1. Introduction :La chromatographie en phase gazeuse (CPG) est une classe de

chromatographie dans laquelle la phase mobile est un gaz- L'échantillon qui estsouvent un liquide à la température'ordinaire est vaporisé aussitôt injecté dans lacolonne.

Chronologiquement la (CPG) est apparue après la chromatographie en phase liquide. Dans les premières méthodes proposées, la phase stationnaire était un adsorbant solide. Par la suite les phases stationnaires liquides développées par MARTIN et SYNGE ont pris une extension considérable. La discussion qui suit concerne uniquement la chromatographie de partage gaz - liquide.

2. Description de l’appareil :

C’est une méthode de séparation de composés susceptibles d’être vaporisés par chauffage (sans décomposition).La séparation se fait dans une colonne soit par partage soit par adsorption. Elle permet :

la microanalyse (du µg au mg) la séparation de mélanges complexes une analyse qualitative et quantitative aisée des analyses dans de nombreux domaines d’applications.

Ses limites d’applications : elle ne convient pas pour les produits qui se décomposent à chaud (thermolabiles) qui sont peu volatils ionisés.

Schéma d’appareillage Un appareil de CPG comprend schématiquement 3 modules spécifiques : un injecteur(1), une colonne contenue dans une enceinte thermostatée (four)(2) et un détecteur (3) relié à un intégrateur ou un ordinateur (4) sur lequel apparaît le chromatogramme .

Le mélange à analyser est injecté sous forme d’un fluide et est vaporisé dans l’injecteur. Le gaz vecteur l’entraîne dans la colonne de séparation thermostatée.Les composés se répartissent différemment dans les 2 phases, se déplacent donc à des vitesses différentes puis sortent à des temps

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différents. A leur sortie, ils sont détectés et un pic apparaît sur l’enregistreur.

1. Injecteur Il permet : l’introduction de l’échantillon, son évaporation et son entraînement par le gaz vecteur vers la colonne : un volume précis est injecté dans l’injecteur qui va vaporiser le liquide et permettre le transfert de l’échantillon vaporisé vers la colonne de chromatographie. Cette injection est faite dans un tube chauffé. Le gaz vecteur arrive par l’une des extrémités du tube et entraîne les solutés vaporisés vers la colonne raccordée à l’autre extrémité.

a) L’injection   : se fait par le biais d’une seringue de faible volume (microseringue de 1 à 10 µL). Elles posent deux problèmes :

Mauvaise reproductibilité des volumes injectés certains appareils sont donc pourvus d’injecteur automatique.

Chauffage brutal du contenu de l’aiguille de la seringue lorsqu’on l’introduit dans l’injecteur, qui entraîne une injection en 2 temps visible sur le chromatogramme. la solution consiste à mesurer le volume désiré puis reculer le piston de façon à aspirer le contenu de l’aiguille, ainsi lorsque l’aiguille sera introduite dans l’injecteur, elle sera vide !, puis il faut injecter rapidement.

L’aiguille de la microseringue entre dans l’injecteur en traversant un septum (une pastille d’élastomère siliconé) qui évite les fuites de gaz au niveau de l’entrée. L’état du septum doit régulièrement être contrôlé.

b) Température de l’injecteur   : L’injecteur est thermostaté à une certaine température de manière à ce que le solvant et les différents solutés de l’échantillon soient vaporisés.Pour éviter la condensation des produits injectés T°injecteur = T°produit le moins volatil

+ 20°C

c) Différents types d’injecteurs   : Selon les types de colonnes reliées aux injecteurs, les caractéristiques des injecteurs et leur mode d’injection sont différentes de façon à optimiser la qualité de la séparation :

Injecteur à vaporisation directe  : pour les colonnes remplies et les colonnes capillaires de gros diamètre. Tout l’échantillon introduit par la seringue est entièrement entraîné dans la colonne

Pb. : Pour les colonnes capillaires à faible débit, les quantités de composés dans la colonne doivent être très petites pour éviter la saturation des colonnes.

