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Transcripción y Procesamiento del RNA
Unidad 6
Facultad de Química, UNAM
1630 Genética y Biología Molecular
Dogma Central de la Biología Molecular.
Flujo de la Información Genética
Replicación
Transcripción.
Síntesis de RNA
Traducción
Síntesis de Proteínas
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SÍNTESIS DE RNA o TRANSCRIPCIÓN
•La enzima RNA polimerasa.
•DNA
•Ribonucleótidos (trifosfatados) ATP, GTP, CTP, UTP.
•Proteínas o factores de transcripción.
Cadena molde 3’-5’
Señales de iniciación (promotor) y de terminación
• Es el proceso mediante el cual se sintetiza RNA a partir de DNA. • El RNA que se sintetiza puede ser el ribosomal, el de transferencia oel mensajero• Se requiere el DNA porque de su secuencia se sintetiza la del RNA, la cual es complementaria
Se requieren:
Producto de la transcripción: RNA de transferencia
Región aceptora
Asa anticodón
Tamaño: 75 – 80 nucleótidos
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Estructura y Función del RNAt
Los RNAt son las moléculas adaptadoras (traductoras) que decodifican la información en el RNAm acarreando al aminoácido correspondiente.
Los RNAt se sintetizan como precursores que son procesados para generar moléculas de 75 a 80 nts de longitud.
Generalmente tienen bases modificadas como:
Ribotimidina Dihidrouridina
Pseudouridina Inosina
Inosina
Producto de transcripción:
RNA ribosomal
PROCARIONTES:
RNAr 23S: 2,904 nts.
RNAr 16S: 1,542 nts.
EUCARIONTES:
RNAr 28S: 4,718 nts.
RNAr 18S: 1,874 nts.
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Producto de la transcripción: RNA mensajero
El tamaño de los RNAs mensajeros es variable y depende del tamaño del gen que se transcribe.
La estructura de los RNAm es variable y depende de la secuencia.
El proceso de transcripción es la síntesis de RNA siguiendo un molde de DNA
Micrografía electrónica de la síntesis de RNA ribosomal
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A diferencia de la replicación del DNA, en la transcripción...
• Solamente un fragmento de DNA, que corresponde a un gen, es copiado en RNA.
• Una de las dos cadenas de DNA es copiada a RNA.
DNA Cadena codificante: 5’-ATTCCGATGTACGAGG-3’
DNA Cadena molde: 3’-TAAGGCTACATGCTCC-5’
RNA 5’-AUUCCGAUGUACGAGG-3’
La secuencia de la molécula de RNA que se sintetiza es complementaria y antiparalela a la cadena molde.
La molécula de RNA que se sintetiza tiene la misma dirección y secuencia (U -> T) que la cadena codificante.
Solamente un fragmento de DNA, que corresponde a un gen, es copiado a RNA.Una de las dos cadenas de DNA es copiada a RNA.
• ¿Cómo sabe la RNA polimerasa cuál de las dos cadenas usará como molde?
• ¿Cómo sabe la RNA polimerasa dónde comenzar a sintetizar?
• ¿Cómo sabe la RNA polimerasa donde terminar de sintetizar?
• ¿Quíen abre la doble hélice de DNA?
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La enzima que sintetiza RNA es la RNA POLIMERASA La enzima de E. coli está formada por 4 subunidades
Subunidad α: ensamblaje de las unidades y unión al promotor
Subunidad β: Sitio catalítico
Subunidad β’: Se une al DNA y parte de la subunidad catalítica
Subunidad σ: Reconocimiento del promotor específico
La subunidad α sirve como nodo para ensamblar la RNA polimerasa holoenzima y esta función reside en el dominio N-terminal de la proteína.
El domino C-terminal de la subunidad α interactúa con la región UP de los promotores que la tengan.
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La estequiometría de subunidades en la holoenzima es α2ββ'σ
Núcleo de la enzima
Cuando la subunidad σse asocia al núcleo se forma la holoenzima
5 –8 pb
• Secuencia -10 o caja Pribnow TATAAT Apertura de la cadena.
• Secuencia –35 TTGTCA Es la región de reconocimiento e interacción con el factor σ de la RNA polimerasa.
Estructura de los promotores procariontes.
Secuencias que se encuentran “corriente arriba” del sitio de inicio de la transcripción. Hay secuencias muy conservadas en los promotores procariontes.
