PONTIFICIA UNIVERSIDAD JAVERIANA

FACULTAD DE CIENCIAS CARRERA DE MICROBIOLOGIA INDUSTRIAL

APLICACIÓN DE LEVADURA Candida spp. COMO UNA ALTERNATIVA VIABLE PARA LA RETARDACIÓN EN LA PUDRICIÓN DEL BANANO

(Musa acuminata).

JONATHAN BUITRAGO ESTRADA ANGÉLICA MARIA ESCOBAR ROMERO

TRABAJO DE GRADO

Presentado como requisito parcial Para optar al título de

MICROBIÓLOGO INDUSTRIAL

Bogotá D. C. Enero 2009

NOTA DE ADVERTENCIA

“Los conceptos y opiniones emitidos en este trabajo son responsabilidad del autor y no comprometen en nada a la

Pontificia Universidad Javeriana”. Artículo 23 de la Resolución No 13 de julio de 1946.

APLICACIÓN DE LEVADURA Candida spp. COMO UNA ALTERNATIVA VIABLE PARA LA RETARDACIÓN EN LA PUDRICIÓN DEL BANANO

(Musa acuminata).

JONATHAN BUITRAGO ESTRADA

ANGÉLICA MARÍA ESCOBAR ROMERO

APROBADO

_________________________________________________ Gerardo Moreno

Director

___________________ __________________

Jurado 1 Jurado 2

APLICACIÓN DE LEVADURA Candida spp. COMO UNA ALTERNATIVA VIABLE PARA LA RETARDACIÓN EN LA PUDRICIÓN DEL BANANO

(Musa acuminata).

JONATHAN BUITRAGO ESTRADA

ANGÉLICA MARÍA ESCOBAR ROMERO

__________________________ _________________________ JANETH ARIAS PALACIOS INGRID SCHULER Directora Carreras de Microbiología Decana Académica facultad de ciencias

Agradecemos a nuestros padres y hermanos Alba, Luis Freddy, Johanna, María

Mercedes, José, Sindy, Duley y Gaby, por su colaboración, comprensión y apoyo

incondicional

A nuestro Director Gerardo Moreno por sus conocimientos, apoyo y entrega.

A nuestros amigos y compañeros por su colaboración y a todos los que nos han

dejado grandes enseñanzas.

TABLA DE CONTENIDO

1. Introducción

2. Marco teórico y revisión de literatura

2.1 Banano (Musa acuminata)

2.1.1 Clasificación taxonómica

2.2 Frutos climatéricos

2.2.1 Fisiología de la maduración.

2.2.2 Cambios durante la maduración.

2.2.2.1 Respiración

2.2.2.2 Producción de etileno

2.2.2.3 Enzimas pécticas

2.2.2.4 Color

2.2.2.5 Peso y tamaño

2.2.2.6 Contenido de sólidos solubles totales

2.2.2.7 Firmeza de la pulpa

2.2.2.8 pH y acidez titulable

2.2.2.9 Tasa de producción de CO2

2.2.2.10 Agua

2.2.2.11 Carbohidratos

2.2.2.12 Almidón.

2.2.2.13 Lípidos

2.2.2.14 Ácidos orgánicos

2.2.2.15 proteínas, fenoles y otros compuestos nitrogenados

2.3 Maduración comercial del banano

2.4 Levadura

2.4.1 Genero Cándida sp.

2.4.1.1 Características Generales

2.4.1.2 Fermentación de azúcares

2.4.1.3 Fisiología y crecimiento

2.4.1.4 Necesidades nutricionales

2.4.2 Cinética de Crecimiento

2.4.3 Efecto de la concentración de azúcares sobre la levadura.

2.4.4 Levaduras en frutos.

3. Formulación del problema

3.1 Justificación de la investigación

4. Objetivos

4.1 Objetivo general

4.2 objetivos específicos

5. Materiales y métodos

5.1 Ensayo preliminar y experimental: Aislamiento y recuperación de la levadura

5.2 Descripción macroscópica y microscópica de la levadura

5.3 Identificación bioquímica API 20C AUX

5.4 Prueba de patogenicidad

5.5 Determinación de biomasa por peso seco

5.6 Curva de crecimiento

5.7 Actividad Enzimática cualitativa

5.8 Crecimiento en agar banano.

5.9 Aplicación en el fruto.

5.9.1 Determinación fisiológica de peso PFP

5.9.2 Determinación de pH

5.9.3 Determinación de Grados Brix

6. Análisis Estadístico

7. Resultados y discusión

8. Conclusiones

9. Recomendaciones

10. Referencias

11. Anexos

LISTA DE TABLAS

1. Composición aproximada de un banano maduro.

2. Caracteres utilizados en la clasificación taxonómica del banano.

3. Número de bananos para cada día de estudio.

4. Resultados de asimilación de azucares por Candida sp.

5. Datos obtenidos a partir de curva de crecimiento C. guillermondii.

6. Resultados de la probabilidad por prueba T para SST con un intervalo de

confianza del 95%.

7. Promedio de pesos de las replicas de los frutos control a través de los días.

8. Promedio de pesos de las replicas de los frutos con aplicación de la

concentración 1.

9. Promedio de pesos de las replicas de los frutos con aplicación de la

concentración 2.

LISTA DE FIGURAS

1. Estadios en el desarrollo y maduración de frutos que experimentan incremento climatérico.

2. Curva de crecimiento típica de una levadura.

3. Clasificación de bananos para posterior aplicación. 4. Bananos después de aplicación. 4. A. Macerado de banano. 4. B. Refractómetro portátil 6. Características microscópicas de Candida sp.

7. Características macroscópicas de Candida sp.

8. Resultado programa informático Api web TM API 20 AUX.

9. Crecimiento de C. guillermondii en agar banano.

10. Curva de peso seco de C. guillermondii.

11. Curva de crecimiento de C. guillermondii.

12. Fase exponencial de C. guillermondii.

13. Comportamiento del pH durante la curva de crecimiento.

14. Ln de la concentración de C. guillermondii en función del tiempo, para determinar tiempo de duplicación y velocidad especifica de crecimiento.

15. Comportamiento del pH durante la maduración del fruto.

16. comportamiento de los SST en tratamientos y control.

17. Efecto de la levadura a concentración 1 sobre el fruto a los 18 días de estudio.

18. Perdida de agua y firmeza en el fruto.

19. Perdida lineal de los frutos control a través del tiempo.

20. Perdida lineal de los frutos con aplicación de la concentración 1 a través del tiempo.

21. Perdida lineal de los frutos con aplicación de la concentración 2 a través del tiempo.

22. Relación de pérdida lineal de peso, entre los frutos control y las concentraciones. 23. Porcentaje de pérdida de peso de los frutos a través del tiempo.

24. Estado de maduración del fruto control frente al fruto con levadura.

LISTA DE ANEXOS

1. Taxonomía, clasificación y nomenclatura de los bananos cultivados en

Colombia

2. Guía de Color del banano (Musa acuminata)

3. Sistema de identificación de levaduras API 20C AUX.

4. Resultados API 20 C AUX para Levadura.

5. Fotografía Confocal de Candida spp.

RESUMEN

El proceso de pudrición de frutos como el banano, ha llevado a la Industria bananera

a pérdidas económicas demasiado altas, ya que el proceso de maduración en este

fruto se ve afectado por la temperatura, la humedad, el transporte y el

almacenamiento.

En este estudio se evaluó el efecto de Candida spp como una alternativa viable para

retardar la pudrición que presenta el fruto del banano, la levadura fue aislada de frutos

de uchuva e identificada, se determinó el comportamiento en cuanto cinética de

crecimiento de la cual se determinaron dos concentraciones dentro de su fase

exponencial para ser aplicadas en los frutos y comparadas contra un control el cual no

fue tratado con levadura. El Estudio se llevó a cabo por 45 días, durante este tiempo

se determinaron variables tales como Sólidos solubles totales (grados Brix), pH,

pérdida de peso a través de los días, además de observar los cambios organolépticos

del fruto.

Los datos obtenidos se analizaron estadísticamente para conocer su comportamiento y

a la vez determinar la concentración óptima de aplicación que tenga efecto de

retardación sobre el fruto del banano.

1. INTRODUCCIÓN

Desde hace algunos años, entre las especies cultivadas de mayor trascendencia

económica en el mundo se encuentra el banano, teniendo un gran potencial en los

mercados de Norteamérica, Europa y últimamente en el continente asiático, siendo

los principales destinos de exportación en los últimos años Bélgica 37%, Estados

Unidos 36% y Alemania 11% según datos reportados por Bancoldex. La importancia

de este cultivo está en el hecho de que forma parte fundamental en la dieta de los

habitantes de los países productores y países importadores, al suministrar gran parte

de calorías. Las exportaciones de banano han registrado un incremento por la

creciente demanda en el exterior, generando ingresos cercanos a los 242 millones de

dólares anuales, según datos reportados por el DANE.

El cultivo de este fruto en Colombia es de gran importancia socio económica por ser

un producto fundamental de la canasta familiar, convirtiéndolo en una fuente de

ingreso de divisas para el país, a la vez que permite el ingreso a nuevos mercados. En

el cultivo y cosecha del banano se deben tener cuidados especiales su manejo, ya que

al ser un fruto climatérico, su rápida maduración juega un papel fundamental en la

obtención de un producto de calidad, es así como este factor natural del fruto se

convierte en un problema para los comercializadores de banano, provocando pérdidas

postcosecha del producto, afectando la economía del sector bananero.

Es necesario conocer los procesos fisiológicos de la maduración para el mejoramiento

de la calidad y la prevención de grandes pérdidas, durante la producción,

almacenamiento, industrialización y mercadeo de los frutos, buscando nuevas

alternativas para controlar este proceso que ha medida del tiempo conlleva a la

pudrición del fruto.

Este estudio forma parte de un proyecto integrado en el que se han evaluado las

características, propiedades, forma de conservación, antagonismo frente a

microorganismos del medio ambiente y fitopatógenos y su respuesta a aplicaciones en

campo de la Levadura Candida spp.

A partir del año 2000 se han realizado estudios que demuestran el efecto de Candida

spp. sobre la retardación en la pudrición de frutos. Por tal razón este estudio pretende

demostrar que la utilización de levadura representa una posibilidad para encontrar el

camino hacia la obtención de un producto con una vida útil más prolongada.

2. MARCO TEORICO

2.1 EL BANANO

El banano es una fruta de agradable sabor, alto contenido de vitaminas y minerales y

fácil digestión. Por cada 100 gramos de banano se tienen 460 calorías. Como pocas

frutas el banano permanece aséptico dentro de su envoltura natural, jamás tiene

gusanos, ni corazón, ni semillas. Es un alimento altamente energético, con hidratos de

carbono fácilmente asimilables, pero pobre en proteínas y lípidos. (Sierra, L. 1993)

Tabla 1. Composición aproximada de un banano maduro.

Humedad Azúcares totales

Dextrosa Levulosa Sucrosa Almidón

Fibra cruda Proteína Grasa

Cenizas

74.8 % 21.2

4.8 % 3.7 12.7 1.2 0.6 1.2 0.2 0.8

Vitaminas en 100 gramos

A Tiamina (B1)

Riboflavina (B2) Acido Ascórbico Piroxidina (B6)

430.0 UI 0.1 Mgr

0.05 Mgr 10.0 Mrg 0.52 Mgr

Tomado de: (Sierra, L. 1993).

El banano posee alrededor del 75% de agua. Mas o menos la cuarta parte corresponde

a hidratos de carbono. No engorda porque la cantidad de azúcar pasa rápidamente a la

sangre. El banano maduro contiene ciertos componentes químicos muy importantes:

serotonina, dopamina y la norafetamina. La serotonina ayuda en el retraso mental y

en las depresiones nerviosas, aumenta la actividad locomotora y reduce la apatía y los

retraimientos. El banano es uno de los alimentos favoritos dentro de las nuevas

tendencias de consumo en los países desarrollados que se inclinan por productos

frescos y saludables. (Sierra, L. 1993)

El banano ofrece enormes posibilidades para la elaboración de productos

transformados e industrializados, en forma de bananos pasos o deshidratados, cremas,

pastas, pulpas, compotas, mermeladas en conserva, frutas confitadas y congeladas,

alimento para ganado, abonos a base de desechos orgánicos, fibras y papel a base de

pseudotallos, alcohol, vinagre de la fermentación de la fruta, etc. (Sierra, L. 1993)

2.1.1 CLASIFICACIÓN TAXONÓMICA

Todas las especies de bananos y plátanos comerciales pertenecen a la familia

musácea. La familia musácea se encuentra subdividida en tres subfamilias:

Musoideae, Strelitroideae y Heliconoideae. La subfamilia Musoideae se divide en los

géneros: Ensete y Musa. El primero agrupa a las hierbas monocarpicas con numero

cromosómico de nueve y no producen frutos comestibles, el segundo, el genero Musa

está constituido por cuatro secciones: Australimusa, Callimusa, Rhodochlamys y

Eumusa (ANEXO 1). La sección Eumusa es la de mayor importancia económica, ya

que la mayor parte de los cultivares de banano y plátano son producto de esta

evolución del género Musa. sus cultivares tuvieron su origen es dos especies

silvestres, Musa acuminata y Musa balbisiana, dando origen por poliploidía e

hibridación a los plátanos y bananos cultivados. (Sierra, L. 1993)

Musa acuminata es una planta de porte bajo, con pseudotallos delgados y un sistema

foliar reducido. Presentan una coloración parduzca que se convierte en manchas

heterogéneas claramente definidas en las láminas de las hojas y una coloración vino

uniforme en las vainas internas del pseudotallo. Los racimos crecen horizontalmente,

son pequeños con dedos muy delgados que producen semillas. (Sierra, L. 1993)

Tabla 2. Caracteres utilizados en la clasificación taxonómica de banano.(Musa

acuminata)

Caracteres Musa acuminata

Color del pseudotallo

Canal peciolar

Más o menso densamente marcado con manchas de color pardo o negro Margen erecto o dilatado con alas escoraseas por debajo, sin abrazar el psudotallo.

