描相结合在一个峰的范围内能得到20个数据

点）都能很方便的采集MS/MS图谱。上述理论估算的结果

在血清样品的代谢轮廓研究上得到了验证。结果证实5-10 s

的峰宽能在峰的跨度范围内采集足够的数据点，并能保证

良好的灵敏度和质量精度。

Orbitrap检测器与U-HPLC联用分析血清样品时，仪器响应信

号与代谢物的浓度在3.5个数量级范围内呈线性关系，最低

检测限低于1μmol/L35。

3.3. 多维液相色谱

多维液相色谱是基于几种色谱分离方法相结合的技术，应

用于复杂肽混合物的分析40。分离技术可以与质谱在线联

用，也可以采用离线的方式，SCX常常与反相色谱相结合作

为多维液相分离方法41。引入U-HPLC更能改善蛋白样品中肽

的鉴定42。

下文中提到的磷酸肽分析和代谢组学研究（见4.4和7）将反

相分离技术与特定的色谱富集步骤（如亲水作用色谱）相

结合。

3.4. 气相分离技术

策略上所有改进的最终目标都是为了减少样品分离步骤。

采用气相分离手段就可以使这一过程极大简化，几乎可以

实现完全的自动化。对全细胞裂解液的蛋白进行肽段分

析，这一实验很好的体现了气相分离手段的分离效率43。而

且该方法还可以被进一步改进，例如，用C-trap连接于线性

离子阱和Orbitrap质量检测器之间，可以重复产生不同质荷

比范围的离子，直至最终产生百万个数量级的电荷差别。

每一个质荷比范围的离子会被分离，并在Orbitrap检测器中

分析，即由上百次扫描形成一张质谱图。这张综合质谱

图具有超过6000倍动态范围，可以达到亚飞摩尔级的灵敏

度，所有这些都得益于一个基于纳流的电子阵列芯片。此

外，对于同一肽段的不同修饰，也能在LTQ Orbitrap检测中得

以定量。和MALDI、LC-MS/MS的肽段图谱一样，LTQ Orbitrap

也同样可以应用于肽段鉴定和修饰图谱的建立44。

如果样品的分离不可避免，那么任何可能产生偏差的步骤

都是蛋白鉴定准确与否的评价因素45。


Orbitrap质量分析器在各领域中的应用

4.Orbitrap质量分析器在各领域中的应用

Orbitrap出版物中的大部分是在蛋白质组学领域发表的科

技文献（图1）。另外一大类的科技文献是关于如何进行

代谢组学分析，包括代谢产物鉴定、结构表征和下文中

代谢组学，环境分析和药物控制的定量分析。代谢组学

和脂类物质分析领域的研究也经常被引证。还有一些文

献描述了关于核酸分析和基础理化分析领域的研究。

图1.表示Orbitrap质量分析器在业界各个应用领域所发表期刊文章的篇数。

4.1.蛋白质组学研究

直到最近，人们才考虑到质谱分析完整真核蛋白质超出

了现有技术的能力范围。但是质谱技术可以捕获全部酵

母蛋白质46。检测到的蛋白质丰度跨越4个数量级，与TAP

标签或标记绿色荧光蛋白质（GFP）标签的全基因组实验

达到89%重合。而且，这种MS方法鉴定出510种蛋白质，

对低丰度蛋白质的鉴定也没有偏差。

大多数研究团队利用了LTQ Orbitrap系列仪器独特的平行采

集模式（Parallel acquisition mode）：使用Orbitrap对母离子

进行高分辨率和高精度检测的同时使用线性离子阱对子

离子进行快速灵敏的检测。LTQ Orbitrap组合型仪器可以额

外提供将线性离子阱中产生的子离子转移到Orbitrap质量

分析器的功能，对所有离子实现高分辨率和高精度的分

析。

子离子检测的高分辨率和高精度弥补了稍低的采集速

率，有利的推动了修饰肽段的搜索27。蛋白质组的研究

非常复杂，常规蛋白质组学处理流程一般包括分离完整

蛋白质和/或肽段的方法和酶解。每个步骤都应该控制

效率、偏差和重现性。各种样品预处理技术的比较能提

供有用的信息。一本全面的检测宫腔液蛋白质的目录中

收录了三种不同的样品前处理方法（胶内酶解与RPLC结

合，一维SDS-PAGE与RPLC结合和二维PAGE）。这三种不同

的方法鉴定的蛋白质仅有部分是重复的，其中鉴定蛋白

质最多的方法是一维SDS-PAGE与RPLC结合47。

蛋白质酶解是样品预处理流程中非常重要的步骤。LTQ

Orbitrap质谱被用于详细评估较少使用的酶解方法48。最

近报道了一种完整的溶解、缓冲盐交换和高效酶解后进

行简单过滤处理的方法。肽段酶解后过滤洗脱得到纯净

的样品，实现了细胞器的一次性分析和极高的蛋白覆盖

率49。除上面提到的酵母以外，文献还报道了胚胎干细

胞、宫腔液蛋白质和其他全基因组的研究32，46，47。尿蛋白

质组通过一维电泳、胶内酶解和反相HPLC分离后进行LTQ

Orbitrap检测，在基本排除了假阳性的结果后，可以鉴定

出超过1500种蛋白50。

采用

Orbitrap

质量分析器的分离技术

蛋白组学研

究

环境、食品和饲料分析

脂类

代谢组学

药物控制

新陈代谢蛋白质组学

其他

Orbitrap应用



以同样的方法对泪液膜蛋白质组进行分析。通过三级质

谱的检测，肽段鉴定的可信度可以大大提高51。几个实验

室合作使用完全不同的方法和仪器对唾液蛋白质组进行

了表征52，53。对人血清蛋白质组学的研究显示了等度固相

萃取-液相色谱与Orbitrap质谱联用的实用性54。

在细胞器蛋白质组学的研究中，样品分离的最大挑战是

如何进行纯化。然而，巧妙运用温和的蛋白酶进行线粒

体的纯化处理，可以准确得到线粒体胞浆一侧蛋白质的

谱图信息55。激光捕获显微分离技术得到的肾小球中已

有超过2400种蛋白质得到了表征56。Langerhans胰岛是LTQ

Orbitrap质谱分析过的另一种类型的“微器官”，研究检测

出6873个蛋白质，其中每种蛋白至少鉴定了两个肽段，总

的FDR<1%，这是到目前为止所表征的最大蛋白质组56。

LTQ Orbitrap的所有优异性能都在人类疾病研究中得以应

用。从头计算法、准确的质量精度、同位素模拟和“重新

测序”肽段分析手段，这些优秀性能都在生物样品β淀粉

样肽段的定性和定量研究中得以应用。靶向分析这些淀

粉样肽段的代谢是现今阿尔茨海默症研究的主导实验手

段。这种高分辨率的测定可以深入揭示淀粉状蛋白的形

成过程，增强了对药物作用机理的理解和药效发挥的研

究57。

4.2.肽段组学

对内源性肽段的分析补充了经典蛋白质组学研究的内

容。Orbitrap质量分析器可以同时对脑脊液样本进行肽组

学和蛋白质组学的研究，利用高质量精度的一级质谱和

二级质谱，神经肽段可以被准确的鉴定出来58。同样的，

LTQ Orbitrap也可用于人关节液的内源性肽段的分析59。神

经元和内分泌细胞的前体蛋白通过蛋白水解后采用质谱

鉴定出400个肽段。这些信息可用于预测调节型分泌途径

蛋白质的处理位点。虽然使用IPI人类数据库检索时没有

定义酶的特异性，但是Orbitrap分析器可靠的高质量精度

将错误发生率减小到0%60。

当然，不仅仅是分析人类的神经肽，对其他物种神经

