UE dHématopoïèse Les antagonistes du récepteur aux hydrocarbures aromatiques (AhR) amplifient laccroissement des cellules hématopoïétiques humaines POULET

UE d’Hématopoïèse

Les antagonistes du récepteur aux hydrocarbures aromatiques (AhR) amplifient l’accroissement des

cellules hématopoïétiques humaines

POULET AlexandreMICHEL Nicolas

Dr. Jean-Noël BastiePr. Gaëtan Jeggo

Hématopoïèse

I) IntroductionII) Résultats expérimentauxIII) Mécanisme d’action et voie AhRIV) Conclusion



Introduction

But: améliorer les transplants de cellules souches hématopoïétiques (CSH).Actuellement très utilisés ; mais problème de compatibilité HLA pour les allogreffes.Alternative: sang de cordon, mais souvent nombre d’unités/cordon relativement faible (NB: on peut cumuler deux sangs de cordon pour avoir une greffe acceptable)

A l’instar de l’insuline pour les diabétiques, il serait cependant intéressant de pouvoir les produire in vivo, et les synthétiser in fine ex vivo.

Problème: trouver un milieu de culture adapté.



Introduction - rappel

Différents types de greffe:-Allogreffe: donneur ≠ receveur, mais HLA-compatible-Autogreffe: cellules mises en banque pour être réutilisées par le donneur

Provenance des CSHs: Cellules souches de sang périphérique (Cytaphérèse) Sang de cordon Moelle osseuse



Introduction - cultures

Ex-vivo, les cultures « traditionnelles » (sérum libre, thrombopoïétine, Stem Cell Factor, Flt3-Ligand et IL-6), efficientes in vivo, donnent bien une prolifération-différenciation ici, mais durant cette dernière les cellules perdent leurs antigènes spécifiques de surface… (CD34 et CD133)

CSH

CD34CD133

Une équipe a donc passé au crible plus de 100.000 molécules susceptibles de proliférer-se différencier tout en conservant les marqueurs cellulaires (cellules CD34+ et CD133+)…

Parmi elles, SR-1 semble la plus prometteuse.



Résultats expérimentaux

SR1 Identification Structure A long terme et effet dose Cellules de cordon Réversibilité ≠ animaux et effet antiprolifératif Total des cellules nucléées Rôle sur la division Lignées Greffe Organes (répartition) Double greffe



Remarque préalable : le DMSO est un simple solvant, utilisé comme témoin.

SR1 – identification

Expression de CD34 et de CD133 en culture en microscopie confocale

Hoechst: colore noyaux.

Dans la culture contrôle, les cellules perdent leurs marqueurs

■ SR1● DMSO Dans la culture SR1:

Les cellules prolifèrent Les CD34 et 133 persistent



SR1 - structure

Stemregenin – 1 (SR1)

2

6

9

Analogue moins puissant

Hétérocycle dérivé purique substitué en 2, 6 et 9



SR1

J7 J21

=> L’efficacité de SR1 est dose-dépendante

=> L’expression des protéines perdure

A long terme:

CD34+ CD133+

x 2,6 x 2,3Effet dose:CD34+ Cell totales

x 73 x 100



SR1 – cellules de cordon

Mise en culture de 1000 cellules (souches ou progéniteurs) dérivés du sang de cordonRésultats après 21 jours, en cytométrie en fluxFold = [SR1]1µM /[DMSO]



SR1 - réversibilité

Après lavage, et remise en culture sans SR1, l’expression de CD34 chute et rejoint celle de DMSO

=> L’effet de SR1 est réversible

■ SR1● DMSO



SR1: ≠ animaux et dose max

■ Cynomolgus ● Rhésus▲ Chien

14 jours de culture

/!\ Représentation des doses à échelle logarithmique

Dose maximale efficace pour [SR1] = 1 µMEffet antiprolifératif si [SR1] > 1 µM

Aucun effet sur ¢ murines (souris)Uniquement ¢ humaines, simiennes et canines



SR1 - TNCs

Culture de 1000 cellules CD34+ de sang de cordon, en SR1 (noir) ou contrôle (blanc).