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Les volumes injectés doivent être très faibles (saturation même pour des v injectés

= 0,1µL). Or les volumes injectés ne peuvent être inférieurs à 0,1 µL et l’utilisation de solutions très diluées entraîne des perturbations dues à l’excès de vapeur de solvant. Il existe donc différents injecteurs permettant de résoudre ce problème :

Injecteur avec système de fuite   : Une grande partie de l’échantillon injecté , vaporisé et mélangé au gaz vecteur est éliminée de l’injecteur par une vanne de fuite. Ainsi, une petite fraction du mélange pénètre dans la colonne. Il existe deux modes selon que l’on injecte vanne de fuite ouverte (mode split) ou vanne fermée pendant environ 1 minute après l’injection(mode splitless)

Injecteur à température programmable (PTV)   :

Le mélange est introduit liquide dans l’injecteur à froid puis l’injecteur est chauffé en mode split ou splitless pour vaporiser les composés

Injection à froid dans la colonne   : le mélange est injecté directement froid et liquide dans la colonne

2. Four Les colonnes sont placées dans des enceintes chauffées appelées four dont la température peut-être régulée au 1/10ème de °C près.La température du four peut-être :

stable et identique du début à la fin de la manipulation (= conditions isothermes)

programmée par palier successif (= en gradients)

3. Colonnes Elles contiennent la phase stationnaire. Elles se présentent sous forme de tubes fins enroulés.Il existe deux types de colonnes :

1. Les colonnes rempliesDiamètre de 2 à 6 mm et longueur de 1 à 3 m. Elles sont en tubes d’acier ou verre.Elles sont remplies d’un support poreux et inerte sous forme de grains sphériques ( d’environ 0,2 mm de diamètre) sur lequel est imprégnée la phase

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stationnaire. Moins résolutives que les colonnes capillaires.

Exemple de supports : Chromosorb® ; Sphérosil® ; Porapak®

2. Les colonnes capillaires (à tube ouvert)Diamètre de 0,1 à 0,53 mm et longueur de 10 à 100 m. Elles sont en tubes d’acier inoxydable ou en silice fondue ;La phase stationnaire est directement déposée sur la paroi interne de la colonne sur une épaisseur de 0,05 à 5 µm.

revêtement extérieursilice fondue

phase stationnaire

On distingue les colonnes WCOT (Wall Coated Open Tubular) : où la phase stationnaire forme une

pellicule liquide à l’intérieur du tube. PLOT (Porous Layer Open Tubular) : où la phase stationnaire forme une

couche d’adsorbant solide.

3. Recommandations d’utilisation des colonnes Avant sa première utilisation : il faut la débarrasser des traces de solvant et

des produits volatils qu’elle peut contenir en la maintenant au moins 12 h au voisinage de sa température limite d’utilisation sans brancher le détecteur pour éviter son encrassement

maturation Après une longue période d’utilisation : remettre la colonne à maturation

pendant 2h. Stockage : avec des bouchons (évite l’oxydation, l’humidification,…) Une colonne doit toujours être parcourue par le gaz vecteur

4. Phases

.1. Phase mobileElle constitue le gaz vecteur. Il s’agit d’un gaz inerte et pur tel que l’hélium, le diazote ou le dihydrogène. La nature du gaz ne modifie pas de manière significative la séparation des composants du fait de l’absence d’interaction entre le gaz et les solutés, seul le facteur température est important.