肽的分析也可有助于我们对自然界生化反应的理解61。

Orbitrap仪器还用于推导出深绿木霉的非核糖体肽的序列。

基于可靠的高质量精度的ms/ms谱图可以排除序列内的羟

脯氨酸残基存在的可能性。对深绿木霉 ATCC 74058中肽

（如包含α-氨基异丁酸的线性抗生的非核糖体肽段）的

详细表征发现，至少有20种属于哈木菌素群的peptaibol和15

种新的peptaibiotic，其序列与出版的化合物数据库或文献

报道的任何序列都不相同62。

4.3.Top-Down蛋白质组学

制药行业内的生物学研究（如重组药用蛋白和疫苗）有不

断增长的趋势。这也点燃了人们对质谱/top-down蛋白质分

析的兴趣。对于肽段图谱表征和监测完整蛋白的翻译后修

饰，Orbitrap技术也是一种很好的工具，它只需要最少的样

品预处理步骤，因此可提供相对少样品修饰（方法诱导）

下的快速分析。LTQ Orbitrap在这一方面的分析应用首先针

对的是25 kDa的中等大小蛋白分子。现在，这一分子大小

的限制早已被超越，近期的一些出版物发表了关于单克隆

抗体的分析。基于源内裂解的方式，单克隆抗体的可变区

域能够被快速鉴别64。该方法的优点就是可以同时裂解各

种带电状态下得蛋白质，这样可以极大的提高MS/MS检测

对碎片离子的灵敏度，而这是其他方法所不具备的。

Bondarenko等讨论了在线LC/MS技术应用于150kDa单克隆免

疫球蛋白γ抗体分析的技巧和出现的问题33。Orbitrap检测

器观察到每个完整蛋白分子的大约50个带电的离子。去卷

积后作者鉴定出抗体的二硫异形体，重链的谷氨酸和焦谷

氨酸变体，以及完整和裂解后的lgG的糖基化情况。质谱

可以基线分辨率区分一些糖型和不同数量的末端半乳糖残

基。轻链的同位素分辨率（MW约为23KDa）可以准确测定

物种的单一同位素质量。值得注意的是，这些分析都是在

RPLC/MS与质谱联用仪器上以真正的高通量方式实现的。

数据解释是相当复杂的一个过程，因为它要合理的解释一

系列的蛋白修饰变化、点突变、插入突变和缺失突变等等

65。


4.4.翻译后修饰

在真核生物的细胞中，磷酸化是细胞调节生命活动的一

个重要手段。调节信号的输入和激酶-底物之间的关系，

可以通过大量的磷酸化数据得以精确的解释。

但是在做这种大规模的质谱分析之前，必须进行磷酸化

肽段的富集。通过LTQ Orbitrap检测，在测量精度和先进的

软件功能（Ascore）确保预期可信度的情况下，只需要一

个单独的实验就检测出了大量的磷酸化位点66。

金属离子亲和色谱（IMAC）技术可以富集磷蛋白质和磷

酸化肽段。双IMAC富集技术与SCX/RP分离技术以及LTQ

Orbitrap质谱联用，应用于哺乳动物细胞的表皮生长因子

的磷酸化蛋白质组学定量分析，鉴定出接近5000个磷酸

化肽段67。采用同样的方法可鉴定出Drosophila磷酸化蛋白

质组的近13000个磷酸化事件68。采用多维分离策略，包括

制备型SDS-PAGE和IMAC对α因子阻滞酵母的大量磷酸化

分析，在确保可信度的情况下，可鉴定出985种蛋白质的

2288个非冗余磷酸化位点。研究还运用Ascore算法测定了

整个数据组的位点定位的确定性69。

文献还报道了一种两次RP分离与金属二氧化物富集步骤

相结合富集磷酸化肽段的方法70。小鼠肝脏的大量的磷酸

化分析都是采用Orbitrap质谱与SCX、IMAC和包含磷酸化酪

氨酸的肽段的免疫沉淀反应相结合的方法。该研究鉴定

出2328种蛋白质的5635个磷酸化位点，并具有相当高频

率的C端磷酸化。41通过两步磷酸化肽段的富集、随后的

Orbitrap检测和稳定同位素标记方法，可以清楚地揭示了

磷酸化如何进行细胞周期的调节。通过识别超过14000个

不同的磷酸化事件以及对主要位点进行定量，构造了人

细胞系中有丝分裂磷酸化作用的定量地图，对主要的磷

酸化位，而这其中至少一半之前从未有过文献报道71。

有一项有趣的研究将阴离子交换色谱与可逆的键合二氧

化钛相结合，用于富集鸡蛋壳基体中的磷酸化蛋白质。

然后在LC-MSn上采用中性丢失扫描法鉴定出超过150个不

同的磷酸化位点，一些蛋白质作为鸡蛋壳基体化合物首

次被检测到72。

裂殖酵母蛋白质酶解后使用制备型SDS-PAGE分离肽段，

然后对比两种磷酸化富集方法（IMAC和二氧化钛）在肽

段分析上的区别。总计清楚的鉴定出1194种蛋白质的2887

个磷酸化位点，预期在肽段水平上的错误发现率小于

0.5%。研究表明这两种方法的结果相互补充73。

最近，一种改进的亲水作用色谱方法被用于磷酸化肽段

的富集与鉴定，这种方法被定义为静电排斥亲水作用色

谱（ERLIC）74。除了能简单分离非磷酸化物种与磷酸化肽

段以外，ERLIC还能将磷酸化肽段彼此分离，且分辨率很

高。此研究还鉴定和确认了5500种磷酸化肽段，其中包括

相对含量较高的包含磷酸化酪氨酸的肽段。

细胞调控的完整过程可以从动态变化的磷酸化蛋白方面

进行考察。细胞的信号传导主要依赖于可逆的蛋白质磷

酸化过程。利用LTQ Orbitrap，已经有超过2200种蛋白的不

少于6600个磷酸化位点被检测到，同时，这些蛋白被激活

后的短暂动态变化也得以观察。研究显示，大部分的蛋

白都包括不同的磷酸化活性位点75。

相对少量的磷酸化酪氨酸（Tyr（p））极大地限制了其在

大量磷酸化蛋白质组学研究实验中的鉴定。LTQ Orbitrap中

特殊的碰撞池能够提供高能碰撞解离（HCD），这对于利

用诊断肽段离子（m/z 216.0426）准确判断肽段的Tyr（p）

是一种非常有用的工具76。有研究采用抗Tyr（p）肽段免

疫沉淀反应从鼠脑中鉴定出414个独特的酪氨酸磷酸化位

点。对Arabidopsis体内磷酸化位点的大规模筛查共鉴定出

1346种蛋白质中的2172个独特的磷酸化位点。磷酸化丝氨

酸、磷酸化苏氨酸和磷酸化酪氨酸位点分别占85.0，10.7

和4.3%，这强调说明了植物体内的酪氨酸磷酸化含量超

出预期范围78。


肽段组学

/Top-Dow

n 蛋白组学

/ 翻译后修饰


小鼠纤维原细胞的PTP1B酶是蛋白酪氨酸磷酸酶（PTP）

家族中的一员，近期定量磷酸化作用的研究对其细胞功

能进行了全面的描述。稳定同位素标记氨基酸细胞培

养（SILAC）被用于分析PTP1B缺失的小鼠纤维原细胞Tyr

（p）信号的变化。在基本培养条件、表皮生长因子或血

小板源生生长因子刺激条件下一共鉴定了124种蛋白质的

301个磷酸化酪氨酸位点。细胞PTP1B功能和基底特异性

的分析方法可以应用于这个重要的酶家族的其它成员，

并且可能应用于定义细胞信号传送网络的其它PTP的功能

79。

蛋白磷酸化作用是一个普遍和基本的调节过程，并不限

于真核细胞。丝氨酸/苏氨酸/酪氨酸的磷酸化作用在很

多关键细菌蛋白质中都存在。对酶解的细胞裂解液的B.