Le total de cellules nucléées augmente de façon très importante.



SR1: division symétrique?

SR1 ≈ DMSO=> Pas de rôle dans la division…

Mais très bonne conservation des CD34+!!

Utilisation du CFSE, colorant fluorescent marquant les divisions cellulaires

SR1DMSO



SR1 - lignées

Augmentation du nombre de néocolonies (CFUs):-Simple myéloïde

=> Soit un accroissement des progéniteurs multipotants précoces

-Simple érythroïde-Bipotentiel granulocyte/monocyte-Multilignée granulocytaire-érythrocytaire-monocytaire-mégacariocytaire.. avec SR1 seul!!



SR1: greffe

Sang après 8 semaines Moelle osseuse 13 semaines=> A partir d’un nombre restreint de ¢, la greffe prend de manière précoce et soutenue avec SR1

A

Mise en culture de 250.000 ¢ CD34+ de sang de cordon pendant 3 semainesGreffe de 300 ou 10.000 ¢ sur souris NOD-SCID (immunodéprimées)



SR1 – organes

La répartition par organe (Moelle osseuse, rate, thymus) est sensiblement équivalente, SR1 ou non.

Au dessus: sans SR1En dessous: avec SR1



SR1: double greffe

SRC (NOD-SCID Repopulating Cells) : cellules humaines capables de reconstitution hématopoïétique = cellules humaines viables après greffe chez la souris

Greffe primaire A

A B

Greffe secondaire B

Les SRC en culture avec SR1 supportent jusqu’à 7 nouvelles transplantations indépendantes !!Transplantation d’une fraction de la culture finale précédente



SR1: mécanisme d’action

Confrontation de SR1 et de 61 protéines kinases (effecteurs): aucune activité inhibitrice significative trouvée…=> Pas de rôle direct

En revanche…



SR1: mécanisme d’action

SR1LGC006CYP1B1AHRR

En comparant SR1 avec son analogue LGC006, 2 gènes-cibles apparaissent très réprimés par l’un et non par l’autre.

Ces deux gènes sont régulés via un mécanisme de signalisation complexe basé sur AhR…



AhR

Récepteur de nature phosphoprotéique.Possède un domaine PAS + structure hélice/boucle/hélice (sans doigt de zinc), et un domaine riche en glutamine pour se lier à l’ADN

Répresseur compétitif : Protéine AHRR (AHR-repressor) localisé dans le noyau interagissant avec Arnt.

Absence de ligand: AHR quiescent dans le cytosol, complexé à 2 HSP90 masquant HBH et PASPrésence de ligands exogènes => phosphorylé par la pkC/Tyr, détache HSPs, forme un hétérodimère avec Arnt (AHR nuclear translocator) => noyau => gènes => domaines XRE (en 5’ des cytochromes P450: leurs substrats = ligands de AhR! Ex: TCDD, une dioxine)Théoriquement bon: détoxifie. En pratique: produits de la détoxification à effets cancérigènes…



L

AhR-CYP450

Ligand

HSP90

AhR

Arnt

Gène -> ARN -> protéine cytochrome P450

Bloqué ici si SR1



L

AhR-AhRR

Ligand

HSP90

AhR

Arnt

Gène-ARN-protéine répresseur AHRR

AhRR



SR1 – antagoniste d’AhR

La luciférase sert de gène rapporteur:C’est une enzyme trouvée chez la luciole, dont l’activité émet de la lumière. En insérant l’ADN codant pour cette enzyme à côté du gène qui nous intéresse, on en fait un gène rapporteur permettant de quantifier l’activité du gène-cible.

