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Transcripción y Procesamiento del RNA
Unidad 6
Facultad de Química, UNAM
1630 Genética y Biología Molecular
Dogma Central de la Biología Molecular.
Flujo de la Información Genética
Replicación
Transcripción.
Síntesis de RNA
Traducción
Síntesis de Proteínas
SÍNTESIS DE RNA o TRANSCRIPCIÓN
•La enzima RNA polimerasa.
•DNA
•Ribonucleótidos (trifosfatados) ATP, GTP, CTP, UTP.
•Proteínas o factores de transcripción.
Cadena molde 3’-5’
Señales de iniciación (promotor) y de terminación
• Es el proceso mediante el cual se sintetiza RNA a partir de
DNA. • El RNA que se sintetiza puede ser el ribosomal, el de
transferencia oel mensajero• Se requiere el DNA porque de su
secuencia se sintetiza la del RNA, la cual es complementaria
Se requieren:
Producto de la transcripción: RNA de transferencia
Región aceptora
Asa anticodón
Tamaño: 75 – 80 nucleótidos
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Estructura y Función del RNAt
Los RNAt son las moléculas adaptadoras (traductoras) que
decodifican la información en el RNAm acarreando al aminoácido
correspondiente.
Los RNAt se sintetizan como precursores que son procesados para
generar moléculas de 75 a 80 nts de longitud.
Generalmente tienen bases modificadas como:
Ribotimidina Dihidrouridina
Pseudouridina Inosina
Inosina
Producto de transcripción:
RNA ribosomal
PROCARIONTES:
RNAr 23S: 2,904 nts.
RNAr 16S: 1,542 nts.
EUCARIONTES:
RNAr 28S: 4,718 nts.
RNAr 18S: 1,874 nts.
Producto de la transcripción: RNA mensajero
El tamaño de los RNAs mensajeros es variable y depende del
tamaño del gen que se transcribe.
La estructura de los RNAm es variable y depende de la
secuencia.
El proceso de transcripción es la síntesis de RNA siguiendo un
molde de DNA
Micrografía electrónica de la síntesis de RNA ribosomal
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A diferencia de la replicación del DNA, en la
transcripción...
• Solamente un fragmento de DNA, que corresponde a un gen, es
copiado en RNA.
• Una de las dos cadenas de DNA es copiada a RNA.
DNA Cadena codificante: 5’-ATTCCGATGTACGAGG-3’
DNA Cadena molde: 3’-TAAGGCTACATGCTCC-5’
RNA 5’-AUUCCGAUGUACGAGG-3’
La secuencia de la molécula de RNA que se sintetiza es
complementaria y antiparalela a la cadena molde.
La molécula de RNA que se sintetiza tiene la misma dirección y
secuencia (U -> T) que la cadena codificante.
Solamente un fragmento de DNA, que corresponde a un gen, es
copiado a RNA.Una de las dos cadenas de DNA es copiada a RNA.
• ¿Cómo sabe la RNA polimerasa cuál de las dos cadenas usará
como molde?
• ¿Cómo sabe la RNA polimerasa dónde comenzar a sintetizar?
• ¿Cómo sabe la RNA polimerasa donde terminar de sintetizar?
• ¿Quíen abre la doble hélice de DNA?
La enzima que sintetiza RNA es la RNA POLIMERASA La enzima de E.
coli está formada por 4 subunidades
Subunidad α: ensamblaje de las unidades y unión al promotor
Subunidad β: Sitio catalíticoSubunidad β’: Se une al DNA y parte
de la subunidad catalítica
Subunidad σ: Reconocimiento del promotor específico
La subunidad α sirve como nodo para ensamblar la RNA polimerasa
holoenzima y esta función reside en el dominio N-terminal de la
proteína.
El domino C-terminal de la subunidad α interactúa con la región
UP de los promotores que la tengan.
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La estequiometría de subunidades en la holoenzima es α2ββ'σ
Núcleo de la enzima
Cuando la subunidad σse asocia al núcleo se forma la
holoenzima
5 –8 pb
• Secuencia -10 o caja Pribnow TATAAT Apertura de la cadena.
• Secuencia –35 TTGTCA Es la región de reconocimiento e
interacción con el factor σ de la RNA polimerasa.
Estructura de los promotores procariontes.
Secuencias que se encuentran “corriente arriba” del sitio de
inicio de la transcripción. Hay secuencias muy conservadas en los
promotores procariontes.
