UIN SYARIF HIDAYATULLAH JAKARTA ISOLASI DAN …repository.uinjkt.ac.id/dspace/bitstream/123456789/49545/1/Giyan R… · Salah satu target obat malaria yang terbaru adalah MQO (Malate

UIN SYARIF HIDAYATULLAH JAKARTA

ISOLASI DAN IDENTIFIKASI SENYAWA METABOLIT

SEKUNDER DARI FRAKSI AKTIF EKSTRAK

DAUN BELUNTAS (Pluchea indica (L) Less.) DAN

UJI AKTIVITAS INHIBISI TERHADAP ENZIM PfMQO

SKRIPSI

GIYAN RAMDAN

11151020000070

PROGRAM STUDI FARMASI

FAKULTAS ILMU KESEHATAN

UNIVERSITAS ISLAM NEGERI SYARIF HIDAYATULLAH

JAKARTA

2019

ii

HALAMAN JUDUL

UIN SYARIF HIDAYATULLAH JAKARTA

ISOLASI DAN IDENTIFIKASI SENYAWA METABOLIT

SEKUNDER DARI FRAKSI AKTIF EKSTRAK

DAUN BELUNTAS (Pluchea indica (L) Less.) DAN

UJI AKTIVITAS INHIBISI TERHADAP ENZIM PfMQO

SKRIPSI

Diajukan sebagai salah satu syarat memperoleh gelar Sarjana Farmasi

GIYAN RAMDAN

11151020000070

PROGRAM STUDI FARMASI

FAKULTAS ILMU KESEHATAN

UNIVERSITAS ISLAM NEGERI SYARIF HIDAYATULLAH

JAKARTA

2019

iii

HALAMAN PERNYATAAN ORISINILITAS

Skripsi ini adalah hasil karya saya sendiri,

dan semua sumber baik yang dikutip maupun dirujuk

telah saya nyatakan dengan benar.

Nama : Giyan Ramdan

NIM : 11151020000070

Tanda tangan :

Tanggal : 11 Desember 2019

iv

HALAMAN PERSETUJUAN PEMBIMBNG

Nama : Giyan Ramdan

NIM : 11151020000070

Program Studi : Farmasi

Judul : Isolasi dan Identifikasi Senyawa Metabolit Sekunder dari

Fraksi Aktif Ekstrak Daun Beluntas (Pluchea indica (L)

Less.) dan Uji Aktivitas Inhibisi terhadap Enzim PfMQO

Disetujui oleh,

Pembimbing I

Hendri Aldrat, M.Si., PhD., Apt

NIP. 197405212005011002

Pembimbing II

Ismiarni Komala, M.Sc., PhD., Apt

NIP. 197806302006042001

Mengetahui,

Ketua Program Studi Farmasi

Fakultas Ilmu Kesehatan

UIN Syarif Hidayatullah Jakarta

Dr. Nurmeilis, M.Si., Apt

NIP. 197407302005012003

v

HALAMAN PENGESAHAN SKRIPSI

Skripsi ini diajukan oleh :

Nama : Giyan Ramdan

NIM : 11151020000070





Telah berhasil dipertahankan di depan Dewan Penguji dan diterima sebagai bagian

persyaratan yang diperlukan untuk memperoleh gelar Sarjana Farmasi pada

Program Studi Farmasi Fakultas Ilmu Kesehatan, Universitas Islam Negeri (UIN)

Syarif Hidayatullah Jakarta.

DEWAN PENGUJI :

Pembimbing I : Hendri Aldrat, M.Si., Ph.D., Apt ( )

Pembimbing II : Ismiarni Komala, M.Sc., Ph.D., Apt ( )

Penguji I : Dr. Delina Hasan, M.Kes., Apt ( )

Penguji II : Vivi Anggia, M.Farm., Apt ( )

Ditetapkan di : Ciputat

Tanggal : 11 Desember 2019

vi


ABSTRAK

Nama : Giyan Ramdan





Malaria merupakan salah satu masalah kesehatan masyarakat yang dapat

menyebabkan kematian yang disebabkan oleh protozoa dari genus plasmodium.