Avec SR1, le taux de transcription des gènes-cibles d’AhR s’effondre!!=> Activité antagoniste d’AhR par action/gènes cibles

● SR1■ DMSO

SR1 n’a que très peu d’effet chez la souris, mais est très efficace pour inhiber chez l’Homme

Spécificité humaine



SR1 – inhibition directe

Prouver le rôle direct de SR1 sur les récepteurs nucléaires d’AhR

Le domaine PAS a une phylogénie très particulière: chez les animaux inférieurs, sa seule fonction est la régulation circadienne (cycles jours/nuits). Ce rôle existe encore chez l’Homme et peut être mis à profit…

On met en présence :-PAL (le ligand à photoaffinité pouvant se fixer sur PAS)-Indirubine, dont la fixation à PAL est connue-SR1 (fixation à démontrer)-LGC006 (l’analogue moins puissant de SR1)

La chromatographie, confirmée par la courbe, révèle que contrairement à LGC006, SR1 s’est lié à tous les PAL (qui n’apparaissent plus) de façon équivalente à l’indirubine.=> Par analogie, SR1 fonctionne bien par fixation directe sur PAS



Rôle d’AhR sur l’induction de SR1

Il reste encore à expliquer de quelle façon AhR est lié avec l’hématopoïèse.

Des cellules de cordon CD34+ ont été infectées avec des lentivirus (rétrovirus) exprimant :-la protéine fluorescente verte GFP (permettant de les voir..)-shRNAs ciblant et inactivant AHR

Dans les cellules CD34+GFP+, shRNA conduit à la diminution de l’ARNm d’AHR et de son expression protéique, et conserve CD34 pendant la culture.

= > l’inactivation d’AhR a des effets similaires à SR1



AhR KD

Mais, les effets de SR1 nécessitent ils l’inactivation d’AhR?

Une version d’AhR privée (Knock-Down) du domaine de fixation pour le ligand a été créé, baptisée CA-AhR..

SR1 ne réussit plus à inhiber l’activité de la luciférase (qui permettait de contrôler l’expression des gènes cibles), et n’a plus aucun effet sur les cellules CD34+ de sang de cordon!!

=> Cela prouve bien qu’SR1 nécessite une fixation à AhR (en l’occurrence celle du ligand), et qu’il augmente le taux de CD34+ des cellules de cordon.



Conclusion

La présence d’AhR a été démontrée dans les cellules hématopoïétiques.Son rôle de facteur de transcription activé par un ligand et induisant des enzymes métabolisant des drogues a pu être ici redémontré

Mais AhR est aussi impliqué dans des voies de régulations de l’hématopoïèse:-HES1-c-MYC-C/EBP-PU.1-β-caténine-CXCR4-STAT5

Un traitement TCDD (dioxine) des souris donneuses entraîne une diminution de l’activité de reconstitution du pool des cellules Lin-cKit+Sca-1+ (= cellules souches)

Reste encore à définir les mécanismes impliqués dans ces processus.



Conclusion

-SR1 augmente le nombre des cellules souches-SR1 et les KD AhR maintiennent l’expression de CD34-SR1 permet la formation de nouvelles colonies multilignéeÞ AHR empêche les cellules souches de prendre en greffe en les empêchant de se différencier.

Cependant, il n’est pas encore possible d’exclure l’existence de mécanismes alternatifs: il faudrait de meilleurs marqueurs spécifiques des cellules souches humaines, ainsi que des études cliniques.



Ouverture

Des études complémentaires à celle-ci avaient été réalisées par la même équipe, essayant soit d’améliorer l’accroissement des cellules souches (angiopoïétine, gènes HOX, chélateurs du cuivre…), soit leur capacité de « Homing » (Prostaglandine E2, fucosylation…)

Cette étude-ci permettra, après avoir exploré le potentiel clinique de SR1, d’améliorer le rendement des transplantations et trouver d’autres applications des transplantations autologues ou allogéniques.



Bibliographie

http://www.academie-veterinaire-defrance.org/bulletin/pdf/2003Numero3/37.pdfhttp://www.ssents.uvsq.fr/spip.php?article42http://molpharm.aspetjournals.org/content/69/1/140



http://www.academie-veterinaire-defrance.org/bulletin/pdf/2003Numero3/37.pdf

http://www.ssents.uvsq.fr/spip.php?article42

http://molpharm.aspetjournals.org/content/69/1/140

Documents

UE dHématopoïèse Les antagonistes du récepteur aux hydrocarbures aromatiques (AhR) amplifient laccroissement des cellules hématopoïétiques humaines POULET