Modelo de la RNA polimerasa de E. coli a partir de los datos
cristalográficos
Núcleo de la enzima α2ββ Holoenzima α2ββσ
El factor sigma permite la iniciación de la transcripción
permitiendo que la RNA polimerasa se una fuertemente al
promotor.
Esta unión depende de la apertura de la doble hélice en esa
región para formar un complejo del promotor accesible a la
enzima.
El factor sigma se disocia de este complejo.
La RNA polimerasa tiene un canal abierto al cual se une el DNA.
Una vez que se unen al DNA, los “dedos” de la enzima se cierran
alrededor del DNA.
Núcleo RNA pol
Holoenzima
Complejo de elongación.
Formación del complejo RNA pol -DNA
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Las funciones de la subunidad σ
El factor sigma selecciona los genes a transcribirse al
facilitar la unión entre la RNA polimerasa y el promotor. Esta
unión depende de la denaturalización local del DNA que permite la
formación de un complejo de promotor abierto
El factor σ se recicla, i.e. cuando se disocia puede ser usado
por otra RNA polimerasa.
Al unirse al promotor, la RNA polimerasa causa la apertura de al
menos 10 - 17 pb de la doble cadena de DNA. Esta “burbuja” de
transcripción se mueve con la polimerasa exponiendo la cadena
molde, de tal manera que puede ser transcrita.
σ
SÍNTESIS Y ESTRUCTURA DE UNACADENA DE RNA
Se añaden ribonucleótidospolimerizándose la cadena a través de
enlaces fosfodiésterLa cadena se sintetiza en dirección 5’ –>
3’
4.- La “burbuja de transcripción” va avanzando, por un lado se
abre el DNAduplex y por el otro se re-bobina.5.- El RNA sintetizado
va formando un híbrido (transitorio), con la cadena 3’ – 5’ del
DNA
Desplazamiento dela polimerasa
35
5
3
5’ ppp RNA naciente
RNA polimerasa
Hélice híbridaRNA - DNA
3Punto de
elongación
RebobinadoDesenrollado
Hebra moldeHebra codificadora
Elongación.1. Mecanismo dependiente de la proteína Rho
La proteína rho es un hexámero que hidroliza ATP en presencia de
RNA.
Se une al RNA que se está sintetizando y se mueve en dirección
al sitio de síntesis. Desestabiliza al híbrido DNA – RNA,
facilitando así la terminación de la transcripción.
Terminación:
RNA polimerasa
Proteína Rho
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2. Mecanismo independiente de la proteína Rho
La secuencia al final del gen contiene repeticiones invertidas
que son complementarias y que permiten la formación de una
estructura de horquilla en el RNA. Hay una región rica en Adeninas,
de tal forma que el híbrido DNA-RNA que se forma es débil y se
disocia.
RNA polimerasa
La rifampicina bloque la transición de iniciación-elongación. Se
une a la subunidad β en el complejo RNA-polimerasa promotor una vez
que se han incorporado dos o tres nucleótidos a la cadena de
RNA.
Inhibición de la transcripción en procariontes.
La rifampicina es producida por Streptomyces sp.
La estreptolidigina inhibe a la RNA polimerasa durante la
elongación.
Transcripción en eucariontes. Hay tres actividades de RNA
polimerasas
RNA polimerasas eucariontes purificadas en una columna de
DEAE-Sephadex. RNA pol I, RNA pol II y RNA pol III
Las RNA polimerasas eucariontes sintetizan distintos RNAs y
difieren en su sensibilidad a inhibidores.
Actividad de RNA polimerasa
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INHIBIDORES DE LA TRANSCRIPCIÓN
Amanita phaloides, hongovenenoso que contieneα - amanitina
La α−amanitina inhibe a la RNA polimerasa II (Kd =10 nM) y un
poco a la III. Inhibe la fase de elongación de la Transcripción
α-amanitina La RNA polimerasa II eucarionte está formada por 12
subunidades. (P.M. aproximado de 550 kDa)
Tres de estas subunidades son homólogas a las subunidades de la
RNA polimerasa procarionte.
Rpb1 =>β’
Rpb2 =>β
Rpb3 =>α
Los promotores de los genes eucariontes son más complejos que
los procariontes. Muestran menor conservación en los elementos de
reconocimiento de las RNA polimerasas.
