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IKO

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WE

RT

UN

G Toxicogenomics –

Anwendungen und Perspektive

in der regulatorischen

ToxikologieA. Oberemm1, K. Paal2, K.-E. Appel2

H.-B. Richter-Reichhelm1, U. Gundert-Remy1

1 Sicherheit von Stoffen und Zubereitungen2 Zentrum für Experimentelle Toxikologie

Axel Oberemm, 08.11.2007, Tag der Wissenschaften (BfR) Seite 2

Toxicogenomics (TXG)

Metabolomics*

* figure from Nicholson et al. 2002

metabolites

transcriptionDNA Genomics/

Transcriptomics

mRNAtranslation

proteins Proteomicsprotein-proteininteractions

R1 R2

� umfassende (globale) Analyse der Expression von Genen und Proteinensowie von Metaboliten nach Exposition mit chemischen Fremdstoffen

Nuwaysir EF, Bittner M, Trent J, et al.Microarrays and toxicology: The advent of toxicogenomicsMOLECULAR CARCINOGENESIS 24 (3): 153-159 MAR 1999

Axel Oberemm, 08.11.2007, Tag der Wissenschaften (BfR) Seite 3

Toxicogenomics & Co

� OMICS – Methoden; Teildisziplin der Molekularen Toxikologie

� analog: Pharmacogenomics (pharmazeutische Stoffe)

� Toxico - / Pharmaco - genetics:umfassende Analyse genetischer Polymorphismen (SNP‘s):Erfassung individueller Empfindlichkeiten, „personalized medicine“

� Toxicoproteomics: umfassende Analyse der Proteinexpressionnach Fremdstoffexposition

Axel Oberemm, 08.11.2007, Tag der Wissenschaften (BfR) Seite 4

Toxicogenomics- Methoden (I)

� umfassende quantitative Erfassungen der:

� GenexpressionGenomics/ Transcriptomics

� Genchips/ DNA-Microarrays

� monochrom vs. dual-channel

� “Komplett” - Genom vs.selektive Auswahl relevanter Gene

� ProteinexpressionToxicoproteomics

� nicht-Gel basierte Verfahrenz.B. ICAT-MS 1, SELDI2, Protein-Arrays

� 2-D (Gel)Elektrophorese (2-DE)+ massenspektrometrische

Proteinidentifizierung (MALDI-MS)

770.0 1202.4 1634.8 2067.2 2499.6 2932.0

Mass (m/z)

0

7029.7

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

100

% In

ten

sity

Sp e c # 1 = > BC= > NF 0 .7 [BP = 2 2 7 3 .1 , 7 0 3 0 ]

2162.061405.04

2272.12

1705.14

1020.06

2151.131433.08

803.951638.13 2288.10

1475.10 1838.081276.07998.11 1493.06 2184.091993.08 2397.941327.101153.06847.10 1482.26 1716.09 2566.09

1 Isotope-Coded Affinity Tag2 Surface-Enhanced Laser Desorption Inization

+

Axel Oberemm, 08.11.2007, Tag der Wissenschaften (BfR) Seite 5

Toxicogenomics- Methoden (II)

� umfassende quantitative Erfassungen der:

� Metabolite: Metabolomics/ Metabonomics (weitgehend synonym)

� 1H-NMR-Spektroskopie

� GC-MS

� HPLC-MS

770.0 1202.4 1634.8 2067.2 2499.6 2932.0

Mass (m/z)

0

7029.7

0

10

20

30

40

50

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70

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nte

nsi

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Spec #1=>BC=>NF0.7[BP = 2273.1 , 7030]

2162.061405.04

2272.12

1705.14

1020.06

2151.131433.08

803.951638.13 2288.10

1475.10 1838.081276.07998.11 1493.06 2184.091993.08 2397.941327.101153.06847.10 1482.26 1716.09 2566.09

Axel Oberemm, 08.11.2007, Tag der Wissenschaften (BfR) Seite 6

Toxicogenomics- Methoden (III):Bioinformatik

� Methoden zur Datenanalyse

� Interpretation der Ergebnisse u.a. durch Datenbank-gestützte Analysen:

� Gen-/ Proteinfunktion

� Zuordung zu funktionalen KategorienZellstoffwechsel, Pathwayanalysen, Netzwerke

� Relevanz für Toxikologie

� Biostatistik zur Auswertung von Expressionsrohdaten:- Proben aus unbehandelter Kontrolle vs. Proben aus Behandlungsgruppen -

� Gen- / Proteinlisten von Identitäten,welche expositionsabhängig dereguliert sind

