Tiroid Lezyonlarına Moleküler Yaklaşım

Dr. Gaye Güler Tezel

Plan

• Karsinogenez ve moleküler genetik

• Sorular ve kullanım alanları

• Olgular

• Klonalite ve Multifokalite• DNA Ploidi• Sitogenetik Değişiklikler• Heterozigosite Kaybı (LOH)• Somatik mutasyonlar• miRNA Ekspresyon Değişiklikleri

Karsinogenez ve Moleküler Genetik

• Monoklonal orijin• Multipl papiller karsinom

odakları sıklıkla farklı klonal orjine sahip bağımsız primer tümörler (HUMARA)

• Aynı glanddaki tümör nodülleri farklı genetik alterasyonlara sahip

Klonalite ve Multifokalite

N Engl J Med 2005;352:2406-2412J Clin Endocrinol Metab 2007;92:3511-3516

• PTK tipik olarak normal DNA içeriğine sahip

• Anöploidi %10’dan az

• FVPTK’da anöploidi hafifçe yüksek

• FA’da anöploidi %20-30

DNA ploidi

Genes Chromosomes Cancer 2004;40:355-364

• Çoğu PTK normal karyotip• %20-40 sitogenetik

anomalite– %50 sayısal (en sık Y kr ya da

22. kr kaybı ve 7. kr kazanımı)– %50 yapısal (en sık 10.kr

inversiyon)

Sitogenetik Değişiklikler

Cancer 2001;92:2529-2538

• PTK’ların %40’ında CGH çalışmalarında kromozomal imbalans saptanmıştır

• Bu oran agresif tümörlerde ve “tall cell” varyantta daha yüksek– 22q ve 9q kaybı en sık– 17q ve 1q kazanımı en sık

Sitogenetik Değişiklikler

Genes Chromosomes Cancer 2001;32:43-49

• FVPTK’larında CGH çalışmalarıyla gösterilen kromozomal imbalans sonuçları klasik PTK’da izlenenlerden çok FK ve FA’a daha yakın bulunmuştur

Sitogenetik Değişiklikler

Wreesmann VB. Genes Chromosomes Cancer 2004;40:355-364

Follicular variant of papillary thyroid carcinoma: genome-wide appraisal of a controversial entity. - Wreesmann VB - Genes Chromosomes Cancer - 01-AUG-2004; 40(4): 355-64

Abstract:The majority of thyroid tumors are classified as papillary (papillary thyroid carcinomas; PTCs) or follicular neoplasms (follicular thyroid adenomas and carcinomas; FTA/FTC) based on nuclear features and the cellular growth pattern. However, classification of the follicular variant of papillary thyroid carcinoma (FVPTC) remains an issue of debate. These tumors contain a predominantly follicular growth pattern but display nuclear features and overall clinical behavior consistent with PTC. In this study, we used comparative genomic hybridization (CGH) to compare the global chromosomal aberrations in FVPTC to the PTC of classical variant (classical PTC) and FTA/FTC. In addition, we assessed the presence of peroxisome proliferator-activated receptor-gamma (PPARG) alteration, a genetic event specific to FTA/FTC, using Southern blot and immunohistochemistry analyses. In sharp contrast to the findings in classical PTC (4% of cases), CGH analysis demonstrated that both FVPTC (59% of cases) and FTA/FTC (36% of cases) were commonly characterized by aneuploidy (P = 0.0002). Moreover, the pattern of chromosomal aberrations (gains at chromosome arms 2q, 4q, 5q, 6q, 8q, and 13q and deletions at 1p, 9q, 16q, 17q, 19q, and 22q) in the follicular variant of PTC closely resembled that of FTA/FTC. Aberrations in PPARG were uniquely detected in FVPTC and FTA/FTC. Our findings suggest a stronger relationship between the FVPTC and FTA/FTC than previously appreciated and support further consideration of the current classification of thyroid neoplasms.Copyright2004 Wiley-Liss, Inc.