subtilis磷酸化蛋白质组进行全面、非凝胶和特异性位点的

分析，鉴定出78种蛋白质的78个独特的磷酸化位点：丝氨

酸上54个，苏氨酸上16个，酪氨酸上8个80。79种E. coli蛋白

质中也同样鉴定出81个磷酸化位点，丝氨酸/苏氨酸/酪氨

酸磷酸化位点各占58%/23%/9%。尽管B. subtilis和E. coli的

基因种类不同，它们的磷酸化蛋白质组在磷酸化蛋白质

的尺寸和种类，以及丝氨酸/苏氨酸/酪氨酸的磷酸化位点

81。

对于组蛋白，磷酸化不是它的唯一一种修饰方式。乙酰

化、甲基化和甲酰赖氨酸残基的泛素化，这三种都是组

蛋白质谱检测过程中需要鉴定的修饰方式82。虽然区别这

些蛋白修饰不是LTQ Orbitrap检测时直接的任务目的，但是

LTQ Orbitrap检测的高质量精度使得它可以作为分析蛋白修

饰的一项有效手段。一个例子就是采用基体辅助激光解

吸/离子化-飞行时间串联质谱（MALDI-TOF）分析鼠类重

组突变的二恶英受体，该受体分子的分子量增加了+28u。

然而，二甲基-赖氨酸（+28.031300 u），甲酸基-赖氨酸

（+27.994915 u）和赖氨酸突变成精氨酸（+28.00615 u）可

以造成分子量28U左右的增加，但是MALDI-TOF的质量精度

通常不能区分这些修饰。作者使用的LTQ Orbitrap组合型仪

器上母离子的质量精度达到亚ppm级，能精确鉴别在受体

上进行的N,Nε-二甲基-赖氨酸修饰83。

糖基化代表了另一大类精细的翻译后修饰。LTQ Orbitrap

系统具有多级裂解（MSn）的能力，能用于鉴定药物

Fondaparinux制备过程中的一种五糖杂质的结构84。

另一项研究试图使用质谱区分1-O-十八烷基-3-O-（N-酰

基）神经氨酰基-sn甘油的钠盐的唾液异头物。研究提出

了关于结构上的假设，肽键方向上的大糖苷配基影响碰

撞诱导裂解碎片85。

在过去几年中，一种叫做电子转移碎裂（ETD）的裂解

手段逐渐应用于蛋白和肽段翻译后修饰的分析鉴定。最

近，有报道显示这种碎裂方式已经在LTQ Orbitrap系统中有

所应用18-20。在真核细胞内的，精氨酸（Arg）的甲基化

发挥着很重要的作用，特别是发生在多个近距离Arg的范

围内。甲基化精氨酸包含在大量Arg中是质谱分析的一个

挑战；肽段在电喷雾离子化（ESI）模式下带很多电荷，

这就限制了很多碰撞诱导裂解（CID）模式下会产生有序

列信息的产物数量。同样，CID模式下由于不稳定的甲基

会脱掉，这阻碍了肽骨架有效的裂解。文献报道了一种

方法用于测定相对复杂的混合物中肽段的Arg甲基化的范

围，这种方法采用纳升LC与CID/ETD联用测定肽段序列，

MA定位和表征，Orbitrap检测器精确测定母离子，MA-肽段化

学计量方法相对定量86。另一研究报道了LTQ Orbitrap质谱在

ETD模式下直接测定α-GlcNAc糖基化87。

在LTQ Orbitrap系统中，对肽段碎裂行为更深入的了解，和

LTQ Orbitrap对离子选择能力的提高，使得我们可以获得

更智能的数据来发展“决策树”这种数据分析方式。实际

上，可以根据母离子分子量和电荷状态为各种裂解技术

（CID，ETD，HCD）实时选择MS/MS数据分析方式。以上

这些分析蛋白和肽段修饰的例子说明，LTQ Orbitrap以其强

大的分析处理能力和简便的操作获得了众多客户的好评

20。


Title page reproduced with permission from J. Am. Soc. Mass Spectrom., August 2009, 20 (8).Copyright 2009 Journal of The American Society for Mass SpectrometryTitle page reproduced with permission from Anal. Chem., May 15, 2007, 79 (10).Copyright 2007 American Chemical Society. Graphic concept by Lucas Magalsky,illustration by Julie Farrar.


