Upload
others
View
0
Download
0
Embed Size (px)
Citation preview
Szkoła Główna Gospodarstwa Wiejskiego
w Warszawie
Wydział Rolnictwa i Biologii
Beata Krowisz Numer albumu 118999
Udział bakteryjnych dioksygenaz z
rodziny AlkB w naprawie
egzocyklicznych uszkodzeń DNA The role of bacterial AlkB dioxygenases in repair of exocylic
DNA adducts
Praca magisterska
na kierunku Biologia
Praca wykonana pod kierunkiem
dr Agnieszki Maciejewskiej
Zakład Biologii Molekularnej IBB PAN
Warszawa, rok 2010
2
3
Pragnę serdecznie podziękować
dr Agnieszce Maciejewskiej
za promotorska opiekę, teoretyczne i praktyczne zapoznanie mnie z tematem,
pomoc i wsparcie podczas pisania niniejszej pracy magisterskiej
prof. dr hab. Jarosławowi Kuśmierkowi
za wsparcie naukowe i umożliwienie mi wykonania części doświadczalnej w Zakładzie
Biologii Molekularnej IBB PAN
4
Praca została zrealizowana w ramach polsko-norweskiego grantu nr PNRF-143-AI-
1/07.
The AlkB protein and its eukaryotic homologues – the role in DNA repair and the
possible role in cancer etiology and target in cancer therapy (Białko AlkB i jego
eukariotyczne homologi – rola w naprawie DNA i potencjalny udział w etiologii
nowotworów oraz jako cel w terapii przeciwnowotworowej).
5
Oświadczenie promotora pracy
Oświadczam, że niniejsza praca została przygotowana pod moim kierunkiem i
stwierdzam, że spełnia ona warunki do przedstawienia jej w postępowaniu o nadanie
tytułu zawodowego.
Data ..................................... Podpis promotora pracy . ............................................
Oświadczenie autora pracy
Świadom odpowiedzialności prawnej oświadczam, że niniejsza praca dyplomowa
została napisana przeze mnie samodzielnie i nie zawiera treści uzyskanych w sposób
niezgodny z obowiązującymi przepisami.
Oświadczam również, że przedstawiona praca nie była wcześniej przedmiotem procedur
związanych z uzyskaniem tytułu zawodowego w wyższej uczelni.
Oświadczam ponadto, że niniejsza wersja pracy jest identyczna z załączoną wersją
elektroniczną.
Data ..................................... Podpis autora pracy . ..................................................
6
7
Streszczenie
Udział bakteryjnych dioksygenaz z rodziny AlkB w naprawie egzocyklicznych
uszkodzeń DNA
Gen alkB jest częścią systemu odpowiedzi adaptacyjnej na środki alkilujące bakterii
Escherichia coli. Białko AlkB jest dioksygenazą zależną od α-ketoglutaranu i Fe (II).
Usuwa grupy metylowe z m3C i m
1A oraz mostki etenowe z cytozyny
i adeniny, pozostawiając natywne DNA. Homologi genu alkB znaleziono u wielu
organizmów, także u człowieka.
Badano właściwości naprawcze białka AlkB i jego homologów: SA-1A i SA-2B,
występujących u Streptomyces avermitilis. Ustalono optymalne warunki naprawy
3,N4-α-hydroksyetanocytozyny i 3,N
4-α-hydroksypropanocytozyny przez AlkB
i SA-1A. Stwierdzono, że SA-1A nie naprawia 1,N6etenoadeniny i 3N
4etenocytozyny
natomiast SA-2B nie wykazuje aktywności wobec żadnego z badanych adduktów.
Słowa kluczowe — dioksygenaza, AlkB, modyfikacje DNA, addukty egzocykliczne,
naprawa DNA
Summary
The role of bacterial AlkB dioxygenases in repair of exocylic DNA adducts
The AlkB gene is a part of the system of adaptive response to alkylating agents in
Escherichia coli. AlkB is a member of the superfamily of α-ketoglutarate- and iron-
dependent dioxygenases. AlkB removes methyl groups from m3C and m
1A, and etheno
bridges from εC and εA, restoring native DNA structure. Analogous alkB genes were
found in various organisms including humans.
Repair activity of AlkB and its homologues from Streptomyces avermitilis: SA-1A and
SA-2B was studied. Optimal conditions for AlkB and SA-1A repair of
3,N4-α-hydroxyethanocytosine and 3,N
4-α-hydroxypropanocytosine were established.
SA-1A does not repair 3,N4-ethenocytosine and 1,N
6-ethenoadenine. SA-2B activity
against the studied adducts was not observed.
Keywords — dioxygenase, AlkB, DNA modifications, exocyclic adducts, DNA repair
8
9
Spis treści
I Wstęp ........................................................................................................................ 13
I.1 Czynniki uszkadzające DNA ............................................................................... 13
I.1.1. Chlorek winylu i produkty jego metabolizmu ............................................... 13
I.1.2. Czynniki alkilujące ...................................................................................... 14
I.1.3. Czynniki oksydacyjne .................................................................................. 15
I.1.4. Produkty peroksydacji lipidów ..................................................................... 16
I.1.5. Egzocykliczne addukty zasad DNA.............................................................. 18
I.1.5.1. Etenoaddukty ......................................................................................... 18
I.1.5.2. Propanoaddukty ..................................................................................... 19
I.2. Naprawa uszkodzonego DNA ............................................................................ 20
I.2.1. Rola białka AlkB w naprawie uszkodzeń DNA ............................................ 22
I.2.1.1. Budowa białka AlkB .............................................................................. 22
I.2.1.2. Mechanizm działania ............................................................................. 23
I.2.1.3. Bakteryjne homologi AlkB .................................................................... 24
I.2.1.4. Homologi AlkB występujące u ssaków .................................................. 26
II Cel pracy ................................................................................................................. 28
III.1. Materiały ......................................................................................................... 29
III.1.1. Odczynniki ................................................................................................ 29
III.1.2. Bufory ....................................................................................................... 30
III.1.2.1. Bufory stosowane do oczyszczania białka ........................................... 30
III.1.2.2. Bufory stosowane do reakcji modyfikacji pentametrów i ich naprawy
przez badane białka............................................................................................ 31
III.1.3. Pentamery ................................................................................................. 31
III.1.4. Enzymy ..................................................................................................... 31
III.1.5. Antybiotyki ............................................................................................... 31
III.1.6. Pożywki .................................................................................................... 31
III.1.7. Aparatura .................................................................................................. 32
III.1.7.1. Aparatura do oczyszczania białek ........................................................ 32
III.1.7.2. Aparatura do reakcji modyfikacji pentametrów i ich naprawy przez
badane białka ..................................................................................................... 32
III.1.8. Inne materiały ........................................................................................... 32
III.2. Metody ............................................................................................................ 33
III.2.1. Sporządzanie buforów ............................................................................... 33
III.2.1.1. Bufory stosowane do oczyszczania białka ........................................... 33
III.2.1.2. Bufory stosowane do reakcji modyfikacji pentametrów i ich naprawy
przez badane białka............................................................................................ 33
III.2.1.3. Bufor do chromatografii wysokociśnieniowej ...................................... 33
III.2.2. Transformacja bakterii szczepu E. coli BL21 (DE3) plazmidem
pET28a/pSA ......................................................................................................... 34
III.2.3. Ekspresja białka SA-2B w szczepie E. coli BL21 (DE3) niosącym plazmid
pET28a/pSA ......................................................................................................... 34
III.2.4. Dysrupcja komórek ................................................................................... 35
III.2.5. Oczyszczanie białka SA-2B ....................................................................... 35
III.2.6. Elektroforeza w żelu poliakrylamidowym .................................................. 36
III.2.7. Oznaczanie stężenia białka metodą Bradford ............................................. 36
III.2.8. Przygotowanie substratów do reakcji naprawy przez badane białka ........... 36
10
III.2.8.1. Otrzymywanie pentamerów zawierających etanocytozynę TT(εC)TT
oraz hydroksyetanocytozynę TT(HEC)TT..........................................................36
III.2.8.2. Otrzymywanie pentamerów zawierających hydroksypropanocytozynę
TT(HPC)TT .......................................................................................................37
III.2.8.3. Otrzymywanie substratu zawierającego etenoadeninę TT(εA)TT.........37
III.2.9. Badanie aktywności białka AlkB, SA-1A i SA-2B .....................................38
III.2.9.1. Zależność naprawy od pH....................................................................38
III.2.9.2. Zależność naprawy od stężenia α-KG ..................................................39
III.2.9.3. Zależność naprawy od stężenia jonów Fe (II) ......................................40
III.2.9.4. Zależność naprawy od czasu ................................................................40
IV Wyniki ...................................................................................................................42
IV.1. Oczyszczanie białka SA-2B .............................................................................42
IV.2. Chemiczna modyfikacja pentamerów TTCTT i TTATT ..................................43
IV.2.1. Modyfikacja pentamerów zawierających cytozynę (TTCTT) .....................43
IV.2.2. Modyfikacja pentamerów zawierających adeninę (TTATT).......................45
IV.3. Badanie naprawy modyfikowanych oligomerów przez białko AlkB in vitro ....46
IV.3.1. Naprawa TT(HEC)TT ...............................................................................47
IV.3.1.1. Zależność naprawy od pH ...................................................................47
IV.3.1.2. Zależność naprawy od stężenia Fe (II) .................................................48
IV.3.1.3. Zależność naprawy od stężenia α-KG ..................................................49
IV.3.1.4. Zależność naprawy od czasu................................................................50
IV.3.2. Naprawa TT(HPC)TT ...............................................................................51
IV.3.2.1. Zależność naprawy od pH ...................................................................51
IV.3.2.2. Zależność naprawy od stężenia Fe (II) .................................................52
IV.3.2.3. Zależność naprawy od stężenia α-KG ..................................................53
IV.3.2.4. Zależność naprawy od czasu................................................................54
IV.4. Badanie naprawy in vitro modyfikowanych oligomerów przez bakteryjne
homologi białka AlkB: SA-1A i SA-2B ....................................................................55
IV.4.1. Białko SA-1A ............................................................................................55
IV.4.1.1. Zależność naprawy od pH ...................................................................57
IV.4.1.2. Zależność naprawy od stężenia α-KG ..................................................58
IV.4.1.3. Zależność naprawy od stężenia Fe (II) .................................................59
IV.4.2. Białko SA-2B ............................................................................................60
V Dyskusja ..................................................................................................................61
Aneks ..........................................................................................................................69
Spis literatury ..............................................................................................................71
Spis rysunków .............................................................................................................79
Spis tabel .....................................................................................................................81
11
Spis używanych skrótów VC (ang. vinyl chloride) – chlorek winylu
CEO (ang. chloroethylene oxide) – tlenek chloroetylenu
CAA (ang. chloroacetaldehyde) – aldehyd chlorooctowy
CRA (ang. crotonaldehyde) – aldehyd krotonowy
ACR (ang. acrolein) – akroleina
HNE (ang. trans-4-hydroxy-2-nonenal) – 4-hydroksynonenal
MDA, MA (ang. malondialdehyde) – dialdehyd malonowy
ROS (ang. reactive oxygen species) – reaktywne formy tlenu
εA – 1,N6-etenoadenina
εC – 3,N4-etenocytozyna
HEC – 3,N4-α-hydroksyetanocytozyna
HPC – 3,N4-α-hydroksypropanocytozyna
TT(εA)TT, TεA – pentamer zawierający 4 tyminy i 1,N6-etenoadeninę (εA)
TT(εC)TT, TεC – pentamer zawierający 4 tyminy i 3,N4-etenocytozynę (εC)
TT(HEC)TT, THEC – pentamer zawierający 4 tyminy i 3,N4-α-hydroksyetanocytozynę
(HEC)
TT(HPC)TT, THPC – pentamer zawierający 4 tyminy i 3,N4-α-
hydroksypropanocytozynę (HPC)
EcAlkB – dioksygenaza AlkB pochodząca z E. coli, główny przedstawiciel rodziny
białek AlkB
SA-1A – homolog białka EcAlkB pochodzący z bakterii Streptomyces avermitilis
SA-2B – homolog białka EcAlkB pochodzący z bakterii Streptomyces avermitilis
HPLC (ang. high performance / high pressure liquid chromatography) –
wysokosprawna / wysokociśnieniowa chromatografia cieczowa
MeOH – metanol
TEAA – octan trójetyloaminy
IPTG – izopropylo-β-D-tiogalaktopiranozyd
SDS – dodecylosiarczan sodu
DTT – ditiotreitol
12
13
I Wstęp
Kwas deoksyrybonukleinowy jest podstawowym nośnikiem informacji
genetycznej, determinującym budowę, metabolizm, a nawet zachowanie organizmów
żywych. Uszkodzenia DNA odgrywają bardzo ważną rolę w procesach nowotworzenia
i starzenia się, dlatego też integralność i stabilność DNA jest niezbędna dla
prawidłowego funkcjonowania komórek. Wszystkie organizmy są wystawione na
działanie czynników mutagennych, zarówno pochodzenia egzo- jak i endogennego. Do
egzogennych czynników uszkadzających DNA zalicza się substancje występujące
w środowisku naturalnym (np.: aflatoksyna B1), substancje chemiczne powstałe podczas
procesów przemysłowych (np.: chlorek winylu), promieniowanie UV i jonizujące,
czynniki alkilujące (np.: metanosulfonian metylu - MMS), składniki dymu
papierosowego. Wśród czynnikami endogennych można wyróżnić aktywne formy tlenu
powstałe w procesie oddychania tlenowego w mitochondriach, czy też produkty
peroksydacji lipidów (Śliwiński i Błasiak 2005).