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.2. Phase stationnairea) Choix de la phase stationnaire Une phase apolaire retiendra d’autant plus un composé qu’il sera apolaire

(et inversement)Exemple : Squalane (apolaire) ; Carbowax (polaire)

Une phase apolaire retiendra les composés dans l’ordre de leur température d’ébullition (donc sortie des composés dans l’ordre de leur température d’ébullition croissante)

Une phase phénylée retiendra mieux un composé aromatiqueEx. : phases OV225 ; DC550

Une phase fluorée retiendra mieux les cétonesEx. : phase QF1

On définit le taux d’imprégnation : la masse de phase stationnaire pour 100g de support

b) Différentes phases stationnaires Les phases les plus courantes sont formées de deux principaux types de constituants :

Les polysiloxanes (« huiles et gommes de silicones ») : correspondant à la répétition d’un motif de base de type :

O CH3

O Si O Si O CH3 n

Les polyéthylèneglycols (PEG) : polymères polaires (composés des colonnes Carbowax®) de type :

O CH2 CH2

n

les phases stationnaires solides constituées de matériaux adsorbants divers tels que de la silice ou de l’alumine désactivée par des sels minéraux, verres ou polymères poreux, carbone graphité (Chromosorb®100, Porapak®)

5. Détecteurs

1. GénéralitésIls peuvent être plus ou moins spécifiques des composés à détecter.

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S'il n’y a pas de spécifications sur la notice de l’appareil  T°détecteur = T°produit le moins volatil + 20°C

On détermine : Sa quantité minimale détectable (QMD) Sa sensibilité : correspond au rapport entre signal / concentration

(mg/mL) ou entre signal / débit (mg/s)Il existe différents types de détecteurs comme le montre le tableau ci-dessous :

DETECTEUR

Gaz vecteur

Linéarité

QMD Sélectivité

(spécificité)

Applications

Catharomètre H2/He 105 1 à 10 ng NS Tous composésFID He/N2 107 20 à 100

pgNS Composés

organiquesCapture d’e- N2 104 0,1 pg S Composés

halogénésThermoioniq

ueN2 104 P :1 pg /

N :10 pgS Composés avec N

ou PPhotométrie de flamme

N2/H2 103 P : 10 pgS : 1 ng

S Composés avec S ou P

2. Principes des principaux détecteurs

a) détecteur à ionisation de flamme (FID) Le plus utilisé pour les composés organiques et de grande sensibilité.Les composés (gazeux) qui sortent de la colonne pénètrent dans la flamme du détecteur. Leur combustion entraîne la formation d'ions et de particules chargées qui sont alors collectés par 2 électrodes. Le courant très faible qui en résulte est fortement amplifié et transformé en une tension mesurable par un électromètre.L'air du pic reflète la quantité de composé élué.

b) détecteur à conductibilité thermique (TCD) Détecteur universel mais de sensibilité moyenne;Il est formé d'un catharomètre composé de 2 thermistors (= filaments chauffés) dont un est balayé par le gaz vecteur seul et l'autre par le gaz en sortie de colonne; Quand un courant gazeux passe sur les filaments, ils sont refroidis en fonction de la température, du débit et de la nature du gaz; la température et le débit sont les mêmes pour le gaz arrivant sur les 2 filaments mais la présence d'1 composé en sortie de colonne modifie la nature du gaz qui alors refroidi

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moins le 2ème filament. Il en résulte une variation de résistance proportionnelle à la concentration du composé.

c) détecteur thermoionique (NPD) (détecteur catharomètre)Spécifique aux composés azotés ou phosphorés. Un petit cylindre en céramique est chauffée par une résistance électrique à 800°C et est alimenté par un mélange air/hydrogène. Les composés contenant N et P sont décomposés en ions négatifs qui sont recueillis par une électrode collectrice reliée à un électromètre qui traduit le courant obtenu en un signal.

d) détecteur à capture d'électrons (ECD) Spécifique des dérivés halogénés et très sensible.Une source radioactive émet des particules génère des électrons au contact d'un courant d'azote. Ces électrons produisent un courant constant qui diminue lors du passage de composés contenant un halogène (F, Cl, Br) car ces composés captent une partie des électrons; la diminution du courant se traduit par un pic.

e) autres détecteur à photométrie de flamme: sélectif pour S et P détecteur à photo-ionisation: envoi de photons (lampe UV) sur les

composés entraîne leur ionisation. Détecteur à émission atomique Couplage de plusieurs détecteurs en série.

