TRANSFECCIONES II

Biología Molecular 2009

Viernes 22 mayo

Interacción de proteínas:Doble híbrido en células de levaduras

pAD

pBD

Plásmidos reporteros

Interacción de proteínas:Doble híbrido en células de mamífero

pBIND

pACT

pG5/luc

Ejemplo de resultados

Enriquecimiento de transfectantes

• Cell sorting

Cotransfectando con vectores de expresión para GFP o proteínas de membrana que sean reconocidas por Ac-fluorescentes

Transfección estable

• Por integración• Por recombinación homóloga• Como episoma

• Requiere de un marcador de selección en el vector

• Util para estudios que impliquen inducción de la expresión

Marcadores de selección eucariontes

• Agent Action Marker Gene

• Blasticidin S Inhiben síntesis BlasticidinS deaminase• Hygromycin B proteica Gen hyg o hph • Puromycin• G-418 Neomycin phosphotransferase• Zeocina Intercalante del DNA gen Sh ble, se une • MTX Inhibits DNA syn. Dihydrofolate reductase

Marcadores de selección

• G418 (Geneticina)– Bloquea la traducción– La resistencia es la neomicina fosfotransferasa ( Neor )– Para células de mamífero, plantas y levaduras

• Zeocina - Antibiótico de la familia bleomicina - Cliva el DNA - El producto del gen ble se une e impide el pegado al DNA. -de amplio espectro (mamíferos, levaduras y bacterias)

Sistema reprimible por tetraciclina

Sistema inducible por tetraciclina

Vector de expresión del regulador

Vector de expresión del regulador

Vector de clonado del gen de interés

Vector de expresión para dos genes regulados por tet

Vector episomal

Sistema de recombinación homóloga

• Flp-in Invitrogen: Recombinación sitio específica de Saccharomyces cerevisiae

• Sitio FRT (Flp recombination target)• Recombinasa Flp

Vector que contiene el sitio FRT

Pasos de recombinación homóloga

1- Generar línea que posea el sitio FRT

Vector de clonado del gen de interés

Vector de clonado del gen de interés

Vector de expresión de la recombinasa

2- Cotransfectar con vector con gen de interés y vector de expresión para recombinasa

Resultado

Disminuir expresión de un gen

-Ribozimas

aaaaa--------auucg--------ccguuua--------uaagc-- ggcaaau----

cDNA

ribozima

Clivado del mRNA blanco

-Antisentido

aaaaa----------------caaucggccccuucguuua----gttagccggggaagcaaat

1-Oligonucleótido pequeño simple cadena (15 -25 bases)

Degradación por RNAsa del híbrido RNA/DNA

Disminuir expresión de un gen

cDNA

aaaaaa5’ 3’a b c

2- Síntesis de un RNA antisentido complementario al gen blanco.

a’ b’ c’

mRNA

Degradación por RNAsa del híbrido RNA/RNA

Disminuir expresión de un gen

Síntesis in vitro

• Síntesis química

• Transcripción in vitro

• Digestión de los dsRNA por RNase III/DICER

Expression in vivo

• Plásmidos

• Templados para PCR (cassette de expresión siRNA)

• Vectores virales

-RNAi (siRNA)

Clivado del mRNA blanco

aaaaa----------------caaucggccccuucguuua----

guuagccggggaagcaaau auuugcuuccccggcuaacRNAi(30 a 50 nucleotidos)

mRNA

a) Síntesis

b) cDNA

Degradación por RNAsa

Procesados por la maquinaria celular (dicer…)

Estrategias siRNA

Expresión de siRNA in vivo

Promotor/Enhancer

• • Pol III (U6, H1)

• • Pol II (CMV)

Secuencia de terminación• Pol III: string of 3-5T’s)Señal de poly(A) SV40

siRNA TempladoTemplado para cadenas sense , hairpin y antisense del siRNA

Vector siRNA

Vectores Plasmídicos

Expresión transiente

• No se trabaja con RNA

• Produce gran cantidad de vector

• Enriquecimiento de células transfectadas por sorting o selección

Expresión Estable (marcadores de selección)

• Produce líneas estables

• Animales transgénicos

Vectores múltiples siRNA

Vectores múltiples siRNA

Control siRNA

Bibliotecas siRNA

Diseño del experimento

Diseño del experimento

Bibliotecas siRNA: ejemplo

Bibliotecas siRNA: ejemplo

Bibliotecas siRNA: ejemplo