5. 定量蛋白质组学分析

定量已经成为现今蛋白质组研究中不可或缺的内容。质

量精度高、分辨率高、离子容量大和检测动态范围广，

相对于单纯的离子阱质谱检测，LTQ Orbitrap的上述优点使

得对特征肽段定量检测能力有了极大的提高88。在包括同

位素标记方法在内的众多蛋白定量手段中，SILAC因其适

应范围广，对绝大多数蛋白均可适用的特性，被一致认

为是较好的蛋白定量手段。通过对经一维电泳和等电聚

焦分离后的小鼠胚胎细胞蛋白进行SILAC，有超过5000种

蛋白被定量并且检测到了相关数据，成为有报道的最大

的定量蛋白质组学数据32。近来，SILAC方法已经应用于完

整蛋白的定量和表征。从裂解碎片离子之间的质量偏差

信息里就可以得到标记残基的大量信息，大大简化了蛋

白的鉴定和表征过程89。

定量蛋白质组学还用于寄生生物学研究。疟原虫

Plasmodium falciparum在滋养体时期的蛋白质表达发生改

变，采用稳定同位素标记结合阴离子交换色谱，SCX/RP分

离和Orbitrap检测器联用测定氯喹和青蒿素处理过程。共

检测出1253种滋养体蛋白，其中30%是新物质。定量分析

了超过800种蛋白质90。

利用稳定同位素、不同处理方式的样品定量检测方法现

已建立。从某一方面来说，绝对定量，在蛋白质组学中

是一个相对较新的概念。通常，由于样品预分离处理具

有一定的可变性，所以它要求在实验流程的后期将标记

的标准品加入。最近，SILAC方法被用于标记重组蛋白，

这些标记的重组蛋白会作为内标直接加入细胞裂解液中

（例如，在样品处理过程中的早期加入可以减少处理过

程导致的变化）91。在这样一个复杂体系中，该方法可

以对跨度为几个数量级的蛋白进行定量。这种检测限

（LOQ）使得HPLC后对碎裂离子未经任何额外选择即获得

了150 attomole。

源于近年来质谱和色谱检测技术的进步，无标记定量这

种定量方法也具备了较高的可信度。这种检测方法主要

基于对某一物质质量和洗脱时间的准确测定，这得益于

Orbitrap质量分析器准确稳定的质量精度，而使得在整个

蛋白质组规模的定量比较实现了经济可行92，93。其中的

一个应用就是利用完整的蛋白/肽段样品对人类血浆的不

定量蛋白质组学分析

同蛋白质组进行分析。每个蛋白/肽段包含2000-4000个细

胞，显示了纳克蛋白质定量的超高灵敏度56。

面对众多的蛋白/肽段定量手段，任何一种尝试比较其

优缺点的研究都是非常有意义的。针对多维LC分离设置

的背景，我们开展了一项对比稳定同位素标记方法和传

统光谱检测方法的研究。稳定同位素的定量方法在生物

复制过程中具备高度的可重复性；而传统的光谱检测方

法，由于可重复的样品蛋白具有较低的光谱吸收，因此

导致检测结果相关度不高94。

另一蛋白定量手段就是同重同位素标签标记定量，如TMT

或iTRAQ试剂，这种方法是基于在低质荷比区域对特定

报告离子的测定，利用的是二级质谱目标肽段的信息，

这些信息现在可以在LTQ Orbitrap系统上通过脉冲-Q-裂解

（PQD）或高能量裂解（HCD）技术得到95，96，97。很重要

的是这种方法一定要非常高的分辨率，尤其是在低质量

范围，这样才能消除真正的报告离子的干扰。比如，精

氨酸的m/z 115.087碎片会影响m/z 115.108的报告离子的定

量，除非仪器在m/z 115时分辨能力能达到大约15000。近

期文献显示将多元TMT或iTRAQ质量标签与ETD裂解方式

相结合是可能实现的，这样可以在裂解过程中保护肽段

序列中不稳定的修饰87，98。ETD测定的报告离子比例的准

确性和精度与CID技术相近。在定量分析晶体中修饰肽段

时，ETD质谱的同一张谱图上提供了可信的序列信息、糖

基化位点的定位和定量信息87。

在复杂混合物的分析中，定量精度被证明是与信噪比

(S/N)息息相关，因此需要开发在低S/N时显著减少测量结

果变化的运算方法。在评估质量测定精度与S/N的相互关

系后，平衡两者关系使鉴定和定量达到了最佳效果99。

修饰/蛋白组学的定量分析


Thomas和同事在分析胰岛素和合成的类似物时，在高分

辨率和质量精度的条件下对内源性肽类激素进行了绝对

定量100。他们采用抗体包被磁珠方法处理尿样得到十分

干净的提取物，使色谱分离和离子化能在纳升级水平上

进行。高分辨全扫描数据验证了鉴定结果，提供定量信

息。CID能将合成的和动物胰岛素与它们的人类同源物区

分开来，这对处理与人类胰岛素具有相同分子量的Lispro

变体特别重要。这篇文章进行了方法验证，结果是LOD

0.5 fmol/mL，精密度 < 20%，回收率~30%，线性范围2-40

fmol/mL。

目标肽段的绝对定量是发展很快的一个领域，使用的仪

器一般是三重四极杆质谱。但是高分辨Orbitrap分析器能

得到可比的方法精密度、准确度、线性和灵敏度。与选

择反应监测（SRM）不同，orbitrap必须使用串联质谱以获

得优异的选择性和灵敏度，Orbitrap分析器可以利用全扫

描模式的高分辨率和质量精度获得理想的灵敏度和选择

性。Orbitrap方法的一些优势有：方法设置容易操作（不

需要建立和优化离子对），捕获串联质谱上所有的信

息，而不是只有目标离子101。其他一些研究团队以Orbitrap

二级质谱数据为基础设置SRM方法，因此极大地推动了目

标SRM方法的发展102，103。

蛋白质组学数据处理

6. 蛋白质组学数据处理

数据处理过程具有巨大的探索空间。现有的商业化数据

处理软件包只能作为数据解析的基本工具，因而许多研

究小组仍然致力于发展在蛋白质组学研究过程中不同阶

段的特异性数据算法。准确测量母离子的单同位素质量

数和所带电荷数可以显著提高肽段鉴定的效率104。在鸟枪

法实验中，利用相似的特征检测算法进行的海量数据处

理结果显示，超过11%的子离子的二级质谱数据是包含其

他物种信息的105。在大部分的这种情况下，仪器会捕获

两个具有相近质量的母离子，导致两个离子在二级质谱

图上重合。在质谱图上重叠的两个峰中只有信号较强的

肽段才能被鉴定。作者通过同时检测两个母离子得到了

母离子质量不同的两个峰的列表，由此达到较高的鉴定

率。

因此，处理肽段一级质谱和二级质谱数据时，一些有趣

的概念应运而生。LTQ Orbitrap系统可以提供综合的数据处

理设置，例如一级质谱结合二级质谱信息，或者二级质

谱结合三级质谱信息，甚至是利用二级质谱的高分辨率

结合单位分辨率信息设定数据处理，这些都是常用的数

据处理方式。通过综合一级质谱和二级质谱的信息可以

大大提高低丰度蛋白质的鉴定灵敏度。该方法的优势就

是根据二级质谱数据得到的检索信息可以在一级质谱的

数据中得以检查和确认106。从Orbitrap质量分析器得到的精

确质量信息，结合LTQ部分的高灵敏度数据进行分析，这

种方式可以带来某些特定优势。诸如，相比于单独进行

Orbitrap和LTQ数据检索，上述综合数据处理设置可以鉴定

更多肽段。更广义的说，上述例子也说明LTQ Orbitrap可为

平行数据采集的利用提供更加清晰明了的处理方式107。

