UNIVERSITÀ - OSPEDALE di PADOVA

MEDICINA NUCLEARE 1

Medicina Nucleare “in Vitro” o metodicheradionuclidiche “non imaging”

Lezione 7:Lezione 7:

GeneralitGeneralità sul RIAà sul RIA

D. Cecchin, F. BuiD. Cecchin, F. Bui

Diverse Diverse ““tipologietipologie”” di RIA ? di RIA ?1) DOSAGGIO ALL’EQUILIBRIO: E la metodica più spesso utilizzata econsiste nell’incubare simultaneamente antigene non marcato, antigenemarcato ed anticorpo.Schema: AB + AG + AG*

2) DOSAGGIO PER COMPETIZIONE DI LEGAME: In un primo tempo siincubano antigene marcato e anticorpo. Il complesso (AB+AG*) viene poiincubato con l’antigene non marcato (che spiazza in parte il marcato).Schema: AB + AG*

ABAG* + AG

3) DOSAGGIO SEQUENZIALE: Si incubano, in eccesso di anticorpo,antigene non marcato e anticorpo. Successivamente viene aggiuntol’antigene marcato che satura i restanti siti anticorpali liberi. Pur essendogeneralmente piu’ sensibile, il range di concentrazioni misurabili e’ moltoridotto.Schema: AB + AG

ABAG + AG*

Conte Conte aspecifiche aspecifiche o Bianco (NSB)o Bianco (NSB)In una situazione ideale (utopica) si riescono a separare perfettamentefrazione legata (ABAG e ABAG*) e frazione libera (AB, AG, AG*).Purtroppo nella realtà una quota della frazione libera non è separabile dallafrazione legata. La quota di antigene marcato libero che resta assieme allafrazione legata da’ dei conteggi aspecifici (perche’ c’e’ solo l’antigenemarcato ma non e’ legato ad un anticorpo).

Tali conteggi vengono anche definiti bianco o conte aspecifiche

Perchè questo fenomeno ?• Piccole quantita’ della frazione libera restano intrappolate nel precipitato

ed e’ difficile anche con buoni lavaggi eliminarla totalmente.• L’isotopo radioattivo puo’ avere contaminanti radioattivi che non si

legano all’antigene ma restano in soluzione e contribuiscono ai conteggiaspecifici. A tal proposito esistono i controlli di qualita’ per il tracciante.

• Adsorbimento alla parete della provetta. Per questo sono stati sviluppatimateriali che minimizzino l’adsorbimento.

• Utilizzo di tecniche sbagliate o poco efficaci per la separazione.

Metodi di separazioneMetodi di separazione

La separazione e’ quella procedura che serve a separare lafrazione libera da quella legata. Se il metodo fosse perfetto laseparazione avrebbe le seguenti caratteristiche ideali:

1) Non essere influenzata dalle sostanze presenti nel siero.2) Separare completamente frazione libera e legata.3) Non interferire con la reazione antigene anticorpo.4) Essere rapida, semplice ed economica.

Come e’ evidente un metodo che soddisfi a tutte questecaratteristiche non esiste. Non resta allora che scegliere divolta in volta il metodo di separazione più efficace.

Separazione: precipitazione Separazione: precipitazione aspecificaaspecificaPrecipitazione non specifica della frazione legata (complessi ABAG eABAG*) con sali e solventi: il PEG (polietilenglicole), l’etanolo, il solfatod’ammonio ed altre sostanze trasformano la frazione legata da solubile adinsolubile provocandone quindi la precipitazione. La frazione libera restainvece solubile e viene quindi eliminata.Come e’ intuitivo e’ importante trovare un giusto equilibrio dellaconcentrazione di sali e solventi in modo tale che precipiti solo la frazionelegata e non anche quella libera.Le concentrazioni consigliate (che variano pero’ con il kit) sono:40-50% per il solfato d’ammonio.12-20 % per il polietilenglicole.30-50% per l’etanolo.Tale tecnica e’ rapida, semplice, economica e riproducibile ma e’ gravata dauna certa precipitazione della frazione libera e da una incompletaprecipitazione di quella legata. Inoltre dipende da pH, temperatura econcentrazione proteica. Se si aumenta la concentrazione di sali e solventiinoltre aumentano molto le conte aspecifiche (bianco).

Separazione: Separazione: immunoprecipitazioneimmunoprecipitazioneImmunoprecipitazione dei complessi (tecnica del doppio anticorpo):Un secondo anticorpo diretto contro l’anticorpo della prima reazione viene“aggiunto alla miscela”. Si ha la formazione di grossi complessi insolubiliche precipitano (AB1AG* + AB1AG + AB2 = AB1AG*AB2 o AB1AGAB2).Tale tecnica viene anche definita postprecipitazione.La preprecipitazione invece consiste nel far reagire i due anticorpi e solo inun secondo momento aggiungere l’antigene. Questa seconda tecnica hauna minore sensibilita’ perche’ spesso il legame fra i due anticorpiinterferiscce con il legame antigene-anticorpo.L’immunoprecipitazione e’ specifica, separa bene frazione libera e legata ede’ indipendente da temperatura e pH tuttavia servono due anticorpi emolti passaggi in piu’ il che richiede tempo, denaro ed e’ indubbia possibilefonte di errori analitici. Talora inoltre alcune proteine possono crossreagirecon il secondo anticorpo

Una variante della tecnica del doppio anticorpo prevede la combinazionecon la tecnica del gel. In altre parole si aggiunge PEG in bassaconcentrazione 5%-6% al fine di accelerare la precipitazione dei dueanticorpi.

