Tvorba protilátok

Biosyntéza protilátokNA ÚROVNI ORGANIZMU• IMUNIZÁCIA

– v prirodzených podmienkach – umelé podanie antigénu (vakcinácia, experimentálna imunizácia)– aktívna: podanie antigénu (prevencia)– pasívna: podanie protilátok, resp. lymfocytov (liečba)

• IMÚNNE a HYPERIMÚNNE SÉRA (ANTISÉRA)• ADJUVANTNÉ LÁTKY

– hydroxid hlinitý – Freundovo adjuvans (FA)

• kompletné: olej + emulgátor + mykobaktérie• nekompletné: olej + emulgátor

Biosyntéza protilátokNA BUNKOVEJ ÚROVNI• T-NEZÁVISLÉ ANTIGÉNY

B-LYMFOCYT PLAZMATICKÁ BUNKA PROTILÁTKY• T-ZÁVISLÉ ANTIGÉNY

BUNKA PREZENTUJÚCA ANTIGÉN (APC)

POMOCNÝ TH-LYMFOCYT B-LYMFOCYT PLAZMATICKÁ BUNKA APC– primárne: makrofágy, monocyty, dendritové bunky,

Langerhansove bunky kože, B-lymfocyty– sekundárne: endotelové bunky ciev, epitelové bunky, čreva

NA MOLEKULOVEJ (GÉNOVEJ) ÚROVNI

Protilátková odpoveď

Protilátková odpoveď

IgG - pri sekundárnej odpovedi na rozpustné a T-závislé antigényIgM - pri primárnej odpovedi na korpuskulárne a T-nezávislé (aj pri sekundárnej

odpovedi) antigény

Dozrievanie a selekcia B-lymfocytov

Spolupráca pri T závislých antigénoch

Exogénna prezentácia antigénu

Endogénna prezentácia antigénu

Porovnanie prezentácie antigénuendogénna cesta exogénna cesta

Ingescia antigénu

syntéza antigénu, väzba s ubikvitínom, vsunutie do proteazómu

pohltenie antigénu endocytózou, vznik endozómu

Degradácia antigénu

enzýmová degradácia v proteazóme (8-9 AK)

degradácia proteolytickými enzýmami v endozóme, (12-25 AK)

Väzba fragmentov na molekuly HLA

prenos fragmentov na ER (HSP70, HSP90), presun cez membránu ER (TAP) k HLA-I a väzba

prenos fragmentov z endozómu do post-Golgiho vakuoly (HSP70) a ich väzba na HLA-II

Transport a zabudova-nie do membrány

transport trojkomplexu (α + β2m + nadviazaný peptid) na povrch bunky, expozícia peptidu

transport 9-molekulového komplexu (γ-trimér x 3 αβ-diméry) do GA, disociácia αβ-dimérov a γ -reťazcov, väzba peptidu na αβ-diméry, transport do membrány bunky, expozícia peptidu

Porovnanie rozpoznanie antigénu

Aktivácia T-lymfocytov

rozpoznanie peptidu TC-lymfocytmi a ich aktivácia (IL-2), vylúčenie perforínov a proteolytických enzýmov na povrchu bunky, lýza bunky BUNKOVÝ typ imunity

rozpoznanie peptidov TH-lymfocytmi, sekrécia IL-4, IL-5, IL-6 a IL-10, vývoj B-lymfocytov na plazmatické bunky, produkcia protilátok PROTILÁTKOVÝ typ imunity

Degradácia proteínov

Príprava MHC na prezentáciu

Teórie o tvorbe protilátokTEÓRIA BOČNÝCH REŤAZCOV• P. Ehrlich (1900)INŠTRUKČNÉ TEÓRIE• templátová teória – Breinl a Haurowitz (1930) • teória variabilného pozohýnania – L. Pauling (1940) SELEKČNÁ TEÓRIA• prirodzená selekčná teória – N.K. Jerne (1955)

hypotéza “jeden gén = jeden polypeptidový reťazec”• klonovo-selekčná teória – M.F. Burnet (1959)ZÁRODKOVÁ (GERMINÁLNA) TEÓRIA – J. Bennett a W. Dreyer (1965)• hypotéza “dva gény = jeden polypeptidový reťazec”, V a C domény• dôkaz: “dva gény = jeden L-polypeptidový reťazec imunoglobulínu”