I.1 Czynniki uszkadzające DNA
I.1.1. Chlorek winylu i produkty jego metabolizmu
Chlorek winylu (VC) jest związkiem chemicznym stosowanym do produkcji
polimerów i kopolimerów wykorzystywanych w przemyśle tworzyw sztucznych.
Należy do rodziny halogenowych pochodnych etylenowych. U ludzi narażonych na
długotrwałe działanie VC stwierdzono liczne zmiany naczyniowe i kostne. Już w latach
czterdziestych ubiegłego wieku obserwowano przypadki powstawania nowotworów
u ludzi wystawionych na długotrwałą ekspozycję chlorkiem winylu, dlatego też
prowadzono badania w celu ustalenia mechanizmów kancerogennego i mutagennego
działania VC i jego metabolitów (Mroczkowska-Słupska i Kuśmierek 1994).
Chlorek winylu jest metabolizowany w wątrobie przy udziale cytochromu P450
II E 1. Pierwotnym produktem utleniania chlorku winylu przez ten cytochrom jest
tlenek chloroetylenu (CEO). Jest to związek wysoce nietrwały, szybko ulega
przegrupowaniu do aldehydu chlorooctowego (CAA) oraz hydrolizie do aldehydu
glikolowego, które są związkami trwałymi. CEO i CAA reagują z kwasami
nukleinowymi i białkami. Posiadają dwie aktywne grupy funkcyjne.
W przypadku CEO są to chlor i ugrupowanie epoksydowe, natomiast w przypadku
CAA chlor i grupa aldehydowa. W wyniku reakcji z kwasami nukleinowymi oba te
14
związki tworzą etenopochodne oraz wiązania krzyżowe. Wśród adduktów zasad DNA
powstałych w wyniku działania VC można wyróżnić 7-(2-oksoetylo)guaninę (7oeG),
N2,3-etenoguaninę (N
2,3-εG), 3,N
4-etenocytozynę (3,N
4εC, εC) oraz 1,N
6-etenoadeninę
(1,N6εA, εA) (Mroczkowska-Słupska i Kuśmierek 1994).
C C
H
Cl
H
H
HOCH2
C
O
H
ClCH2
C
O
H
C C
H
Cl
H
H
O
chlorek winylu (VC)
[O]
cytochrom P-450 2E1
aldehyd glikolowy tlenek chloroetylenu
( CEO)
aldehyd chlorooctowy
( CAA)
hydroliza przegrupowanie
Rys 1. Aktywacja metaboliczna chlorku winylu (Mroczkowska-Słupska i Kuśmierek 1994)
I.1.2. Czynniki alkilujące
Do czynników alkilujących należy grupa mutagenów i kancerogenów, które
modyfikują DNA poprzez alkilację. Niektóre z tych czynników są rozpowszechnione
w środowisku, inne natomiast to produkty normalnego metabolizmu. Związki alkilujące
mogą zakłócać replikację, transkrypcję czy też sygnalizować aktywację apoptozy.
U ssaków mogą być zaangażowane w kancerogenezę, choroby neurodegeneracyjne,
procesy starzenia (Nieminuszczy J, Grzesiuk E, 2007). Czynniki alkilujące mogą
dołączać grupy metylowe i etylowe do wszystkich dostępnych atomów tlenu i azotu
w zasadach DNA produkując dużą liczbę uszkodzeń. Dwie spośród 11
zidentyfikowanych modyfikacji DNA: 3-metyloadenina (m3A) oraz O
6-metyloguanina
(O6meG), są głównie odpowiedzialne za biologiczne efekty alkilacji (Singer 1976).
Rodzaj wywoływanych uszkodzeń zależy od czynnika, mechanizmu reakcji i struktury
drugorzędowej substratu (Nieminuszczy i Grzesiuk 2007).
Ze względu na mechanizm reakcji, czynniki alkilujące można podzielić na dwie
podgrupy. Czynniki z podgrupy SN1, takie jak N-metylo-N-nitrozomocznik (MNU)
i N-metylo-N’-nitro-N-nitrozoguanidyna (MNNG), wykorzystują mechanizm
15
jednocząsteczkowy. Natomiast te z podgrupy SN2 np.: metanosulfonian metylu (MMS),
jodek metylu (MeI), bazują na mechanizmie dwucząsteczkowym. Czynniki alkilujące
typu SN1 przyłączają addukty do atomów tlenu i azotu, natomiast czynniki typu SN2
alkilują tylko atom azotu. Głównymi modyfikacjami wywołanymi przez czynniki
metylujące w dwuniciowym DNA są: m7G, m
3A, O
6meG, natomiast m
1A, m
3C, m
7A
i O4meT występują rzadziej. W jednoniciowym DNA m
1A i m
3C występują częściej niż
w dsDNA. Wśród czynników metylujących najbardziej mutagenny jest O6meG.
Modyfikacja ta w dsDNA powoduje tranzycję GC→AT (Falnes i Rognes 2003).
Jak już wspomniano, czynniki alkilujące występują nie tylko w środowisku,
mogą też mieć pochodzenie endogenne. Do takich związków można zaliczyć
S-adenozylometioninę (SAM), która jest głównym biologicznym donorem grup
metylowych oraz prekursorem grup aminopropylowych wykorzystywanych
w biosyntezie poliamin (Lu 2000). Ponieważ metylacja odgrywa niezwykle ważną rolę
w procesach odbywających się w komórce (np.: w ekspresji genów), każda zmiana
stężenia SAM może powodować zaburzenia w funkcjonowaniu komórki.
Nieprawidłowości w metabolizmie SAM mogą być przyczyną chorób wątroby,
niektórych zaburzeń neurologicznych i kancerogenezy (Lutz 1990). SAM może
spontanicznie metylować DNA. Wykorzystuje mechanizm typu SN2 i powoduje
powstawanie głównie m7G i m
3A, rzadziej O
6meG ( Nieminuszczy i Grzesiuk 2007).
Wśród czynników alkilujących występujących w środowisku, bardzo duży
wpływ na zdrowie ludzi mają nitrozoaminy będące składnikami dymu papierosowego.
Do najbardziej kancerogennych należą 4-(metylonitrozoamino)-1-(3-pirydylo)-
1-butanon (NNK), 4-(metylonitrozoamino)-1-(3-pirydylo)-1-butanol (NNAL)
i N’-nitrozonornikotyna (NNN) (Hecht 2002).
I.1.3. Czynniki oksydacyjne
W wyniku wielu procesów metabolicznych zachodzących w komórce powstają
reaktywne formy tlenu takie jak: nadtlenek wodoru, tlen atomowy czy rodnik
hydroksylowy. Związki te mogą reagować z DNA i powodować pęknięcia nici,
uszkodzenia pojedynczej zasady, tworzenie adduktów objętościowych. Termin addukty
objętościowe określa m.in.: wiązania krzyżowe oraz addukty pierścieniowe (Moller
i Tallin 1998). Wśród modyfikacji zasad azotowych można wyróżnić takie, które są
potencjalnie mutagenne oraz takie, które blokują proces replikacji. Jednym
16
z oksydacyjnych uszkodzeń hamujących replikację DNA jest glikol tyminy.
Prawdopodobnie produkty częściowego rozpadu pierścienia purynowego (FapyA
i FapyG) również mogą zablokować proces replikacji (Wallace 1994).
I.1.4. Produkty peroksydacji lipidów
Peroksydacja lipidów to proces fizjologiczny, podczas którego dochodzi do
utlenienia wielonienasyconych kwasów tłuszczowych (PUFA), będących podstawowym
składnikiem błon biologicznych. Powstałe wodoronadtlenki ulegają dalszym
przemianom, w wyniku których powstają stabilne, nierodnikowe związki zawierające
grupy funkcyjne: aldehydowe, ketonowe, hydroksylowe, karboksylowe, peroksylowe
i epoksydowe oraz węglowodory m.in. alkany i alkeny (Marnett 1999). Aktywne
chemicznie związki powstające w wyniku tych procesów, przeważnie o charakterze
aldehydów, są w stanie przemieszczać się do jądra komórkowego, gdzie reagują
z DNA. Mogą też powstawać in situ w wyniku peroksydacji lipidów chromatynowych,
głównie fosfolipidów (Matulewicz i Przybyszewski 2004).
Wśród związków powstałych w wyniku peroksydacji lipidów można wymienić
dwualdehyd malonowy (MDA), akroleinę, aldehyd krotonowy, glioksal, tlenek etylenu,
eten, propen, trans-4-hydroksy-2-nonenal (HNE), 4-hydroksyheksenal (HHE).
Wszystkie działają mutagennie i kancerogennie (Matulewicz i Przybyszewski 2004,
Pastoriza Gallego i Sarasin 2003, Plastaras i wsp. 2000). Wśród nich dużą
toksycznością charakteryzuje się HNE. Najbardziej mutagenny jest MDA (Marnett
1999, Niederhofer i wsp. 2003).
MDA jest czynnikiem mutagennym dla komórek bakterii i ssaków oraz
kancerogennym dla szczurów (Przybyszewski i wsp. 2005). Reakcje MDA z zasadami
DNA, prowadzące do powstawania adduktów, są złożone, m.in.: z powodu procesów
polimeryzacji, którym ulega ten związek. W wyniku tych procesów w komórkach
pojawiają się dimeryczne i trimeryczne postacie MDA, które również reagują
z zasadami azotowymi. Reakcja MDA z deoksyguanozyną prowadzi do powstania
struktury pirymidopurynonu, określanej symbolem M1dG. W wyniku reakcji MDA
z deoksyadenozyną i deoksycytydyną powstają związki oksopropenylowe:
N6-(3-oksopropenyl)deoksyadenozyny oraz śladowe ilości N
6-(3-
oksopropenyl)deoksycytydyny (Marnett 2002, Marnett i wsp. 2003).
17
Rys 2. Powstawanie eteno- i propanoadduktów pod wpływem produktów peroksydacji lipidów
(Przybyszewski i wsp. 2005)
Produkty peroksydacji lipidów: aldehyd krotonowy, akroleina i HNE są
przekształcane do epoksyaldehydów, które modyfikują zasady DNA tworząc
etenoaddukty. W wyniku reakcji epoksyaldehydów z DNA powstają: N2,3
etenoguanina
1,N2etenoguanina, 1,N
6etenoadenina i 3,N
4etenocytozyna. Oddziaływanie akroleiny
z zasadami azotowymi powoduje powstanie 1,N2-etenoguaniny (Golding i wsp. 1996).