Salah satu target obat malaria yang terbaru adalah MQO (Malate Quinone

Oxidoreductase) dimana MQO adalah enzim kunci yang terlibat di siklus TCA,

siklus fumarat dan rantai respirasi yang sangat penting dalam siklus hidup parasit

P. falciparum namun tidak terdapat pada genom manusia. Salah satu tanaman yang

telah dimanfaatkan untuk antimalaria adalah daun beluntas (Pluchea indica (L)

Less.). Penelitian ini bertujuan untuk mengisolasi dan mengidentifikasi kandungan

metabolit sekunder dari ekstrak etil asetat daun beluntas yang aktif terhadap

PfMQO dengan menggunakan teknik kromatografi kolom dan identifikasi struktur

senyawa menggunakan metode spektroskopi 1H-NMR. Pada penelitian ini berhasil

mengisolasi senyawa Stigmasterol dengan nilai IC50 PfMQO sebesar 7,435 µg/mL.

Kata kunci : Pluchea indica (L) Less., stigmasterol, antimalaria, IC50, Plasmodium

falciparum, enzim PfMQO

vii


ABSTRACT

Nama : Giyan Ramdan


Judul : Isolation and identification of secondary metabolite

compounds from an active fraction of Beluntas leaf extract

(Pluchea indica (L) Less.) and test of inhibition activity

against the PfMQO enzyme

Malaria is one of the problems of public health that can cause death caused by

protozoa of the Plasmodium genus. One of the latest malaria drug targets is MQO

(Malate Quinone Oxidoreductase) where MQO is the key enzyme involved in the

TCA cycle, fumarate cycle and respiration chain that are crucial in the life cycles

of the P. falciparum parasites but are not on the human genom. One plant that has

been utilized for antimalarials is the beluntas leaf (Pluchea indica (L) Less.). The

study aims to isolate and identify the secondary metabolite content of the ethyl

acetate of the beluntas leaf that are active against PfMQO by using column

chromatography techniques and identifying compound structures using methods A

spectroscopy of 1H-NMR. In this research successfully isolate the Stigmasterol

compound with a value of IC50 PfMQO of 7.435 μg/mL.

Keywords : Pluchea indica (L) Less., stigmasterol, antimalarial, IC50, Plasmodium

falciparum, PfMQO enzyme

viii


KATA PENGANTAR

Puji syukur penulis panjatkan kehadirat Allah SWT yang telah memberikan

rahmat dan hidayah-Nya sehingga dapat menyelesaikan skripsi yang berjudul

“Isolasi dan Identifikasi Senyawa Metabolit Sekunder dari Fraksi Aktif

Ekstrak Daun Beluntas (Pluchea indica (L) Less.) dan Uji Aktivitas Inhibisi

terhadap Enzim PfMQO” sebagai salah satu syarat kelulusan untuk mendapat

gelar Sarjana Farmasi UIN Syarif Hidayatullah Jakarta.

Selama penulisan skripsi ini ada banyak hambatan yang penulis hadapi, tetapi

dengan dukungan, dorongan, serta doa, hambatan tersebut dapat dilewati dengan

baik. Oleh karena itu saya berterimakasih yang sebesar-besarnya kepada :

1. Dr. Zilhadia, M.Si., Apt selaku Dekan Fakultas Ilmu Kesehatan UIN Syarif

Hidayatullah Jakarta.

2. Dr. Nurmeilis, M.Si., Apt selaku Ketua Program Studi Farmasi UIN Syarif


3. Hendri Aldrat, M.Si., Ph,D., Apt dan Ismiarni Komala, M.Sc., Ph.D., Apt

selaku pembimbing saya yang telah menyediakan banyak waktu dan dengan

sabar memberikan ilmu, pengarahan, bimbingan, nasehat, tenaga, dan

dorongan moril selama penulis menyelesaikan skripsi.

4. Bapak dan ibu dosen pengajar Program Studi Farmasi UIN Syarif


5. Keluarga saya terutama bapak Oma Rusyana dan ibu Mimin yang telah

memberikan curahan kasih sayang, do’a, nasehat, serta dukungan moral

maupun materil. Tidak ada sesuatu didunia ini yang dapat membalas semua

kebaikan, cinta, dan kasih sayang yang telah kalian berikan.

6. Teman-teman se-pembimbing Nuri, Dwipus, Farijal, Kiki, Tiara, Aditia,

dan Jane, yang telah berjuang bersama dari awal penyusunan skripsi hingga

skripsi ini selesai.