Chromatographe

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6. Identification et mesure quantitative des pics :C'est le temps de rétention qui permet d'identifier n'importe quelle

substance émergeant sur le chromatogramme, par rapport à des étalons de nature connue. Mais cette approche est plutôt incertaine dans la mesure où un grand nombre de substances peuvent avoir le même temps de rétention. En variant les condition expérimentales (changement de phase mobile et de phasestationnaire), on peut contribuer à identifier positivement une substance si sontemps de rétention est toujours le même que celui de l'étalon.

La meilleure méthode est de coupler un chromatographe avec un spectromètre de masse. Ce dernier peut, après fragmentation de la masse d'une molécule, de détecter et d'identifier chaque soluté de l'échantillon à analyser.La méthode de l'étalon interne consiste à ajouter à l'échantillon à analyser unétalon interne en quantité connue. Celui- ci subit les purifications et traitementschimiques imposés à la prise d'essai, il s'incorpore à toutes les phases de lachromatographie et émerge sous forme d'un pic isolé. La fractionéventuellement perdue renseigne sur la quantité globale des pertes solubles partous les autres constituants du mélange. On applique ainsi une correctionstandardisée. La mesure quantitative des pics se fait soit :* En découpant et en pesant les pics.* En mesurant la hauteur du pic, ou en mesurant la surface en multipliant lahauteur par la largeur du pic à mi- hauteur.* Par un intégrateur mécanique ou électronique, faisant partie de F enregistreur.Cette méthode étant la plus précise. Modalités pratiques :

L'idéal en (CPG) serait d'obtenir un tracé comportant autant de pics qu'ily a se composés à analyser. Tous ces pics doivent être nettement séparés etsymétriques, se rapprochant le plus possible des courbes Gauss. Pour obtenir cesconditions, il est nécessaire, en plus des connaissances théoriques, d'acquérirune certaine expérience en chromatographie,

Chois de la température :La température influe sur la mobilité et sur la détection. Dans sa versionsimple, la technique de chromatographie est isotherme. Cependant, pour certainsmélanges, il est parfois difficile de concilier les exigences de chacun desconstituants. Si on choisit la température la plus favorable à la sortie de lasubstance la moins retenue par la colonne, il en résulte pour les autres temps derétention élevés ; donc des pics tardifs, larges et qui peuvent traîner. Inversementsi on choisit une température convenant aux substances sortant les dernières, ilen résulte une sortie beaucoup plus rapide des premiers pics qui ne sont pas ou

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sont mal séparés. La programmation de température est, dans ce cas, unesolution efficace aux problèmes de la séparation.

L’échantillon   : L'introduction d'une quantité d'échantillon supérieure à la capacité detravail de la colonne est à proscrire, il en résulte une largeur des pics. La rapidité d'introduction et de vaporisation de l'échantillon doit se faire telle que la vaporisation soit immédiate. Lorsque les solutés à analyser sont directementvolatilisables, le traitement de l'échantillon ne se pose pas. Mais si les solutés nesont pas volatils ou se décomposent à la température de travail, il faut lestransformer avant l'analyse en dérivés volatils stables.

Choix du gaz vecteur   : Ce choix est conditionné par F efficacité de la séparation et la sensibilitédu détecteur. Le gaz vecteur doit être choisi de manière à être le moins miscibleavec la phase stationnaire ; des gaz tels que N2 ou CO^, ayant une faiblediffusibilité sont préférables.