Pedúnculo Pedicelos

Por lo general pubescente o piloso Cortos

Rudimentos seminales Dos hileras regulares en cada lóculo Hombro de bráctea

Enrollamiento de la bráctea Por lo general alto La bráctea se repliega y enrolla hacia atrás después de abrirse

Forma de la bráctea

Ápice la bráctea

Lanceolada o estrechamente aovada aguzándose abruptamente a partir del hombro Agudo

Color de la bráctea

Atenuamiento del color

Rojo, purpura mato o amarillo, en la parte exterior rosado, purpura mate o amarillo dentro. El color interno de la bráctea se atenúa hasta llegar al amarillo en dirección a la base.

Sépalo libre de la flor

Color de la flor Color del estigma

Corrugado en forma variable, por debajo de la punta. Banano cremoso Anaranjado o amarillo intenso

Tomado de Sierra, L. 1993

2.2 FRUTOS CLIMATÉRICOS

Los cambios en la respiración de las frutas a través del tiempo desde su crecimiento

hasta su senescencia marcan la característica de los dos tipos de frutos los llamados

climatéricos y no climatéricos. Los frutos climatéricos durante la división celular

tiene una actividad respiratoria muy alta, cuando termina esta etapa, la fruta pasa a un

estado de maduración, cuando esta etapa esta terminando se inicia dentro ella la

maduración final (organoléptica o sensorial) que coincide con un aumento en la

actividad respiratoria hasta completar la maduración, la que disminuye con el

envejecimiento del fruto, este incremento en la respiración, se denomina pico

climatérico o sencillamente climaterio. En los productos climatéricos como respuesta

a diferentes concentraciones ascendentes de (C2H4) se activa prematuramente la

maduración. Los productos climatéricos requieren de un manejo especial con el fin de

evitar que el climaterio se active y lo lleve a la senescencia rápidamente perdiendo

gran parte o la totalidad de su valor comercial. (Gallo, F. 1997)

2.2.1 Fisiología de la maduración.

La maduración es un proceso fisiológico que ocurre en un periodo de tiempo como

parte del crecimiento y desarrollo de una fruta, es una secuencia de hechos naturales.

Se produce sin que haya en muchos casos, un crecimiento en tamaño; es una

transformación interna de la fruta, que constituye uno de los más extraordinarios

fenómenos fisiológicos. El fruto se transforma totalmente en pocos días, pasando de

ser simple, sin atractivo, no comestible a uno atractivo, de un alto sabor, aroma y

deseable para ser consumido. Siendo la maduración un proceso de cambio

irreversible que proporciona las características óptimas para el consumo de una fruta.

(Cayón, D. et al. 2000).

Los procesos fisiológicos de la maduración ocurren a nivel celular y cuando terminan

las transformaciones se inician los procesos de degradación o desintegración de

sustancias como la clorofila, aromas, sabores, etc. y organelos iniciando por los

ribosomas y plastos, terminando con el núcleo y el plasmalema causando finalmente

la muerte de la célula. Estas últimas etapas de la maduración son los periodos de la

desorganización de tejidos o senescencia y la destrucción final. (Gallo, F. 1997). La

senescencia es la fase final de la vida útil de un órgano en el cual se presentan

alteraciones irreversibles que conducen al desorden y muertes celulares por el

aumento de la actividad de enzimas hidrolíticas. (Cayón, D. et al. 2000).

Después de cosechados, los frutos climatéricos como el banano (Musa acuminata)

pasan por cuatro estadios de desarrollo fisiológico: preclimaterio, climaterio,

maduración, maduración de consumo y senescencia. El preclimaterio representa el

periodo desde la cosecha hasta la iniciación de la respiración climatérica; durante esta

fase los frutos son verdes, de textura rígida y la actividad metabólica es baja, siendo

el objetivo comercial prolongar al máximo esta fase. El climaterio se caracteriza por

un incremento rápido en la respiración denominado “respiración climatérico” que

generalmente ocurre cuando se completa el del proceso de maduración del fruto. El

máximo climaterio puede ocurrir antes o después que el fruto es removido de la

planta, dependiendo del tipo del fruto y los procedimientos de cosecha. Durante el

estadio de maduración el cambio más notable es la pérdida paulatina del color verde y

amarillento de la cáscara como resultado de la degradación de la clorofila,

permitiendo que la pigmentación debida a los carotenos y xantofilas se torne visible;

al mismo tiempo, la pulpa comienza a ablandarse y el almidón es convertido

rápidamente a sacarosa, glucosa y fructosa. (Cayón, D. et al. 2000).

2.2.2 Cambios durante la maduración.

2.2.2.1 Respiración En todos los frutos, la tasa respiratoria es elevada cuando son

jóvenes mientras las células aun se dividen y crecen con rapidez. Después la tasa

declina de manera gradual, incluso si el fruto se corta. Sin embargo, en muchas

especies como el banano la disminución gradual en la respiración se revierte en un

marcado incremento conocido como climatérico (Figura 1), este suele coincidir con la

maduración plena y la adquisición del sabor del fruto que se acelera por la producción

celular de etileno que estimula la maduración. Una acumulación adicional provoca

senescencia y disminución en la respiración. (Salisbury, F. Ross, C., 1994)

Tomado de Salisbury y Ross, 1994

Figura 1. Estadios en el desarrollo y maduración de frutos que experimentan

incremento climatérico en la respiración y de frutos que no la experimentan.

Los bananos al pertenecer al grupo de las frutas climatéricas, siguen madurando

después de la cosecha. En fruta inmadura de tipo climatérico, la aplicación de un

tratamiento con etileno exógeno acelera el comienzo de los cambios de maduración,

sin alterar, generalmente, el patrón de los cambios de respiración; una vez que ha

entrado en esta fase y se ha iniciado la elevación climatérica, la maduración es un

proceso irreversible que puede ser atrasado pero no detenido por factores externos. El

banano es una fruta que muestra aumentos en la respiración y producción de etileno

al comienzo de la maduración. La respiración se incrementa como consecuencia de

los daños mecánicos y del estado de sanidad del banano; para que la respiración no se

acelere el producto debe colocarse en un lugar fresco, sin corrientes fuertes de aire,

evitando el exceso de manipulación y los daños causados por éste. (Ovalle, J. Et.al.

1999).

La respiración es un proceso global que consiste en una oxido-reducción en la que

algunos compuestos se oxidan a CO2 y el oxigeno que se absorbe se reduce para

formar agua. El almidón, sacarosa, azucares simples, grasas y ácidos orgánicos

pueden servir como sustratos respiratorios. La respiración es una serie de 50

reacciones o más que se complementan entre sí, cada una catalizada por una enzima

distinta. Es una oxidación que se efectúa en un medio acuoso, a un pH casi neutro y a

temperatura moderada. Esta degradación paulatina de moléculas grandes es un medio

para convertir energía en ATP. Además a medida que se efectúa la degradación se

obtienen intermediarios útiles para un gran número de otros productos vegetales

esenciales. Entre estos productos se incluyen aminoácidos para proteínas, nucleótidos

para ácidos nucleicos y precursores carbonados para pigmentos porfirínicos (clorofila

y citocromos), así como otros compuestos aromáticos (lignina). (Salisbury, F. Ross,

C., 1994).

2.2.2.2 Producción de etileno Además de mostrar un incremento en la respiración,

la fruta climatérica produce también etileno, que aumenta durante la maduración. El

etileno ha sido identificado como una hormona natural en las plantas; ejerce mayor

influencia sobre los aspectos del crecimiento, el desarrollo y la senescencia,

incluyendo la iniciación de la maduración. El banano emite etileno entre 0.1 y 1.0 µl

C2H4 Kg h (microlitros de etileno hora por cada kilo de fruta). Su sensibilidad por

este gas es grande, por lo que en contacto con algunas frutas que lo produzcan, como

maracuyá, chirimoya o uchuva, se acelera su maduración. (Ovalle, J. Et.al. 1999).

Los tejidos vegetales sintetizan etileno a través de una ruta metabólica que utiliza

como precursor el aminoácido metionina. El etileno difiere de todas las fitohormonas

conocidas en su extrema volatilidad, característica gaseosa, que permite que el etileno

producido por una planta o fruto influya sobre el crecimiento y desarrollo de otros

cercanos. (Cayón, D. Et al. 2000). La sensibilidad de los frutos al etileno se reduce

durante el almacenamiento a bajas temperaturas, con el incremento de los niveles de

CO2 (inhibiendo la respiración) o disminuyendo la presión parcial de oxigeno que

inhibe la respiración y la síntesis de etileno. (Gallo, F. 1997)

2.2.2.3 Enzimas pécticas Juegan un papel importante en los cambios de la textura

durante el proceso de maduración. El ablandamiento se ha atribuido a la

solubilización de pectina por efecto de enzimas pécticas como la poligalacturonasa

(PG) (E.C.3.2.1.1.11), que cataliza la hidrólisis de los enlaces glicosidicos α1-4 de las

sustancias pécticas generando una disminución de la firmeza de los tejidos. Así

mismo la pectinestereasa (E.C.3.1.1.11) hidroliza los grupos metil éster del ácido

pectico y de la pectina produciendo grupos carboxilo libres. (Gallo, F. 1997)

La actividad de la PG se ha cuantificado mediante la formación de grupos reductores

por los métodos de Samogy-Nelson (1944), Luschinger and Cornesky (1962),

también se utiliza el método de Gross et. al., 1982, el cual es más fácil y sensible que

los otros métodos debido a que cuantifica nanomoles de azúcares reductores. (Gallo,

F. 1997)

2.2.2.4 Color Es el cambio más notorio en muchas frutas durante su maduración y

con frecuencia es el criterio más utilizado para decidir sobre la madurez de esta. La

transformación más importante es la degradación del color verde. La perdida de color

verde es consecuencia de la degradación de la clorofila se debe a uno o varios

procesos secuenciales, los más relevantes son el cambio de pH, los procesos

oxidativos y la acción de las clorofilazas. Esta desaparición de color verde esta

asociado con la síntesis o el desenmascaramiento de pigmentos cuyos colores oscilan

entre amarillo y el rojo. Los pigmentos responsables son los carotenoides,

hidrocarburos no saturados de cuarenta carbonos generalmente y cuyas moléculas

pueden contener una o mas funciones oxigenadas, las antocianinas que son

hidrosolubles, producen colores muy fuertes que pueden en ocasiones enmascarar a

los carotenoides y a la clorofila. (Gallo, F. 1997). Los cambios de color en el banano

son debidos a una degradación de la clorofila. Con la maduración a temperatura alta

(arriba de 27°C) no hay degradación de la clorofila; lo cual resulta en fruta madura,

pero con cáscara verde. (Ovalle, J. Et.al. 1999).

A medida que transcurre la maduración del fruto, se sintetizan los azucares totales

encontrándose muy bajos contenidos en frutos en estado verde y valores alrededor del

35 % en frutos maduros la síntesis de azúcares es lenta después de cosechado el fruto

y hasta que este alcanza el estado verde claro, correspondiente a la fase de

preclimaterio; el aumento en azucares ocurre cuando el fruto empieza a tornarse

amarillo acelerándose la síntesis de azucares hasta alcanzar la coloración totalmente

amarilla. (Cayón, D. Et al. 2000).

2.2.2.5 Peso y tamaño La propiedades físicas del fruto cambian durante el proceso

natural de maduración disminuyendo significativamente el peso promedio y la

humedad del fruto, el peso de la pulpa aumenta y el de la cáscara disminuye,

incrementándose la relación pulpa-cáscara. La reducción del peso fresco es típica del

comportamiento metabólico de los frutos durante la postcosecha, siendo más

pronunciada en los frutos que se desarrollan en las zonas cálidas y secas. (Cayón, D.

Et al. 2000).

2.2.2.6 Contenido de sólidos solubles totales. Durante la maduración de los

bananos, el contenido de sólidos solubles totales aumenta. En algunos híbridos, el

contenido aumenta hasta un pico y luego disminuye (la caída puede deberse a la

conversión del azúcar de la pulpa en alcohol), mientras que en otros, los sólidos

solubles continúan su aumento con la maduración. (Chang-Yuen, Et.al 2005)

2.2.2.7 Firmeza de la pulpa. La fruta crujiente, dura, y verde se convierte en una

fruta amarilla, con pulpa tierna y suave en la etapa óptima de madurez, y se torna

blanda a medida que avanza hacia la senescencia. La firmeza de la pulpa a menudo

está relacionada con la maduración, implicando que al progresar la maduración, la

firmeza de la pulpa disminuye. La pérdida de firmeza de la pulpa se asocia a 3

procesos: 1. Degradación del almidón para formar azúcar; 2. Degradación de las

paredes celulares o reducción en la cohesión de la lamela media debido a la

solubilización de las sustancias pécticas; 3. El movimiento del agua desde la cáscara

hacia la pulpa debido al proceso de ósmosis. (Chang-Yuen, Et.al 2005)

2.2.2.8 pH y acidez titulable. En la mayoría de los híbridos y cultivares existe una

rápida disminución del pH de la pulpa, en respuesta a un aumento en la madurez (la

magnitud de la disminución depende del cultivar). La acidez titulable de los tejidos de

la pulpa, de la mayoría de los cultivares e híbridos de banano, muestra grandes

aumentos durante la maduración. (Chang-Yuen, Et.al 2005)

2.2.2.9 Tasa de producción de CO2. Durante la maduración de los bananos existe un

gran aumento en la cantidad del etileno producido, usualmente acompañado por un

aumento en la tasa de respiración de la fruta (climaterio). El control del proceso de

maduración de frutos climatéricos es uno de los aspectos clave para la

comercialización internacional de este tipo de fruta; esto se debe a que el proceso está

íntimamente relacionado con la capacidad de esa fruta para soportar períodos de

transporte y almacenamiento prolongados hasta alcanzar los mercados de destino.

