TRANSCRIPCIÓN

EN

TRIPANOSOMÁTIDOS

20072007

• 4 ARN polimerasas (I, II y III; y mitocondrial) 4 ARN polimerasas (I, II y III; y mitocondrial)

• Factor universal de transcripción relacionado con Factor universal de transcripción relacionado con TBP (TRF4: TBP related factor 4)TBP (TRF4: TBP related factor 4)

• Organización general de genes: policistrónica (no Organización general de genes: policistrónica (no relacionados funcionalmente) relacionados funcionalmente)

• ““Capping” de ARNm (por Capping” de ARNm (por transtrans-splicing) -splicing)

• La regulación post-transcripcional es la clave para los La regulación post-transcripcional es la clave para los cambios en la expresión génicacambios en la expresión génica

• Esta regulación se ejerce a través de elementos en Esta regulación se ejerce a través de elementos en las regiones intergénicas (rol de las regiones UTR)las regiones intergénicas (rol de las regiones UTR)

Transcripción en Tripanosomátidos

•Transcribe ARN pequeños (5S, tARNs y snARN) usando snARN

•Básicamente presenta los mismos promotores que eucariotas superiores: estar tanto en la región 3’ como 5’

ARN polimerasa III

? ? ?? ? ?Tipo 3Tipo 3

AA CCTipo 1Tipo 1

AA BBTipo 2Tipo 2

Punto de inicioPunto de inicio

ARNr 5S

ARNt

U1-U5 (diferencia con eucariotas sup)

•Transcribe ARN ribosomal (nucleolo) y además, Transcribe ARN ribosomal (nucleolo) y además, transcribe 2 grupos de genes que incluye Ags de transcribe 2 grupos de genes que incluye Ags de superficie (VSG y PRO)superficie (VSG y PRO)

•Los transcriptos ARNr no se le agrega cap: 20% Los transcriptos ARNr no se le agrega cap: 20% 5’ tri-PO4 y 80% 5’ OH5’ tri-PO4 y 80% 5’ OH

•La estructura del promotor es semejante a los La estructura del promotor es semejante a los otros eucariotas: bipartitaotros eucariotas: bipartita

Core promoter

Punto de inicioPunto de inicio

–170 –150 –130 –110 –60 –40 –20 –10 +10 +20Upstream control element

Pol I

ARN polimerasa I

Core

Promotores de ARN Pol I

Similar a los promotores de ARNr euc. superiores

Suficiente para transcribir VSG

Se estimula la actividad por la presencia de elementos en el 5’ (UCE)

Aparentemente están siempre activos (la regulación para las unidades de VSG y de PRO es en la elongación).

Mitocondrial transcripción: Mitocondrial transcripción: ARN polimerasa mitocondrial ARN polimerasa mitocondrial (mitARNpol)(mitARNpol)

Nota: El ADN en el kinetoplasto está distribuído en: maxi- y mini- círculos

30-50kb 0.8-1.6 kb 10-30 copias 30000-50000 copias genoma mitocondrial ARNguias

No se han encontrado secuencias promotoras consenso

mitARNpol es transcripta en el núcleo como una única subunidad

Nota: los ARNt del kinetoplasto se transcriben en el núcleo y se deben importar

•Es responsable de la transcripción de genes estructurales (actina y tubulina), de los genes del miniexon (ARN-ME o SLRNA) y otros snARN

• Bajo nº de promotores y diferentes a otros eucariotas

•No hay gran regulación en el inicio de la transcripción

•Expresión constitutiva

•Sin intrones (excep Poli(A) polim. de T.brucei, T.cruzi)

• Transcripción policistrónica

•la finalización de la transcripción al final del policistrón no está caracterizada aún

• mRNA maduro monocistrónico: capping, poli(A)

ARN polimerasa II (presenta dominio CTD)

SL-RNA T...TT...T

-60 -30 Pol II

Promotores de ARN Pol II

Como no existen evidencias de promotores clásicos de ARN pol II, se ha sugerido que inicia la transcripción al azar

Se conoce:-Secuencias consenso en promotores para miniexon-Proteínas de unión a promotor del miniexon