• Meta-analiz– PTK %2.5– FK %20

3p,4q,10q en sık delesyon

Klasik PTK’na oranla folliküler, onkositik ve “tall cell” varyantta LOH oranları daha yüksek

Heterozigosite Kaybı (LOH)

Diagn Mol Pathol 2004;13:41-46

Studies of allelic loss in thyroid tumorsreveal major differences in

chromosomal instability between papillaryand follicular carcinomas.

Ward LS. J Clin Endocrinol Metab 1998;83:525:530

• Multipl sinyal iletim yolakları

• Mitojen-aktive edilmiş protein kinaz (MAPK) yolağında aktivasyon

• Özgün etki

Somatik Mutasyonlar

Diagn Mol Pathol 2004;13:41-46

MAPK Yolağı

• %70’inde genetik değişiklikler

• BRAF veya RAS genlerindeki mutasyonlar

• RET ve NTRK1 genlerindeki gen rearanjmanları

• Aynı tümörde birlikte görülmesi çok nadir

PTK

MAPK-Aktive Edici Mutasyonlar ve Fenotipik İlişkileri

Mutasyon Prevalans FenotipBRAF nokta mutasyonu %29-69 Daha ileri yaş

Klasik, “tall cell”varyantEkstratiroidalYüksek tümör evresi RekürrensDediferansiasyon

RET/PTK gen aranjmanı %11-43 Daha genç Klasik, diffüz sklerozanRadyasyon öyküsüLN metastazıDüşük tümör evresi

RAS nokta mutasyonu %15 FVPTKEnkapsüle tümörLN met yokUzak metastaz

TRK rearanjmanı <%5 İyi tanımlanmamış

BRAF• PTK’daki en sık genetik değişiklik• Mutasyon, genin lokalize olduğu 7.kr uzun

kolunda genin 15.ekzonunda, 1799. Timin nükleotidi yerine adenin geçmesi sonucu 600. kodonun kodladığı Valin yerine Glutamat oluşmasına neden olur (V600E)

• BRAF kinaz aktivasyonuna, sırasıyla MEK, ERK aktivasyonuna yol açar

BRAF• Agresif tümör karakteristikleri

– Ekstratiroidal uzanım– Rekürrens– Uzak metastaz

VEGF ve MMP upregülasyonu

Tümör dediferansiasyonu ve anaplastik transformasyon ile ilişkili

Endocr Rev 2007;28:742-762 J Clin Endocrinol Metab 2006;91:3667-3670Endocrinology 2006;147:5699-5707

• RET geni kromozom 10q11.2 de lokalizedir ve hücre membran reseptör tirozin kinazıolan RET proteinini kodlar

• nöral krest orjinli hücrelerde eksprese olur

• böbrek gelişimi ve gastrointestinal nöralgelişimde rol oynar

• “Wild type” RET normal tiroidde sadece C hücrelerinde eksprese olur

RET/PTK gen rearanjmanı

• Onkogenik aktivasyonu insan T-celllenfoma DNA’sı ile NIH3T3 hücrelerinin transfeksiyonu sırasında tanımlanmıştır

Takahashi M, Cell 1985

Reseptör tirozin kinazlar benzer yapısal özelliklere sahiptir

• Ekstraselüler ligandbağlayan domain

• Transmembrandomain

• Sitoplazmik tirozinkinaz domain

Sinyal domainKaderin-benzeri domain

Sisteinden zengin domainTirozin kinaz domain

RET

RET-PTK2

RET-PTK3

RET-PTK1

Asa S, Mod Pathol 2001

RET/PTK gen rearranjmanı

RET/PTK gen rearranjmanı

• RET/PTK1 ve RET/PTK3 de 10. kromozomda inversiyon,

• RET/PTK2 de ise kromozom10/17 translokasyonu söz konusudur.

• En sık H4 (PTK1) (%60-70)ve ELE1 (PTK3) (%20-30)

• Radyasyonla indüklenmiş tümörlerde %60’a varan sıklık

RET/PTK gen rearranjmanı

Papiller karsinomda RET/PTK prevalansı

• Değişik coğrafik bölgeler arasında farklılıklar gösterir; Amerika Birleşik Devletleri’nde %11-43 arasında değişir.