Inicio de la transcripción
Caja TATA: TATA(A/T)A(A/T)
18 - 25 nts
*URE (Elementos regulatorios “río arriba”). Son sitios de unión
de otras proteínas (factores de transcripción) que facilitan la
unión de la RNA polimerasa y la transcripción de ese gen. De 100 a
200 pb del inicio.
Enhancers (Sec. Intensificadoras). Regiones en el DNA que están
alejadas por más de 1000 pb del sitio de inicio y que activan al
promotor para que ocurra una transcripción más eficiente.
La caja TATA funciona como señal para la unión de la proteína
TBP (TATA-binding protein). La unión de TBP al DNA causa una
torsión de éste, facilitando la apertura de la doble hélice.
El factor de transcripción IID (TFIID) se une a promotores que
contienen la caja TATA a través de la proteína TBP.
Se forma un complejo multiproteíco en el promotor que permite la
asociación de proteínas que están unidas a otras regiones en el
promotor.
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Modificaciones post-transcripcionales de RNAs
eucariontes
Cada tipo de RNA sufre una forma diferente de PROCESAMIENTO
POST-TRANSCRIPCIONAL o MADURACIÓN
RNAt
RNAmEuc.
RNAr
PROCESAMIENTOo MADURACIÓN
Remoción de los extremosModificación de la ribosa Modificación
de las bases
Empalme o splicingAdición del CAP en el extremo 5’Adición del
poliA en el extremo 3’
Metilación de la ribosaRemoción de partes intermediasde un
pre-RNAr largo que origina varios RNAr más cortos
RNAr 28S
PreRNA45S
RNArmaduros
18S 5.8S 28S
RNAr18S RNAr 5.8S
18S 5.8S 28S
Metilación en el 2’-OH de la ribosa
corte
RNA ribosomales. Son sintetizados por la RNA pol I.
Los RNA ribosomales 28S, 18S, y 5.8S se sintetizan como un
transcrito largo de 13,000 nucleótidos que es procesado para
generar los RNAr maduros.
Los RNA de transferencia también son procesados
La RNAsa P hace un corte y genera el extremo 5’-OH
La RNAsa P es un ribozima. Contiena una subunidad de proteína y
otra de RNA.
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RNAm Eucarionte: Adición del CAP
• Residuo 7-metil guanosina,añadida por una
guanililtransferasa
• Puente 5´-5´ trifosfato
• El “capuchón” o “capping” puedeestar metilada en O(2´) (1 o
dosnucleósidos terminales) o no (cap-0).
RNAm eucarionte: Adición de la cola de poliA
Secuencias consenso
PABP
Señal de corte
Hidrólisis por una endonucleasa específica
Adición de adeninas (50-300) por una poli-A polimerasa
RNAm poliadenilado
RNAm eucarionte: Corte y empalme/ “splicing”
DNA
RNAm hetero-nuclear
Transcripción
Procesamiento: eliminación de intrones.
RNAm maduro
Empalme de exones
RNAm eucarionte: Corte y empalme o splicing
Las dos primeras bases del intron son GU
Las dos últimas bases del intron son AG
Sitio de ramificación
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RNAm eucarionte: Corte y empalme o splicing RNAm eucarionte:
Corte y empalme o splicing
El “splicing” del RNAm es catalizado por snRNP (small nuclear
RiboNuclear Particles)
snRNP: Moléculas de RNA ricas en uracilo asociadas a
proteínas.
U1, U2, U4, U5, U6. La subunidad de RNA forma puentes de
hidrógeno con las bases en los sitios de reconocimiento de los
intrones (3’, 5’ y la rama).
“Spliceosome” = espliceosoma
RNA autocatalítico.
Algunos intrones se pueden eliminar de transcritos
heteronucleares sin el requerimiento de proteínas.
En este mecanismo hay un ataque en el sitio 5’ de splicing y la
ruptura, y no se forma el lazo (lariat).
“Splicing” alternativo.Los RNAhn de algunos genes pueden ser
procesados (splicing) de manera diferencial generando dos RNAm
maduros distintos.
Por lo general, el resultado del “splicing” alternativo son
proteínas relacionadas estructuralmente. Generalmente se obtienen
isoformas de una proteína.
A partir de un gen, se produce más de una proteína.
Splicing alternativo
Traducción
Proteína BProteína A
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Comparación de la expresión génica entre eucariontes y
procariontes
Eucariontes Procariontes