•image from Nature Vol.424, August 2003, p.611

Axel Oberemm, 08.11.2007, Tag der Wissenschaften (BfR) Seite 7

Endpunkte Toxikologie1

1 “hazard identification”human health- related

chemicals/ biocides

(Sub-) ChronischeToxizität

�oral�dermal�inhalativ

Akute Toxizität�oral�dermal�inhalativ

Reproduktionstoxizität� Fruchtbarkeit� Entwicklungs-

schädigung

Mutagenität /Gen(o)toxizität

in vitro/ in vivo�nicht-Säuger

�Säuger

hoher Bedarf an Tierstudien:� Ethik� Kosten� Zeit

Kanzerogenität�oral�(inhalativ)

ÄtzwirkungHaut- + AugenreizungSensibilisierung

�Atemwege�Haut

Hazard IdentificationHazard Identification

• LD50

• LOAEL• NOAEL• pos. / neg.• Pathologie• Histopathologie• Physiologie

„black box“

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Antworten Toxicogenomics: Zellen/ Gewebe

Axel Oberemm, 08.11.2007, Tag der Wissenschaften (BfR) Seite 9

Zellstoffwechsel Roche Applied Science "Biochemical Pathways" wall chart:http://www.expasy.ch/cgi-bin/show_thumbnails.pl?2

Axel Oberemm, 08.11.2007, Tag der Wissenschaften (BfR) Seite 10

Endpunkte Toxicogenomics

� Störung der Homöostase bis hin zur Entstehung irreversibler Veränderungen

� Signaltransduktion: Kaskaden biochemischer Veränderungen

Biochemie der Zelle: Schutz vor durch exogene Faktoren verursachten zelluläre Schäden:

� Reparaturmechanismen (z.B. Reparatur von DNA-Schäden, Proteinstrukturen)

� Rezeptoraktivierung (z.B. Östrogenrezeptor)

� Aktivierung fremdstoffmetabolisierender Enzyme

Analyse/ Aufklärung toxischer Wirkungsmechanismen

Axel Oberemm, 08.11.2007, Tag der Wissenschaften (BfR) Seite 11

aus dem “Fingerprint”abgeleitete Zuordnung

zu einer toxischen Kategorie/(z.B. hautreizend, lebertoxisch

gentoxisch etc.)„Klassifizierung“

Allgemeine Konzeption

Prüfstrategie-weitere Studien?

in vitro

In vivo

Erfassung der Veränderungen von Mustern

� der GenexpressionGenomics/ Toxicogenomics

� der ProteinexpressionProteomics/ Toxicoproteomics

� der StoffwechselmetaboliteMetabolomics

Kurzzeit-Expositionin vitro - in vivo

Datenbankanalyse

Zuordnung zu einemcharakteristischen

Veränderungsmusteroder toxikologischen

Wirkungsmechanismus

„toxikologischer Fingerabdruck”

Axel Oberemm, 08.11.2007, Tag der Wissenschaften (BfR) Seite 12

Einsatz von Omics-Methoden in der Toxikologie

� Einsatz in Kurzzeitassays, um schneller (als mit herkömmlichen Verfahren)grundlegende Informationen zu inhärenten toxischen Eigenschaftenvon Stoffen zu bekommen (Screeningverfahren) :

z.B.

Anwendungen

�von Stoffen/ Wirkstoffen bei der Produktentwicklung

�von HPV-Altstoffen, von Stoffen unter REACH („priority setting“ )

� Aufklärung toxikologischer Wirkungsmechanismen

Potentiale

� Erhöhung des Prädiktionswertes von tierexperimentellen Daten:� mittels mechanistischer Daten kann abgeleitet werden, ob Befunde aus Tierversuchen

für den Menschen relevant sind

� Verbesserung der Aussagefähigkeit/ Relevanz von in vitro Methoden

� direkte und indirekte Einsparung von Tierversuchen

� Identifizierung von Biomarkern (Rückschlüsse auf Exposition und Effekte)

Axel Oberemm, 08.11.2007, Tag der Wissenschaften (BfR) Seite 13

Vision

� komplementärer Einsatz von in silico Methoden (QSAR) und Omics Methodenzur Modellierung/ Prädiktion toxischer Effekte von Stoffen

� öffentlich zugängliche Datenbanken

Voraussetzungen

� zentral koordinierte internationale Aktivitäten (Industrie & wiss. Einrichtungen)

Axel Oberemm, 08.11.2007, Tag der Wissenschaften (BfR) Seite 14

Fallbeispiel: Perfluoroctansäure (PFOA)