PBP2PBP1

3 subunidadesuna TBP-like

Evidencia que reclutala pol II

Los promotores se encuentran en el 5’ de cada copia (bipartita)

Finalización?(semejante a bacteria: rho-independiente)

•Todos los ARNm estudiados comienzan con la misma secuencia de 30-40 nt -> miniexon (ME - SL)

•Esa secuencia no se encuentra en las vecindades del gen que está siendo analizado

•Existen 100-200 genes para ME por núcleo en tandem

•c/u está presente en un repetido de aprox 1,3 kb

•Su transcripto presenta Cap 4 (m7G, metilaciones 2’OH ribosas 1-4 y metilaciones en las bases 1 y 4) y es monocistrónico

Procesamiento del pre-ARNm / Trans-splicing

ADN

El El transtrans-splicing es un mecanismo utilizado para generar -splicing es un mecanismo utilizado para generar ARNm maduro para ser exportado del núcleoARNm maduro para ser exportado del núcleo

trans-splicing y poliadenilación están acoplados

TransTrans-splicing alternativo: se describió para LYT una proteína de -splicing alternativo: se describió para LYT una proteína de asociada con la virulencia. La diferncia son 28 aa en el N-t: La > es asociada con la virulencia. La diferncia son 28 aa en el N-t: La > es de membr (fase virulenta) la menor está en el kinetoplasto.de membr (fase virulenta) la menor está en el kinetoplasto.

Transcripción de genes para proteínas es constitutiva

No existen factores que regulen la iniciación de la transcripción

Regulación se debe dar luego del inicio de la transcripción

ElongaciónME/poli(A)

3’UTRtraduccional

estabilidad de la proteína

transcripto policistrónico Maquinaria de procesamiento de ARNm

ARN polimerasa encargada de la elongación

Control sobre secuencias intergénicas

Podría ser más eficiente si se cambia la elección de un gen en un ARN Podría ser más eficiente si se cambia la elección de un gen en un ARN pre-existente que en el ADN ya que se debe reclutar reguladores pre-existente que en el ADN ya que se debe reclutar reguladores específicos (aunque esto implique una gran degradación del específicos (aunque esto implique una gran degradación del transcriptoma)transcriptoma)

3’UTR de PRO: Estabilidad / Degradación

MEME AAAAA AAAAA nn

5’ UTR5’ UTR 3’ UTR3’ UTR

MEME AAAAA AAAAA nn

AAAAME

MEME AAAAA AAAAA nn

AAAAME

Se cree que estos factores externos actúan sobre elementos en el 3’UTRSe cree que estos factores externos actúan sobre elementos en el 3’UTR

Factores que regulan la producción de ARNm de PRO también regulan opuestamente el sitio activo de transcripción de la VSG

27ºcitrato

37ºno-citratoTranscripción Transcripción

basalbasal

Editado• Modificación de la información génica codificada en el ADN.

• Se adicionan o se remueven bases del ARNm.

• Generalmente se introducen o se sacan “U”

• Se corrige el marco de lectura

• Ocurre en la mayor parte de los ARN mitocondrial.

Simple: número pequeño de U en el extremo 5´ cox2 en T.brucei Extensa: 60% del ARNm maduro no codificado por el gen

> 50% de los genes de T. brucei mitocondriales, ej. Cox3

- En mitocondrias de Trypanosoma:

la citocromo oxidasa subII (coxII) que tiene insertadas 4 U

que cambian aminoácidos y además cambia el marco de

lectura. Como no existe otro gen, las U fueron agregadas

luego de la transcripción

- Mecanismo: se encontraron ARN-guías, que contiene una secuencia

complementaria del transcripto

Acción de la TUTasa usando pool de UTP de la célula

Endorribonucleasa y ligasa (ATP)

Eucariotas inferiores:

• Todos los gRNA tienen su propio gen en el minicírculos mitocondriales (salvo el 3’ de COXII)

•Son pequeños (40-70nts) y no sufren edición.

•El extremo 5’ de cada gRNA es complementario a la secuencia cercana a la región editada hacia el 3’ del mRNA.