(S. Tonegawa a N. Hozumi, 1976)SOMATICKÉ TEÓRIE• somaticko-mutačná teória – M. Cohn (1970) • somaticko-rekombinančná teória – Gally a Edelman (1972)

Ehrichova teória bočných reťazcov

1. syntéza viacerých receptorov

2. naviazanie antigénu na receptor

3. rozmnoženie receptorov na povrchu bunky

4. uvoľnenie receptorov – syntéza protilátky

Paulingova inštrukčná teória

A, C – väzbové miesta

ABC – dobre tvarovateľný reťazec

Mechanizmy rozmanitosti protilátok

Mechanizmus Jeho vyjadrenie

Zárodkový Existencia mnohých subgénov schopných utvoriť komplexný V-gén

Rôzne rekombinácie V(D)J

Rôzne rekombinácie VH a VL

Rôzne možnosti spojenia subgénov VL-JL, VH-D, D-JH

Rozmanitosť sekvencií N-oblastí

Čítanie D-subgénov podľa troch rôznych rámov

Mutačný Somatické bodové hypermutácie

Rekombinačný

Spojovací

Gény kódujúce imunoglobulínyKOMPLEXNÉ GÉNY, rozštiepené, nespojité, segmentované• zložené štruktúrne gény vznikajúce preskupovaním (rearrangement)

subgénovTRANSLOKÓNY - Lκ, Lλ a H• rodiny génov umiestnené na 3 rôznych chromozómoch (22, 2, 14)• typická exónovo-intrónová štruktúra

(intróny – nekódujúce, exóny – kódujúce)

ĽAHKÉ REŤAZCE: V, J subgény (V-doména) + C gény (C-doména)ŤAŽKÉ REŤAZCE: V, D a J subgény (V-doména) + C gény (C-doména)

V – variabilný segment: V-doména, CDR1, CDR2 (95 N-koncových AK)D – segment rozmanitosti (diversity)

1-15 AK od 95. pozície obsahuje aj CDR3J – spojovací segment (joining)

13-17 AK, kóduje poslednú AK CDR3, VL a CL alebo VH a CH1L – vedúca sekvencia (leader sequence)

slúži na transport do endoplazmového retikula

Kombinácie V D JH Lκ Lλ

V 51 40 31D 25 0 0J 6 5 4

kombinácie V-D-J

51 x 25 x 6 = 7650 40 x 5 = 200 31 x 4 = 124

kombinácie H a L

7650 x (200 + 124) = 2,48.106

výpočet na základe zárodkového a rekombinančného mechanizmu

V BASE databáza ľudských imunoglobulínových génovhttp://vbase.mrc-cpe.cam.ac.uk/

Myšacie gény

Diferenciácia B-lymfocytov

PLAZMATICKÁ BUNKA

(plasma cell)

PRESKUPENIE V-GÉNU

nezávislé od antigénu (fet. pečeň, kostná dreň)

PREŠMYK TRIED (class switching)

závislé od antigénu (periférne lymfoidné

orgány)

a

b

c

d

f, g

e

KMEŇOVÁ BUNKA PLURIPOTENTNÁ HEMOPOETICKÁ

(stem cell)

VDJH VJL

IgM

VDJH VJL

IgM

IgD

DJH

VDJH (µ)

PRO-B-BUNKA (pro-B-cell)

PRE-PRO-B-BUNKA (commited cell)

PRE-B-BUNKA (pre-B-cell)

PANENSKÁ B-BUNKA

(immature cell)

B-BUNKA s 2 receptormi (mature cell)