一种简单的采集后数据处理方法可以极大的提高肽段的

鉴定率。不考虑ETD质谱的一些特点（如母离子电荷减

少，中性丢失），肽段的鉴定率提高了28.6%，错误发现

率保持在~1%108。

有些团队已经着手相关定量软件的开发。像无标记分析

一样，这些团队中的一些接受高分辨或单位分辨的数

据，并且将其用于多标记和无标记分析109。综合液质联用

和高分辨的质量精度及洗脱时间定位，相应的处理软件

得以开发。这种分析流程扩增和结合了已有的LCMS/MS和

LC-MS数据分析的开放性资源平台，并且对于大部分人群

是免费可用的110。

LTQ Orbitrap带来了一种独一无二的工具，叫做“从头测

序”，换句话说，即质量精度高、包含二级质谱和多级质

谱信息相结合的一种新的去除方式。比如，利于HCD裂

解从头测序测序可以确保碎片离子的高质量精度和分辨

率，亚胺离子和其它低分子量离子被检测到。通过简单

的手动或自动处理可以有效的去卷积。达到一定质谱测

定精密度的肽段“从头测序”，就是直接查看肽段序列，而

不是在某一质谱数据库中比较。这种分析手段已经被证

实是相当有效的，并且允许以一种新颖的方式利用数据

库资源，例如检索可变剪切的肽段产物或融合蛋白的产

物112。综合“从头测序”方法和传统的序列相似性检索的方

法是具有一定优势的。这种方法可以深入分析一种血液

寄生虫疾病（美洲锥虫病），这种疾病在现今这些基于

基因组学的序列数据中是无法分类的113。


这里必须要说的关于“从头测序”的一个问题：肽段鉴定的

可信度介于统计学边缘，这就造成了蛋白质组特征分析

时关于可靠性和重复性的一个明显的瓶颈。因此，一个

完整的研究流程是，既要具备“从头测序”软件（二级质谱

信息）的独立性，同时又可以紧接着进行基于BLAST策略

的序列相似性数据库检索。在利用线虫蛋白进行研究的

模型中，有超过70%的处于可信度临界值的质谱检索结果

可以得到快速分配处理114。

每一次蛋白质组学Top-Down研究策略的更新都伴随着相关

软件的发展。数据解释是相当复杂的一个过程，因为它

要合理的解释一系列的蛋白修饰变化、点突变、插入突

变和缺失突变等等65。ProSight软件是当前分析高分辨一级

质谱和二级质谱谱图的最先进的工具包。它是基于鸟枪

法肽段数据库（如一个肽段数据库加上众所周知的蛋白

质修饰活动）结合质量偏差小于5ppm的肽段碎片数据，

因而充分利用了新一代组合型FT质谱的优势115。文献最近

报道了母离子独立top-down算法用于分析所有蛋白质的串

联质谱图，自动鉴别蛋白质116。

蛋白组学的定量分析

/ 蛋白组学数据处理


7. LTQ Orbitrap在代谢组学研究中的应用

代谢组学同蛋白质组学具有很多的相似之处，即都是高

通量的分析复杂的样品基质，并且最终目标相同。这种

对代谢产物的最大范围和最可靠的鉴定将基于设备的高

分辨率，同时结合母离子和子离子的多级质谱检测4，117。

这一策略已经通过对血浆中间代谢产物氧甾醇的研究得

以实现，氧甾醇属于一种和神经退行性疾病（例如阿尔

茨海默症，多发性硬化疾病）相关的化合物亚种118。

Orbitrap质量分析器的应用使得代谢组学的整体研究手段

得以进一步简化。例如，LTQ Orbitrap的分辨率使得色谱分

离过程大大精简。生物样品可以被直接引入测定。这种

方法的有效性已经在基质效应、线性相关和定量精密度

方面被逐一验证。相同的分析也包括对多级质谱裂解数

据的研究，这些数据是结构验证的基础，而样品结构验

证的基础取决于仪器对母离子检测的质量精度119。

基于LC/MS的代谢轮廓研究主要集中在开发有效的正离子

和负离子电喷雾模式下的LC/MS方法，用于鉴定生物学样

品中大量的代谢产物。研究详细比较了各种LC固定相和

流动相系统，最终选择了分离45种混合代谢化合物效率

最好的流动相和固定相系统。小孔径（如<100 Å）和大

表面积（如>400 m2/g）的填料对极性小分子的保留效果

最好。此研究中优化得到的流动相为含10mM醋酸铵的水

（醋酸调节pH到5.3，A相）和含10mM醋酸铵的90%乙腈

/10%水混合溶剂，正离子或负离子ESI模式都适用。指数

型的梯度洗脱能得到更好的分离效果34。

代谢提取物可能十分复杂，一般包含小分子有机酸和氨

基酸、核苷酸、碳氢化合物、维生素和脂类物质。极性

化合物在C18反相色谱柱上在死体积时间内就会被洗脱出

来。亲水作用色谱（HILIC）的流动相加入合适比例的水

（通常是5-15%）可以在极性固定相上形成稳定的水层，

待测物在流动相和此水层之间进行分配。HILIC是通过强

有机溶剂流动相和亲水固定相上将化合物分离，增加流

动相中水的比例可以缩短分析物洗脱的时间。

有机溶剂（如甲醇和乙腈）流动相的挥发性使HILIC的柱

后压较低，有利于提高二级质谱检测的API离子化效率

120。利用HILIC保留亲水性化合物，使憎水性物质很快的流

出，这对代谢轮廓研究实验非常有用。鞘脂类和卵磷脂

LTQ Orbitrap在代谢组学研究中的应用

之类的化合物在色谱柱上很快被洗脱下来121。采用HILIC-

LTQ Orbitrap平台研究rosy (ry) 果蝇突变的代谢轮廓，所检测

到的代谢物变化与之前的报道十分符合。另外，在一些

代谢途径的研究中发现有完全出乎意料的变化122。

在用反相色谱分析富含硒的研究中，同样发现很多含硒

化合物在死体积时间内被洗脱出来。将极性化合物保留

在HILIC柱上有利于它们的检测和表征。HILIC与LTQ Orbitrap

质谱联用广泛应用于富硒物种的鉴定，电感耦合等离子

质谱证实Orbitrap检测器上观察到的9种化合物占含硒化合

物总进样量的97%。这9种含硒化合物中的七种在HILIC与

TOF MS联用仪器上未检测到，通过比较突出了Orbitrap质

谱更高扫描内动态范围的重要性。与TOF MS相比的另一

个不可否认的优势是Orbitrap采用4级质谱时的质量精度仍

有亚ppm级，而且大的碎片窗口能够覆盖所有同位素的质

量范围30。

代谢组学研究的一个重要压力来源于投入时间、费用和

产出效益的问题。在对真菌麦角固醇抑制途径的研究

中，LTQ Orbitrap可以合理的处理上述矛盾关系。在几秒

钟的数据处理后，就找到了该代谢途径中断的关键位点

123。其他团队将注意力集中在如何优化代谢产物的提取

分离条件。这些研究的最初结果导致了一种二元毛细管

液相色谱的产生，它可以从藻类代谢提取物中可重复的

检测到大约900个特征峰34。

提高效率的另一个趋势是使用U-HPLC，色谱填料粒径小于

2μm，压力高达15000psi。为了保证在较窄的色谱峰内得

到足够的数据点，必须快速采集数据。U-HPLC与Orbitrap质

谱联用技术的应用已经在上面的第三部分详细讨论过35，

38。


8. 脂类物质分析

尽管一些真核生物体的转录组、蛋白质组和相互作用组

已经详细描述过了，有关脂类学的讨论仍然相当少。

Orbitrap质量分析器的高分辨率可以直接描述出整个脂类

提取物的所有信息。主要类别的脂类物质可通过准确