(Chang-Yuen, Et.al 2005)

2.2.2.10 Agua El agua es el mayor componente del fruto confiriéndole fragilidad a

los tejidos, la pulpa esta compuesta esencialmente de agua y carbohidratos, mientras

que los contenidos de grasas y proteínas son bajos. Las condiciones del trópico

favorecen la perdida rápida de agua de los frutos de plátano y se ha demostrado que

esta perdida de agua acelera la maduración, reduciendo la duración de la vida verde

pre climatérica del fruto, además de las condiciones ambientales, los cambios físicos

a los frutos también influyen en la maduración. El fruto verde, inmediatamente

después de cortado, muestra una baja intensidad transpiratoria que luego se estabiliza

a un nivel continuo que depende de la temperatura y la humedad: en el climaterio

ocurre un drástico aumento de la transpiración, a medida que el fruto madura se

mantiene un nuevo estado constante mayor que el de el preclimaterio y, finalmente se

registra una caída en pérdida de agua. El contenido de humedad de la cáscara

disminuye durante la maduración mientras en la pulpa aumenta, el porcentaje de agua

en la pulpa aumenta durante la maduración, no solo por la hidrólisis del almidón sino

también por el movimiento osmótico de agua desde la cáscara hacia la pulpa. Un

incremento en el peso de la pulpa afectando la relación pulpa: cáscara, parece ser una

consecuencia de la salida osmótica de la humedad de la cáscara. Una diferencia

marcada de la presión osmótica entre la pulpa: cáscara se desarrolla durante la

maduración ya que la concentración de azucares se incrementa más rápidamente en la

pulpa que en la cáscara. La cáscara del plátano aunque no es usada para la

alimentación humana ejerce una función reguladora entre la pulpa comestible y las

condiciones ambientales externas, además de ser particularmente importante para

proteger la pulpa contra daños físicos y desecación. (Cayón, D. Et al. 2000).

2.2.2.11 Carbohidratos presentan el cambio más importante de los frutos

climatéricos, el almidón es convertido casi en su totalidad en azúcares. Esta

transformación altera el sabor, la textura y consistencia del fruto; haciéndolo mas

dulce y con mayor aceptabilidad. La degradación de sustratos poliméricos,

especialmente de las sustancias pécticas y hemicelulosa, debilita las paredes celulares

y las fuerzas cohesivas que mantienen las células unidas. Las sustancias pécticas

proceden de un precursor insoluble en agua llamado protopectina; es un

macropolimero; ligado por enlaces cruzados con otros polímeros, a través de puentes

de calcio, unido con otros azucares y otros derivados fosforilados de los mismos

dando una molécula de tamaño excesivo. Durante la maduración la protopectina va

degradándose a fracciones de peso molecular mas bajo, las cuales son más solubles

en el agua; la velocidad de esta degradación y de las sustancias pécticas induce la

velocidad de ablandamiento de la fruta. (Gallo, F. 1997).

La sacarosa necesaria para la síntesis del almidón en la pulpa de los frutos en

formación provienen, en su mayoría, de la fotosíntesis foliar y muy poco de la

fotosíntesis realizada por la cáscara, ya que la actividad fotosintética de las hojas del

plátano es mayor a la de la cáscara de los frutos en formación como consecuencia de

la muy baja densidad estomática de la cáscara comparada con la de las hojas. (Cayón,

D. et al. 2000).

2.2.2.12 Almidón. Es el carbohidrato predominante en el fruto del banano, cuyo

porcentaje es del 48% de la materia seca o del 12.7 % del peso fresco. La pulpa fresca

del fruto verde contiene 62.4% de agua, 23.3% de almidón y 2.1% de glucosa, los

tejidos de la cáscara contienen almidón alrededor del 3% del peso fresco. Los frutos

acumulan almidón durante su desarrollo y se transforman o degradan en azucares mas

sencillos antes o durante la maduración por acción de las enzimas. (Cayón, D. et al.

2000).

La mayoría de los pasos de la degradación de almidón a glucosa pueden ser

catalizados por tres enzimas distintas, si bien hay otras más que se necesitan para

completar el proceso. Las primeras tres enzimas son-. Una alfa amilasa, una beta

amilasa y la almidón fosforilasa. De estas al parecer solo la alfa amilasa puede atacar

gránulos de almidón intactos, por lo que cuando participa la beta amilasa y la almidón

fosforilasa, es probable que actúe sobre los primeros productos liberados por alfa

amilasa. La alfa amilasa ataca de manera aleatoria enlaces 1-4 en las moléculas de

amilosa y amilopectina, al principio creando huecos al azar en los gránulos de

almidón y liberando productos que aun son grandes. En cadenas de amilosa no

ramificadas, el ataque repetido por la alfa amilasa produce maltosa, un disacárido que

contiene dos unidades de glucosa. Sin embargo la alfa amilasa no puede atacar los

enlaces 1-6 localizados en los puntos de ramificación de la amilopectina, por lo que la

digestión de amilopectina cesa cuando aun quedan dextrinas ramificadas con cadena

de longitud corta. Muchas alfa amilasas son activadas por Calcio siendo este un

elemento esencial. (Salisbury, F.; Ross, C.; 1994).

La beta amilasa hidroliza el almidón en beta maltosa; la enzima actúa primero sobre

los extremos no reductores. La beta maltosa cambia con rapidez, por muta rotación,

para formar las mezclas naturales de isómeros alfa y beta. La hidrólisis de amilosa

por la beta amilasa es casi completa, pero la degradación de amilopectina es

incompleta porque no son atacados los enlaces de los puntos de ramificación

quedando nuevamente dextrinas ramificadas. La actividad de ambas amilasas implica

la incorporación de una molécula de agua por cada enlace roto por lo que son enzimas

hidrolasas, las reacciones hidrolíticas no son reversibles, de modo que no se puede

detectar síntesis de almidón por amilasas. La almidón fosforilasa degrada el almidón

empezando por un extremo no reductor, esta degradación no se realiza incorporando

agua en los productos como lo hacen las amilasas, si no incorporando fosfatos.

(Salisbury, F.; Ross, C.; 1994).

La amilopectina solo es degradada parcialmente por la acción de la almidón

fosforilasa. La reacción procede de manera consecutiva a partir del extremo no

reductor de cada cadena principal o cadena ramificada, hasta unos pocos residuos de

glucosa de las uniones alfa 1-6 de las ramificaciones. Las uniones 1-6 de las

ramificaciones de la amilopectina o las dextrinas ramificadas que no son atacadas por

ninguna de las enzimas mencionadas, son hidrolizadas por diversas enzimas

desramificantes. Las plantas contienen tres tipos principales dependiendo de los tipos

de polisacáridos que atacan: una pululanasa, una isoamilasa y una dextrinasa limite.

La acción de estas enzimas sobre cadenas de almidón ramificadas, generan grupos

terminales adicionales sobre los que actúan la amilasa o la almidón fosforilasa.

(Salisbury, F. Ross, C., 1994).

2.2.2.13 Lípidos El contenido de lípidos en la pulpa de los frutos de banano es bajo y

permanecen constantes durante el proceso de maduración. El 45% de los ácidos

grasos de los lípidos son saturados, siendo el ácido linolénico el principal

componente. La concentración total de lípidos en la pulpa fresca es de 0.2 a 0.5 % y

en la cáscara fresca de 1.0 %. (Cayón, D. Et al. 2000).

2.2.2.14 Ácidos orgánicos Los ácidos orgánicos son esenciales para el

mantenimiento del balance azúcar: ácido que confiere a los frutos del plátano y

banano un sabor agradable durante la maduración y pueden ser considerados como

una reserva energética de los frutos ya que normalmente son degradados y

convertidos a azucares durante la maduración. Se sabe que la mayoría de frutos tienen

concentraciones elevadas de ácidos orgánicos relacionados con el ciclo de los ácidos

tricarboxilicos (ciclo de krebs) y otras rutas metabólicas, cuyo exceso suele

almacenarse en las vacuolas. (Cayón, D. Et al. 2000).

Los principales ácidos orgánicos en la pulpa del fruto son: málico, cítrico y oxálico,

cuyos niveles se incrementan durante la maduración. En el fruto verde la

concentración de ácido oxálico es mayor, mientras que en el fruto maduro es el ácido

málico. La pulpa del fruto contiene en estado verde 0.7% de ácido málico y 1.5% en

estado maduro. La cáscara en estado verde contiene 1.0% de ácido málico y 1.4% en

estado maduro. (Cayón, D. Et al. 2000).

2.2.2.15 Proteínas, fenoles y otros compuestos nitrogenados Durante la

maduración se producen cambios el la actividad enzimática, que alteran las

estructuras subcelulares provocando cambios en la actividad mitocondrial,

desintegración interna de las mitocondrias y perdida de la eficiencia respiratoria, la

cantidad total de compuestos nitrogenados permanece constante una vez que el fruto

es arrancado de la planta, pero se presenta un ligero incremento neto en la proteína

durante la maduración de algunos frutos. Algunos cambios en las rutas metabólicas

observadas durante la maduración, entre ellos el aumento de la actividad de la enzima

málica y la carboxilasa pirúvica, pueden explicar el aumento climatérico de la

producción de CO2 que ocurre en los frutos del plátano.

La pulpa de plátano, como muchos otros frutos, es susceptible al pardeamiento

cuando es cortado o tajado, fenómeno directamente relacionado con niveles de ácido

ascórbico, contenido de polifenoles, actividad de la enzima polifenol oxidasa (PPO) o

a una combinación de estos factores, el grado de pardeamiento de la pulpa esta

correlacionado positivamente con la concentración total de polifenoles y la actividad

de la PPO. (Cayón, D. Et al. 2000).

Durante el periodo climatérico puede producirse un descenso en la cantidad de los

aminoácidos libres, atribuible a la síntesis proteica y durante la senescencia se

presenta un incremento en el contenido de los aminoácidos libres, consecuencia de la

degradación de enzimas. (Gallo, F. 1997).

2.3 MADURACIÓN COMERCIAL DEL BANANO

El inicio de la maduración organoléptica natural en los frutos climatéricos viene

acompañado de un incremento en la producción de etileno (C2H4); el tratamiento con

etileno exógeno en el período preclimatérico acelera el comienzo del proceso de

maduración. En la práctica comercial se aprovecha esta respuesta al etileno exógeno

para controlar la maduración del banano.

En los depósitos de almacenamiento se puede acumular el etileno generado por otros

frutos o el que provenga de otras fuentes, y puede alcanzar niveles que desencadenen

un proceso de maduración no deseado en otras frutas ¨verdes¨ presentes en ese mismo

depósito. Hay etapas de la cadena comercial en que es bastante frecuente que se

almacenen juntas diversas frutas y hortalizas; en tales condiciones, el etileno

desprendido por unas puede afectar negativamente a otras.

El banano suele cosecharse antes de que haya adquirido su grado óptimo de fruta

comestible (banano hecho verde); en ese estado se transporta a distancias

considerables hasta las áreas de consumo; donde se deja madurar bajo condiciones

controladas de temperatura y humedad relativa y por acción del etileno (tanto natural

como exógeno); en algunos casos, se da la acción del acetileno exógeno (C2H2),

liberado del carburo de calcio CaC2 en contacto con el agua. (Ovalle, J. Et.al. 1999).

El banano madura, generalmente a una temperatura de 18 a 21 °C, con una humedad

relativa de 90% a 95% y en 1000 ppm de etileno durante 24 horas; al cabo de 5 días,

se obtienen esas condiciones un banano en estado 5. (Anexo 2 Tomado de Turbana).