Pochodna aldehydu krotonowego, 3-epoksybutanal, prowadzi do powstania 1,N6-
etenoadenozyny, 3,N4-etenocytydyny, 1,N
2-etenoadenozyny (Nair i Offerman 1985).
Natomiast pochodna HNE, 2,3-epoksy-4-hydroksynonenal (EH), w wyniku
podstawienia grup hydroksyheptanowych do guaniny i adeniny tworzy 1,N2- i N
2,3-
etenoguaninę oraz 1,N6-etenoadeninę (Sodum i Chung 1989, 1991).
18
I.1.5. Egzocykliczne addukty zasad DNA
Egzocykliczne addukty zasad DNA charakteryzują się dodatkowym
pierścieniem przy atomie azotu grupy aminowej. Uszkodzenia te, jeżeli nie są
naprawione, mogą wywoływać u ssaków różnego rodzaju choroby chroniczne
i nowotworowe. Wiele z adduktów egzocyklicznych ma pochodzenie endogenne,
prawdopodobnie jako rezultat reakcji produktów peroksydacji lipidów z zasadami DNA
(Borys-Brzywczy i wsp. 2005).
I.1.5.1. Etenoaddukty
Etenoaddukty należą do grupy egzocyklicznych adduktów zasad DNA i są
tworzone przez różne czynniki egzo- i endocykliczne takie jak chlorek winylu, aldehyd
chlorooctowy, produkty peroksydacji lipidów (Maciejewska i wsp. 2010). Powstają
w wyniku utworzenia dodatkowego pierścienia imidazolowego w strukturze cząsteczek
zasad DNA. Możliwe jest utworzenie 4 etenoadduktów: 1,N6-etenoadeniny (εA);
3,N4-etenocytozyny (εC); N
2,3-eteonoguaniny (N
2,3-εG) oraz 1,N
2-etenoguaniny
(1,N2-εG) (Barbin 2000). W reakcjach aldehydu chlorooctowego lub tlenku
chloroetylenu z adeniną i cytozyną zaobserwowano powstawanie uwodnionych form
pośrednich takich jak 3,N4-α-hydroksyetanocytozyna (HEC) (Krzyżosiak i wsp. 1979,
Kuśmierek i Singer 1982, Guengerich i Raney 1992). W DNA formy te są
przekształcane do pochodnych etenowych. W dwuniciowym DNA etenopochodne są
stosunkowo trwałe. εA może być jednak degradowane do 4-amino-5(-imidazol-2-
yl)imidazolu (β) (Yip i Tsou 1973). Natomiast 1,N2-εG może być przekształcona do
N1-2-(oksoetyl)guaniny (Akasaka i Guengerich 1999).
Pierwsze badania nad właściwościami mutagennymi etenoadduktów były
prowadzone w 1981 roku w trzech niezależnych laboratoriach i wykazały, że εA może
powodować błędy w przyłączaniu guaniny lub adeniny. Natomiast εC może wpływać
na niewłaściwe przyłączanie tyminy lub adeniny (Barbin i wsp. 1981, Hall i wsp. 1981,
Spengler i Singer 1981). Kolejne badania wykazały, że u Escherichia coli
i w komórkach nerki małpy εA powoduje tranzycję A→G oraz rzadziej transwersję
A→T i A→C. εC wywołuje w tych komórkach substytucje C→A i C→T, rzadziej
C→G. Dodatkowo εC powoduje jedno- i dwuzasadowe delecje (Basu i wsp. 1993,
Shibutani i wsp. 1996, Palejwala i wsp. 1993). HEC, podobnie jak εC, prowadzi do
tranzycji C→T u E.coli (Jacobsen i wsp. 1989, Borys i wsp. 1994). N2,3-εG in vitro
i w komórkach E.coli może wywoływać tranzycje G→A (Singer i wsp. 1983),
19
natomiast 1,N2-εG powoduje transwersje GC→TA oraz GC→CG (Langouët
i wsp.1997). Badania in vitro wykazały też, że 1,N2-εG silnie hamuje replikację
i sprzyja powstawaniu delecji i mutacji punktowych (Akasaka i Guengerich 1999).
Rys 3. Wzory chemiczne etenoadduktów powstałych pod wpływem aldehydu chlorooctowego (wg
Maciejewska i wsp. 2010)
I.1.5.2. Propanoaddukty
Propanoaddukty powstają w reakcjach produktów peroksydacji lipidów:
aldehydu krotonowego (CRA), akroleiny (ACR) i 4-hydroksynonenalu (HNE) z DNA
i obserwowane są w tkankach zawierających dużo tłuszczu, takich jak mózg, wątroba,
okrężnica (Nath i wsp. 1996). Inkubacja aldehydu krotonowego z DNA sprzyja
powstawaniu adduktów propanowych z guanozyną takich jak 1,N2-(1-hydroksy-3-
metylopropano)-2’-deoksyguanozyna. (Hecht i wsp. 2001). Akroleina i aldehyd
krotonowy tworzą też propanoaddukty z deoksycytozyną. Akroleina powoduje
powstawanie 3,N4-α-hydroksypropano-deoksycytozyny (HPC). Natomiast aldehyd
krotonowy w reakcji z deoksycytozyną tworzy 3,N4-α-hydroksy-γ-metylopropano-
deoksycytozynę (mHPC). (Borys-Brzywczy i wsp. 2005). W wyniku bezpośredniej
20
reakcji HNE z DNA powstaje głównie propanowy addukt guaniny podstawiony
łańcuchem alifatycznym (Douki i wsp. 2004). Badania in vitro wykazały, że HNE
oddziałuje z deoksynukleozydami tworząc propano- i etenocykliczne addukty
posiadające boczny łańcuch hydroksyalkilowy. Powodują one wzrost częstości mutacji
oraz hamują syntezę DNA in vitro u E. coli (Kowalczyk i wsp. 2004).
Rys 4. Wzory chemiczne propanoadduktów akroleiny i aldehydu krotonowego z deoksycytozyną
(na podstawie Borys-Brzywczy i wsp. 2005)
I.2. Naprawa uszkodzonego DNA
DNA wszystkich żywych organizmów jest nieustannie modyfikowane przez
związki pochodzenia endo- i egzogennego. Aby zachować prawidłowe funkcjonowanie
komórek, wykształcone zostały różne mechanizmy naprawy DNA, które zapobiegają
kumulacji szkodliwych mutacji w komórce.
U bakterii Escherichia coli można wyróżnić cztery mechanizmy naprawy
uszkodzeń kwasów nukleinowych spowodowanych przez związki alkilujące. Pierwszy
z nich to BER (ang. base excision repair), czyli naprawa przez wycinanie zasad.
Kolejnym jest NER (ang. nucleotide excision repair), który polega na wycinaniu
uszkodzonych nukleotydów. Trzeci mechanizm, MMR (ang. mismatch repair),
21
naprawia błędnie sparowane zasady. Ostatni sposób to naprawa bezpośrednia przez
odwrócenie np.: przez metylotransferazy (Nieminuszczy i Grzesiuk 2007).
Większość oksydacyjnych modyfikacji DNA np.: zmiany struktury chemicznej
zasady, jest naprawiana z wykorzystaniem mechanizmu naprawy przez wycinanie zasad
(BER) (Gros i wsp. 2003). Wycięcie zmodyfikowanej zasady polega na hydrolizie
wiązania N-glikozydowego pomiędzy zmienioną chemicznie zasadą a cukrem.
N-glikozylaza rozpoznaje uszkodzoną zasadę i przecina wiązanie β-N-glikozydowe
między uszkodzoną zasadą a cząsteczką deoksyrybozy, tworząc miejsce
apurynowe/pirymidynowe. Następnie endonukleaza AP rozpoznaje to miejsce i nacina
DNA w kierunku 5' od miejsca AP tworząc wolny koniec 3'-OH. Polimeraza DNA,
Pol I, wydłuża nić DNA od wolnego końca 3'-OH wykorzystując aktywność
egzonukleazy do zastąpienia nukleotydu z uszkodzoną zasadą oraz kilku następnych.
Na końcu nowa nić jest łączona ze starą za pomocą ligazy DNA (Roszkowski 2002,
Krwawicz i wsp. 2007).
Naprawa przez wycięcie nukleotydu (NER) jest bardziej złożonym procesem niż
BER oraz wymaga ATP jako źródła energii. Jest też mniej specyficznym systemem niż
BER (Wood 1996; Sancar 1996). Fragment DNA, który zawiera uszkodzenie jest
nacinany po obu stronach przez nukleazę, a następnie usuwany. U bakterii jest to
fragment składający się z 12-13 nukleotydów. W komórkach eukariotycznych fragment
ten ma długość 27-29 nukleotydów (Pietrzykowska i Krwawicz 1999; Ma i wsp. 1995).
System naprawy błędnie sparowanych zasad azotowych (MMR) usuwa głównie
błędy, które powstały podczas replikacji DNA i nie zostały naprawione przez
polimerazę DNA oraz niewłaściwe pary zasad tworzące się w wyniku rekombinacji
DNA oraz spontanicznej lub indukowanej deaminacji, utleniania bądź metylacji zasad
azotowych (Modrich i Lahue 1996).
Do naprawy DNA, oprócz skomplikowanych kompleksów naprawczych,
komórka może wykorzystywać także proste mechanizmy naprawy kwasów
nukleinowych, które nie naruszają ich integralności. Należy do nich bezpośrednia
naprawa przez odwrócenie, w której bierze udział wysoce specyficzne białko. Białko to
eliminuje dodatkowe grupy atomów bezpośrednio w miejscu ich przyłączenia. Dzieje
się tak na przykład w przypadku dioksygenazy AlkB naprawiającej 3-metylocytozynę
oraz 1-metyloadeninę (Falnes i wsp. 2002).
22
I.2.1. Rola białka AlkB w naprawie uszkodzeń DNA
Gen alkB został odkryty ponad 20 lat temu podczas izolacji mutantów E. coli ze
zwiększoną wrażliwością na czynniki alkilujące (Hataoka i wsp. 1983). Gen ten
wchodzi w skład systemu odpowiedzi adaptacyjnej na czynniki alkilujące u E. coli wraz
z genami ada, alkA i aidB. Białka Ada, Alka i AlkB naprawiają uszkodzone zasady
DNA przy użyciu różnych mechanizmów. Funkcja AidB nie została jeszcze ostatecznie
ustalona (Nieminuszczy i Grzesiuk 2007). Białko AlkB preferuje jednoniciowe DNA
jako substrat (Falnes i wsp. 2004). Badania biochemiczne wykazały, że najlepszymi
substratami dla AlkB są 3-metylocytozyna (m3C) oraz 1-metyloadenina (m
1A) (Dinglay
i wsp. 2000). Analiza bioinformatyczna wykazała, że białko AlkB należy do rodziny
dioksygenaz zależnych od Fe(II) i α-ketoglutaranu (Aravind i Koonin 2001).
I.2.1.1. Budowa białka AlkB
Badania nad strukturą przestrzenną białka AlkB wykazały, że składa się ono
z 216 aminokwasów i zawiera trzy ważne domeny. Są to:
C-terminalna domena dioksygenazowa, część katalityczna (aa 90-216)
Sekwencja NRL rozpoznająca nukleotyd (aa 46-89),
N-terminalna domena (aa 1-45) (Yang i wsp. 2008; Yu i wsp. 2006).
Rys 5. Struktura kompleksu białka AlkB z Fe(II), α-ketoglutaranem i metylowanym
trójnukleotydem (Yu i wsp. 2006). Niebieskim kolorem oznaczona jest domena rozpoznająca nukleotyd, zielonym rdzeń katalityczny, a żółtym fragment N-końcowy.