Chois de la phase stationnaire   : La phase stationnaire est, selon les cas, un hydrocarbure, un silicone, un

ester ou un polyol, phase stationnaire polaire retient d'autant plus une substanceque celle ci elle même plus polaire- II en est de même pour une phase apolairevis à vis des substances peu polaires. Pour des substances de constitution etpolarité voisines et pour une phase stationnaire donnée, les pics sortent de lamême colonne par ordre de point de fusion croissant Pour augmenter oudiminuer la polarité de la colonne, on peut, non seulement, changer de phasestationnaire, mais encore agir sur le taux d'imprégnation du support.

3. Principe de base :La chromatographie en phase gazeuse (CPG) est une méthode de

séparation très utilisée. Elle est composée de plusieurs partie (appareillage) etdont la plus importante est la colonne, lieu de séparation des différentscomposés. Le choix de la colonne est dicté par la nature des composés à éluer.Chaque composé injecté est caractérisé par son temps de rétention, sachant quece dernier est le temps qui s'écoule entre l'injection et le maximum du picconsidéré.La seule différence entre la CPG et les autres techniques chromatographiquesréside dans l'utilisation d'un gaz comme phase mobile. Dans une cavité métallique se trouve un filament inconstant (à base de platine ou de tungstène). Il est sensible à la température et au même temps il est conducteur de courant. Ce filament est placé dans un flux gazeux de gaz vecteur, l'arrivée d'un soluté modifie la conductibilité thermique du milieu gazeux, ce qui va se traduire par un signal électrique, et donc un pic.

4. But du T.P : Le but de notre travail consiste à analyser l’Hexane par

chromatographie en phase gazeuse, de déterminer leur temps de rétention.

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5. Conditions opératoires :II est indispensable de déterminer les conditions opératoires qui influent

sensiblement sur le temps de rétention de l’élément à analyser.Pour ce travail, on utilise un chromatogramme a gaz équipé d'un détecteur àionisation de flamme (FID).

La température du détecteur est Tdet = 220°C, elle est généralement plus

proche ou égale à celle de la chambre d'injection qui est Tinj = 200°C. La colonne est de type Se30 : (OV101) comme phase stationnaire qui est

apolaire est analyse des composés apolaires. La température de la colonne est de 62°C Longueur de la colonne : L = 27m Le diamètre de la colonne est :D=0.25mm. Le gaz vecteur utilisé est l'azote à un débit de : 10 ml/min. Le papier du chromatogramme a une vitesse de déroulement de : 10

mm/min. La colonne est remplie de SE30

6. Mode opératoire :a- On fixe les températures des compartiments et on règle l'appareil.b- on prend l’échantillon a analysé et avec une micro- seringue, on l'injecte dansla chambre d'injection. Il est a signaler que cette opération nécessite une extrême rapidité, de plus il faut utiliser la quantité adéquate. Cette étape est délicate, il faut donc prendre des précautions et laver la seringue après chaque utilisation pour éviter l'apparition de plusieurs pics.c- A chaque apparition de pic sur le papier du chromatogramme, il faut prendre

les mesures de distances de rétention.Le chromatogramme Obtenue est le suivant :

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7. Expression des résultats :L’échantillon analysé est l’hexane, on a trouvé dans le chromatogramme 4 pic dont :

Le pic N° 1 a un temps de rétention TR=1.637s et il représente 92.5765% du total de l’échantillon analysé.

Le pic N° 2 a un temps de rétention TR=1.729s et il représente 6.9555% du total de l’échantillon analysé.

Le pic N° 3 a un temps de rétention TR=1.827s et il représente 0.3519% du total de l’échantillon analysé.

Le pic N° 4 a un temps de rétention TR=2.593s et il représente 0.1161% du total de l’échantillon analysé.