测定母离子质量数进行鉴别，不需要求助于MS/MS。这

种自动化“鸟枪法脂质组学”分析可应用于Saccharomyces

cerevisiae的单个脂类物质分子在脂质组范围内的绝对定

量。对21种主要脂类类别的250个脂类分子进行了绝对定

量，覆盖了95%的酵母脂质组，与之前的方法相比，灵敏

度提高了125倍124。

脂类结构的鉴定是质谱应用的另一重要领域。LTQ Orbitrap

在脂类分析中的第一次应用是对鞘脂类和甘油磷酸脂类

分子组成进行快速、广泛和特异性的结构描述125。LTQ

Orbitrap所具备的正离子和负离子扫描模式清晰的揭示了

在完整的脂质A中脂肪酸的分布126。在脂质分析的领域，

数据分析手段（Boolean扫描）必须能够深入解释碎裂的

母离子的结构信息127。在整个一系列实验中，随后的主

要化合物分析清楚的揭示了脂类丰度和物种的不同所产

生的干扰。在相同的数据采集设置下，可以通过二级质

谱信息鉴定有修饰的脂类。这种高通量筛选手段可以为

功能基因组学的研究做出很大的贡献128。

可以将样品直接注入质谱仪中完成进样，然而，对于复

杂的样品，我们使用RP液相色谱对其进行简化。已有文

献报道使用U-HPLC与Orbitrap质谱联用分析了人血清样品中

的磷脂24。

LTQ Orbitrap所具有的高质量精度和分辨能力在脂质氧化过

程的研究中是非常必要的，尤其是将脂质氧化作为冠心

病发展和治疗效果的相应评价标准129。另外一个和脂质

氧化相关的就是大鼠脑中胆固醇代谢物鉴定方法的建立

130。注入50 μg大脑到色谱柱中，鉴定得到了新的氧化固

醇。二级质谱和三级质谱在这个水平上已经可以提供足

够的结构测定信息。

脂类物质分析

最近有研究揭示了高血压与脂类轮廓的具体联系。95种

脂类物质通过top-down脂类学研究方法测定了丰度，这95

种脂类物质来自于70位男性血清中的10类脂，其中19名男

性患有高血压。研究揭示了高血压与血浆游离胆固醇和

醚脂水平的降低有具体联系，特别是卵磷脂和磷脂酰乙

醇胺醚，其它脂类物质几乎没有受到影响。这些结论可

能成为治疗代谢综合症和高血压的新饮食策略的基础131。

Orbitrap

应用于代谢组学

脂类分析


9. 代谢产物分析

代谢物鉴定研究仍然是临床前和临床药物开发项目必须

而且很重要的一部分。由于大量内源物质会掩盖药物及

其代谢物，生物样品的分析面临着很大的挑战，如血

浆、尿液、粪便和胆汁。人类样品的分析更为复杂。人

类与动物物种不同，动物群体是维持在某一个受控的环

境中，而人类生物基体有很大变量（环境因素、种族差

异、饮食习惯、疾病状态和自我医疗等等）。尽管分离

技术联用可以部分减少样品的复杂性，高分辨质谱仍然

是一种快速经济的样品分析方式。

当前在药物开发阶段（如药代动力学，微粒体稳定性研

究）的代谢组学研究主要还是采用三重四极杆质谱进

行定量分析。此方法必须优化仪器参数，如Q1和Q3 m/z

值、碰撞能量和接口电压。这些研究仅仅检测特定的化

合物（目标物方法），像代谢物等其它化合物的信息都

没有。全扫描数据采集定量分析可以不用优化化合物，

还能检测代谢产物和其他非药物相关的内源化合物。

Orbitrap质量分析器能对单次采集的数据同时进行定性和

定量分析36。

Orbitrap质量分析器的低质量偏差可以减少或消除背景化

学噪声，显著提高验证的灵敏度或消除代谢产物和其同

质异素体。采用这种方法分析了萘法唑酮代谢产物132。人

类肝微粒体制备的拉呋替丁和其代谢物的分析也采用相

同的策略133。串联质谱结合准确质量数测定应用于小鼠尿

样中14种镇静安眠剂代谢物的结构鉴定。鉴定出的一些

代谢物是以往文献从未报道过的134。另一项研究报道了类

似的卡维地洛的一些新GSH结合物，这可能解释了临床试

验和近期临床问题中的肝中毒135。

利用Orbitrap我们发展了一套简单快速的LC-MS/MS定性方

法，用于在天然植物提取物中分析环丙烷多巴和哌嗪二

酮类生物碱类化合物。基于二级质谱数据就可以鉴定出

生物碱类物质基本的组成成分及其在色谱中的保留能

力，并且低于5ng/mL的浓度我们都可以检测到。这种筛选

方法降低了生物碱类物质在检测时间和成本上的消耗，

因此也可以作为其他具有类似结构的天然化合物的一种

简单便捷的检测手段136。

有趣的是，研究人员使用氢氘交换色谱时，LTQ Orbitrap可

代谢产物分析

以应用于痕量级杂质的鉴定137。

最近，出版物提出了定量的问题，将Orbitrap与Sciex™ API

4000三重四极杆质谱SRM检测模式进行了比较。这两种

方法具有可比的方法精密度、准确度、线性和灵敏度。

15种药物在这两种方法上的检测结果具有统计上的一致

性。作者评价全扫描高分辨质谱的一个最大的优势在于

其不仅能获得目标物的信息，还能得到样品中其它化合

物的信息，这些数据可以在任何时候进行检索。在这种

情况下离子阱同时采集二级质谱数据可以确认代谢物的

结构。总而言之，高分辨质谱可以将生物分析过程简单

化，因为计算的分析物的理论质量可直接用于小分子定

量，任何化合物都不需要调谐138。

高分辨率、高质量精度和扫描速率的质谱使目标物分析

和无偏差的代谢物轮廓分析成为可能24。由于理论质量

数可以用于提取离子，因此可以在理论候选代谢物列表

中查询数据，不需要任何预先实验筛选、实验结果或证

据。然而，真正的优势在于在所需质量范围内可以获得

任何离子的准确质量数，具有与二级质谱方法相同的特

异性24。

值得注意的是，在三重四极杆质谱中应用很好的一些实

验现在也转移到LTQ Orbitrap中进行，以便利用LTQ Orbitrap

极高的质量精度来确定某些代谢产物。在四极杆线性离

子阱质谱中，同位素分布谱图质量的下降是其非常大的

一个缺陷（是在enhanced mass 模式下），这种现象在低丰

度的次级代谢产物的测定中尤为明显。但是，LTQ Orbitrap

的全面FT扫描模式可以很好的还原同位素分布139。最近，

关于同位素标记丰度的详细研究显示，误差主要保持在

几个百分点以内。RP分辨率为7500时检测到的10种化合物

（m/z 639到1,663 Da）的误差不超过3%，分辨率达到60000

时的误差在可接受范围内140。


Orbitrap质量分析器能够清晰的获得同位素数据，这种能

力可以用来激发数据相关的子离子扫描模式。与传统的

子离子扫描模式或中性离子丢失的扫描模式相比，该方

法具备很宽的检测限，原因在于它是独立于化合物的碰

撞诱导解离过程的。这一特性在含金属化合物和某一特

定同位素原子标签化合物的分析中非常方便，例如硫元

素和溴元素。像这样一种方法，就能够同时对谷胱甘肽

结合物代谢的新产物进行检测和结构分析141。

像砷、硒这种能够含有金属离子的代谢产物，由于其营

养价值以及潜在的毒性而得到重视。。许多金属化合物

都可以以数据依赖的同位素模式进行分析。在质谱检测

中，硒化物的同位素模式可以检测到低至0.001的丰度，

即LTQ Orbitrap百万分之一的质量精度可以使得检测中不需