� verwendet zur Herstellung von Polymeren�Teflon� Fluortelomeralkohole (FTOH), zur Beschichtung von Kleidung, Möbeln, Lebensmittelverpackungen

� Exposition des Menschen und der Umwelt (weltweit nachgewiesen)

� Daten aus Tierversuchen:� potentiell reproduktionstoxisch + kanzerogen

� keine eindeutigen Ergebnisse über solche Effekte beim Menschen

� Probleme bei der Risikobewertung:Übertragbarkeit der Tierversuchsdaten auf den Menschen

� Effekte im Tier werden auf einen Wirkungsmechanismus zurückgeführt,der für den Menschen kaum relevant ist:� durch den Rezeptor PPARα - ausgelöste Peroxisomenproliferation

Axel Oberemm, 08.11.2007, Tag der Wissenschaften (BfR) Seite 15

Perfluoroctansäure (PFOA) (II)

� Humanrelevanz der Tierdaten muss weiter untersucht werden!

� Reprotox Studien an PPARα - knock-out Mäusen undGenexpressionsanalysen mit PFOA- exponierten Maus-Feten (Lungen - + Lebergewebe)

� auch Effekte, die durch andere PPAR-Rezeptoren + andere Faktoren verursacht wurden

Takacs ML, Abbott BDActivation of mouse and human peroxisome proliferator-activated receptors (alpha, beta/delta, gamma)by perfluorooctanoic acid and perfluorooctane sulfonateTOXICOLOGICAL SCIENCES 95 (1): 108-117 JAN 2007

Abbott BD, Wolf CJ, Schmid JE, et al.Perfluorooctanoic acid-induced developmental toxicity in the mouse is dependent on expression ofperoxisome proliferator-activated receptor-alphaTOXICOLOGICAL SCIENCES 98 (2): 571-581 AUG 2007

Rosen MB, Thibodeaux JR, Wood CR, et al.Gene expression profiling in the lung and liver of PFOA-exposed mouse fetusesTOXICOLOGY 239 (1-2): 15-33 SEP 24 2007

aber:

Axel Oberemm, 08.11.2007, Tag der Wissenschaften (BfR) Seite 16

Toxicogenomics - Aktivitäten

� national/ deutschsprachiger Raum:Industrie, (BfR), (BfARM)

� international/ EU:Industrie/ ECETOC1, NGI/ NTC2, (ECVAM3)

� USA:Industrie/ ILSI4/ HESI, FDA5, NIEHS6, EPA7, NAS8

� Japan: Industrie, METI9/ NEDO10

� international: OECD/ IPCS11: „Toxicogenomics Extended Advisory Group“, ICCA12

1 European Centre for Ecotoxicology and Toxicology of Chemicals; 2 Netherlands Genomics Initiative/ Netherlands ToxicogenomicsCentre; 3 European Centre for the Validation of Alternative Methods; 4 International Life Sciences Institute; 5Food And Drug Administration; 6 National Institute of Environmental Health Sciences; 7 Environmental Protection Agency; 8 National Academy of Sciences; 9 Ministry of Economy, Trade and Industry; 10 New Energy and Industrial Technology Development Organization; 11 Int. Programme on Chemical Safety; 12 International Congress and Convention Association

Axel Oberemm, 08.11.2007, Tag der Wissenschaften (BfR) Seite 17

Toxicogenomics im BfR

� Identifizierung hepatozellulärer Biomarker zur Früherkennungkanzerogener Eigenschaften von chemischen Stoffen (in vivo - in vitro)1

� Vergleichende Proteomanalyse von Lebertumoren der Mausmit aktivierenden Mutationen in den Onkogenen ß-Catenin, Ha-Ras und B-Rafnach Induktion durch Dioxin- und Phenobarbital- artige PCB (polychlorierte Biphenyle)2

2 Kooperation mit Uni Tübingen, Prof. Schwarz

Zentrum für experimentelle Toxikologie

1 gefördert durch das

� Identifizierung von molekularen proteomischen Biomarkernfür die Risikoabschätzung von Lebensmittelinhaltsstoffen

Abteilung Lebensmittelsicherheit

� Effekte von durch neue technologische Verfahren hergestelltefunktionelle Lebensmittel auf das Proteom von humanen Darmzellen1

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DANKE FÜR IHRE AUFMERKSAMKEIT

Axel Oberemm

Bundesinstitut für Risikobewertung

Thielallee 88-92 � D-14195 Berlin

Tel. 0 30 - 84 12 - 0 � Fax 0 30 - 84 12 - 47 41

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