Le premier pic représente l’Héxane, et les autre son des impurté

8. Influence de la température :La température à laquelle se fait la séparation dépend beaucoup des conditions expérimentales, un bon choix initial est une température de chromatographie a quelques degrés au dessous du point d’ébullition du constituant principalSi toutes les substances du mélange ont sensiblement la même températured’ébullition, la séparation dépendra surtout de la nature de la phase stationnaire.Si on augmente la température, les pics chromatographiques se rapprochententre eux et la distance qui les sépare diminue. En tenant compte des faits expérimentaux, on choisi en définitif la températureentraînant la séparation désirée dans un laps de temps satisfaisant voir partiethéorique). Il est recommandé d'utiliser initialement une température inférieurede quelques degrés au point d'ébullition ou du principal constituant puis la faireaugmenter jusqu'à avoir un bon chromatogramme lisible et en tenir compte de la résistance de l'appareil vis à vis des températures élevées.

On remarque que l’évolution de la température en fonction du temps de rétention varie inversement, autrement dis plus la colonne est chauffé, plus le composé se volatilise rapidement et il est vite dégager.

D’une manière générale les composés les plus volatils sont rapidement entraînés vue leur importance de leur tension de vapeur, toute fois si la température est trop élevée, la séparation entre les phases ne peut s’établir et au delà, apparaissent presque tous en même temps.

D’autre part si la température est trop bas, la vitesse d’échange étant lente donc diffuse trop vite. Le temps de rétention de certaines substance devient trop long et les pics correspondant sont déformés ; pour cela il faut faire plusieurs essai avant de trouver la température qui donne la meilleure séparation des pics. Lorsque l’écart entre les points d’ébullition des constituant du m élange à analysé est très grand, il est préférable d’augmenter la température du four, afin d’obtenir une bonne séparation

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des pics. Dans le cas ou le débit est suffisant, l’augmentation de température est nécessaire pour améliorer la qualité de la séparation.

Application   : Détermination de la composition en acide gras dans le Blé :1/ Préparation de l’échantillon :Cette étape consiste a la transformation des acides gras en esters méthylique ; la méthode utilisée est celle décrit dans : (Tranchant 1982). Mode Opératoire :

Introduire deux gouttes (environ 40mg) de huile dans un tube en verre. Ajouter 1ml d’hexane, agiter 2 second. Introduire ensuite à l’aide d’une pipette 0.2 ml de soude 2N dans du

méthanol. Boucher le tube, agiter 2 second. Porter 20second en bain marie à 50°C, agiter 10 second. Ajouter 0.2ml d’acide chlorhydrique 2N dans du méthanol. Agiter et laisser décanter. La phase surnagent constitue les esters méthyliques dont le prélevement

pour l’injection dans le chromatographe se fera dans cette phase.

2/ Analyse des esters méthylique d’acide gras par CPG (AFNOR NF T60 234)L’analyse par chromatographie en phase gazeuse des esters méthyliques d’acide gras a été réalisé a l’aise d’un chromatogra mme GOW MAV serie 600 avec peak simple Data systeme avec détecteur a ionisation de flamme (FID)3/ les conditions opératoire :

Colonne capilaire OV-17 (moyennement polaire) de 30m de longueur et 0.25mm de diamètre interne.

Température de colonne = 100°C pendant 8 minutes puis 100 à250°C avec 7°C / min (T° de programmation).

T° d’injection=250°C (avec mode d’injection split). Température de détecteur=290°C Gaz vecteur : l’azote N2

Quantité de la prise d’essai injecté est de 1.5µl.L’identification des acides gras et l’etude qualificatif est réalisé en utilisant un étalon interne qui est l’acide stéarique C18 :0.

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Conclusion   :

D’après ce TP, on a constaté que la chromatographie en phase gazeuse est une technologie de pointe car elle peut séparé et détecté des substance a l’échelle de quelque µl, on a pu déterminer le pourcentage de la substance a analysé qui est l’hexane dans la solution et on a met en évidence la présence d’impureté, donc c’est une méthode fiable, rapide et très délicate.

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Référence bibliographique

[1] Valorisation du germe de blé par extraction de huile à froid et sa

caractérisation pour l’obtention d’un complément alimentaire

(2003/2004).

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