23
Wszystkie homologi AlkB posiadają motywy i reszty niezbędne dla
enzymatycznej aktywności (motyw HXD, pojedyncze H i motyw RXXXXR). U AlkB
motywy te wyglądają następująco: H131XD133………H187………R204YNLTFR210. Dwie
histydyny i kwas asparaginowy biorą udział w wiązaniu żelaza, natomiast pierwsza
arginina oddziałuje z α-KG (Wei i wsp. 1996; Aas i wsp. 2003; Kurowski i wsp. 2003).
I.2.1.2. Mechanizm działania
Białko AlkB usuwa alkilacyjne oraz etenowe uszkodzenia zasad DNA. W obu
przypadkach mechanizm naprawy odbywa się w dwóch etapach.
W przypadku naprawy modyfikacji alkilowych pierwszy etap polega na
hydroksylacji wiązania C-H w grupie alkilowej dołączonej do zasady. Wiąże się to
z oksydatywną dekarboksylacją α-ketoglutaranu, w wyniku czego następuje uwolnienie
cząsteczki bursztynianu i dwutlenku węgla. Jeden z atomów cząsteczki tlenu zostaje
wbudowany we fragment alkilowy jako grupa hydroksylowa, drugi natomiast stanowi
cześć grupy karboksylowej bursztynianu (Schofield i Hang 1999; Prescott i Lloyd 2000;
Ryle i Hausinger 2002). W ten sposób białko AlkB bezpośrednio przekształca
3-metylocytozynę i 1-metyloadeninę w cytozynę i adeninę z jednoczesnym
uwolnieniem utlenionej grupy metylowej w postaci formaldehydu. Produktami
przejściowymi w tych reakcjach są niestabilne 3-hydroksymetylocytozyna
i 1-hydroksymetyloadenina (Trewick i wsp. 2002) (Rys. 6).
Rys 6. Mechanizm naprawy uszkodzeń alkilacyjnych przez białko AlkB (Begley i Samson 2003)
W podobny sposób naprawiane są uszkodzenia etenowe. W pierwszej kolejności
mostek eteonowy utleniany jest do epoksydu, który w wyniku addycji cząsteczki wody
24
tworzy glikol. Następnie powstały alkohol uwalnia się spontanicznie w postaci
glioksalu z odtworzeniem natywnej formy zasady (Delaney i wsp. 2005) (Rys. 6).
Rys 6. Mechanizm naprawy uszkodzeń etenowych przez białko AlkB (Delaney i wsp. 2005)
I.2.1.3. Bakteryjne homologi AlkB
Van den Born i współpracownicy na podstawie analizy sekwencji bakteryjnych
białek AlkB opracowali drzewo filogenetyczne i wyodrębnili 4 grupy: 1A, 1B, 2A i 2B.
Dowiedziono, że białka z grup 1A i 2B posiadają kilka tych samych konserwowanych
ewolucyjnie aminokwasów co białka 1B, znajdujących się w regionie odpowiadającym
domenie NRL. Pozwala to przypuszczać, że te 3 grupy białek mogą oddziaływać z tym
samym substratem. (van den Born i wsp. 2009). W białkach grup 1B i 2B w domenie
N-terminalnej występują takie same konserwowane sekwencje. Również w obrębie
domeny NRL występują wspólne dla grup 1B i 2B konserwowane ewolucyjnie
aminokwasy. Nie wykazano natomiast wspólnych konserwowanych sekwencji dla
białek z grup 1A i 2A. W trakcie badań nie ujawniono podobieństwa sekwencji domeny
N-terminalnej białek z grup 1A i 1B. Przypuszcza się jednak, że zawierają one kilka
kluczowych reszt w obrębie domeny NRL, łącznie z resztami Trp69 i Tyr76. (Yu i wsp.
2006) Wykazano też, że białka z grup 1A, 1B oraz 2B uczestniczą głównie w naprawie
DNA, podczas gdy funkcją białek z grupy 2A jest przede wszystkim modyfikacja tRNA
(van den Born i wsp. 2009).
Grupa 1A
Białka z tej grupy są szeroko rozpowszechnione w królestwie bakterii,
zwłaszcza u Proteobacteria. W grupie tej znajduje się białko AlkB E. coli, a także białka
SA-1A i SC-1A występujące u bakterii z rodzaju Streptomyces. Białka te mają w 79%
identyczne sekwencje aminokwasowe i wykazują podobne właściwości. Przypuszcza
się, że grupa 1A zawiera białka o funkcji podobnej do białka modelowego dla rodziny
AlkB – EcAlkB (van den Born i wsp. 2009).
25
Grupa 1B
Białka z grupy 1B występują u β- i γ-proteobacteria, a także u cyanobacteria.
Wykazują podobieństwo do homologów AlkB występujących u kręgowców: ALKBH2
i ALKBH3, które posiadają podobną aktywność naprawczą do EcAlkB. W grupie tej
znajduje się białko XC-1B, występujące u Xanthomonas campestris i wykazujące
wysoką aktywność naprawczą. Analiza bioinformatyczna i badania doświadczalne
wykazały, że białka z grupy 1B posiadają aktywność naprawczą, a ich funkcja jest
zbliżona do EcAlkB (van den Born i wsp. 2009).
Grupa 2B
Białka z grupy 2B występują głównie u Actinobacteria. Wykazano również
występowanie tych białek u kilku patogenów roślinnych z rodzaju Xanthomonas
(γ-proteobacteria) i Burkholderia (β-proteobacteria). Bakterie te mogły nabyć geny
kodujące białka AlkB przez horyzontalny transfer genów od Actinobacteria, będących
w większości bakteriami glebowymi (Madigan i wsp. 2003). Analiza sekwencji
wykazała, że białka z grupy 1B i 2B posiadają kilka takich samych zakonserwowanych
reszt w regionie NRL. Białka z grupy 2B, takie jak: MT-2B, SC-2B, SA-2B i XC-2B
wykazują aktywność naprawczą. Ich specyficzność substratowa jest jednak dość
zróżnicowana. Białko MT-2B, w przeciwieństwie do XC-2B, wykazuje wysoką
aktywność w stosunku do uszkodzeń metylowych i niską w stosunku do etenoadduktów
(van den Born i wsp. 2009).
Grupa 2A
Białka z grupy 2A występują u proteobacteria takich jak: Agrobacterium,
Rickettsia i Rhizobium. Część z tych bakterii to patogeny roślin, które podczas inwazji
na gospodarza przenoszą fragmenty swojego DNA do komórek roślinnych.
U niektórych bakterii np.: Roseobacter denitrificans, Roseobacter etli, Sinorhizobium
meliloti, Sinorhizobium medicae, geny kodujące białka z grupy 2A znajdują się częściej
na plazmidach niż na chromosomach, co sugeruje że być może zostały one uzyskane
z genomu gospodarza (van den Born i wsp. 2009). Białka z grupy 2A wykazują dużą
homologię względem zwierzęcych i roślinnych białek ALKBH8 (Falnes i wsp. 2009).
Po analizach bioinformatycznych zasugerowano, że białka te są raczej zaangażowane
w modyfikację tRNA niż w naprawę DNA (van den Born i wsp. 2009).
26
Tabela 1. Rozmieszczenie bakteryjnych białek AlkB w kompletnie zsekwencjonowanych genomach
Liczba białek
AlkB
Grupa Liczba
gatunków
Przykłady rodzajów/gatunków bakterii
1
1
1
1
1
2
2 2
2
2
2
2
2
2 2
2
3
3
3
1A
1B
2A
2B
Razem
1A
1A+1B 1A+2A
1A+2B
1B
1B+2A
1B+2B
2A
2A+2B 2B
Razem
1A(2)+1B
1B
Razem
65
61
6
12
144
1
2 5
3
1
0
4
0
0 2
18
1
1
2
Escherichia, Salmonella, Bradyrhizobium
Shewanella, Burkholderia, Xylella
Agrobacterium, Rickettsia
Mycobacterium, Nocardia
Ralstonia metallidurans
Pseudomonas fluorescens Sinorhizobium, Rhizobium, Roseobacter
Streptomyces, Rhodococcus
Acaryochloris marina
-
Xanthomonas, Burkholderia enovorans
-
- Frankia
Burkholderia sp. 383
Flavobacterium johnsoniae
Razem 164
I.2.1.4. Homologi AlkB występujące u ssaków
Geny kodujące homologi białka AlkB wykryto nie tylko u bakterii, ale również
w DNA ssaków. U ssaków zidentyfikowano 9 homologów tego białka: ALKBH1-
ALKBH8 (Drablos i wsp. 2004; Aravind i Koonin 2001) oraz białko FTO, które jest
związane z otyłością (Gerken i wsp. 2007; Sanchez-Pulido i Andrade-Navarro 2007).
Ekspresja poszczególnych genów kodujących homologi AlkB nie jest taka sama
we wszystkich tkankach ludzkich i może wynikać z rozbieżności funkcji tych białek
(Lee i wsp. 2005). Zaobserwowano wysoki poziom hABH2 w nieproliferujących
tkankach wątroby, natomiast wysoka ekspresja hABH3 występowała w sercu, wątrobie,
prostacie i jądrach (Sedgwick i wsp. 2007).
Pierwszy ludzki homolog, hABH1, wykazuje 52% podobieństwo i jest w 23%
identyczne z EcAlkB (Mishina i He 2006). Jest funkcjonalnym mitochondrialnym
homologiem AlkB, który naprawia m3C w jednoniciowym DNA i RNA, ale nie
naprawia m1A, ani dsDNA. Aktywność naprawcza hABH1 jest niższa niż AlkB,
hABH2 i hABH3, ale nie można wykluczyć, że białko to ma jeszcze inne substraty
(Westbye 2008). hABH1 wykazuje też aktywność liazy wobec miejsc AP w DNA
(Muller i wsp. 2010).
27
Odkryto, że hABH2 jest odpowiedzialny głównie za naprawę m1A, natomiast ta
sama funkcja u hABH3 pozostaje niejasna (Ringvoll i wsp. 2006). hABH2 jako substrat
bardziej preferuje dwuniciowe DNA (dsDNA) niż jednoniciowe (ssDNA) oraz ma
niskie powinowactwo w stosunku do RNA. Tymczasem hABH3 i AlkB jest bardziej
aktywne w przypadku substratów ssDNA i ssRNA (Aas i wsp. 2003; Falnes i wsp.
2004). hABH2 i hABH3, oprócz tego że preferują różne substraty, mają też inną
lokalizację w komórce. hABH2 występuje tylko w jądrze komórkowym i uczestniczy
w naprawie DNA w pobliżu widełek replikacyjnych. Natomiast hABH3 występuje
w jądrze komórkowym i w cytoplazmie (Duncan i wsp. 2002; Aas i wsp. 2003).
W 2007 roku wielką niespodzianką było odkrycie, że związany z otyłością gen
FTO koduje funkcjonalny homolog białka AlkB (Gerken i wsp. 2007; Sanchez-Pulido
i Andrade-Navarro 2007). Wysoka ekspresja tego genu występuje w podwzgórzu,
a defekt genu FTO powiązano ze zwiększeniem się ilości tkanki tłuszczowej
w organizmie (Dina i wsp. 2007; Frayling i wsp. 2007, Scott i wsp. 2007). Białko FTO
posiada homologiczną sekwencję do białek z rodziny AlkB. Wykazano, że enzym ten
w obecności żelaza, α-KG i O2 ma zdolność do demetylacji m3T w jednoniciowym
DNA (Gerken i wsp. 2007).
Zróżnicowanie właściwości występujących u ssaków homologów białka AlkB
sugeruje, że mogą pełnić one różne funkcje w komórce (Sundheim i wsp. 2006).