2.4 LEVADURA

Las levaduras son un grupo de organismos unicelulares, muchas de las cuales son

dimorfitas, es decir que son capaces de cambiar desde una fase de crecimiento

unicelular a una fase micelial. Sus células son ovales o cilíndricas las cuales se

reproducen de manera asexual por gemación; este es un proceso en el cual se forma

una pequeña protuberancia (yema) que con el tiempo se separa de la célula

progenitora (Port 1990). Las levadura también se reproducen de manera asexual por

fisión y en forma sexual por medio de un proceso llamado apareamiento

(combinación), en el cual dos células se fusionan, dando origen a un cigoto dentro del

cual se producen ascosporas; las células de levadura son mucho más grandes que las

bacterianas y pueden distinguirse no solo por su tamaño sino por la presencia obvia

de elementos intracelulares tales como el núcleo. Además, la célula de levadura

contiene citoplasma, pared celular, membrana citoplasmática y se encuentra rodeada

por una capa de celulosa. El núcleo, no presenta membrana de separación por lo

tanto se encuentra incluido en el citoplasma, en este último puede haber una o más

vacuolas, las cuales son especies de bolsas con materiales de reserva (azúcares,

grasas, etc.) o con productos de desecho del metabolismo celular (Biely 1987). La

membrana citoplasmática es semipermeable, dejando pasar los elementos nutritivos

que necesita la célula y permitiendo la salida de desechos de la misma. (Vargas,L

2002)

La mayoría de levaduras crecen mejor en medios en los que se dispone de agua en

gran cantidad, y cabe anotar que casi todas requieren más agua que los hongos. El Aw

de las levaduras normales necesaria para su crecimiento se encuentra entre 0.88 y

0.94 (Stewart & Russel 1991); sin embargo, las levaduras osmofílicas, es decir las

que crecen en concentraciones de soluto altas, crecen escasamente en medios con Aw

más baja que 0.78, por lo tanto, cada levadura tiene un Aw óptimo y un intervalo de

Aw para su crecimiento; los valores de Aw varían cuando lo hacen las propiedades

nutritivas del sustrato, pH, temperatura, disponibilidad de oxígeno y presencia de

sustancias inhibitorias. El intervalo de temperaturas de crecimiento de las levaduras,

es en general semejante al de los hongos, con un óptimo alrededor de 25°C a 30°C y

un máximo de aproximadamente 35-47°C (Port 1990). El crecimiento de la mayoría

de levaduras se favorece con un pH ácido próximo a 4-4.5 y no se desarrollan bien en

medio alcalino a menos que se hayan adaptado al mismo; por otro lado, las levaduras

crecen mejor en condiciones oxigénicas, pero las fermentativas pueden hacerlo

lentamente en condiciones anoxigénicas. Usualmente, los azúcares son los mejores

alimentos energéticos de las levaduras, aunque las oxidativas, como lo son las

formadoras de película, oxidan ácidos orgánicos y alcoholes (Boulton & Ratledge

1984).

2.4.1 Género Candida spp.

Este género fue propuesto por Berkhout en el año 1923 y desde entonces ha

experimentado algunas modificaciones en cuanto a su definición y composición. Este

género pertenece a la clase Blastomycetes que comprende las levaduras imperfectas

(asexuales). Se considera un taxón heterogéneo que puede dividirse en 40 secciones

que comprenden tres grupos principales, basados principalmente en la composición

de sus ácidos grasos y en el cariotipado electroforético. El nombre del género

significa “blanco radiante” y de ahí que sus células no contengan pigmentos

carotenoides. Forman hifas verdaderas o falsas con abundantes células en gemación o

blastosporas y pude formar clamidosporas (Pelczar 1994).

Las especies de Candida son clasificadas como levaduras, que frecuentemente se

confunden con los hongos, pero estas poseen un predominante modo unicelular de

desarrollo. El genero Candida abarca más de 160 especies, de las cuales se considera

que sólo 18 son patógenas, cuya mas común característica es la ausencia de una

forma sexual. (Odds, F. 1988)

El tubo germinal es una extensión filamentosa de la levadura, sin estrechamiento en

su origen, cuyo ancho suele ser la mitad de la célula progenitora y su longitud tres o

cuatro veces mayor que la célula madre. Sólo C. albicans es capaz de producir

verdaderos tubos germinales; sin embargo, otras especies como C. tropicalis pueden

producir pseudohifas precoces de aspecto similar a los tubos germinales pero con una

zona de constricción característica adyacente a la célula madre, por lo que esta

prueba es útil para diferenciar C. albicans del resto de las especies de Candida,

aunque no está exenta de falsos negativos. (Linares, M; Solís, F. 2001).

Estas levaduras de forma muy variada se reproducen vegetativamente, mediante

gemación. Tienen metabolismo oxidativo, igualmente como fermentativo, en ciertas

condiciones especiales de cultivo forman pseudomicelio. (Romero, J. 2002)

Las especies de Candida pueden secretar una variedad de sustancias durante el

crecimiento, la mayoria de estos son ácidos y alcoholes, todas las formas de acetato y

piruvato como metabolitos comunes. Propionato, succinato, lactato isovalerato y

formato son encontrados en cultivos de C. albicans y otras especies de Candida spp.

La mayoria de especies de cepas patógenas producen acetoína y otras poseen

aminotransferasas que son capaces de formar derivados de piruvato y desde lactato y

alcoholes se da el catabolismo de aminoácidos aromáticos. (Odds, F. 1988)

El potencial patógeno de las levaduras varía en forma considerable, siendo el

microorganismo más virulento Candida albicans, especie del género capaz de generar

con mayor frecuencia enfermedad mortal en seres humanos. C. tropicalis es la

segunda levadura de importancia en cuanto a su patogenicidad. C. parapsilosis

también aparece con cierto grado de virulencia, asociada a micosis oportunistas. Por

otra parte, no todas las cepas de una misma especie presentan igual capacidad

patogénica. Otras especies de Candida causan algunas infecciones, pero la debilidad

del huésped debe ser muy marcada para permitir que estos microorganismos menos

virulentos lo invadan. (López, C. et al. 2005) En el sentido más estricto de la palabra,

no existen levaduras patógenas por naturaleza; las que están relacionadas con

enfermedad en el hombre o animales, son incapaces de producir infección en un

individuo sano. Se deben presentar algunas alteraciones en las defensas celulares del

huésped, en la fisiología, o en la composición de la flora normal para que pueda

producirse la colonización, infección y la enfermedad por levaduras.

Tradicionalmente, la taxonomía de las levaduras se ha llevado a cabo en base a

estudios morfológicos y fisiológicos, pero éstos dependen de las condiciones de

cultivo de las cepas. (López, C. et al. 2005)

La caracterización de levaduras hasta el nivel de especie es de relevancia desde el

punto de vista industrial, debido a que muchos grupos forman parte de la microflora

natural de alimentos y bebidas fermentadas y/o participan en el proceso de obtención

de éstos. De ahí la necesidad de poseer métodos de identificación rápidos, precisos y

fáciles, que puedan ser aplicados al control de la calidad en la industria, con el fin de

asegurar que la cepa de partida, la que conduce el proceso y la que rinde el producto

final, sea la misma. (Orberá, T. 2004)

2.4.1.1 Características Bioquímicas y Fisiológicas

Mientras que las características morfológicas y sexuales permiten generalmente

identificar el género, las características bioquímicas permiten definir la especie de la

levadura. Los principales caracteres son la utilización de compuestos carbonados y

nitrogenados, el crecimiento a 37°C, el crecimiento en medio sin vitaminas y la

resistencia a la ciclohexamida (Beech et al. 1980)

2.4.1.2 Fermentación de los azúcares

Los azúcares probados habitualmente en fermentación son la glucosa, la galactosa, la

sacarosa, la maltosa, la lactosa y la rafinosa. Pueden igualmente probarse otros como

la trehalosa, la melobiosa, y polisacáridos como la inulina o el almidón (Gancedo &

Serrano 1989). La solución base que se utiliza para la fermentación de los azúcares es

el medio agua de levadura (extracto de levadura al 0.5% en agua), provista de una

campana de Durham. Antes de la siembra, en estos tubos se añaden soluciones

estériles de los azúcares a ensayar. La concentración final del azúcar debe ser del 2%

para todos los azúcares salvo para la rafinosa que debe ser del 4%. Los cultivos se

incuban a 25-28°C durante un tiempo que va de 48 horas a tres semanas. Un azúcar

es fermentado cuando hay presencia de gas en la campana (Fiechter et al. 1981).

2.4.1.3 Fisiología del crecimiento de la levadura

El crecimiento de un microorganismo puede considerarse como un serie de

interacciones entre las células y el entorno, aportando el medio los elementos

necesarios para el crecimiento y siendo el mismo modificado por el metabolismo de

las células. Además del aporte de elementos nutritivos, el medio crea alrededor de las

células un entorno más o menos favorable en función de su humedad, de su

temperatura, de su pH o por la presencia de sustancias antimicrobianas (Gancedo &

Serrano 1989).

2.4.1.4 Necesidades nutricionales

El medio de cultivo debe aportar todos los elementos necesarios para la síntesis

celular y para cubrir las necesidades energéticas de las levaduras. Se han dedicado a

este tema trabajos de revisión, entre los cuales se destacan los requerimientos

nutricionales para el crecimiento y la fermentación con levaduras, utilizando

diferentes oligoelementos y sales minerales (Jones & Greenfields 1984, Jones et al.

1981).

Carbono

El carbono es el compuesto mayoritario de la célula de levadura: alrededor del 50%

del peso seco; los compuestos carbonados son utilizados por las levaduras a la vez

como fuente de energía y como fuente de carbono (Fiechter et al. 1981). Según el tipo

de levadura, la capacidad de utilizar ciertos compuestos carbonados varía; algunas

levaduras pueden utilizar una amplia gama de compuestos pero otras asimilan

solamente un número pequeño de ellos (Harrison & Rose 1983).

Entre las fuentes de carbono, los carbohidratos son los más frecuentemente utilizados:

los carbohidratos simples como las hexosas, los disacáridos y los trisacáridos son

metabolizados por un gran número de levaduras (Jones & Greenfields 1984). Durante

los últimos diez años, se han realizado trabajos sobre los carbohidratos abundantes y

poco costosos: las pentosas y los polisacáridos. S. cerevisiae es incapaz de utilizar

pentosas, pero algunas especies de Candida, Metschnikowia y Pichia pueden

convertir la D-xilosa en etanol (Schneider et al. 1998). Además de los carbohidratos,

pueden ser utilizados otros compuestos carbonados que incluyen alcoholes, ácidos o

compuestos menos oxigenados como hidrocarburos. Ha sido efectuada por Levi et al.

(1980) una revisión de las levaduras que crecen sobre alcanos, entre las cuales se

destaca principalmente el género Candida. Ninguna levadura puede oxidar metano,

pero varias especies pueden utilizar el metanol y han sido cultivadas como fuente de

proteína; los principales géneros involucrados son Candida, Hansenula, Pichia y

Torulopsis (Van Unden & Buckley 1982).

Nitrógeno

El nitrógeno es cuantitativamente el segundo constituyente aportado por el medio de

cultivo. Es utilizado por las células en los aminoácidos, los nucleótidos y algunas

vitaminas. Pueden ser utilizadas numerosas fuentes de nitrógeno. Todas las levaduras

son capaces de utilizar el nitrógeno en forma de ion amonio; los iones amonio pueden

ser aportados en el medio por el cloruro amónico, el nitrato amónico, el fosfato

amónico y sobre todo el sulfato amónico, que es el mejor compuesto pues aporta al

mismo tiempo azufre necesario para la síntesis de ciertos aminoácidos (Cooper 1982).

Algunas levaduras son capaces de utilizar los nitratos y los nitritos, en particular las

de los géneros Hansenula, Pachysolen, Citeromyces y ciertas especies de Candida y

de Trichosporon; esta capacidad se utiliza en taxonomía (Kreger Van Rij 1984). En

los medios de cultivo, los nitritos forman a pH inferior a seis ácido nitroso que es

tóxico para las células.

Fósforo

El fósforo se halla incluido en los ácidos nucleicos y los nucleósidos di y trifosfato.

Se encuentra también en forma de polímeros lineales polifosfatos que juegan un papel

importante en la regulación del metabolismo celular (Kulaev & Vagabov 1983). La

concentración de iones fosfato (PO4-3) regula la síntesis de lípidos y carbohidratos. El

fósforo es asimilado por la célula en forma de iones orto fosfato (H2PO4). Las fuentes

de fósforo en el medio de cultivo deben estar constituidas por dihidrogenofosfato de

potasio (KH2PO4) o por el dihidrogenofosfato disódico (Na2 H PO4). En condición

limitante de fósforo en el medio, la célula sintetiza una fosfatasa a partir de los ésteres

fosfóricos (Schurr & Yagil 1981).

Otros compuestos

Pueden añadirse otros compuestos al medio de cultivo como potasio, magnesio,

calcio, zinc, manganeso, y ciertos iones, las necesidades varían cuantitativamente y

según las cepas (Beech et al. 1980). Algunos compuestos son factores de crecimiento

como el inositol y el pantotenato. El inositol juega un papel importante en la síntesis

de los lípidos de las membranas (Henry 1996), pero sólo puede ser utilizada la forma

“meso” (Nikawa et al. 1998). Normalmente el inositol puede ser sintetizado por las

levaduras. El pantotenato se incorpora a las coenzimas A implicadas en las reacciones

de oxidación de los ácidos cetónicos y en el metabolismo de los ácidos grasos. La

vitamina B6 o piridoxina es trasformada en fosfato de piridoxal y en piridoxamina,

coenzimas implicadas en la desaminación y la descarboxilación de los aminoácidos

(Stryer 1981); juega igualmente un papel en el metabolismo de los carbohidratos y de

los ácidos nucleicos (cantidad necesaria: 6.25 mg.1-1 en forma de piridoxina – HCl).

En la formulación de un medio de cultivo o en un medio industrial complejo, es

necesario tener en cuenta las interacciones entre los diferentes constituyentes;

Nagamune et al. (1991) mostraron por ejemplo, el efecto de la interacción de las

concentraciones en (NH4)2SO4 y KH2PO4 sobre la tasa de crecimiento. Por otro lado,

ciertos elementos, a concentraciones demasiado altas, pueden llegar a ser tóxicos.