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Modelo de la RNA polimerasa de E. coli a partir de los datos cristalográficos
Núcleo de la enzima α2ββ Holoenzima α2ββσ
El factor sigma permite la iniciación de la transcripción permitiendo que la RNA polimerasa se una fuertemente al promotor.
Esta unión depende de la apertura de la doble hélice en esa región para formar un complejo del promotor accesible a la enzima.
El factor sigma se disocia de este complejo.
La RNA polimerasa tiene un canal abierto al cual se une el DNA. Una vez que se unen al DNA, los “dedos” de la enzima se cierran alrededor del DNA.
Núcleo RNA pol
Holoenzima
Complejo de elongación.
Formación del complejo RNA pol -DNA
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Las funciones de la subunidad σ
El factor sigma selecciona los genes a transcribirse al facilitar la unión entre la RNA polimerasa y el promotor. Esta unión depende de la denaturalización local del DNA que permite la formación de un complejo de promotor abierto
El factor σ se recicla, i.e. cuando se disocia puede ser usado por otra RNA polimerasa.
Al unirse al promotor, la RNA polimerasa causa la apertura de al menos 10 - 17 pb de la doble cadena de DNA. Esta “burbuja” de transcripción se mueve con la polimerasa exponiendo la cadena molde, de tal manera que puede ser transcrita.
σ
SÍNTESIS Y ESTRUCTURA DE UNACADENA DE RNA
Se añaden ribonucleótidospolimerizándose la cadena a través de enlaces fosfodiésterLa cadena se sintetiza en dirección 5’ –> 3’
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4.- La “burbuja de transcripción” va avanzando, por un lado se abre el DNAduplex y por el otro se re-bobina.5.- El RNA sintetizado va formando un híbrido (transitorio), con la cadena 3’ – 5’ del DNA
Desplazamiento dela polimerasa
35
5
3
5’ ppp RNA naciente
RNA polimerasa
Hélice híbridaRNA - DNA
3Punto de
elongación
RebobinadoDesenrollado
Hebra moldeHebra codificadora
Elongación.
1. Mecanismo dependiente de la proteína Rho
La proteína rho es un hexámero que hidroliza ATP en presencia de RNA.
Se une al RNA que se está sintetizando y se mueve en dirección al sitio de síntesis. Desestabiliza al híbrido DNA – RNA, facilitando así la terminación de la transcripción.
Terminación:
RNA polimerasa
Proteína Rho
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2. Mecanismo independiente de la proteína Rho
La secuencia al final del gen contiene repeticiones invertidas que son complementarias y que permiten la formación de una estructura de horquilla en el RNA. Hay una región rica en Adeninas, de tal forma que el híbrido DNA-RNA que se forma es débil y se disocia.
RNA polimerasa
La rifampicina bloque la transición de iniciación-elongación. Se une a la subunidad β en el complejo RNA-polimerasa promotor una vez que se han incorporado dos o tres nucleótidos a la cadena de RNA.
Inhibición de la transcripción en procariontes.
La rifampicina es producida por Streptomyces sp.
La estreptolidigina inhibe a la RNA polimerasa durante la elongación.
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Transcripción en eucariontes. Hay tres actividades de RNA polimerasas
RNA polimerasas eucariontes purificadas en una columna de DEAE-Sephadex. RNA pol I, RNA pol II y RNA pol III
Las RNA polimerasas eucariontes sintetizan distintos RNAs y difieren en su sensibilidad a inhibidores.
Actividad de RNA polimerasa
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INHIBIDORES DE LA TRANSCRIPCIÓN
Amanita phaloides, hongovenenoso que contieneα - amanitina
La α−amanitina inhibe a la RNA polimerasa II (Kd =10 nM) y un poco a la III. Inhibe la fase de elongación de la Transcripción
α-amanitina
La RNA polimerasa II eucarionte está formada por 12 subunidades. (P.M. aproximado de 550 kDa)
Tres de estas subunidades son homólogas a las subunidades de la RNA polimerasa procarionte.
Rpb1 =>β’
Rpb2 =>β
Rpb3 =>α
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Los promotores de los genes eucariontes son más complejos que los procariontes. Muestran menor conservación en los elementos de reconocimiento de las RNA polimerasas.