28
II Cel pracy
Celem pracy było ustalenie warunków naprawy HEC i HPC przez białko AlkB
oraz określenie specyficzności substratowej homologów AlkB w stosunku do adduktów
egzocyklicznych i wyznaczenie optymalnych warunki naprawy tych uszkodzeń
w zależności od pH buforu, stężenia -ketoglutaranu i jonów żelaza. Wykorzystano tu
modyfikujące własności aldehydu chlorooctowego i akroleiny. Naprawa
powodowanych przez nie uszkodzeń przebiega w sposób bezpośredni - bez naruszania
ciągłości nici DNA. Przedmiotem badań były wyizolowane i oczyszczone białka: AlkB
oraz SA-1A i SA-2B, pochodzące od bakterii Streptomyces avermitilis.
29
III Materiały i metody
III.1. Materiały
III.1.1. Odczynniki
α-ketoglutaran (α-KG) – Fluka
Akroleina (ACR) – Fluka
Aldehyd chlorooctowy (CAA) – Fluka
Bis-Tris – Sigma
Ditiotreitol (DTT) – Sigma
Kwas octowy (CH3COOH, AcOH) – POCh
Kwas solny (HCl) – Chempur
Kwas 4-(2-hydroksyetylo)piperazino-1-etanosulfonowy (HEPES) – Sigma
Metanol (CH3OH, MeOH) – Lab-scan
Octan sodu (NaCOOH) – Chempur
Sześciouwodniony siarczan amonowo-żelazawy (NH4)2Fe(SO4)2 · 6H2O – Fluka
Trietyloamina (TEA, Et3N) – Merck
Wodorotlenek sodu (NaOH) – Stanlab
Odczynniki do elektroforezy
Żel rozdzielający (15%):
30% akrylamid - 2,5ml – Fluka
1,5M Tris (pH 8.8) – 1,3ml
10% SDS – 0,05ml
miliQ H2O – 1,1ml
10% nadsiarczan amonu (APS) - 0,05ml – Bio-Rad
N, N, N’ N’ - tetrametyletylenodiamina (TEMED) – 0,002ml - Fluka
Żel zagęszczający (4,5%):
30% akrylamid – 0,17ml
1M Tris (pH 6,8) – 0,13ml
10% SDS – 0,01ml
miliQ H2O – 0,68ml
10% nadsiarczan amonu (APS) – 0,01ml
N, N, N’ N’ - tetrametyletylenodiamina (TEMED) – 0,001ml
30
Marker
SigmaMarker™ Low Range (M.W. 6,500 - 66,000) – Sigma
Barwnik Coomasie Brillant Blue G – 250
0,2 % Coomasie Brillant Blue G – 250
10 % kwas octowy
45 % metanol
Odbarwiacz
10 % kwas octowy
25 % metanol
III.1.2. Bufory
III.1.2.1. Bufory stosowane do oczyszczania białka
Bufor sodowo-fosforanowy 160mM pH 7,4
Bufor do wiązania (BB) pH 7,4
Bufor do elucji (EB) pH 7,4
Bufor do przechowywania (ST) pH 7,4
Bufor do elektroforezy SDS-PAGE (pH 8,3)
0,125M Tris/HCl pH 8,3
0,96M glicyna
0,5% SDS
Bufor Laemmli’ego (pH 6,8)
0,25M Tris/HCl pH 6,8
50% glicerol
25% β-merkaptoetanol
10% SDS
0,05% błękit bromofenolowy
Bufor do dializy (pH 7,4)
40mM Tris/HCl pH 7,4
200mM NaCl
10% glicerol
5mM DTT
1mM PMSF
31
III.1.2.2. Bufory stosowane do reakcji modyfikacji pentametrów i ich naprawy
przez badane białka
0,5M Bis-Tris w zakresie pH 5,8 – 7,0
0,5M bufor octanowy w zakresie pH 4,2 – 5,6
0,5M HEPES w zakresie pH 6,8 – 7,8
Bufor kakodylanowy pH 6,5 – (CH3)2AsO2Na x 3H2O (BDH)
Bufor TE pH 7,8 (10mM Tris-HCl pH 7,8 + 1mM EDTA pH 8,0)
1,5M TEAB pH ok. 7-8 (węglan trietyloaminy)
Bufor do chromatografii wysokociśnieniowej
1M TEAA (octan trietyloaminy) pH ok. 6,5
30% metanol w H2O
III.1.3. Pentamery
TTATT – Metabion, Martinsried, Germany
TTCTT – Metabion, Martinsried, Germany
III.1.4. Enzymy
Plazmid niosący sklonowany gen alkB z E. coli otrzymano z pracowni prof.
Seeberga (Uniwersytet w Oslo). Plazmidy pET28a niosące sklonowane geny białek
SA-1A i SA-2B otrzymano z pracowni prof. Falnesa (Uniwersytet w Oslo). Plazmidem
transformowano szczep E. coli BL21 (DE3). Preparaty oczyszczonych białek EcAlkB,
SA-1A, SA-2B (His-tag) zostały otrzymane w Zakładzie Biologii Molekularnej IBB
PAN wykorzystując plazmid pET28a. Białka EcAlkB i SA-1A zostały otrzymane przez
dr Jadwigę Nieminuszczy, natomiast białko SA-2B zostało otrzymane przeze mnie.
III.1.5. Antybiotyki
Kanamycyna – Sigma
III.1.6. Pożywki
Pożywka LB płynna
0,5 % NaCl
0,5 % ekstrakt drożdżowy
1 % trypton
32
Pożywka LB stała
Podłoże LB płynne z dodatkiem 1 % agaru
III.1.7. Aparatura
III.1.7.1. Aparatura do oczyszczania białek
Zestaw do chromatografii niskociśnieniowej Äcta prime (Amersham)
Kolumna niklowa HisTrap (Amersham)
Spektrofotometr: Cary 3 UBV – Visible Spectrophotometer Varian
Spektrofotometr ULTROSPEC PLUS 4054 UV/VISIBLE Spectrophotometer LKB
BIOCHROM
Elektroporator: TransPorator Plus - BTX
Wirówka J2-21M/E – Beckman
Wirówka miniSpin – Eppendorf
Sonikator Branson Sonifier 250
pH-metr - inoLab
III.1.7.2. Aparatura do reakcji modyfikacji pentametrów i ich naprawy przez
badane białka
HPLC (High Pressure Liquid Chromatography) firmy Knauer na bazie systemu
podwójnego, zapewniającego gradient dwuskładnikowy, obsługiwany przez program
EuroChrom Basic Edition (wersja 3.05) i wyposażony w detektor UV.
Analityczny i preparatywny rozdział próbek prowadzono na kolumnach:
- Waters Nova-Pak® C18, 60Å, 4μm, 4,6mm x 250mm, z prędkością przepływu
1 ml/min,
- HR C18, 60Å, 6μm, 3,9mm x 300mm, z prędkością przepływu 1,75 ml/min,
z użyciem liniowego gradientu 20mM octanu trietyloaminy o pH 6,5 x 30% MeOH
w wodzie przez 30 minut i detekcją UV przy długości fali 270nm
Spektrofotometr: Cary 3 UBV – Visible Spectrophotometer Varian
Wirówka miniSpin – Eppendorf
pH-metr – MeterLab®
III.1.8. Inne materiały
bibuła 3mm – Whatman
33
folia spożywcza do przykrywania żeli
kuwety do elektroporacji – Bio-Rad
kuwety do spektrofotometrii – Medlab
papierki wskaźnikowe – MERCK
szyby 14cm x 16cm z przekładkami i grzebieniem 0,4mm
III.2. Metody
III.2.1. Sporządzanie buforów
Wszystkie bufory zostały wykonane na bazie wody dejonizowanej mQ.
III.2.1.1. Bufory stosowane do oczyszczania białka
Bufor wiążący (BB)
400ml buforu wiążącego uzyskano poprzez zmieszanie 50ml buforu sodowo-
fosforanowego z 2ml 10mM imidazolu i uzupełnienie wodą miliQ. Mieszaninę
stabilizowano kwasem solnym do pH o wartości 7,4.
Bufor do elucji (EB)
W celu sporządzenia buforu do elucji zmieszano 12,5ml buforu sodowo-
fosforanowego z 25ml 500mM imidazolu i uzupełniono wodą do 100ml.
pH ustabilizowano również do wartości 7,4. Tak przygotowane bufory BB i EB
schłodzono.
Bufor do przechowywania (ST)
Aby przygotować bufor do przechowywania zmieszano 40mM Tris/HCl,
200mM NaCl, 10% glicerolu. pH ustabilizowano do wartości 7,4.
III.2.1.2. Bufory stosowane do reakcji modyfikacji pentametrów i ich naprawy
przez badane białka
Sporządzono 0,2M bufory z przygotowanych wcześniej 0,5M buforów:
octanowego, HEPES i Bis-Tris. Do każdego dodano DTT do końcowego stężenia 5mM.
III.2.1.3. Bufor do chromatografii wysokociśnieniowej
1M octan trójetyloaminy (TEAA) o pH ~ 6,5 przygotowano w dwóch etapach.
I etap: Destylacja TEA
Kilka sit molekularnych wrzucono do kolby (o objętości 500ml) z TEA ~ 300ml
i ogrzano do wrzenia. Następnie obniżono temperaturę do 1800C. Przedgon zbierano do
34
momentu ustabilizowania się temperatury na termometrze (była nieco niższa niż 90ºC).
Następnie zebrano ok. 200ml destylatu TEA. Wyłączono transformator i pozostawiono
wszystko do wystygnięcia.
II etap
Schłodzono 1 mol (139,2 ml) świeżo destylowanej trójetyloaminy (Et3N, TEA),
1 mol (57,5 ml z 17,4M) kwasu octowego (AcOH) i 700 ml H2O mQ. Zlewkę z wodą
wstawiono w łaźni lodowej na mieszadło. Dodano TEA, który pływał po powierzchni
jak olej. Następnie powoli dodawano AcOH aż do uzyskania pH 6,5. Uzupełniono wodą
do 1000 ml i całość przesączono na sączku do HPLC.
Do rozdziałów chromatograficznych używano 20mM TEAA.
III.2.2. Transformacja bakterii szczepu E. coli BL21 (DE3) plazmidem pET28a/pSA
Dwie porcje zawierające po 100μl komórek elektrokompetentnych bakterii
szczepu E. coli BL21 (DE3) rozmrożono na lodzie. Do jednego z nich dodano 1μl
plazmidu pET28a/pSC, niosącego sklonowany gen białka SA-2B z Streptomyces
avermitilis, drugi natomiast stanowił kontrolę negatywną. Przygotowaną mieszaninę
transformacyjną przenoszono następnie do schłodzonej w lodzie kuwety. Kuwetę
wstawiono do elektroporatora i poddawano działaniu impulsu elektrycznego o napięciu
2,5 kV/cm. Do mieszaniny transformacyjnej dodawano następnie 1ml LB i inkubowano
przez 1 godz. w 37ºC w celu wyrażenia genu oporności na kanamycynę. Po
transformacji mieszaninę bakteryjną wysiano na płytki ze stałym podłożem LB
zawierającym kanamycynę o końcowym stężeniu 50 μg/ml. Płytki inkubowano przez
noc w temperaturze 37ºC. Następnie sprawdzano na płytkach obecność transformantów
oraz brak wzrostu na kontroli negatywnej.
III.2.3. Ekspresja białka SA-2B w szczepie E. coli BL21 (DE3) niosącym plazmid
pET28a/pSA
100ml płynnej pożywki LB z dodatkiem kanamycyny (50μg/ml) zaszczepiano
pojedynczą kolonią szczepu E. coli BL21 (DE3), niosącego plazmid kodujący białko
AlkB pET28a-SA-2B. Bakterie hodowano przez noc w 37ºC z wytrząsaniem 200 rpm.