• Farklı moleküler tekniklerin kullanılması

RET/PTK• Papiller karsinom ve

mikrokarsinom

• Anaplastikkarsinomda yok

• Az diferansiye? • Dediferansiasyon/

progresyon düşük potansiyel

• Hyalinize trabeküleradenom,

• Hashimoto tiroiditi, • Hiperplastik

nodüller, • Folliküler adenom,• Eksternal radyasyon

öyküsüne sahip hastalarda benigntiroid nodülleri

PrevalansPTK FK Az Dif. Anaplastik K.

Santoro (1992) %1933/77

00/37

00/15

Wynford-Thomas (1993)

00/45

00/19

Tallini (1998) %4081/201

00/22

00/15

00/17

Nikiforov %1918/93

00/46

00/12

00/11

Santoro (2002) %138/62

RAS• PTK’un %10’unda ve

hemen daima FVPTK’u ile ilişkili

• Kodon 12, 13 ve 61 NRAS, HRAS, KRAS

• Mutasyon proteini aktif GTP bağlı konformasyonda tutar ve MAPK ve PI3K/AKT yolaklarını uyarır

RAS• FVPTK ile güçlü korelasyonu yanısıra

daha sık enkapsüle tümör, daha az papiller nükleer özellik ve düşük lenf nod metastaz oranı ile ilişkili

• Bazı yayınlarda uzak organ metastazı ile ilişkili

RAS• En sık NRAS kodon61 mutasyonu

• Konvansiyonel FA’ların yaklaşık %30’u• Konvansiyonel FK’ların yaklaşık %50’si

PAX8/PPARG gen rearranjmanı

• FK’da RAS mutasyonundan sonra en sık 2. genetik değişiklik

• Konvansiyonel FK’da %30-40• Onkositik FK’da %5-10• T(2;3) (q13;p25)

PAX8/PPARG gen rearranjmanı

• Gen rearanjmanı pozitif tümörler daha genç hasta, daha küçük tümör, solid gelişim paterni ve vasküler invazyonla ilişkili

• FK vakalarında aynı vakada PAX8/PPARG ve Ras mutasyon birlikteliği yok

Diagnostic Pathology and Molecular Genetics of the Thyroid. 2009 Nikiforov Y.

TRK• NTRK1 gen rearanjmanı (TRK) PTK’da en az

görülen rearranjman• NTRK1 geni kromozom 1q22 da lokalizedir

ve tirozin kinaz aktivitesiyle hücre membran reseptörü kodlar

• NTRK1 normal tiroid follikül hücrelerinde eksprese olmaz

• TPM3 ve TPR genleriyle olan reaaranjman intrakromozomal inversiyon iken, TFG geni ile olan t(1:3) translokasyonudur

PI3K/PTEN/AKT Yolak Mutasyonları• Bu yolak RAS

mutasyonu sonucu aktive olabileceği gibi PI3K ve PTEN genlerindeki mutasyonla da aktive olabilir

• Anaplastik karsinomda sık, daha az olarak Folliküler karsinomda, PTK’da %2-5 oranda bulunur

• MikroRNA’lar protein-kodlayan genlerin negatif düzenleyicileri

• Kanser hücrelerinde spesifik miRNA düzeylerinde up/down regülasyon mevcut

• PTK’unda miR-221, miR-222, miR-187, miR-181b, miR-146b upregüle

miRNA Ekspresyon Değişiklikleri

J Clin Endocrinol Metab 2008;93:1600-1608

Sorular ve Kullanım Alanları

• PTK kuşkulu bir İAB’de moleküler analizler tanıya yardımcı olabilir mi?