2.4.2 Cinética de Crecimiento

Para preparar un medio de cultivo para el crecimiento de levaduras, es necesario

determinar que componentes químicos son fuente potencial de alimento para estos

organismos, debido a que algunas sustancias son más aceptables con respecto a otras,

generando en algunas ocasiones efectos antagonistas resultado del crecimiento de

levaduras y otro tipo de organismos debido a la presencia de una mezcla de

componentes no definidos en el medio de cultivo (Haettn 1986). Variaciones en las

condiciones físicas del medio de cultivo, como cambios en la temperatura, pH y

aireación, afectan el crecimiento de las levaduras; por lo tanto, este tipo de factores

deben ser controlados, generando una constante en la población de levaduras y la

evaluación de la cinética de crecimiento en las fases de esporulación, formación de

pseudomicelio, además de la estandarización de un proceso de criopreservación

efectivo para este tipo de microorganismos (Kirsop 1987).

Curva de crecimiento

La cinética de crecimiento de una levadura, puede ser evidenciada en un medio de

cultivo que proporcione todos los requerimientos nutricionales para el

microorganismo, además de poseer las condiciones óptimas de temperatura, pH,

aireación y agitación (Graham & Horman 1990). Las fases conocidas de una curva de

crecimiento típica de una levadura, incluyen la fase de adaptación, fase de

crecimiento exponencial, fase estacionaria y fase de decaimiento (figura 2).

Figura 2. Curva de crecimiento típica de una levadura. Tomado de:

http://microbiology/yeast/images.com

(1) Fase de adaptación. Esta fase es generalmente considerada como el período que

precede al estado de crecimiento exponencial, que en la mayoría de casos presenta

una duración corta. La fase de adaptación se considera en dos partes: (a) un período

de adaptación durante el cual las células comienzan a usar los nuevos sustratos, y por

lo tanto se puede observar un decrecimiento en la viabilidad de las células y (b) un

período en el cual se empieza la división celular en el cual ocurre un porcentaje de

incremento en la población de levaduras (Cook 1985).

(2) Fase de crecimiento exponencial. En esta fase el número de células se

incrementa exponencialmente, debido a que cada una de las células se encuentra en

un estado interno de división celular. La duración de la fase exponencial es

controlada por los componentes presentes en el medio de cultivo y el número de

células por unidad de volumen (Arnold 1981). Cuando se prepara un medio de

cultivo, es importante recordar que el progreso de la fase exponencial de crecimiento,

está dado por la rápida utilización de los nutrientes, seguida de un incremento del

número de células y una acumulación de productos metabólicos finales, los cuales

pueden causar daños a las células. El medio de cultivo se debe mantener en continua

agitación, permitiendo el intercambio de gases entre el medio y la atmósfera interior;

además, es importante adicionar al medio una sustancia buffer durante la fase

exponencial, la cual protege a las células de los continuos cambios de pH, los cuales

son originados por la acumulación de productos metabólicos en su gran mayoría

ácidos (Beech et al. 1980). El tamaño del inóculo no influye en el porcentaje de

crecimiento durante la fase exponencial, sin embargo, un inóculo pequeño puede

retardar la iniciación del crecimiento de la población (Rhan 1991). Es pertinente

mencionar, que todas las determinaciones en el porcentaje de crecimiento de la

población de levaduras, pueden ser modificadas si no se ejerce un rígido control de la

temperatura, debido a que una variación en este factor, es generalmente reflejada en

un cambio sustancial en el porcentaje de crecimiento (Arnold 1981).

(3) Fase estacionaria. En este período el porcentaje de crecimiento comienza a

decrecer y eventualmente el número de células comienza a ser constante. En este

caso, el número de células que mueren es comparativamente igual, al número de

células que se forman, lo cual establece un estado de equilibrio entre las dos

condiciones. Existen diferentes factores que ayudan a la reducción del porcentaje de

reproducción en esta fase, entre los cuales se encuentran los asociados al descenso de

los nutrientes o a la acumulación de productos metabólicos tóxicos (Cook 1985). El

efecto de la disminución de algún nutriente en particular en el medio de cultivo,

supone que el porcentaje de crecimiento es dependiente de la función de ese nutriente

en el metabolismo celular (Berry & Brown 1987).

(4) Fase de decaimiento. Generalmente, el número de células que mueren exceden el

número de células que se producen y el cultivo experimenta una fase de declive

(Cook 1985).

2.4.3 Efecto de la concentración de azucares sobre la levadura

Sin embargo, según sea la severidad del estrés osmótico, el citoesqueleto puede llegar

a colapsar, conllevando a una despolarización de los parches de actina (Willem et al.,

2002), siendo el citoesqueleto una red de fibras proteicas, cuya función es modelar y

organizar el citoplasma, donde muchas de las moléculas individuales de éste se

adhieren al citoesqueleto (Audesirk, 1997). La respuesta primaria de las células de

levadura frente al continuo estrés osmótico, consiste en varios eventos moleculares

que son activados por los cambios celulares repentinos. En primera instancia, la

célula temporalmente detiene el crecimiento, pero hasta el momento no es claro en

qué punto específico del ciclo celular se detiene. Sin embargo, este bloqueo ha sido

reportado a nivel de la G1 (primera fase del ciclo celular en la que existe crecimiento

celular con síntesis de proteínas y de ARN), probablemente por una baja transcripción

de genes que codifican para ciclinas y quinasas dependientes de ciclinas que son

sintetizadas para fosforilar las serinas y treoninas de proteínas diana y desencadenar

así los procesos celulares necesarios para la continuación del ciclo (Willem et al.,

2002).

No es claro hasta el momento por qué las células detienen el crecimiento durante el

ciclo, pero probablemente es parte de un mecanismo estratégico de reajuste, requerido

para un apropiado acondicionamiento a las nuevas condiciones en las que se

encuentran (Willem et al., 2002). En segunda instancia, con el fin de buscar una

recuperación en la turgencia celular, las células producen glicerol como soluto

compatible (Erasmus et al., 2002), el cual es formado como un subproducto durante

la fermentación de etanol por muchas levaduras en concentraciones entre 2.5 y 3.6%

de la producción total de etanol (Petrovska et al., 1999). Por otro lado, el

metabolismo del glicerol cumple un papel muy importante en el balance redox al

igual que en la biosíntesis de fosfolípidos (Willem et al., 2002). En tercera instancia,

la ruta HOG MAP Kinasa (Glicerol en respuesta a la osmolaridad) es activada

resultando en una rápida fosforilación y en una translocación nuclear de la MAP

kinasa Hog1p, encargada de regular tanto la represión como la activación de genes

tales como el gen GPD1, el cual codifica para la expresión de la enzima glicerol 3-

fosfato deshidrogenasa (Willem et al., 2002).

2.4.4 Levaduras en las frutas

Las levaduras mas importantes encontradas dentro de los tejidos de algunas frutas

son; Torulopsis albida, en uva, Rhodotorula glutinis en cereza, junto con Candida

humícola. También se ha encontrado gran variedad de levaduras en el jugo de

naranja, manzana y uva. (Romero, J. 2002)

En los jugos cítricos se ha encontrado Candida krusei, C. parapsilosis,

Hanseniospora melligeri, Pichia fermentaus y Oidum lactis. Donde las propiedades

biológicas de las levaduras determinan la participación en diferentes frutas, siendo

igualmente importante los factores como la temperatura, el pH y la humedad.

(Romero, J. 2002)

Estudios realizados por Ortegón y Ramírez, 2001; Romero, 2002, y Vargas, 2002,

demostraron la presencia de una levadura del género Candida en tomates

heteroinjertados, los cuales fueron estudiados por que presentan un fenómeno de

momificación, ya que se conserva durante más de cuatro meses y medio sin presentar

putrefacción, y además, presenta efecto antagónico frente a ciertos patógenos.

Este fenómeno de momificación en tomates heteroinjertados se ha observado en

frutos de uchuva recolectados de un biocultivo en condiciones de almacenamiento,

por lo que se ha llevado a investigar la posible presencia de esta misma levadura u

otro género como responsable de tal efecto. (Romero, J. 2002)

3. JUSTIFICACION

Colombia es el tercer productor mundial de banano con un área cultivada aproximada

de 30.000 Ha, de las cuales aproximadamente 500.000 toneladas son de banano para

el consumo nacional. Las pérdidas durante la cosecha y postcosecha de banano se han

estimado en 50.000 toneladas/año, equivalentes a más del 10% de la producción

nacional, lo que afecta seriamente la economía del país. El control del proceso de

maduración de frutos climatéricos es uno de los aspectos claves para la

comercialización de este tipo de fruta; esto se debe a que el proceso está íntimamente

relacionado con la baja capacidad de este fruto para soportar períodos de transporte y

almacenamiento prolongados hasta alcanzar los mercados de destino, encontrándose

el producto afectado por factores físicos, biológicos y químicos. Debido a que el

banano se comercializa en diferentes estados de maduración y se almacena bajo

diferentes condiciones se quiere evaluar la eficacia de la aplicación de levadura in

vivo a diferentes concentraciones sobre banano del género Musa especie acuminata,

con el fin de obtener la retardación de la pudrición del fruto y adicionalmente

observar el comportamiento a lo largo del tiempo, siendo ésta una alternativa

biotecnológica, que conlleve a un beneficio potencial a nivel tecnológico, económico

y social. Los bananos son susceptibles de daño mecánico durante la cosecha,

transporte, almacenamiento o procesamiento; dichos cambios causan estrés físico que

afecta los tejidos de la planta y altera el metabolismo fenólico. Las enzimas son

activadas al momento de la cosecha, por lo tanto, durante la maduración se producen

cambios en la actividad enzimática que alteran las estructuras subcelulares. En

ensayos previos realizados en la PUJ se estudio el efecto de una levadura

perteneciente al género Candida spp, aislada inicialmente de tomates HIB y luego

conservada en frutos de uchuva HIB, los resultados obtenidos mostraron que la

levadura disminuía la actividad de la poligalacturonasa PG encargada del proceso de

maduración en postcosecha y de la producción de etileno, siendo capaz de retardar la

pudrición del fruto aproximadamente por 30 días. Es por esto que se pretende evaluar

el efecto de diferentes concentraciones de levadura sobre la retardación de la

maduración del fruto de banano.

4. OBJETIVOS

4.1 Objetivo general

• Aplicación de levadura Cándida sp. como una alternativa viable para la

retardación en la pudrición del banano (Musa acuminata)

4.2 Objetivos específicos

• Aislar de frutos de uchuva HIB, multiplicar y evaluar la cinética de

crecimiento de Candida sp.

• Establecer la concentración más apropiada de inóculo para ser aplicado en el

fruto del banano en un estado de maduración definido.

• Evaluar el efecto de la levadura sobre la maduración de los frutos de banano.

5. MATERIALES Y METODOS

Este proyecto de investigación, se desarrolló en las instalaciones del laboratorio de

Microbiología Ambiental de la Pontificia Universidad Javeriana.

5.Material Vegetal

Se seleccionaron frutos de uchuva HIB provenientes de la Estación Experimental de

la Pontificia Universidad Javeriana que se encontraran en buen estado fitosanitario.

5.1 Ensayo Experimental: Aislamiento y recuperación de la levadura

Al llegar la muestra al laboratorio se procedió a retirar las posibles impurezas

(Guerrero, 2003). Se pesaron 10 gramos de las uchuvas seleccionadas y se lavaron

con agua destilada estéril. En un mortero se macero la fruta, empleando técnicas

asépticas con el fin de evitar contaminación cruzada. (Romero, 2002). El resultado de

la uchuva macerada (extracto) fue llevado a un frasco de vidrio con 90ml de agua

peptonada estéril al 0.1% (Vargas, 2002; Ortiz y Pedraza, 1999). Se realizaron

diluciones en base 10, de 10-1 a 10-3, siendo el frasco de vidrio la primera dilución

(10-1). Se sembró en superficie por duplicado 0.1ml de cada una de las diluciones en

Agar Extracto de malta. Posteriormente se incubo a 25°C +/- 2 durante 5 días. Se

realizaron repiques en Agar YGC el cual se incubo a 25°C durante 4 días (Merck,

2006).

5.2 Descripción macroscópica y microscópica de la levadura

Se realizo una observación macroscópica de la morfología de las colonias teniendo

en cuenta: a) aspecto superficial: liso, arrugado o membranoso, b) color: mate o

brillante; c) consistencia (Casas, 1989). Para la observación microscópica se utilizo la

coloración de Gram y la coloración con azul de lactofenol.

5.3 Identificación bioquímica API 20C AUX (Protocolo de Biomerieux)

A partir de un cultivo joven de la levadura, se realizo una suspensión en 2 ml de agua

destilada estéril hasta obtener una turbidez igual al tubo 2 de McFarland, a partir de

este se transfirieron 100 μl (2 gotas) de la suspensión del Kit API 20C AUX de la

casa comercial Biomerieux a una ampolla de C Medium y se homogenizo evitando la

formación de burbujas. Las cúpulas fueron llenadas con la suspensión anterior

evitando la formación de burbujas y creando un nivel horizontal para generar

resultados correctos, se llevo a incubación a 30 °C durante 48 y 72 h respectivamente.

La lectura de estas reacciones se hizo por comparación con un control de crecimiento

y la identificación fue determinada utilizando el programa Apiweb TM. (ANEXO 3).

5.4 Prueba de patogenicidad

Siguiendo el protocolo expuesto por Linares, F.; Solis, M. 2001 Se emulsiono una

colonia aislada en 0,5 ml de suero humano, se incubo a 35°C durante 2 h. y se

visualizó por coloración de Gram a objetivo 100x.