Następnie hodowlę przeszczepiano na świeżą pożywkę (3 x 1 litr). 20 ml hodowli
nocnej dodano do każdej kolby zawierającej 1 litr płynnej pożywki LB z kanamycyną,
zawartość kolb połączono. Całość hodowano w 37ºC z wytrząsaniem do momentu
35
osiągnięcia gęstości OD600=0,6 (ok. 2,5 godziny) Z zawiesiny bakterii pobrano 1 ml
(kontrola nieindukowana). Resztę przeniesiono do 16ºC i hodowano przez 1 godzinę
w celu schłodzenia hodowli. Następnie indukowano ekspresję białka poprzez dodanie
izopropylo-β-tiogalaktopiranozyd (IPTG) do końcowego stężenia 0,1mM. Po indukcji
bakterie hodowano przez 16 godzin w 16ºC z wytrząsaniem 150 rpm. Po tym czasie
hodowle wirowano (6000 rpm w 4ºC przez 15 min). Supernatant odrzucono, a osady
zamrożono w -20ºC.
III.2.4. Dysrupcja komórek
Do osadu komórek bakteryjnych dodano β-merkaptoetanol (70μl/100ml)
i PMSF (1ml/100ml). Całość zawieszono w 60 ml buforu wiążącego pH 7,4 (20mM
bufor fosforanowy, 0,5M NaCl, 10mM imidazol). Zawiesinę przeniesiono do falkonów
i umieszczono w ciekłym azocie w celu szybkiego zamrożenia, następnie rozmrożono
pod zimną, bieżącą wodą. Po przeniesieniu zawartości falkonów do dwóch zlewek
i umieszczeniu w łaźni lodowej komórki sonikowano 2 razy po 3 minuty za pomocą
ultradźwięków o energii 250W, używając sonikatora Branson Sonifier 250. Kolejnym
etapem było zwirowanie próbek z prędkością 12000 x g/10 min w 4ºC (ultrawirówka
Beckman J2-21M/E). Osad odrzucono, a supernatant zebrano i przefiltrowano przez filtr
celulozowo-nitrowy 0,2μm (Milipore).
III.2.5. Oczyszczanie białka SA-2B
Plazmid bakteryjny pSA kodujący białko SA-2B (homologi AlkB) otrzymano od
prof. Falnesa z Uniwersytetu w Oslo. Plazmid pET28a/pSA zawierał wklonowaną
sekwencję cDNA kodującą białko SA-2B.
Wszystkie etapy oczyszczania białka odbywały się w temperaturze 4ºC.
Supernatant nakładano na kolumny ze złożem niklowym HisTrap (Amersham)
z wykorzystaniem urządzenia Äcta Prime. Białko eluowano w buforze elucyjnym
gradientem stężenia imidazolu od 10mM do 0,5M. Zebrane frakcje zachowano do
dalszej analizy, natomiast frakcje, które zawierały białko SA-2B zostały poddane
dializie do buforu do przechowywania 2xST (storage buffer) o pH 7,4 (40mM
Tris-HCl, 200mM NaCl, 10% glicerol). Na koniec dodano glicerol do końcowego
stężenia 50%.
Oczyszczone białka przechowywano w temperaturze -80ºC.
36
III.2.6. Elektroforeza w żelu poliakrylamidowym
Białka obecne w zebranych frakcjach (osad bakterii nieidukowanych IPTG,
supernatant przed nałożeniem na złoże, frakcje zebrane po dializie) zostały rozdzielone
elektroforetycznie w żelu poliakrylamidowym w obecności SDS-PAGE (warunki
denaturujące). Zastosowano metodę według modyfikacji Laemmli’ego, czyli w tzw.
systemie nieciągłym. W metodzie tej żel składa się z dwóch części. Część górna
zawiera 4,5% akrylamid o pH 6,8 i służy do zagęszczenia białek. Natomiast część dolna
zawiera 15% akrylamid o pH 8,8. Dochodzi w niej do rozdziału białek w zależności od
ich wielkości. Zanim próbki o objętości 5µl nałożono na żel, dodano do nich 1,5µl
5x stężonego buforu Laemmli’ego. Elektroforezę prowadzono w buforze do
elektroforezy SDS-PAGE (1x) pod napięciem 200 V do momentu wyjścia barwnika
z żelu. Rozdziałowi poddano też marker wielkości białek SigmaMarker™ Low Range
w zakresie 6,5 - 66 kDa, służący do oceny wielkości białka. Po rozdziale białka
barwiono Coomassie Brillant Blue G-250 przez 30 minut. Następnie barwnik zlewano,
a żel umieszczano w odbarwiaczu, który zmieniano kilkakrotnie, aż do całkowitego
odbarwienia się tła.
III.2.7. Oznaczanie stężenia białka metodą Bradford
Każdy pomiar wykonano w trzech powtórzeniach, ostateczny wynik stanowił
średnią arytmetyczną wszystkich wyników dla danej frakcji. 5μl każdej
z analizowanych frakcji rozcieńczano w kuwetach zawierających po 795μl sterylnej
wody miliQ, dodawano 200μl odczynnika Bradford, mieszano i odstawiano na 10 minut
w ciemności. Po tym czasie mierzono absorbancję roztworów przy długości fali 595 nm
względem kontroli (mieszanina 800μl wody i 200μl odczynnika Bradford). Stężenie
białka w analizowanych frakcjach określano na podstawie krzywej wzorcowej.
III.2.8. Przygotowanie substratów do reakcji naprawy przez badane białka
III.2.8.1. Otrzymywanie pentamerów zawierających etanocytozynę TT(εC)TT oraz
hydroksyetanocytozynę TT(HEC)TT
Do 276,5μl 1,5M buforu TEAB pH ok. 7-8 dodano 12,5μl pentameru TTCTT
o stężeniu 2 OD/μl (555nmoli) oraz 29,75μl (180μmol) 45% roztworu aldehydu
37
chlorooctowego (CAA). Całość inkubowano przez 2,5h w 37°C. Następnie mieszaninę
reakcyjną (nieprzereagowany TTCTT oraz TT(HEC)TT i TT(εC)TT) oczyszczono
i rozfrakcjonowano za pomocą HPLC na kolumnie preparatywnej, nakładając całkowitą
objętość reakcji. W celu określenia stężenia oligomeru zebrane frakcje poddano
pomiarowi absorbancji, po czym rozdzielono je za pomocą rozdziału analitycznego na
HPLC w celu sprawdzenia ich składu (nakładano po ok. 1nmol substancji). Następnie
frakcje zawierające modyfikowane pentamery liofilizowano do sucha i zawieszono
w buforze TE pH 8 w końcowym stężeniu 500pm/μl. Frakcje zawierające czysty THEC
umieszczono w temp. - 20ºC. Do frakcji zawierających mieszaninę TεC i THEC dodano
1M bufor kakodylanowy pH 6,5 i poddano procesowi dehydratacji przez ogrzewanie
w 37ºC w pH 6,5 przez 72h.
III.2.8.2. Otrzymywanie pentamerów zawierających hydroksypropanocytozynę
TT(HPC)TT
Do 214μl 1M buforu octanowego o pH 4,5 dodano 5μl pentameru TTCTT
o stężeniu 2 OD/μl (222nmoli) oraz 39μl (1nmol) akroleiny (ACR). Całość inkubowano
przez 4h w 37°C. Następnie mieszaninę reakcyjną oczyszczono za pomocą HPLC na
kolumnie preparatywnej, nakładając całkowitą objętość reakcji. W celu określenia
stężenia oligomeru zebrane frakcje zawierające TT(HPC)TT poddano pomiarowi
absorbancji, po czym rozdzielono je za pomocą HPLC na kolumnie analitycznej
(nakładano po ok. 1nmol substancji). Frakcje zawierające pożądany produkt połączono,
zliofilizowano, a następnie rozpuszczono w buforze TE do stężenia 500pmoli/μl.
III.2.8.3. Otrzymywanie substratu zawierającego etenoadeninę TT(εA)TT
Do 442,4μl 0,5 M buforu octanowego o pH 4,6 dodano 5μl pentameru TTATT
o stężeniu 2 OD/μl (222 nmole) oraz 47,6 μl (288 μmol) 45 % roztworu aldehydu
chlorooctowego (CAA). Całość inkubowano przez 24 h w 37°C. Następnie mieszaninę
reakcyjną oczyszczano za pomocą HPLC na kolumnie, nakładając całkowitą objętość
reakcji. Zebrane frakcje zawierające TTεATT poddano pomiarowi absorbancji w celu
określenia stężenia oligomeru, a następnie rozdziałowi za pomocą HPLC na kolumnie
analitycznej (nakładano po ok. 1 nmol substancji). Frakcje zawierające pożądany
produkt połączono, zliofilizowano, a następnie rozpuszczono w buforze TE do stężenia
500 pmoli/μl.
38
III.2.9. Badanie aktywności białka AlkB, SA-1A i SA-2B
W celu badania aktywności badanych białek przygotowano 0,2M bufory:
Bis-Tris, HEPES i octanowy w różnych zakresach pH wraz z dodatkiem 1M DTT
(5μl/ml). Reakcje prowadzono w zależności od pH buforu, czasu, stężenia jonów Fe (II)
i stężenia α-ketoglutaranu. Objętości wszystkich mieszanin reakcyjnych wynosiły 20μl,
a ich inkubacja w temp. 37ºC trwała 30 minut (w przypadku badania zależności od
czasu inkubacja trwała do 30 minut). Po upływie tego czasu reakcje zatrzymywano
przez dodanie 230μl wody i zamrożenie. Analizę składu mieszaniny reakcyjnej
prowadzono za pomocą HPLC na kolumnie analitycznej.
Wydajność naprawy obliczano porównując procentowy udział modyfikowanego
i niemodyfikowanego pentameru w rozdziale chromatograficznym HPLC przed i po
reakcji z badanym białkiem.
III.2.9.1. Zależność naprawy od pH
Reakcje startowano buforem o odpowiednim pH. α-ketoglutaran i jony Fe (II)
w postaci (NH4)2Fe(SO4)2 x 6H2O dodawano tuż przed reakcją ze względu na ich
nietrwałość.
TT(HEC)TT
W przypadku białka AlkB reakcje naprawy prowadzono w buforze octanowym
o pH 5,4 oraz w buforze Bis-Tris o pH: 5,8; 6,0; 6,2 lub 6,6. Reakcje z białkami SA-1A
i SA-2B prowadzono w buforze Bis-Tris o pH: 5,8; 6,0; 6,2; 6,6 i 7,0. We wszystkich
mieszaninach z białkiem SA-1A i SA-2B końcowe stężenia α-ketoglutaranu i Fe (II)
wynosiły po 0,5mM. Natomiast w reakcjach z białkiem AlkB stężenie Fe (II) wynosiło
1mM, a stężenie α-KG 0,5mM. Pozostałe składniki reakcji stanowiły: woda miliQ,
substrat TT(HEC)TT (500pm) oraz białko (AlkB 25pm, SA-1A 20pm i SA-2B 50pm).
TT(HPC)TT
Reakcje z udziałem białka AlkB i SA1A prowadzono w buforze HEPES
o pH: 6,8; 7,2; 7,4; 7,6 oraz 7,8. W reakcji z białkiem SA-1A stężenie α-KG było równe
0,5mM, natomiast stężenie Fe (II) wynosiło 0,1mM. W reakcjach z białkiem AlkB
stężenie Fe (II)i α-KG wynosiło 0,05mM. Pozostałe składniki stanowiła woda, substrat
TT(HPC)TT (500pm) i białko (AlkB 25pm, SA-1A 20pm).
39
TT(εC)TT i TT(εA)TT
Reakcje dla białek SA-1A i SA-2B prowadzono w buforze octanowym o pH:
4,2; 4,6; 5,0; 5,4 i 5,6. Stężenie α-ketoglutaranu wynosiło 0,5mM, natomiast stężenie Fe
(II) 3mM. Pozostałe składniki stanowiła woda miliQ, substrat (500pm) oraz białko
(50pm).
III.2.9.2. Zależność naprawy od stężenia α-KG
W celu porównania uzyskanych wyników i zminimalizowania błędu
pipetowania z wyjściowego roztworu o stężeniu 100mM przygotowano szereg
rozcieńczeń α-KG.