Separazione: Separazione: Adsorbimento Adsorbimento su fase solidasu fase solidaAdsorbimento dell’anticorpo su fase solida (es provette sensibilizzatecon l’anticorpo): Provette di materiale plastico (polistirene, polivinile opolipropilene) vengono lasciate a contatto dell’anticorpo per molte ore. Unlegame non covalente, aspecifico, idrofobico lega gli anticorpi alla paretedelle provette. Si utilizzano poi i supporti cosi’ preparati per la reazioneimmune. Si noti che affinche’ una proteina venga adsorbita con un legameidrofobico ad una parete e’ necessario un pH tra 8.5-10 per le IgG, unagiusta concentrazione di sali (forza ionica), la temperatura intorno ai 20gradi e due ore di tempo. Le provette vanno conservate a 4 gradi. Quandoi successivi passaggi lo consentano si possono trattare le provette conglutaraldeide che trasforma il legame da idrofobico a covalente.L’adsorbimento su fase solida quindi pur essendo efficace è gravato dallecondizioni suddette e da altri svantaggi: Ha dei limiti con grossi ormonipolipeptidici (che” fanno fatica” a spostarsi in soluzione fino alle pareti dellaprovetta), servono grosse quote di anticorpo ed esiste un limite fisico stericoal numero di anticorpi legabili (per non ostacolare la reazione antigeneanticorpo) .Oltre alle provette l’anticorpo puo’ essere legato a molti altrimateriali: particelle (polimeri di polisaccaridi e grani come il Sephadex),dischi di carta o vetro, cellulosa attivata ( con bromuro di cianogeno) ecc

Separazione: Separazione: Adsorbimento Adsorbimento su fase solidasu fase solidaAdsorbimento non specifico dell’antigene:Il DCC o carbone attivato destrano ha una superficie irregolarein grado di adsorbire molecole in modo diverso a seconda dellaloro massa e carica. Se, quindi massa e carica di frazionelibera e legata sono abbastanza diverse il carbone lega lafrazione libera e viene eliminato lasciando in soluzione lafrazione legata.Anche talco, silice, idrossiapatite e resine a scambio ionicofunzionano in modo analogo.L’adsorbimento non specifico, quando possibile, e’ una tecnicasemplice riproducibile, che richiede un solo passaggio edeconomica. Tuttavia e’ influenzata da pH, temperatura, forzaionica e concentrazione proteica (standard controlli ecampioni devono avere una concentrazione proteica moltosimile).

Separazione: Filtrazione e Proteina ASeparazione: Filtrazione e Proteina A

Filtrazione su gel (e cromatografia ed elettroforesi): Un gelcomposto da destrani polimerizzati (es Sephadex) ha laproprietà di “imprigionare” nella sua trama la frazione libera. Lafrazione legata che è piu’ grande e pesante invece attraversa ilgel. La tecnica non è semplice e viene utilizzata di rado.

Proteina A: La proteina A è una costituente della parete delloStafilococco Aureo. Ha la peculiarità di legare il frammento Fcdella maggior parte delle immunoglobuline G (IgG) deimammiferi. Tale sito è importante perchè è lontano dal sito dilegame con l’antigene (e’ una tecnica simile a quella del doppioanticorpo).

UNIVERSITÀ - OSPEDALE di PADOVA

MEDICINA NUCLEARE 1

Medicina Nucleare “in Vitro” o metodicheradionuclidiche “non imaging”

Lezione 7:Lezione 7:

GeneralitGeneralità sullà sull’’IRMAIRMA

D. Cecchin, F. BuiD. Cecchin, F. Bui

Definizione:Definizione:La tecnica IRMA è simile concettualmente al RIA mavengono marcati gli anticorpi e non gli antigeni. Si lavorain eccesso di anticorpo. L’impulso alla tecnica fu lapossibilità di ottenere anticorpi monoclonali con la tecnicadegli ibridomi (si fonde una cellula di mieloma con unlinfocita, che produce una specifica immunoglobulina,ottenendo un ibridoma. Si inietta poi tale ibridoma nelperitoneo del topo. In tale sede si forma una coltura di celluledi mieloma che riversano anticorpi monoclonali nel liquidoascitico che risultano facilmente prelevabili).Proprio perchè utilizza anticorpi monoclonali (come talispecifici e provenienti da una sola linea cellulare) l’IRMA e’in genere piu’ sensibile del RIA.E’ un metodo non competitivo. Si ottiene una curva doserisposta dove i conteggi crescono linearmente con l’aumentodella concentrazione dell’analita in esame

Metodologia: IRMA Metodologia: IRMA ““SandwichSandwich””Si utilizzano due diversi anticorpi diretti contro due diversiepitopi dell’antigene. Uno dei due e’ legato in fase solida, ilsecondo e’ marcato con un isotopo (I-125).

La procedura prevede:a) Il campione del paziente viene aggiunto ad una provettadove c’e’ l’anticorpo legato in fase solida.b) Incubazionec) Si lava l’eccesso di liquido e si aggiunge il secondoanticorpo marcato con un isotopo (I-125)d) Si forma un “sandwich” AB-AG-AB(I125) adeso alla parete.e) Si lava e si conta la fase solida.

Metodologia: IRMA ClassicoMetodologia: IRMA ClassicoL’IRMA possiede, come detto, il vantaggio della maggioresensibilita’ ma e’ gravata dall’effetto hook che consiste neldistacco dei complessi AB-AG legati in fase solida ed ilformarsi di complessi AB-AG-AB(I125) in soluzione (nonlegati alla parete) che vengono lavati via.

IRMA “classico”:Si fanno reagire anticorpo marcato ed antigene in soluzione.Passo poi la soluzione cosi’ ottenuta in una provetta che haadesi alla parete antigeni. L’anticorpo marcato non legato sileghera’ alle pareti lasciando in soluzione la frazione legata.