5.5 Determinación de biomasa por peso seco en función del tiempo

Para realizar la curva patrón de peso seco, se preparó una suspensión concentrada de

la levadura, fue lavada dos veces con solución salina 0.85% (p/v) por centrifugación a

2250 g por 20 minutos. El pellet se resuspendió al volumen inicial. Posteriormente,

fueron adicionados en 10 tubos previamente pesados 10 mL de la solución de células

a cada uno, igualmente 10 mL de solución salina en 10 tubos que sirvieron como

blanco. Estos fueron llevados al horno a 105°C por 24 horas, terminado el tiempo de

evaporación del líquido se pasaron al desecador para ser pesados nuevamente y

determinar el promedio del peso de los 10 tubos que contenían las células y el de los

10 tubos con solución salina, a partir de esto se calculó la diferencia de peso entre los

dos promedios para expresar la concentración en gramos de biomasa seca por litro de

solución (g/L). A partir de la solución concentrada de células se realizaron diluciones

por triplicado para ajustar la absorbancia entre 0.2 – 0.9 y calcular las

concentraciones finales para cada dilución. Esto permitió hallar la ecuación

bcmAbs += * al graficar la absorbancia promedio en función de la concentración

celular (g/L). Se realizaron diluciones 1/1.5, 1/2, 1/3, 1/4, 1/5, 1/6, 1/7, 1/8, 1/9. Y se

registro la absorbancia de cada réplica a 620 nm.

5.6 Curva de crecimiento

Preparación de Inoculo

La cepa de levadura fue cultivada en agar YGC cuya composición es en g/L: extracto

de levadura 5, D-glucosa 20, cloramfenicol 0.1 y agar-agar 14.9, pH final 6.6 (Merck,

2000), bajo condiciones controladas de 25ºC por 4 días. Posteriormente, se realizó un

raspado de las colonias para preparar una suspensión de 5 ml en solución salina

0.85%(p/v), a una concentración de 108 células/ml, igualando al tubo 3 de McFarland.

y realizando recuento en cámara de Neubauer para obtener la misma concentración,

esta suspensión fue adicionada a 45 ml de caldo YGC el cual se incubó por 24 horas a

25° C y 120 RPM.

Fermentación.

En un erlenmeyer de 1000 ml se adicionaron 450 ml de caldo YGC estéril y

posteriormente se agregó el 10% de inóculo (50 ml) y las condiciones de operación

fueron controladas: temperatura 25°C, agitación de 120 rpm (Noor, et al., 2003).

Luego de ser inoculado el erlenmeyer se retiraron 3 ml de muestra, que correspondió

a la hora cero (0) y posteriormente se realizaron cada dos horas hasta completar26

horas; a estas muestras se les determinó el pH, la Absorbancia a 620 nm y se realizo

recuento en Cámara de Neubauer.

Recuento en placa

A partir de las muestras de cada uno de los tiempos de fermentación, se tomó 1 ml del

cultivo y se realizaron diluciones seriadas de 10 -1 a 10 -9 y se sembró 50 microlitros

mediante la técnica de microgota en medio YGC. Las cajas fueron incubadas a

temperatura óptima de 25°C por 72 horas. Transcurrido el tiempo de incubación se

realizó recuento de UFC/ml por triplicado.

5.7 Actividad Enzimática Cualitativa

Se realizó un pre enriquecimiento de la levadura en caldos específicos para inducir las

diferentes actividades enzimáticas; por lo tanto, se inoculó una colonia de levadura en

200 ml de medio, distribuido en erlenmeyer de 500 ml y se dejó en agitación a 200

rpm durante 48 horas. Los medios utilizados en este procedimiento incluyeron: caldo

celulosa, caldo pectina y caldo almidón. (Barrera 2000)

5.8 Crecimiento en Agar Banano

Con el fin de evidenciar la capacidad de la levadura por consumir los sustratos que le

proporciona el banano, se procedió a realizar un agar cuya composición fue: 20 g/L

de pulpa de banano en estado de maduración 3 según la tabla de Turbana y 15 g/L de

agar agar, no se agrego ningún inhibidor con el fin de evidenciar si se presentaba

alguna relación de tipo antagonista con otros microorganismos nativos provenientes

del banano, se realizo el mismo procedimiento pero utilizando banano en estado de

maduración 5 según la tabla de Turbana (Anexo 2) con el fin de proporcionar mayor

cantidad de azúcares disponibles para el crecimiento de la levadura.

5.9 Aplicación

Para la aplicación de la levadura se utilizaron bananos baby (Musa acuminata) en

estado de maduración número 5 según la tabla de colores de Turbana (Anexo 2), se

realizaron 3 aplicaciones con 3 replicas para controles, concentración #1 y

concentración #2 respectivamente. (Tabla 3).

Dias control concentracion 1 concentracion 2 0 3 3 33 3 3 36 3 3 39 3 3 3

12 3 3 315 3 3 318 3 3 327 3 3 336 3 3 345 3 3 3

30 30 30Total  90

Numero de bananos

Tabla 3. Número de bananos para cada día de estudio

Los bananos a utilizar en la aplicación y como controles fueron agrupados de

acuerdo a su peso y condiciones físicas Figura 3.

Figura 3. Clasificación y agrupación de bananos para el estudio.

La forma de aplicación utilizada en este estudio fue inmersión por 2 min la cual ha

sido utilizada en estudios previos de deshidratación de frutos por Lemos, L. et al,

2006. El ensayo fue realizado en el laboratorio bajo condiciones ambientales de

temperatura entre 19°C y 20 °C, y una humedad relativa de 70%. Fueron

determinadas variables para evaluar el desarrollo de la maduración de los frutos cada

3 días. Las variables evaluadas fueron:

5.9.1 Pérdida Fisiológica de Peso (PFP)

Los frutos fueron agrupados según el tratamiento y pesados cada 3 días en una

balanza analítica con el fin de determinar su peso en gramos y evaluar el

comportamiento. Figura 4

Figura 4. Bananos después de aplicación.

5.9.2 Determinación de pH:

Se preparo una mezcla de pulpa/agua 1:1 en agua destilada, se homogenizo y se

midió el pH siguiendo el protocolo descrito por Arrieta, A et al. 2006

5.9.3 Determinación de Grados Brix: Debido a la dificultad de obtener liquido a

partir del fruto, 30g de fruta fueron macerados en 90ml de agua destilada, (Figura 5.

A) Esta mezcla fue filtrada y una gota de jugo se colocó sobre el cristal del

refractómetro y se observo a la luz el ocular del instrumento observando la escala,

(Foto 5 B) teniendo en cuenta la temperatura de medición, la determinación se hizo

por triplicado para cada tratamiento. (Arrieta, A.; et al 2006)

Figura 5-A: Macerado de banano Figura 5.B: Refractómetro Portatil

6. ANALISIS ESTADISTICO

Los datos obtenidos a partir de los promedios de los pesos del fruto con respecto al

tiempo, en los controles y en las concentraciones de estudio, se analizaron

estadisticamente por medio de anova, la prueba T student y regresión lineal, con el fin

de evaluar el comportamiento de los datos y poder comparar las concentraciones

utilizadas, para conocer la acción de la levadura en el fruto.

Hipotesis general

Ho = No hay diferencia significativa entre los datos.

Fexp< Ftabla; acepta la Ho. Fexp>Ftabla; rechaza la Ho. Hi = Hay diferencia significativa entre las concentraciones.

Fexp>Ftabla; acepta la Hi. Fexp<Ftabla; rechaza la Hi. Ho= No hay diferencia significativa entre los grados brix entre concentraciones, para p<0.05 Si p<0.05: se acepta Ho Si p>0.05: se rechaza Ho

Ho=No hay diferencia significativa entre los valores de pH entre las

concentraciones, para p <0.05 Si p<0.05: se acepta Ho Si p>0.05: se rechaza Ho

7. RESULTADOS Y DISCUSIÓN

7.1 Descripción Macroscópica y Microscópica

A partir de los frutos de uchuva recolectados, se realizo el aislamiento de la

Levadura en medio YGC, La coloración de Gram mostró células, ovaladas, con

diámetro considerable, en estado de gemación y Gram positivas, debido a la presencia

de una pared celular gruesa, que permite la retención del complejo cristal violeta-

yodo, confirmando así la presencia de estructuras levaduriformes (Figura 6).

Figura 6. Características microscópicas de Cándida sp. obtenidas por coloración de

Gram.

Las colonias de Candida spp, en este medio se visualizan como colonias blancas

pequeñas, redondas, lisas, brillantes, las cuales a través del tiempo toman una forma

puntiforme (Figura 7). El agar YGC favoreció el crecimiento de esta levadura por su

alto contenido de glucosa como fuente de carbono y extracto de levadura como fuente

de nitrógeno

Figura 7. Características macroscópicas de las colonias de Candida sp. en agar YGC

7.2 Prueba de patogenicidad

La presencia de Candida albicans fue descartada al realizar la prueba de tubo

germinal, donde el resultado fue negativo ya que solamente se observo la levadura

aislada, donde se evidencio la ausencia del tubo germinal (filamentación precoz)

7.3 Prueba de asimilación de azúcares (API 20 C AUX)

La identificación realizada mediante pruebas bioquímicas en caldo de hidratos de

carbono base rojo de fenol, permitió evidenciar la ausencia de CO2 en la campana de

Durham, lo que indica la ausencia de metabolismo fermentativo por parte de la

levadura. Los resultados en tubo fueron evaluados con base en el cambio de pH

(viraje de color) y crecimiento (turbidez).

Tabla 4. Resultados de asimilación de azucares por Candida spp.

Hidrato de carbono Resultado de la asimilación

Glucosa Positivo

Sacarosa Positivo

Lactosa Negativo

Xilosa Positivo

Fructosa Positivo

Galactosa Positivo

Celobiosa Positivo

La identificación de la Levadura fue llevada a cabo por el API 20C AUX, luego de

ser observados los resultados de las bioquímicas, para conocer la asimilación de

azucares por parte de la levadura, para contar con mayor exactitud en los resultados.

Luego de las 48 y 72 horas de incubación del API 20C AUX, el resultado se

evidencio al evaluar las cúpulas con respecto al control de crecimiento (ANEXO 4),

de esta manera los resultados fueron adicionados al programa informático Apiweb

TM, el perfil numérico arrojado por la levadura fue 6776377, identificándose de esta

forma la levadura Candida guilliermondii presentando un taxón significativo de

99.7%. (Figura 8).

Fig. 3 Resultado programa informático Apiweb TM API 20 C AUX.

7.4 Crecimiento en agar banano amarillo y verde

Para determinar si la levadura de estudio contaba con la capacidad enzimática para

tomar como sustrato los componentes del banano se realizó un agar a base del fruto

del banano donde la levadura fue sembrada a partir de colonias aisladas del agar

YGC, de esta manera, después de 5 días de crecimiento a temperatura ambiente se

observo la presencia de colonias mucosas, blancas, pequeñas (Figura 9). En el agar

banano maduro se evidencio que el tamaño de las colonias era más grande y el

crecimiento se presento en menos días, en agar banano verde se evidencio

crecimiento, sin embargo, un poco más limitado que en agar banano amarillo,

probablemente por la disponibilidad de nutrientes en los diferentes tipos de banano,

puesto que por factores fisiológicos de la maduración del banano, la concentración de

almidón es mucho mas alta al estar el banano en estado verde que en estado de mayor

maduración de color amarillo donde este ya ha sido convertido en azucares simples,

siendo mas fácil su asimilación por parte de la C. guillermondii.

Figura 9. Crecimiento de C. guillermondii en agar banano

7.5 Actividad enzimática cualitativa

El comportamiento presentado en el caldo enriquecido con almidón mostró la

ausencia de actividad amilolitica por parte de la levadura, es decir, carece de la

maquinaria enzimática propia para poder degradar la molécula de almidón en

moléculas simples de glucosa, este resultado demuestra el pobre crecimiento que

presenta la levadura aplicada en los frutos de banano verde en estado de maduración

1 y 2 según la tabla de colores de Turbana ya que su principal componente es el

almidón. Sharrock y Lusty (2000) encontraron que los niveles de almidón en banano

verde son del orden del 20%, y van disminuyendo hasta 1%-2% en banano

completamente maduro, por esta razón la aplicación se realizo en banano en estado

de maduración 3, donde la concentración de azucares disponibles es mayor para la

levadura y le permite colonizar rápidamente el fruto.

Por otra parte se evaluó el comportamiento celulolitico por parte de la levadura

evidenciándose un crecimiento favorable en este caldo, siendo este el principal

componente de la cascara del fruto, lo que sugiere la capacidad que tiene la levadura

de poder penetrar por las laminas de la cascara llegando a la pulpa. La actividad

pectinolitica se evidencio por crecimiento en caldo pectina, este componente es un

polisacárido constituido principalmente por la unión de moléculas de acido

galacturónico parcialmente metoxilado, siendo abundante en la pulpa del fruto, la

actividad que presento la levadura frente a este sustrato fue favorable demostrándose

su capacidad por consumir esta fuente de carbono para su crecimiento y consiguiente

colonización del fruto.