BRAF V600E mutasyonu• Papiller karsinom için güvenilir bir

marker• Farklı araştırmacılar tarafından çalışılan

500’den fazla benign tümörün herhangi birinde saptanmamıştır

• Klasik ve tall cell varyant• Mutasyone tümörlerin ancak %10’u

folliküler varyant olguları

Endocr Relat Cancer 2005;12:245-262

• Prospektif çalışma: >1000 TİİAS örneğinde BRAF mutasyon varlığı cerrahi materyalde %100 papiller karsinom tanısı ile korele

Nikiforov Y, 77th Annual Meeting of the America Thyroid Association, 2006

Nikiforov Y. Molecular Testing for Mutations in Improving theFine-Needle Aspiration Diagnosis of Thyroid Nodules

J Clin Endocrinol Metab, 2009, 94(6):2092–2098

• Tanı – Papiller karsinom için diagnostik marker

• TİİAS ve cerrahi materyal

• Prognoz?– %13 Az diferansiye, %35 Anaplastik

karsinom (progresyon yüksek)– “Tall cell” varyant

• Tedavi

Kullanım Alanları-I(BRAF)

• Tanı – Papiller karsinom için diagnostik marker– TİİAB; selüler folliküler lezyon, papiller

karsinom açısından şüpheli grup– Malignite potansiyeli belirsiz neoplazm

• Prognoz? – Agresif lenfatik tutulum (Sugg, JCEM 1996)

– Agresif seyir ile ekspresyon korele değil (Nikiforov, Am J Surg Pathol 2001)

*solid varyantta RET-PTK3 hariç

• Tedavi

Kullanım Alanları-II(RET/PTK)

Tedavi• Anti-anjiogenetik faktörler• Anti-büyüme faktör ve

reseptörleri• Hedeflenmiş tedavi

– Sorafenib (BAY-43-9006)• RET/PTK rearanjmanı taşıyan PTK

hücreleri BRAF mutasyonu taşıyanlara göre daha duyarlı

J Clin Pathol published online 15 Jan 2009

• 40 Y, K

• İstmusda 0.3cm nodül

• TİİAS: Önemi belirsiz atipi

* From the Catalogue of Somatic Mutations in Cancer, available online at the Sanger Institute. † Lowest mutation level in a sample resulting in a measured frequency ≥LOD.

• Folliküler adenomlarda bugün için bildiğimiz spesifik mutasyon var mıdır?

• Folliküler paternli lezyonların ayırıcı tanısında moleküler analizlerin katkısı ne kadardır?

• Braf V600E nokta mutasyonu ya da klonal RET/PTK gen rearanjmanı papiller karsinom için tanısal nitelikte– *Ancak FVPTK’da her iki genetik değişiklik

de nadir

• Buna karşın Ras mutasyonu FVPTK (%40) sık, neoplazm için kuvvetli bir gösterge– *Ancak FA (%30) ve FK (%50) ’de de

görülebildiğinden FVPTK için tanısal değil

• Tanı – Folliküler karsinomların %35’inde görülür

• TİİAB ve cerrahi materyal

• *Folliküler adenomların %5’inde görülebilmesine rağmen malignite için güçlü kanıt

Kullanım Alanları-III(PAX8/PPARγ)

• Tanı – Tiroid rezeksiyonlarında sınırlı yararlılık– TİİAB de daha büyük rol

• *Malignite için spesifik değil• Konvansiyonel FK’da %40-50• FVPTK’da %40• FA’da %30

Kullanım Alanları-IV(RAS)

Olgu Sunumu

• 23 K• Sağ tiroid lobunda 2 cm çaplı

hipoaktif nodül

• Folliküler Adenom

• Papiller Karsinom, folliküler varyant

• Malignite potansiyeli şüpheli, iyi diferansiye tiroid tümörü

Ayırıcı Tanı

CK-19HBME-1

RET-PTK gen rearanjmanının araştırılması

165 200bp

100bp

TİİAB: Papiller karsinom

TİİAB: MNG

200bp

100bp

165

MNG Papiller karsinom

Mutasyon tipi Histoloji

• BRAF

• RET/PTK

• RAS

• PAX8/PPARG

• PTK

• PTK

• FVPTK, FK, FA,

• FK, FA

Teşekkürler….