TT(HEC)TT
Reakcje z białkiem AlkB i SA-1A prowadzono w buforze Bis-Tris o pH 5,8.
Stężenia α-KG w reakcjach z AlkB wynosiły 0,01mM; 0,025mM; 0,05mM; 0,1mM;
0,25mM; 0,5mM, a w reakcjach z SA-1A wynosiły 0mM; 0,01mM; 0,025mM;
0,05mM; 0,1mM i 0,5mM. Pozostałe składniki reakcji to: Fe (II) (1mM w reakcji
z AlkB, 500μM w reakcji z SA-1A), woda miliQ, substrat TT(HEC)TT (500pm)
i białko (AlkB 25pm, SA-1A 20pm).
TT(HPC)TT
Reakcje z białkiem AlkB prowadzono w buforze HEPES o pH 7,4, natomiast
reakcje z białkiem SA-1A prowadzono w buforze HEPES o pH 7,4. Stężenia α-KG
w reakcjach z AlkB wynosiły 0,025mM; 0,05mM; 0,1mM; 0,25mM; 0,5mM i 1mM.
Natomiast w reakcjach z SA-1A stężenia α-KG wynosiły 0mM; 0,01mM; 0,025mM;
0,05mM; 0,1mM i 0,5mM. Pozostałe składniki reakcji to: 100μM Fe (II), woda miliQ,
substrat TT(HPC)TT (500pm) i białko (50pm).
TT(εA)TT i TT(εC)TT
Reakcje naprawy przez białko SA-1A przeprowadzono w buforze octanowym
o pH 5,0. Stężenia α-KG w reakcjach wynosiły 0mM; 0,01mM; 0,025mM; 0,05mM;
0,1mM i 0,5mM. Pozostałe składniki stanowiły: Fe (II) o stężeniu 3mM, woda miliQ,
substrat (500pm) i białko (50pm).
40
III.2.9.3. Zależność naprawy od stężenia jonów Fe (II)
W celu porównania uzyskanych wyników i zminimalizowania błędu
pipetowania z wyjściowego roztworu o stężeniu 100mM przygotowano szereg
rozcieńczeń jonów Fe (II) w postaci (NH4)2Fe(SO4)2 x 6H2O.
TT(HEC)TT
Reakcje z białkiem AlkB, SA-1A i SA-2B prowadzono w buforze Bis-Tris o pH
5,8. Stężenia Fe (II) w reakcjach z AlkB wynosiły 0,25mM; 0,5mM; 1mM; 1,5mM;
2mM; 2,5mM i 3mM, a w reakcjach z SA-1A i SA-2B: 0mM; 0,1mM; 0,5mM; 1mM;
2mM i 3mM. Pozostałe składniki reakcji to: α-ketoglutaran (500 μM w reakcji z AlkB,
25μM w reakcji z SA-1A i 250μM w reakcji z SA-2B), woda miliQ, substrat
TT(HEC)TT (500pm) i białko (AlkB 25pm, SA-1A i SA-2B 50pm).
TT(HPC)TT
Reakcje z białkiem AlkB i SA-1A prowadzono w buforze HEPES o pH 7,4.
Stężenia Fe (II) w reakcjach z AlkB wynosiły 0,01mM; 0,025mM; 0,05mM; 0,1mM;
0,25mM, a w reakcjach z SA-1A: 0mM; 0,01mM; 0,05mM; 0,1mM; 0,25mM i 0,5mM.
Pozostałe składniki reakcji to: α-ketoglutaran (50μM), woda miliQ, substrat
TT(HPC)TT (500pm) i białko (AlkB 25pm, SA-1A 50pm).
TT(εA)TT i TT(εC)TT
Reakcje naprawy przez białko SA-2B przeprowadzono w buforze octanowym
o pH 5,0. Użyto α-KG o stężeniu 250μM. Stężenia Fe (II) w reakcjach wynosiły
0,5mM, 1,5mM, 3mM i 5mM. Pozostałe składniki stanowiła woda, substrat (500pm)
i białko (50pm).
III.2.9.4. Zależność naprawy od czasu
W reakcjach z białkiem AlkB inkubacja mieszaniny reakcyjnej w temp. 37ºC
trwała odpowiednio: 1; 2,5; 5; 10; 20 lub 30 minut.
TT(HEC)TT
Reakcje z białkiem AlkB prowadzono w buforze Bis-Tris o pH 5,8; przy
stężeniu Fe (II) równym 1mM i stężeniu α-ketoglutaranu wynoszącym 500 μM.
41
Pozostałe składniki mieszaniny reakcyjnej to: woda miliQ, substrat TT(HEC)TT
(500pm) i białko (25pm).
TT(HPC)TT
Reakcje z białkiem AlkB prowadzono w buforze HEPES o pH 7,5; przy stężeniu
Fe (II) równym 100 μM i stężeniu α-ketoglutaranu 500 μM. Pozostałe składniki
mieszaniny reakcyjnej stanowiły: woda miliQ, substrat TT(HPC)TT (500pm) i białko
(12,5pm).
42
IV Wyniki
IV.1. Oczyszczanie białka SA-2B
Otrzymane w wyniku oczyszczania frakcje białka charakteryzowały się różną
czystością. W związku z tym, w doświadczeniach wykorzystano najbardziej czyste
frakcje, zawierające w większości niezdegradowane białka, które posiadają sekwencję
aminokwasową pełnej długości.
Rys 7. Zdjęcie żelu z frakcjami po oczyszczaniu białka SA-2B. Frakcje: O- osad, S- supernatant, 3, 10,
18-27.
Największe stężenie białka SA-2B otrzymano we frakcji 25. Uzyskano 2ml
preparatu w stężeniu 0,92 μg/μl. Frakcja ta została podzielona na porcje i zamrożona
w -800C do czasu przeprowadzania reakcji napraw z wykorzystaniem tego białka.
43
IV.2. Chemiczna modyfikacja pentamerów TTCTT i TTATT
IV.2.1. Modyfikacja pentamerów zawierających cytozynę (TTCTT)
Oligomer TTCTT modyfikowano za pomocą związków chemicznych: aldehydu
chlorooctowego (CAA) oraz akroleiny (ACR). W tych warunkach tymina nie ulega
przekształceniom, modyfikacji ulegają jedynie cząsteczki cytozyny.
Gdy TTCTT inkubowano z CAA w 1,5 M buforze TEAB o pH ok. 7-8 przez
2,5h w temperaturze 37°C otrzymaną główną pochodną była hydroksyetanocytozyna
(HEC) (Rys. 8). Po dodaniu do oligomeru akroleiny w 1 M buforze octanowym o pH
4,5 i 3,5h inkubacji w temperaturze 37°C uzyskano hydroksypropanocytozynę (HPC)
(Rys. 9).
Do monitorowania postępu reakcji i czystości otrzymanych pochodnych
posłużyło HPLC.
Rys 8. Chromatogram przedstawiający analityczny rozdział produktów reakcji modyfikacji
pentameru TTCTT (T/C) aldehydem chlorooctowym
W reakcji T/C z CAA użyto 10 j.op substratu (220 nmoli) i otrzymano
następującą wydajność reakcji: uzyskano 70% modyfikacji, w tym 55% T/HEC i 15%
T/εC.
44
Rys 9. Chromatogram przedstawiający analityczny rozdział produktów reakcji modyfikacji
pentameru TTCTT (T/C) akroleiną
W reakcji T/C z akroleiną użyto 10 j.op substratu (220 nmoli) i uzyskano 100%
wydajność reakcji, gdyż cała ilość TTCTT przereagowała z czynnikiem modyfikującym
substrat.
Następnie dokonano izolacji produktów za pomocą preparatywnego rozdziału na
HPL (rys. 10 i 11). Wybrane frakcje po połączeniu i zliofilizowaniu rozpuszczono
w buforze TE. Próbki te zostały rozdzielone analitycznie na HPLC.
Rys 10. Chromatogram przedstawiający preparatywny rozdział produktów reakcji modyfikacji
pentameru TTCTT (T/C) aldehydem chlorooctowym. Pik 1 reprezentuje niezmodyfikowany substrat
T/C; 2 - T/HEC; 3 – T/ εC, 4 i 5 – niezidentyfikowane produkty reakcji.
45
Rys 11. Chromatogram przedstawiający preparatywny rozdział produktów reakcji modyfikacji
pentameru TTCTT (T/C) akroleiną
IV.2.2. Modyfikacja pentamerów zawierających adeninę (TTATT)
Oligomer TTATT modyfikowano za pomocą aldehydu chlorooctowego (CAA).
Reakcję modyfikacji przeprowadzano w 0,5 M buforze octanowym o pH 4,6 w ciągu 23
h i w temperaturze 25°C. W jej wyniku uzyskano pochodną etenową (εA). Postęp
reakcji i czystość otrzymanej pochodnej monitorowano przy użyciu HPLC.
Następnie dokonano izolacji produktu za pomocą preparatywnego rozdziału na
HPLC. Ponieważ reakcja zaszła ze 100% wydajnością, rozdział ten miał na celu
usunięcie toksycznego dla białka AlkB aldehydu chlorooctowego. Wybrane frakcje po
połączeniu i zliofilizowaniu rozpuszczono w buforze TE. Otrzymana próbka została
rozdzielona analitycznie na HPLC.
46
Rys 12. Chromatogram przedstawiający analityczny rozdział produktów reakcji modyfikacji pentameru TTATT (T/A) aldehydem chlorooctowym
IV.3. Badanie naprawy modyfikowanych oligomerów przez białko
AlkB in vitro
W celu analizy aktywności naprawczej białka wobec otrzymanych substratów
przeprowadzono inkubację oczyszczonych pentametrów z białkiem AlkB w obecności
α-ketoglutaranu (α-KG), jonów żelaza (II), buforu o odpowiednim pH, ditiotreitolu
(DTT) oraz wody. Badano wpływ różnych czynników takich jak: pH, stężenie Fe (II),
stężenie α-KG, czas; na wydajność naprawy poszczególnych substratów przez białko
AlkB. Stopień naprawy oligomeru przez białko AlkB był określany na podstawie
analizy uzyskanych chromatogramów.
47
IV.3.1. Naprawa TT(HEC)TT
IV.3.1.1. Zależność naprawy od pH
Rys 13. Chromatogram przedstawiający skład mieszaniny reakcyjnej po inkubacji TT(HEC)TT
z białkiem AlkB w pH 5,8. Wydajność naprawy wynosiła 67,7%.
0
20
40
60
80
5 5,4 5,8 6,2 6,6pH
% n
ap
raw
y
Rys 14. Zależność wydajności naprawy substratu TT(HEC)TT przez białko AlkB od pH buforu
w mieszaninie reakcyjnej
Najlepszą naprawę HEC przez AlkB obserwowano przy pH 5,8.
48
IV.3.1.2. Zależność naprawy od stężenia Fe (II)
Rys 15. Chromatogram przedstawiający skład mieszaniny reakcyjnej po inkubacji TT(HEC)TT
z białkiem AlkB przy stężeniu Fe (II) równym 0,5mM. Wydajność naprawy wynosiła 64,4%.
0
20
40
60
80
0 1 2 3Fe (II) [mM]
% n
ap
raw
y
Rys 16. Zależność wydajności naprawy substratu TT(HEC)TT przez białko AlkB od stężenia Fe
w mieszaninie reakcyjnej
Najlepszą naprawę HEC przez AlkB obserwowano przy stężeniu żelaza równym 1mM.
49
IV.3.1.3. Zależność naprawy od stężenia α-KG
Rys 17. Chromatogram przedstawiający skład mieszaniny reakcyjnej po inkubacji TT(HEC)TT
z białkiem AlkB przy stężeniu α-KG równym 0,05mM. Wydajność naprawy wynosiła 71,8%.
0
20
40
60
80
0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6αKG [mM]
% n
ap
raw
y
Rys 18. Zależność wydajności naprawy substratu TT(HEC)TT przez białko AlkB od stężenia α-KG
w mieszaninie reakcyjnej
Najlepszą naprawę HEC przez AlkB obserwowano przy stężeniu α-ketoglutaranu
równym 0,025mM.