要考虑化合物的浓度30。在检测的同时，还可以结合硒化

物代谢的物种区别对其进行细节上的特征分析，所有这

些在单一的一针色谱分析中就可以实现。

LTQ Orbitrap和电感耦合等离子体质谱（ICP-MS）联用，可

以成为分析含金属的各种代谢产物的有力工具。ICP-MS

擅长于以高灵敏度和极宽的浓度范围来检测含金属化合

物。LTQ Orbitrap则利用其多级质谱能力完成鉴定的同时可

以进行化合物结构特性的分析。ICP-MS和Orbitrap MS的联

用方法应用于研究砷的形态，特别是亚砷酸盐植物螯合

物。这两种MS技术在鉴定和定量分析植物根部提取物中

砷的形态时都是必要的142。只要是含金属或类金属的化合

物都能在ICP-MS上分析；药物研究中的一个新的含溴抗结

核化合物在两个质谱平台上都进行了代谢物轮廓和鉴定

分析143。

质量数测定准确的多级质谱被用于阐明Fondaparinux制备过

程中的一个五糖硫酸盐杂质的结构。连续多级质谱裂解

通过分离特定的加和物和评估它们的裂解方式得到了有

价值的结构信息84。

代谢产物鉴定过程中数据的处理

10. 代谢产物鉴定过程中数据的处理

代谢产物检测和鉴定产生的大量数据代表了海量信息，

这需要依靠先进的数据处理工具来进行分析。多重的后

处理数据工具可以挖掘出很多的综合信息，诸如提取离

子流色谱中的特征峰、质量亏损过滤、子离子色谱图和

中性离子丢失过滤技术。这些手段互为补充，可进行稀

有代谢产物的检测和表征23。最近，商业软件包中也包括

了多重质量亏损过滤用于说明这是一个快速发展的领域

144。

小鼠肝脏处理过程中茚地那韦代谢物的分析例证了多重

后处理数据技术的实用性。高分辨率提取离子色谱对测

定具有预计分子量的代谢产物非常有效。与茚地那韦和

其关键底物的代谢物的质量亏损量相似的代谢产物可以

使用质量亏损过滤来搜索，从而找出在提取离子色谱上

未检测到的代谢产物。与茚地那韦和其已知代谢物裂解

途径类似的代谢产物可通过高分辨子离子色谱图和中性

离子丢失过滤进行选择性的测定。最终共检测和鉴定了15

个代谢产物，其中包括两个茚地那韦代谢产物145。

高分辨MS能区分带奇数和偶数电子的离子，这种能力有

助于详细研究裂解行为。这些信息能帮助现代软件包建

立和验证广泛的化合物裂解机理的数据库，反过来，这

些机理又可以用于解释未知物的图谱和裂解方式146。

可快速自动标记代谢产物分子式的软件，可以进行高通

量的代谢产物鉴定。近期有文献提出了解决这个问题的

途径147。计算方法的发展同样能显著改善质量精度。LC/

MS方法中普遍存在的背景离子允许精确的质量定位和内

部质量校准26，28。

代谢物分析/代谢分析数据处理


16

11. 药物监控

在药物监控领域，代谢产物的鉴定和定量极大程度上是

得益于Orbitrap质谱的高质量精度，它能通过解释裂解途

径测定产物离子。对裂解途径的了解能帮助鉴定滥用药

物、相关化合物以及它们的代谢产物，这对药物测试实

验室来说极为重要。

选择性雄激素受体调节子（SARMs）是用于抵抗肌肉萎缩

和骨质疏松症的一种新的非甾体同化药，在业余或专业

运动中是被禁用的。采用LTQ Orbitrap质谱研究了这些化合

物的正离子和负离子ESI裂解途径。通过测定诊断子离子

和常规裂解模式可以确定筛选过程，从而鉴定SARMs和其

假定代谢产物148-153。相同方式测定的其它类别的化合物和

用于验证方法的化合物包括：胰岛素样生长因子-1及其类

似物；合成的人体促肾上腺皮质激素的类似物、乙酰胆

碱酯酶抑制剂、抗抑郁药西布曲明的代谢产物、乙法昔

罗、吡唑甲基睾丸素和蛋白酶154-162。另一个团队近日公布

了一种可以检测出29种禁药的筛选方法，这些禁药包括

抗雌激素类、β2受体激动剂、外源的促同化类激素和其

他同化激素类药。HPLC和LTQ Orbitrap检测串联应用，源内

碰撞诱导解离和大气压化学电离源配合使用，使所有化

合物的检测限均达到100pg/mL，这也证实了Orbitrap方法能

达到与三重四极杆质谱的SRM方法相似的定量性能。作者

评价了Orbitrap平台的耐用性，它能连续测量300个样品而

不需要进行常规维护162。

药物监控

采用U-HPLC分析毛发提取物中的激素和兽药残留以及其

它14个类固醇脂时突出显示了高分辨率对全扫描质量选

择性的作用。研究揭示，如果质谱的质量分辨率不足以

分离分析物离子和其同质量数的样品基体离子时会得到

错误了结果（假阳性）38。最近，一种测定促性腺激素释

放激素（GnRH）的质谱方法得到了很好的验证结果。方

法设计为测定常规尿样药物控制样品中的非降解激素，

采用了毛细管色谱柱（内径75 μm），流速为750 nL/min。

Orbitrap MS的全扫描分析能测定准确质量数（单同位

素），确保了结果的高准确性163。


12. 环境、食品和饲料分析

环境样品的分析是Orbitrap MS的另一个应用领域。欧洲法

规中不断涌现对亲水化合物筛选的需求，也就是对监测

水环境的方法开发的要求。高精度质量扫描已经应用于

各种样品的目标物分析，包括药品、苯并三唑、毒品、

以及地下水样品中未知物的鉴定和垃圾填埋场土壤提取

物中极性成分的分析164。

开发一种用于测定饮用水和地表水中的1H-苯并三唑和苯

并噻唑的方法，并将其扩展至在离子阱中同时监测一个

或多个子离子。在单位分辨率下得到的子离子质谱图可

以用于化合物的确认。这种方法使这些残留物定量方法

的检出限低至0.01μg/L165。另一项研究中定量测定了饮用

水和废水样品中皮克级的N-亚硝胺，方法具有高灵敏度

和选择性166。

食品和饲料基体中的残留分析是一个富有挑战性的领

域。对常规样品预处理技术（通常是简单的提取/稀释）

得到的提取物进行广泛的筛选非常复杂。这些常规预处

理方法缺失选择性，需要高性能仪器分析来补偿。而

且，灵敏度需要达到法规对残留物的要求ng/g。Orbitrap分

析器就是能在单次分析中同时进行定性和定量的一种新

的技术。

Orbitrap技术首次用于食品残留分析就是测定尿样中的吡

唑甲基睾丸素。作者最初采用QqTOF仪器测定子离子的准

确质谱谱图，用以确认样品中吡唑甲基睾丸素的鉴定，

但是，一些碎片离子的实验值与理论值相差很远，大多

数碎片离子的质量不能达到10mmu内的质量误差。然而，

在分辨率为60000时，清楚发现了质量数不准确的原因，

因为QqTOF碎片谱图存在质量数仅有微小差别的双峰，而

此实验中QqTOF的分辨率（约10000）不能将双峰分离167。

QqTOF与Orbitrap质量分析器另一个直接的比较是用于激素

和兽药残留的分析。分辨率为10000的QqTOF检测不出毛发

提取物中的类固醇脂。而分辨率为60000的Orbitrap能检测

和准确测定这个复杂基体中的ng/g级的14种类固醇脂38。

采用U-HPLC与Orbitrap MS联用测定蜂蜜和动物饲料（10-250

ng/g）常规提取物中的151种杀虫剂、兽药、毒枝菌素和

植物毒素。研究总结了测定复杂基体中低浓度分析物

时，如果要得到准确一致的质量数（误差<2ppm），仪器