Inicio de la transcripción
Caja TATA: TATA(A/T)A(A/T)
18 - 25 nts
*URE (Elementos regulatorios “río arriba”). Son sitios de unión de otras proteínas (factores de transcripción) que facilitan la unión de la RNA polimerasa y la transcripción de ese gen. De 100 a 200 pb del inicio.
Enhancers (Sec. Intensificadoras). Regiones en el DNA que están alejadas por más de 1000 pb del sitio de inicio y que activan al promotor para que ocurra una transcripción más eficiente.
La caja TATA funciona como señal para la unión de la proteína TBP (TATA-binding protein). La unión de TBP al DNA causa una torsión de éste, facilitando la apertura de la doble hélice.
El factor de transcripción IID (TFIID) se une a promotores que contienen la caja TATA a través de la proteína TBP.
Se forma un complejo multiproteíco en el promotor que permite la asociación de proteínas que están unidas a otras regiones en el promotor.
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Modificaciones post-transcripcionales de RNAs
eucariontes
Cada tipo de RNA sufre una forma diferente de PROCESAMIENTO POST-TRANSCRIPCIONAL o MADURACIÓN
RNAt
RNAmEuc.
RNAr
PROCESAMIENTOo MADURACIÓN
Remoción de los extremosModificación de la ribosa Modificación de las bases
Empalme o splicingAdición del CAP en el extremo 5’Adición del poliA en el extremo 3’
Metilación de la ribosaRemoción de partes intermediasde un pre-RNAr largo que origina varios RNAr más cortos
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RNAr 28S
PreRNA45S
RNArmaduros
18S 5.8S 28S
RNAr18S RNAr 5.8S
18S 5.8S 28S
Metilación en el 2’-OH de la ribosa
corte
RNA ribosomales. Son sintetizados por la RNA pol I.
Los RNA ribosomales 28S, 18S, y 5.8S se sintetizan como un transcrito largo de 13,000 nucleótidos que es procesado para generar los RNAr maduros.
Los RNA de transferencia también son procesados
La RNAsa P hace un corte y genera el extremo 5’-OH
La RNAsa P es un ribozima. Contiena una subunidad de proteína y otra de RNA.
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RNAm Eucarionte: Adición del CAP
• Residuo 7-metil guanosina,añadida por una guanililtransferasa
• Puente 5´-5´ trifosfato
• El “capuchón” o “capping” puedeestar metilada en O(2´) (1 o dosnucleósidos terminales) o no (cap-0).
RNAm eucarionte: Adición de la cola de poliA
Secuencias consenso
PABP
Señal de corte
Hidrólisis por una endonucleasa específica
Adición de adeninas (50-300) por una poli-A polimerasa
RNAm poliadenilado
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RNAm eucarionte: Corte y empalme/ “splicing”
DNA
RNAm hetero-nuclear
Transcripción
Procesamiento: eliminación de intrones.
RNAm maduro
Empalme de exones
RNAm eucarionte: Corte y empalme o splicing
Las dos primeras bases del intron son GU
Las dos últimas bases del intron son AG
Sitio de ramificación
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RNAm eucarionte: Corte y empalme o splicing
RNAm eucarionte: Corte y empalme o splicing
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El “splicing” del RNAm es catalizado por snRNP (small nuclear RiboNuclear Particles)
snRNP: Moléculas de RNA ricas en uracilo asociadas a proteínas.
U1, U2, U4, U5, U6. La subunidad de RNA forma puentes de hidrógeno con las bases en los sitios de reconocimiento de los intrones (3’, 5’ y la rama).
“Spliceosome” = espliceosoma
RNA autocatalítico.
Algunos intrones se pueden eliminar de transcritos heteronucleares sin el requerimiento de proteínas.
En este mecanismo hay un ataque en el sitio 5’ de splicing y la ruptura, y no se forma el lazo (lariat).
“Splicing” alternativo.Los RNAhn de algunos genes pueden ser procesados (splicing) de manera diferencial generando dos RNAm maduros distintos.
Por lo general, el resultado del “splicing” alternativo son proteínas relacionadas estructuralmente. Generalmente se obtienen isoformas de una proteína.
A partir de un gen, se produce más de una proteína.
Splicing alternativo
Traducción
Proteína BProteína A
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Comparación de la expresión génica entre eucariontes y procariontes
Eucariontes Procariontes