7.6 Determinación de parámetros cinéticos de crecimiento

En la curva de peso seco, no se tuvo en cuenta el peso de la sal, ya que esta es soluble

en agua y se retiro al dejar solo 2mL en los tubos para el secado, por esta razón los

tubos con solución salina presentaron mayor peso, por lo cual no fue posible

determinar la diferencia con los tubos de biomasa, de esta manera solo fueron

tomados los pesos de biomasa para establecer la curva de peso seco. (Figura 10)

 

y = 0.2584x + 0.0401R² = 0.9918

0.0000.1000.2000.3000.4000.5000.6000.7000.8000.9001.000

0.00 0.50 1.00 1.50 2.00 2.50 3.00 3.50 4.00

ABS

 (620

nm)

Concentración (g/L)

CURVA DE PESO SECO 

Figura 10. Curva de peso seco de C. guillermondii. Absorbancia en función de la

concentración de Biomasa (g/L)

Debido al optimo crecimiento por parte de la levadura en agar YGC, se llevo a cabo

la curva de crecimiento, en la cual se evidencio el comportamiento de C.

guilliermondii en función del tiempo. La curva de crecimiento fue llevada a cabo con

el fin de determinar la concentración de levadura para aplicar al fruto del banano,

conociendo la fase exponencial, para así asegurar que la aplicación cuenta con la

levadura en su momento máximo de duplicación. (Tabla 5)

Tabla 5. Datos de abs y concentración obtenidos a partir de la curva de crecimiento

de C. guillermondii

TIEMPO  (Horas) Abs 620  nm CONCENTRACIÓN  g/L CONCENTRACIÓN mg/L Ln  Biomasa  UFC/mL0 0,511 0,239 239 5,476 5,80E+082 0,713 0,32 320 5,768 7,00E+084 0,944 0,412 412 6,021 8,00E+08

6 1,304 0,556 556 6,321 9,80E+088 1,470 0,622 622 6,433 1,80E+0910 1,620 0,682 682 6,525 2,60E+0912 1,668 0,701 701 6,553 3,80E+09

14 1,753 0,736 736 6,601 4,50E+09

16 1,721 0,723 723 6,583 4,10E+0918 1,790 0,75 750 6,620 4,63E+0920 1,864 0,78 780 6,659 4,79E+09

22 1,932 0,807 807 6,693 4,96E+09

24 1,912 0,799 799 6,683 4,88E+0926 1,900 0,794 794 6,677 4,82E+09

En la curva de crecimiento al utilizar un pre inoculo de 24 horas correspondiente al

10% del volumen final de escalado, se pudo reducir la fase de latencia al inicio de la

curva de crecimiento evaluándose hasta la hora 26 (Figura 11).

0,000

0,500

1,000

1,500

2,000

2,500

0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 26 28

Abs 620

 nm

Tiempo (horas)

Abs (nm) Vs Tiempo (horas)

Figura 11. Curva de crecimiento C. guillermondii en medio YGC.

La fase exponencial donde la levadura cumple con su mayor ciclo de duplicación se

evidencio desde la hora 0 hasta la hora 14 (Figura 12), aunque el mayor crecimiento

de la levadura fue presentado a la hora 22, este tiempo de crecimiento no fue tomado

en la fase exponencial de C. guillermondii, debido a la baja linealidad que se

presento entre la hora 14 a 22 mostrando un comportamiento correspondiente a la

fase estacionaria del crecimiento de la levadura, por tal razón luego de conocer la

curva de crecimiento, la levadura fue aplicada en el fruto a las 14 y 22 horas de

crecimiento; donde la biomasa de C. guillermondii estaba a una concentración de 4.7

x 109 UFC/mL a las 14 horas de crecimiento siendo esta la concentración 1, y a una

concentración de 5.17 x 109 UFC/mL, correspondiente a las 22 horas de crecimiento,

siendo esta ultima la concentración 2 de aplicación.

y = 0.0932x + 0.5955R² = 0.9459

0.000

0.500

1.000

1.500

2.000

0 2 4 6 8 10 12 14 16

Abs (6

20nm

)

Tiempo (horas)

Crecimiento Exponencial de Candida guillermondii

Figura 12. Fase exponencial de C. guillermondii. Abs 620 nm en función del tiempo

(horas)

El comportamiento del pH no se mantuvo estable a través del tiempo, debido al

crecimiento de C. guillermondii en el medio, el pH fue de 5.42 a la hora 0 de la curva

de crecimiento, a través del tiempo, el pH disminuyo hasta llegar a un valor de 4.73 a

las 10 horas, indicando la acidificación del medio debido al consumo de glucosa y

producción de ácidos como el succínico, acético, fórmico, propiónico y pirúvico por

parte de la levadura los cuales no fueron cuantificados, sin embargo varios autores lo

reportan, el pH ácido (4.5 – 5) que se evidencia durante la curva es una de las

condiciones óptimas para la levadura al incrementar la producción de biomasa (Yu y

Zhang, 2004; Martín, et al, 2005; Palmarola, et al, 2005). A partir de la hora 12 el pH

aumento debido al consumo del extracto de levadura; ya que se genera la liberación

de aminoácidos y otros productos nitrogenados (Buitrago. J; Tenjo, D. 2007.).

(Figura 13)

4.64.74.84.95

5.15.25.35.45.5

0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 26 28

pH

Tiempo (horas)

Comportamiento del pH en función de tiempo (horas)

Figura 13. Comportamiento del pH durante la curva de crecimiento

La cinética de crecimiento presentada por C. guillermondii a través de la curva de

peso seco, demostró la presencia de una prolongada etapa de crecimiento logarítmico,

sin embargo, debido posiblemente al tipo de sustrato la tasa reproductiva fue baja y el

tiempo de duplicación estuvo entre las 7 horas 37 min con una velocidad especifica

de crecimiento de 0.0908h-1. (Figura 14)

Td= Ln2 / μx Td= 0,693/0.0908hTd= 7.63h Td= 7h 37'

y = 0,0908x + 7,7289R² = 0,8833

7,000

7,500

8,000

8,500

9,000

9,500

0 2 4 6 8 10 12 14 16

Ln (Con

centración

 mg/L)

Tiempo (horas)

Ln  de la concentración (mg/L) en función del tiempo 

Figura 14. Determinación de la velocidad específica de crecimiento por C. guillermondii

7.8 Comportamiento del pH en el fruto.

El pH ácido que se evidencia durante el proceso de maduración en el fruto (Figura

15) se reporta según literatura que es debido a la presencia de ácidos orgánicos en la

pulpa del fruto tales como: málico, cítrico y oxálico, cuyos niveles se incrementan

durante el proceso. En un fruto verde la concentración de ácido oxálico es mayor,

mientras que en el fruto maduro es el ácido málico. La pulpa del fruto contiene en

estado verde 0.7% de ácido málico y 1.5% en estado maduro. La cáscara en estado

verde contiene 1.0% de ácido málico y 1.4% en estado maduro. (Cayón, D. Et al.

2000).

Los resultados obtenidos con respecto al pH en los frutos de banano, mostraron un

incremento de la acidez a medida que aumentaba su tiempo de maduración tal y como

se reporta anteriormente, sin embargo a partir del día 18 aproximadamente en los

tratamientos se evidencia un comportamiento que tiende a aumentar el pH según

literatura esto puede deberse a que durante la senescencia se presenta un incremento

en el contenido de los aminoácidos libres, consecuencia de la degradación de

enzimas. (Gallo, F. 1997).

4

4,5

5

5,5

6

6,5

0 10 20 30 40 50

pH

Tiempo (dias)

Comportamiento del pH durante la maduración de Musa acuminata. 

Conc. 1 

control

conc 2 

Figura 15. Comportamiento del pH durante la maduración del fruto Tratamientos y

control.

Con relación a los sólidos solubles totales (grados Brix), éstos se incrementaron en

función a las semanas de maduración de los frutos. Debido a la dificultad de extraer

pulpa para realizar el macerado, los SST fueron cuantificados hasta el día 25.

Según Hubbard et al. (1990) y Seymour et al. (1987), los grados Brix aumentan

durante la maduración debido a la rápida degradación del almidón, acumulándose

azúcares, principalmente glucosa, fructosa y sacarosa. Tanto en los dos tratamientos

como en el fruto control, el comportamiento de los SST fue similar debido a que el

proceso de maduración no es inherente en el fruto, sin embargo, en el fruto control a

los 20 días, se evidencia un incremento en los SST seguido de un periodo de

estabilidad esto puede deberse a que en la pulpa se presenta conversión del azúcar en

alcohol, proceso natural que se presenta durante la maduración del fruto. (Figura 16).

10121416182022242628

0 5 10 15 20 25

°Brix

Tiempo (días)

Comportamiento de los SST (° Brix)  en función del tiempo (dias)

Control

Concentración 1 

Concentracion 2 

Figura 16. Comportamiento de los SST durante la maduración del banano en

tratamientos y control.

Analizando estadísticamente los datos de SST por la prueba T (Tabla 6), se demostró

que no hay diferencias estadísticamente significativas entre los datos obtenidos con

respecto a los controles y la concentración 1 y 2, corroborando que el

comportamiento de los SST es similar tanto en los frutos control como en los frutos

con levadura, lo que indica que el aumento en los SST es un proceso fisiológico

natural de la maduración y no se ve significativamente influenciado por la aplicación

de levadura.

Prueba T Ctr Vs Conc 1 0,44446287Prueba T Ctr Vs Conc 2  0,24868646Prueba T conc 1 Vs conc 2  0,68963099

Tabla 6. Resultados de la probabilidad por prueba T para SST con un intervalo de

confianza del 95 %.

7.9 Textura

Durante el tiempo de estudio se evidencio pérdida de firmeza de la pulpa del fruto

tanto en los controles como en los tratamientos este comportamiento se asocia a tres

procesos principalmente, 1. Degradación del almidón para formar azúcar; 2.

Degradación de las paredes celulares o reducción en la cohesión de la lamela media

debido a la solubilización de las sustancias pécticas; 3. El movimiento del agua desde

la cáscara hacia la pulpa debido al proceso de ósmosis, el cual favorece posiblemente

la movilidad de la levadura dentro del fruto permitiéndole invadir el fruto y ejercer

efecto sobre el. Este comportamiento de la textura es muy leve al inicio de la

maduración porque el fruto está verde, pero de ahí en adelante la estructura se debilita

por la maduración hasta llegar a la senescencia, efecto causado por la degradación de

la protopectina en pectina y en ácido galacturónico. (Chang-Yuen, Et.al 2005)

La perdida de firmeza y agua en el fruto posiblemente sea una de la causas por la

cuales aproximadamente entre el día 15 y 18 donde se evidencia deshidratación del

fruto (Figura 17) haya una disminución considerable en la población de la levadura

debido a la dificultad de movilizarse dentro de la pulpa, lo que le impide consumir el

sustrato presente en el medio, provocando su decaimiento.

Figura 17. Efecto de la levadura a concentración 1 sobre el fruto a los 18 días de

estudio.

Estudios realizados por Rubiano, A. 2008, han demostrado que la concentración de

levadura dentro del fruto se incrementa progresivamente, se estudio el crecimiento de

la levadura C. guillermondii en la Cáscara Total (CT), Pulpa Exterior (PE) y en la

Pulpa Centro (PC) del banano (Musa acuminata) en estado de maduración 5 leída a lo

largo de 17 días de experimento y sometida durante 5 min en una solución acuosa con

una concentración de 45*108 UFC/ml y 46*108 UFC/ml.

Los resultados encontrados por Rubiano, A. 2008, demuestran la presencia de la

levadura y su incremento progresivo en la cascara y en la pulpa del fruto. Se observa

que la levadura en un tratamiento de inmersión por 5 min, empezó a migrar en la

pulpa a partir del día 11 y se incremento hasta el día 14 con 200 UFC. Este

comportamiento se relaciona directamente con el comportamiento del pH en el fruto

(Figura 15) ya que aproximadamente a partir de este día se evidencia una fase de

estabilización del pH lo que no ocurre con el fruto control en el cual el pH sigue

disminuyendo progresivamente, comportamiento natural del fruto.

El comportamiento de la levadura en los dos tratamientos posiblemente sea escaso ya

que el tiempo de inmersión no fue el adecuado para permitir una completa

impregnación de la levadura en el fruto.

En un banano control (Figura 18) el contenido de humedad de la cáscara disminuye

durante la maduración mientras en la pulpa aumenta, el porcentaje de agua en la

pulpa aumenta durante la maduración, no solo por la hidrólisis del almidón sino

también por el movimiento osmótico de agua desde la cáscara hacia la pulpa. Un

incremento en el peso de la pulpa afectando la relación pulpa: cáscara, parece ser una

consecuencia de la salida osmótica de la humedad de la cáscara. (Chang-Yuen, Et.al

2005). Efecto similar en cuanto al contenido del agua de la cáscara se evidencia en

los dos tratamientos sin embargo a partir del día 15 se evidencia que el

comportamiento del peso se estabiliza, efecto contrario al fruto control, esto puede

deberse a que aunque la perdida de agua en el banano a lo largo del estudio es

notoria, su peso se mantiene debido a que aproximadamente en este día se encuentra

la mayor población de levadura dentro del fruto y esta a su vez se encarga de

consumir el agua presente en el fruto necesaria para su supervivencia, una hipótesis

planteada acerca de el tiempo que puede durar la levadura en el fruto se atribuye

igualmente a la cantidad de agua en el fruto ya que como se relaciona anteriormente

en los frutos tratados se evidencia un proceso de deshidratación que se prolonga

desde el día 15 y continua por los 45 días del estudio (Figura 18), la disminución de

agua en la pulpa del fruto impide que haya una textura suave en el fruto cerrándose

los canales entre las laminas que le permitían a la levadura movilizarse para consumir

alimento presente en el fruto, es por esto que la concentración de levadura tendería a

disminuir hasta que llegue el momento en que sea insignificante dentro del fruto.