50
IV.3.1.4. Zależność naprawy od czasu
Rys 19. Chromatogram przedstawiający skład mieszaniny reakcyjnej po inkubacji TT(HEC)TT
z białkiem AlkB w czasie 30min. Wydajność naprawy wynosiła 42%.
0
10
20
30
40
50
0 10 20 30czas [min.]
% n
ap
raw
y
Rys 20. Zależność wydajności naprawy substratu TT(HEC)TT przez białko AlkB od czasu
Najlepszą naprawę HEC przez AlkB obserwowano przy reakcji prowadzonej przez
30min.
51
IV.3.2. Naprawa TT(HPC)TT
IV.3.2.1. Zależność naprawy od pH
Rys 21. Chromatogram przedstawiający skład mieszaniny reakcyjnej po inkubacji TT(HPC)TT
z białkiem AlkB w pH 6,8. Wydajność naprawy wynosiła 23,2%.
0
10
20
30
40
50
60
70
6,5 7 7,5 8
pH
% n
ap
raw
y
Rys 22. Zależność wydajności naprawy substratu TT(HPC)TT przez białko AlkB od pH buforu
w mieszaninie reakcyjnej
Najlepszą naprawę HPC przez AlkB obserwowano przy pH 7,4.
52
IV.3.2.2. Zależność naprawy od stężenia Fe (II)
Rys 23. Chromatogram przedstawiający skład mieszaniny reakcyjnej po inkubacji TT(HPC)TT
z białkiem AlkB przy stężeniu Fe (II) równym 0,1mM. Wydajność naprawy wynosiła 68%.
0
20
40
60
80
0 0,05 0,1 0,15 0,2 0,25 0,3
Fe (II) [mM]
% n
ap
raw
y
Rys 24. Zależność wydajności naprawy substratu TT(HPC)TT przez białko AlkB od stężenia Fe
(II) w mieszaninie reakcyjnej
Najlepszą naprawę HPC przez AlkB obserwowano przy stężeniu żelaza równym
0,1mM.
53
IV.3.2.3. Zależność naprawy od stężenia α-KG
Rys 25. Chromatogram przedstawiający skład mieszaniny reakcyjnej po inkubacji TT(HPC)TT
z białkiem AlkB przy stężeniu α-KG równym 0,1mM. Wydajność naprawy wynosiła 69,3%.
0
20
40
60
80
100
0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6αKG [mM]
% n
ap
raw
y
Rys 26. Zależność wydajności naprawy substratu TT(HPC)TT przez białko AlkB od stężenia α-KG
w mieszaninie reakcyjnej
Najlepszą naprawę HPC przez AlkB obserwowano przy stężeniu α-ketoglutaranu
równym 0,05mM.
54
IV.3.2.4. Zależność naprawy od czasu
Rys 27. Chromatogram przedstawiający skład mieszaniny reakcyjnej po inkubacji TT(HPC)TT
z białkiem AlkB po 20min. Wydajność naprawy wynosiła 63,4%.
0
20
40
60
0 10 20 30czas [min.]
% n
ap
raw
y
Rys 28. Zależność wydajności naprawy substratu TT(HPC)TT przez białko AlkB od czasu
Najlepszą naprawę HPC przez AlkB obserwowano przy reakcji prowadzonej przez
30min.
55
IV.4. Badanie naprawy in vitro modyfikowanych oligomerów przez
bakteryjne homologi białka AlkB: SA-1A i SA-2B
Przeprowadzono analizę aktywności naprawczej białka SA-1A i SA-2B wobec
zsyntetyzowanych substratów. W tym celu inkubowano w 37°C otrzymane oczyszczone
pentamery z każdym z tych białek w obecności α-ketoglutaranu (α-KG), jonów Fe (II),
buforu o odpowiednim pH, ditiotreitolu (DTT) oraz wody. W celu zatrzymania reakcji
mieszaniny reakcyjne rozcieńczano wodą i zamrażano. Badano wpływ różnych
czynników takich jak: pH, stężenie Fe, stężenie α-KG, czas; na wydajność naprawy
poszczególnych substratów przez białko SA-1 i SA-2. Analizując wyniki reakcji po
rozdziale chromatograficznym określano stopień naprawy oligomeru przez homologi
białka AlkB.
IV.4.1. Białko SA-1A
Na rys. 29, 30, 31 i 32 przedstawiono wzorce substratów użytych do badania
specyficzności substratowej białka SA-1:
Rys 29. Chromatogram przedstawiający wzorzec substratu (poddany następnie inkubacji
z białkiem SA-1A), otrzymany po reakcji TTCTT z CAA
56
Rys 30. Chromatogram przedstawiający wzorzec substratu (poddany następnie inkubacji
z białkiem SA-1A), otrzymany po reakcji TTCTT z CAA
Rys 31. Chromatogram przedstawiający wzorzec substratu (poddany następnie inkubacji
z białkiem SA-1A), otrzymany po reakcji TTCTT z akroleiną
57
Rys 32. Chromatogram przedstawiający wzorzec substratu (poddany następnie inkubacji
z białkiem SA-1A), otrzymany po reakcji TTATT z CAA
IV.4.1.1. Zależność naprawy od pH
Rys 33. Chromatogram przedstawiający skład mieszaniny reakcyjnej po inkubacji TT(HEC)TT
z białkiem SA-1A w pH 5,8. Wydajność naprawy wynosiła 80,8%.
58
0%
20%
40%
60%
80%
100%
4 4,5 5 5,5 6 6,5 7 7,5 8
pH
% n
ap
raw
y
HEC εC εA HPC
Rys 34. Zależność wydajności naprawy uzyskanych substratów przez białko SA-1A od pH buforu
w mieszaninie reakcyjnej
Najlepszą naprawę HEC obserwowano przy pH 5,8; natomiast najlepszą
naprawę HPC obserwowano przy pH 7,4. Wyniki napraw εC i εA były zbyt niskie, by
można było stwierdzić naprawę i ustalić optimum.
IV.4.1.2. Zależność naprawy od stężenia α-KG
Rys 35. Chromatogram przedstawiający skład mieszaniny reakcyjnej po inkubacji TT(HPC)TT
z białkiem SA-1A przy stężeniu α-ketoglutaranu równym 0,05mM. Wydajność naprawy wynosiła 22,4%.
59
0%
20%
40%
60%
0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5
stężenie alfa-KG (w mM)
% n
ap
raw
y
HEC εC εA HPC
Rys 36. Zależność wydajności naprawy uzyskanych substratów przez białko SA-1A od stężenia
α-KG w mieszaninie reakcyjnej
Najlepszą naprawę HEC obserwowano przy stężeniu α-KG równym 0,01mM;
natomiast HPC było najlepiej naprawiane przy stężeniu α-KG równym 0,05mM.
Wyniki napraw εC i εA były zbyt niskie, by można było stwierdzić naprawę i ustalić
optimum.
IV.4.1.3. Zależność naprawy od stężenia Fe (II)
Rys 37. Chromatogram przedstawiający skład mieszaniny reakcyjnej po inkubacji TT(HEC)TT
z białkiem SA-1A przy stężeniu Fe (II) równym 2mM. Wydajność naprawy wynosiła 74,5%.
60
0%
20%
40%
60%
80%
100%
0 0,5 1 1,5 2 2,5 3
Stężenie Fe (w mM)
% n
ap
raw
y
HPC HEC
Rys 38. Zależność wydajności naprawy substratu uzyskanych substratów przez białko SA-1A od
stężenia Fe w mieszaninie reakcyjnej
Optimum stężenia Fe (II) dla naprawy HEC 0,5mM, natomiast HPC najlepiej
naprawiało się przy stężeniu Fe (II) równym 0,05mM.
IV.4.2. Białko SA-2B
W sposób analogiczny do badań dla SA-1A przeprowadzono reakcje mające na
celu sprawdzenie specyficzności substratowej oraz zależności wydajności naprawy
substratów od pH i stężenia żelaza. W przeprowadzonych reakcjach białka SA-2B
z pięciomerami zawierającymi HEC, εC i εA nie uzyskano naprawy, dlatego też
wyciągnięto wniosek, że w warunkach stosowanych w reakcjach SA-2B nie naprawia
badanych substratów. Stąd też nie prowadzono dalszych badań nad zależnością
wydajności naprawy substratów od stężenia α-ketoglutaranu i od czasu.
61
V Dyskusja
Białko AlkB jest enzymem, który naprawia DNA według unikalnego
mechanizmu, polegającego na usuwaniu uszkodzeń z zasady bez naruszania
integralności nici DNA, podczas gdy większość znanych mechanizmów naprawy polega
na usuwaniu i wymianie uszkodzonych fragmentów podwójnej helisy DNA. AlkB
utlenia grupy metylowe 1-metyloadeniny i 3-metylocytozyny w ssDNA (Trewick i wsp.
2002, Falnes i wsp. 2002), dsDNA oraz ssRNA (Aas i wsp. 2003). Efektywniej
naprawia uszkodzenia w ssDNA niż w dsDNA (Dinglay i wsp. 2000). Naprawia
również etenoadeninę, etenocytozynę oraz hydroksyetanocytozynę (Delaney i wsp.
2005, Mishina i wsp. 2005, Maciejewska i wsp. 2010). Badania prowadzone w
Zakładzie Biologii Molekularnej IBB przez prof. Jarosława Kuśmierka i dr Agnieszkę
Maciejewską wykazały, że białko AlkB naprawia również z dużą wydajnością
hydroksypropanocytozynę (Maciejewska i wsp., publikacja w przygotowaniu).
Niniejsza praca miała na celu ustalenie optymalnych warunkach naprawy
3,N4-α-hydroksyetanocytozyny i 3,N
4-α-hydroksypropanocytozyny przez AlkB oraz
określenie specyficzności substratowej homologów AlkB: SA-1A i SA-2B,
pochodzących z Streptomyces avermitilis. Te występujące w glebie bakterie, należące
do rzędu promieniowców, produkują wiele metabolitów wtórnych, w tym awermektyny,
które są wykorzystywane w medycynie jako czynniki antypasożytnicze (Ōmura
i współpracownicy 2001). Efektywność naprawy przez SA-1 i SA-2B badano dla
3,N4-α-hydroksyetanocytozyny (HEC), 3,N
4-α-hydroksypropanocytozyny (HPC),
1,N6-etenoadeniny oraz 3,N
4-etenocytozyny. Dla naprawianych przez te homologi
substratów ustalono optymalne warunki naprawy.
Pierwszym etapem badań było uzyskanie oczyszczonych białek
wykorzystywanych następnie do reakcji naprawy. Jak pokazują wyniki metoda,
polegająca na transformacji bakterii szczepu E. coli BL21 (DE3) plazmidem
pET28a/alkB, następnie ekspresji białka w szczepie E. coli BL21 (DE3) i oczyszczaniu
go na kolumnie niklowej HisTrap (Amersham) z wykorzystaniem urządzenia Akta
Prime, jest skuteczna i pozwala uzyskać aktywne enzymy, które można przechowywać
w temperaturze -800C i wykorzystywać do badań nad ich specyficznością substratową.
Drugim etapem badań była modyfikacja komercyjnie dostępnych pentamerów
DNA, które służyły jako substraty do reakcji naprawy przez białko AlkB i jego
homologi. Używane do modyfikacji pentamery składają się z 4 tymin i A lub C,
62
ponieważ tymina jako jedyna zasada nie ma egzocyklicznej grupy NH2 i nie tworzy
adduktów egzocyklicznych, ponieważ nie reaguje z aldehydem chlorooctowym
i akroleiną. Za pomocą ACR i CAA modyfikowano pentamery zawierające cytozynę.
W reakcji z akroleiną otrzymywano HPC, natomiast w reakcji
z aldehydem chloroocrowym otrzymywano HEC i εC. P