VDJH VJL IgG

Ag

Diferenciácia B-lymfocytovPRESKUPENIE V-GÉNU• expresia B220: znak B-buniek a ich prekurzorov (a)• preskupenie génov ťažkého VH-reťazca (b)• preskupenie génov ľahkého VL-reťazca (c)• zmeny v procesovaní RNA (d)

PREPNUTIE MEDZI TRIEDAMI H-REŤAZCOV • stimulácia antigénom (e)• prepnutie medzi triedami H-reťazcov (class switching)(f)• diferenciácia aktivovanej B-bunky na plazmatické bunky (g)

Prepis ťažkého reťazca

Model tvorby sekrečného a membránového reťazca

Prepis ľahkého reťazca

Prepis TCR

Počty ľudských subgénov pre TCR

Expresia imunoglobulínových génovRegulácia transkripcie

PROMÓTORY (promoters)ZOSILŇOVAČE (enhancers)TLMIČE (silencers)

Osobitosti expresie Ig génov

• exprimujú sa len v bunkách B-lymfocytovej línie• transkripcia sa môže začať len po preskupení subgénov

V-D-J• ALELOVÁ EXKLÚZIA – prejaví sa len na jednom z

párových chromozómov a len na úrovni jednej bunky• počas vývinu B-buniek sa gény pre ťažké reťazce

exprimujú skôr ako gény pre ľahké reťazce• IZOTOPOVÁ EXKLÚZIA – jedna bunka syntetizuje len

reťazec kappa (k) alebo lambda (l)• produkcia imunoglobulínov sa mnohonásobne zvyšuje,

keď B-lymfocyt dozrie na plazmatickú bunku

Produkcia protilátok bez vylúčenia alel

LL Ll lL ll

HH LHHL LHHl lHHL lHHl

Hh LHhL LHhl lHhL lHhl

hH LhHL LhHl lhHL lhHl

hh LhhL Lhhl lhhL lhhl

10 druhov protilátok t.j. „zriedenie“ špecificity účinnej protilátky na 10 %

protilátky s rozličnými väzbovými miestami sa nemôžu zúčastňovať viacväzbových interakcií

Alelová exklúzia

Izotypová exklúzia

Alelová exklúzia

aizotyp

preskupenie 1. alely Igκ

nefunkčná funkčná

preskupenie 2. alely Igκ syntéza reťazca κinhibícia expresie iných Igκ a Igλ

nefunkčná funkčná

syntéza reťazca κinhibícia expresie Igλ

preskupenie 1. alely Igλ

nefunkčná funkčná

syntéza reťazca λinhibícia expresie druhej alely Igλ

preskupenie 2. alely Igλ

nefunkčná funkčná

žiadna syntéza

Mechanizmus preskupovania subgénov V, D a J

RSS – rekombinačné signálne sekvencie

Všetky zárodkové subgény sú olemované (flanked) palindrómovým heptamérom a nonamérom (veľa A a T), ktoré oddeľuje medzerníková sekvencia (spacer sequence) obsahujúca 12 1 alebo 23 1 bp.

Spôsob rekombináciePRAVIDLO 12-23• rekombinovať sa môžu len také dva subgény, z ktorých

jeden má na 3’-konci signálnu sekvenciu s medzerníkom 23 bp a druhý má na 5’-konci sekvenciu s 12 bp medzerníkom

VL - JL, D - JH, VH - D - JH

V(D)J-rekombináza• pre-B-lymfocyty: preskupovanie imunoglobulínových

subgénov• pre-T-lymfocyty: preskupovanie subgénov V-oblastí TCR

Model rekombinačného mechanizmu

Postup rekombinácie • presné rozštiepenie oboch vlákien DNA endonukleázou,

tvorba hairpinu na kódujúcej oblasti• odstránenie nukleotidov exonukleázou (len z kódujúcich

sekvencií)• tvorba N-oblasti pomocou terminálnej

deoxynukleotidyltransferázy (TdT)• polymerizácia a ligácia: jeden reťazec sa predlžuje,

druhý sa komplementárne dosyntetizuje pomocou DNA-polymerázy a prerušené reťazce sa spoja DNA-ligázou