Figura 18. Perdida de agua y firmeza en el fruto del banano después de la aplicación

de levadura (Musa acuminata).

De izquierda a derecha fruto control y tratamiento Concentración 1.

Con respecto al color de la pulpa se evidencio que en los frutos tratados después del

día 18 presentaron pardeamiento de la pulpa, fenómeno directamente relacionado

según literatura con los niveles de ácido ascórbico, el contenido de polifenoles, la

actividad de la enzima polifenol oxidasa (PPO) o una combinación de estos factores,

el grado de pardeamiento de la pulpa esta correlacionado positivamente con la

concentración total de polifenoles y la actividad de la PPO. (Cayón, D. Et al. 2000).

Otras de las hipótesis planteadas para argumentar la desaparición de la levadura en el

fruto es la concentración de glucosa a la que se encuentra expuesta en el fruto

maduro, esto puede ser una consecuencia de la respuesta primaria hacia el estrés

osmótico al que están expuestas continuamente las levaduras (Willem et al., 2002).

Resultados similares fueron obtenidos por Erasmus y colaboradores (2003), quienes

encontraron que el estrés osmótico redujo significativamente el crecimiento de

Saccharomyces cerevisiae en jugo de uva, el cual tenía una concentración de azúcar

del 40% (w/v).

Las levaduras tienen la capacidad de responder rápidamente al estrés provocado por

las concentraciones de azúcar en el medio en el que se encuentran mediante una serie

de mecanismos, entre los que se distinguen: 1) cambios celulares inmediatos, que

ocurren como consecuencia de las fuerzas físico-mecánicas que se presentan bajo

estas condiciones; 2) procesos de defensa primaria que buscan dar protección a la

célula, reparación y recuperación, al igual que 3) eventos adaptativos que permiten la

restauración de la homeostasis celular bajo las nuevas circunstancias (Willem et al.,

2002).

Se puede entonces establecer que factores como el pH, la temperatura y las altas

concentraciones de glucosa (esta última relacionada con el Aw y el estrés osmótico)

ejercen una gran influencia en el desarrollo y supervivencia de las levaduras.

7.10. ANÁLISIS ESTADÍSTICO.

Análisis estadístico.

Por medio de la herramienta estadística Anova normal, se determino la diferencia

significativa entre los datos de los pesos de los frutos control, frutos con aplicación de

concentración 1 y frutos con aplicación de concentración 2 de C. guillermondii,

presentándose un comportamiento normal de los datos obtenidos. (Tabla 7, 8, 9)

Tabla 7. Promedio de pesos de las replicas de los frutos control a través de los días.

Réplicas  dia 0 dia 3  dia 6  dia  9 dia 12 dia 15 dia 18 dia 27 dia 36 dia 45 R 1 58.32 57.45 55.67 53.04 50.14 45.27 44.08 41.09 37.16 35.67R 2 58.44 56.87 53.72 52.42 51.84 49.65 45.17 42.74 38.29 36.49R 3 59.21 57.78 56.48 55.53 52.72 47.06 44.53 41.72 37.38 36.08

dia 0 dia 3  dia 6  dia  9 dia 12 dia 15 dia 18 dia 27 dia 36 dia 45 Promedio 58.66 57.37 55.29 53.66 51.57 47.33 44.59 41.85 37.61 36.08Desviacion 0.483 0.461 1.419 1.646 1.312 2.202 0.548 0.831 0.599 0.410

Decrecimiento  1.29 2.08 1.63 2.10 4.24 2.73 2.74 4.24 1.53Perdida de peso total 22.58Porcentaje de perdida 0 5.71 9.20 7.20 9.29 18.78 12.11 12.14 18.78 6.78

Tabla 8. Promedio de pesos de las replicas de los frutos con aplicación de la

concentración 1.

Réplicas  dia 0 dia 3  dia 6  dia  9 dia 12 dia 15 dia 18 dia 27 dia 36 dia 45 R 1 51.79 50.92 49.39 47.18 44.68 40.17 38.96 37.08 36.96 35.98R 2 52.18 51.22 49.71 47.66 45.35 41.06 39.29 37.36 37.24 36.16R 3 51.90 50.57 49.36 47.10 44.44 39.13 38.34 36.59 36.52 35.68

dia 0 dia 3  dia 6  dia  9 dia 12 dia 15 dia 18 dia 27 dia 36 dia 45 Promedio 51.96 50.90 49.49 47.31 44.82 40.12 38.86 37.01 36.91 35.94Desviacion 0.201 0.325 0.194 0.303 0.472 0.966 0.482 0.390 0.363 0.242

Decrecimiento  1.05 1.42 2.17 2.49 4.70 1.26 1.85 0.10 0.97Perdida de peso total 16.02Porcentaje de perdida 0 6.58 8.84 13.57 15.55 29.37 7.85 11.57 0.65 6.04

Tabla 9. Promedio de pesos de las replicas de los frutos con aplicación de la

concentración 2.

Réplicas  dia 0 dia 3  dia 6  dia  9 dia 12 dia 15 dia 18 dia 27 dia 36 dia 45 R 1 53.98 52.12 50.08 47.71 45.05 43.24 41.98 41.16 39.65 38.03R 2 53.88 51.89 50.21 48.14 45.58 43.52 42.48 41.45 39.89 38.34R 3 53.91 52.02 49.98 46.84 44.73 42.79 41.89 40.85 39.28 37.87

dia 0 dia 3  dia 6  dia  9 dia 12 dia 15 dia 18 dia 27 dia 36 dia 45 Promedio 53.92 52.01 50.09 47.56 45.12 43.18 42.12 41.15 39.61 38.08Desviacion 0.051 0.115 0.115 0.662 0.429 0.368 0.318 0.300 0.307 0.239

Decrecimiento  1.91 1.92 2.53 2.44 1.94 1.07 0.96 1.55 1.53Perdida de peso total 15.84Porcentaje de perdida 0 12.08 12.12 15.95 15.42 12.22 6.73 6.08 9.76 9.64

A partir de la regresión lineal de los datos de la pérdida de peso a medida del tiempo,

se determino la ecuación de la recta y = mx + b tanto de los controles, concentración

1 y concentración 2, la pendiente con tendencia negativa por su comportamiento

decreciente, determino que la pérdida de peso es directamente proporcional al

tiempo, de este modo se obtuvieron pendientes iguales a un valor de: -0.5403 para los

controles,-0.3856 para la concentración 1 y de -0.3399 para la concentración 2.

(Figura 19, 20, 21)

y = ‐0.5403x + 57.639R² = 0.95

0.00

10.00

20.00

30.00

40.00

50.00

60.00

70.00

0 3 6 9 12 15 18 21 24 27 30 33 36 39 42 45 48

Peso frutos (gram

os)

Tiempo (días)

PERDIDA DE PESO DE LOS FRUTOS CONTROL

Figura 19. Perdida lineal de peso de los frutos control a través del tiempo.

y = ‐0.3856x + 49.926R² = 0.8172

0.00

10.00

20.00

30.00

40.00

50.00

60.00

0 3 6 9 12 15 18 21 24 27 30 33 36 39 42 45 48

Peso frutos (gram

os)

Tiempo (días)

PERDIDA DE PESO DE LOS FRUTOS CONCENTRACIÓN 1

Figura 20. Perdida lineal de peso de los frutos con aplicación de la concentración 1 a

través del tiempo.

y = ‐0.3399x + 51.098R² = 0.8519

0.00

10.00

20.00

30.00

40.00

50.00

60.00

0 3 6 9 12 15 18 21 24 27 30 33 36 39 42 45 48

Peso Frutos (gramos)

Tiempo (días)

PERDIDA DE PESO DE LOS FRUTOS  CONCENTRACIÓN 2

Figura 21. Perdida lineal de peso de los frutos con aplicación de la concentración 2 a

través del tiempo.

La pendiente más cercana a 0, presenta una tendencia mucho más lineal que las

demás, por tal motivo, tanto los controles como las concentraciones utilizadas

presentaron este comportamiento, sin embargo los controles mostraron una linealidad

mayor a la de las concentraciones aplicadas en el fruto, (Figura 19) es decir que la

pérdida de peso de los frutos se ve afectada por las concentraciones de levadura

aplicadas, a través de los 45 días de estudio, en cada una de las replicas se presencio

la acción de C. guillermondii, de esta manera al ser comparadas las dos

concentraciones por medio de la linealidad, se determino que la levadura presenta

efectividad al ser aplicada a las concentraciones usadas. El estadístico de ANOVA

determinó que no existe diferencia significativa entre los pesos de cada una de las

replicas en cada uno de los días de estudio, lo que comprueba que los datos se

comportan normalmente. Según ANOVA normal existe una diferencia significativa

entre la pérdida de peso de los frutos control y los frutos con levadura, de igual

manera existe una diferencia significativa entre las dos concentraciones aplicadas en

los frutos, aunque la linealidad no mostro gran diferencia entre los tratamientos

(Figura 22), solo estadísticamente se pudo comprobar las diferencias significativas

entre estos.

 

0.00

10.00

20.00

30.00

40.00

50.00

60.00

70.00

0 3 6 9 12 15 18 21 24 27 30 33 36 39 42 45 48

Peso frutos (gram

os)

Tiempo(días)

PERDIDA DE PESO DE LOS FRUTOS EN FUNCIÓN DEL TIEMPO

CONCENTRACIÓN 1

CONCENTRACIÓN 2

CONTROLES

Figura 22. Relación de pérdida lineal de peso entre los frutos control y las

concentraciones.

Por medio de los resultados obtenidos estadísticamente se evidencio que tanto la

concentración 1 como la concentración 2 aplicada en el fruto, cumplen con el mismo

fin de retardar la maduración del fruto y de deshidratarlo a través del tiempo. Aunque,

por medio de la regresión lineal se evidencio que la concentración 1 presento una

linealidad menor, lo que muestra un mejor comportamiento en cuanto a la actividad

de la retardación del fruto por medio de C. guillermondii, ya que indica que luego de

los 18 días de aplicación de la levadura, se genera un mayor estado de reposo de la

perdida de peso del fruto, con respecto a los frutos control y los frutos en los cuales la

levadura fue aplicada a la concentración 2. Según el porcentaje de perdida de peso

del fruto a través del tiempo de estudio, los frutos control, y los frutos aplicados con

la levadura a concentración 1 perdieron mas peso a los 15 días de estudio, mientras

que en la concentración 2 a los 9 días de estudio se evidencia la mayor perdida de

peso, (Figura 23) esto posiblemente debido a los azucares disponibles para que C.

guillermondii asimilara a través de su proceso de duplicación y transporte en el

interior del fruto, ya que a medida de los días la levadura recorría internamente y

colonizaba mucho mas el fruto, es por esta razón que la levadura a la concentración 2

produce una mayor perdida de peso del fruto con respecto a los controles y los frutos

con concentración 1, debido a ingresar mas biomasa al fruto y por ende actuar de

manera más rápida en el.

Figura 23. Porcentaje de pérdida de peso de los frutos a través del tiempo, controles

frente a concentración 1 y concentración 2.

Mientras los frutos tratados con las concentraciones de C. guillermondii perdieron

peso por medio de este microorganismo, los controles maduraron a medida que

transcurrió el tiempo de estudio por medio de su proceso natural de maduración

fisiológica, de esta manera perdieron peso constantemente a través del tiempo. En las

concentraciones aplicadas se evidencio y se diferencio visualmente la deshidratación

del fruto al ser comparados con los controles. (Figura 24).

Figura 24. Estado de maduración del fruto control frente al fruto con levadura.

8. Conclusiones

• La cepa de levadura en estudio fue aislada de uchuva HIB cultivada en la

estación experimental de la Pontificia Universidad Javeriana.

• La levadura fue identificada mediante la técnica de API 20C AUX con un

99.7% de certeza de ser C. guillermondii

• Después de varias pruebas se descartó la presencia de tubo germinal

evidenciándose que no es una levadura patógena.

• La levadura C. guillermondii presenta su máximo crecimiento entre las 14

horas y 22 horas, su velocidad especifica de crecimiento es igual a 0.0908h-1,

y se duplica cada 7 horas y 37 minutos en caldo YGC.

• La actividad de la Levadura C1 (4.7 x 109 UFC/mL) y de la C2 (5.17 x 109

UFC/mL), generaron diferencias significativas, con respecto a la pérdida de

peso de los frutos durante el tiempo de estudio.

• Del estudio de las dos Concentraciones de levadura, se encontró que la C1

genera mayor pérdida de peso (16.02 %) produciendo un mayor efecto en la

retardación de la pudrición del fruto.

• C. guillermondii a partir de los 12 días de aplicación muestra la máxima

perdida de peso y el inicio de la deshidratación del fruto del banano.

9. Recomendaciones

• Buscar nuevas técnicas de identificación que confirmen que es C.

guillermondii aplicando técnicas o métodos de biología molecular.

• Realizar el estudio por un tiempo mayor a 45 días, para conocer más aspectos

importantes con respecto a la deshidratación del fruto.

• Cuantificar compuestos producidos por acción de la levadura en el fruto por

medio de cromatografía.

• Evaluar otras formas de aplicación de C. guillermondii diferentes a inmersión.

• Estudiar el efecto de la levadura en la retardación de la pudrición de frutos

diferentes al banano, al igual que el efecto de deshidratación.

• Estudiar el gradiente de pérdida de agua en el fruto durante el tiempo de

estudio

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