必须具有高分辨率（>50000）37。

污染点和食品残留分析中也不仅仅只对小分子化合物感

兴趣。重组牛生长激素（rbST）是一种用于增加奶牛产奶

量的多肽激素，在欧洲是禁止使用的。文献研究了一种

基于测定其N-端肽段的方法。通过测定激素酶解得到的肽

段区分内源性和重组形式的生长激素。此方法可以直接

检测样品中10 ng/mL的rbST，甚至注入rbST两天后的山羊血

清中的残留也能测定168。

药物控制



13. DNA和RNA分析

对于杂环的芳香族氨基酸和脱氧核糖核苷反应的活性代

谢产物，可以用串联的三级质谱检测来获得大量的信

息。高精度质量数和多级质谱相结合能为已知加和物和

两种新加和物的鉴定和表征提供新的信息169。在另一项研

究中，高分辨率和精度的质量数据能区分siRNA的两个可

能的代谢产物序列，单同位素分子质量差小于1 Da170。这

个特殊的领域面临着很多分析方法和样品预处理技术的

挑战，这是首次有报道的高可信度的siRNA药物代谢产物

的鉴定，其操作方式自动化程度更高。

Orbitrap技术在DNA和RNA分析/基础研究中的应用

14. Orbitrap技术在基础研究中的应用

在一些基础科学的研究领域，LTQ Orbitrap也有应用。利用

LTQ Orbitrap的负离子和正离子扫描模式研究了困难的气相

化学过程，并通过密度函数计算的补充，可以深入研究

原子质子化和去质子化反应的活性位点171。

15. 前沿技术的发展

15.1. 离子迁移

脏基体的挑战难度不断提高。因此一些新的离子化和分离

技术不断加入到传统LC/MS技术中。成功的LC/MS方法需要

将分析物从基体中分离出来。尽管通过裂解方式和分辨率

的改进，质谱多维选择性不断提高，性噪比不断改善，但

是同分子量物质的干扰和裂解效果差的化合物仍为分析带

来了一定难度的挑战。离子迁移（更具体的名称是，不对

称场离子迁移谱，FAIMS）在生物分析上得到应用。它能

在LC分离后分离时间差为毫秒的离子，然后再让离子进入

质谱的真空区域。它能利用高电场中离子迁移的差别，从

而推动具有相同分子量化合物的分离172。

FAIMS在药物研发方面能提高生物分析的样品通量。它能

确保消除内源性物质和代谢产物的干扰，因此分析简单基

体时不需要使用液相色谱173。尽管FAIMS的大部分应用都

是与三重四极杆质谱相结合，但是其与高分辨Orbitrap质谱

相结合分析复杂混合物时能带来毋庸置疑的好处。这种联

用技术的首次报道是应用在蛋白质组学研究方面174。研究

发现FAIMS可以部分分离具有相同序列但修饰位点不同的

磷酸肽，并通过ETD质谱确认分离的化合物。

15.2. 新颖的解吸技术

尽管发表的大部分代谢组学研究分析是采用电喷雾和纳

喷离子化技术结合LTQ Orbitrap质谱，其它类型的大气压

离子化技术如解吸电喷雾离子化（DESI）也能提供令人

感兴趣的分析潜力。有研究将DESI与LTQ Orbitrap质谱联用

技术直接用于药片活性成分的（酮替芬药片中的氯雷他

定）测试和鉴定175。

最近报道了一种新的叫做激光二极管热解吸（LDTD）

的大气压离子化技术。样品先在特质的96孔板的孔内干

燥，然后采用LDTD源的红外激光二极管解吸样品。解吸

的气相分子被载气吹扫至一个corona放电区域进行大气

压化学离子化（APCI），然后直接传送到质谱中。分析

和检测完整的解吸分子在几秒内就能完成，并能获得相

当大的样品通量（1.9小时分析960个样品）。LDTD源与

LTQ Orbitrap MS联用被应用于多环分子的分析。LDTD源比

ESI或APCI具有更好的性能，这种优势体现在样品通量更

大，容易操作，光谱品质更好，且测定具有更好的特异

性176。


19

15.3. 基体辅助激光解吸/离子化

最近，基体辅助激光解吸/离子化（MALDI）已经成为

Orbitrap组合仪器家族的一员了177。它提供了实验室动物

（组织成像）部分组织甚至全部组织中药物和/或代谢产

物的母离子分布可视化的可能性。与传统的免疫细胞化

学相比，MALDI成像实验能提供关于化合物分布的相当

多的信息，但是分辨率由于仪器的限制相对较低，例如

样品预处理过程中激光束的尺寸和分析物一定水平的扩

散。然而，MALDI成像能区分相同分子量物质，具有更高

样品通量，以实现大规模化合物定位178。已经出现了大气

压MALDI与LTQ Orbitrap MS联用的技术179。

Chen et al.对Homarus americanus神经系统中神经肽的表达

和定位进行了全面的调查。他们比较了3种不同的MALDI

质谱（TOF/TOF，Orbitrap和傅里叶变换离子回旋共振分

析器）。具有中等分辨率的MALDI TOF/TOF仪器具有明显

缺点。比如，它检测不出SSEDMDRLGFG (m/z 1213.51538)

和 FDAFTTGFGHN (m/z 1213.52726) 肽段的峰，但是Thermo

Scientific MALDI LTQ Orbitrap能够可靠的检测这两种物质。研

究为进一步理解神经肽的生物学功能提供了有用的信息

178。

另一项研究分析了神经组织中解吸出来的脂类物质，

Orbitrap质量分析器采集到的谱图中质量分辨率得到了改

善，背景噪声也有所降低。因此能获得神经组织中脂类

物质分布更准确的质谱图像。仪器的线性离子阱部分用

于采集MS/MS谱图，以确认检测到的脂类物质。两种质

量分析器的引入提供了基于二级质谱裂解和高分辨率/精

度的快速可靠的化合物鉴定方式179。

Luo et al.等采用MALDI LTQ Orbitrap MS的手动和自动一级质

谱和二级质谱分析了分离后的蛋白质混合物。作者很容

易的将复杂化合物分离开来，与MALDI QqTOF和MALDI离子

阱相比显著提高了蛋白质鉴定的可信度。而且，针对实

验中的基体，灵敏度达到了亚飞摩尔级。采用中性丢失

扫描分析混合物中的磷酸肽也能获得相似的灵敏度181。

前沿技术的发展

DN

A和

RNA分析

Orbitrap 技

术应用于基础研究


16. 结论

本篇综述还远远没有详尽列举Orbitrap质量分析器应用方

面的文献。本文引用的文献讨论了Orbitrap技术在质量分

析，小分子和大分子，定性和定量测定方面的应用。没

有任何一种质谱平台发表文献的数量或应用的范围能与

Orbitrap媲美。Orbitrap质量分析器真正在促进科学发展方

面扮演了重要角色，让我们的世界更健康、更清洁和更

安全。

17. 致谢

感谢Alexander Makarov, Rosa Viner, Thomas Moehring, Anastassios

Giannakopulos和Robert Malek对本文提出的建设性意见。

18. 参考文献


结论/致谢/参考文献（竖

版）


参考文献


参考文献


参考文献


参考文献


参考文献


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