•El extremo 3’ de los gRNAs tienen una cola de U (5-15nts), que es agregada por una terminal uridil transferasa (TUTasa).

•La secuencia intermedia contiene una secuencia que es complementaria a la porción editada del mRNA. (AU, GC y GU)

CARACTERÍSTICAS DE LOS gARN

Armar marcos de lectura:

- crear codón de inicio y de terminación,

- establecer marcos de lecturas funcionales

La edición es esencial para la diferenciación en T. brucei

Las cantidades relativas de ARNm editado y sin editar varía en los diferentes estadios (mecanismo de regulación?)

Algunas consideraciones del editado

RNA editing mechanism

pre-mRNA

gRNAuuuupoly-U tail

Variación antigénica

T. brucei:Inmunofluorescencia de formas sanguíneas usando anticuerpos contra la VSG 221 (verde) o la VSG VO2 (rojo).

• Glicoproteínas variables de superficie que constituyen una cubierta densa e inmunogénica de la membrana plasmática (107 por organismo)

• Son grandes 450-500kDa

• Sólo una se expresa por vez

• El cambio de expresión de VSG se realiza en forma espontánea (1 cada 100 por generación)

• Existen aproximadamente 1000 potenciales variantes por organismo

Variant surface glycoprotein (VSG)

• Los sitios de expresión están ligados a telómeros

• Existen aproximadamente 20 sitios de expresión

• El sitio activo de expresión aparentemente no se encuentra en un cuerpo nucleolar

Sólo una se expresa, es decir que sólo se expresa la copia ELC que está localizada en el sitio de expresión que está bien cerca del telómero

• Cada cambio se acompaña de un pico de parasitemia

1. Southern blot: ADN de distintas poblaciones del parásito, Digestión con enzimas de restricción, Electroforesis en gel de agarosa, Transferencia a membrana de nylon, Hibridización.

2. Hirbridización con un ADNc de una población (pej. b)

a b c d ...etc

Copia Básica (BC)

Copia ligada a la expresión (ECL)

Más del 50% de los genes VSGs siguen este patrón

Genes VSG: copia ligada a la expresión (ECL)

Cada VSG es codificado por una copia básica que puede encontrarse a 5-15kb del telómero (teloméricos) o >50kb del telómero (internos)

VSG(tel-inact)

VSG(interno)

VSG(tel-act)

Expresión algo programada (aparentemente involucra a la cantidad de repetidos de 70pb)

VSG(tel-inact)

VSG(interno)

VSG(tel-act)

VSG(tel-inact)

VSG(interno)

VSG(tel-act)

VSG(tel-inact)

VSG(interno)

VSG(tel-act)

VSG(tel-inact)

VSG(interno)

VSG(copia-act)

VSG(tel-act)

VSG(tel-inact)

VSG(interno)

VSG(tel-act)

VSG(interno)

VSG(tel-inact)

La formación del ELC ocurre por conversión génica

Existen muchas copias del gen VSG en el genoma. Existen muchas copias del gen VSG en el genoma.

La mayoría de los genes VSG son pseudogenes: La mayoría de los genes VSG son pseudogenes: recombinación puede generar nuevos genes VSG recombinación puede generar nuevos genes VSG aumentando la variabilidad.aumentando la variabilidad.

Esta nueva información la guarda temporariamente Esta nueva información la guarda temporariamente cambiando el sitio de expresióncambiando el sitio de expresión

Aparentemente el silenciamiento de los otros sitios de Aparentemente el silenciamiento de los otros sitios de expresión y la recombinación son independientesexpresión y la recombinación son independientes

Otro ejemplo es la bacteria Borrelia hermsii que causa la fiebre recurren-te en el hombre. Esta bacteria sobrevive alterando una proteína de superficie (VMP), que están asociados con rearreglos en el genoma. El gen VMP activo está localizado cerca del telómero de un plásmido lineal.

3000pb

Región transpuesta

Repetidos cortos?8kb40kb

5’ 3’ TELOMERO

VSG1500pb

(CCCTAA)n