7. Teman-teman seperjuangan saya di Farmasi 2015 (Captopril) yang banyak

memberikan dukungan, doa, dan momen-momen tak terlupakan dari awal

menjadi mahasiswa hingga selesai.

ix


8. Teman-teman satu laboratorium selama penelitian yang telah melewati

penelitian bersama dan saling membantu.

9. Teman-teman satu grup mlehoy dan lahaula yang selalu memberikan

kebahagiaan selama penelitian berlangsung.

10. Nurlisna Fauziyah Imtinan selaku teman lintas jurusan yang selalu

memberikan semangat dan dukungan selama penelitian berlangsung

11. Pihak lain yang tidak bisa saya sebutkan satu persatu, yang telah berperan

membantu saya selama penelitian dan penyusunan.

Akhir kata, penulis berharap semoga Allah SWT berkenan membalas

kebaikan dari semua pihak yang telah membantu. Semoga skripsi ini dapat

bermanfaat bagi pembaca dan perkembangan ilmu pengetahuan.

Ciputat, Desember 2019

Penulis,

Giyan Ramdan

x


HALAMAN PERNYATAAN PERSETUJUAN PUBLIKASI

TUGAS AKHIR UNTUK KEPENTINGAN AKADEMIS

Sebagai civitas akademik Universitas Islam Negeri (UIN) Syarif Hidayatullah

Jakarta Saya yang bertanda tangan dibawah ini :

Nama : Giyan Ramdan

NIM : 11151020000070


Fakultas : Ilmu Kesehatan

Demi perkembangan ilmu pengetahuan, saya menyetujui skripsi karya ilmiah saya

dengan judul :

ISOLASI DAN IDENTIFIKASI SENYAWA METABOLIT SEKUNDER

DARI FRAKSI AKTIF EKSTRAK DAUN BELUNTAS (Pluchea indica (L)

Less.) DAN UJI AKTIVITAS INHIBISI TERHADAP ENZIM PfMQO

Untuk dipublikasikan atau ditampilkan di internet atau media lain yaitu Digital

Library Perpustakaan Universitas Islam Negeri (UIN) Syarif Hidayatullah Jakarta

untuk kepentingan akademis sebatas sesuai dengan Undang-Undang Hak Cipta.

Demikian pernyataan persetujuan publikasi karya ilmiah ini saya buat dengan

sebenarnya.

Dibuat di : Ciputat

Pada Tanggal : 12 Desember 2019

Yang Menyatakan

Giyan Ramdan

xi


DAFTAR ISI

Halaman

HALAMAN JUDUL ............................................................................................. ii

HALAMAN PERNYATAAN ORISINILITAS ................................................. iii

HALAMAN PERSETUJUAN PEMBIMBNG .................................................. iv

HALAMAN PENGESAHAN SKRIPSI .............................................................. v

ABSTRAK ............................................................................................................ vi

ABSTRACT ......................................................................................................... vii

KATA PENGANTAR ........................................................................................ viii

HALAMAN PERNYATAAN PERSETUJUAN PUBLIKASI.......................... x

DAFTAR ISI ......................................................................................................... xi

DAFTAR TABEL .............................................................................................. xiii

DAFTAR GAMBAR .......................................................................................... xiv

DAFTAR LAMPIRAN ....................................................................................... xv

BAB I PENDAHULUAN ...................................................................................... 1

1.1 Latar Belakang ................................................................................................ 1

1.2 Rumusan Masalah .......................................................................................... 4

1.3 Tujuan Penelitian ............................................................................................ 4

1.4 Hipotesis .......................................................................................................... 4

1.5 Manfaat penelitian .......................................................................................... 4

BAB II TINJAUAN PUSTAKA ........................................................................... 5

2.1 Tanaman Beluntas .......................................................................................... 5

2.1.1 Taksonomi dan Morfologi Tanaman Beluntas .............................. 5

2.1.2 Nama Daerah Tanaman Beluntas .................................................. 6

2.1.3 Kandungan Kimia Tanaman Beluntas ........................................... 6

2.1.4 Manfaat Tanaman Beluntas ........................................................... 7

2.2 Malaria ............................................................................................................. 8

2.2.1 Etiologi Malaria ............................................................................. 8

2.2.2 Penyebab Penyakit Malaria ........................................................... 8

2.2.3 Gejala Malaria ............................................................................. 10

2.3 Produksi Energi Pada Makhluk Hidup ...................................................... 11

2.4 Simplisia ........................................................................................................ 13

2.4.1 Penyiapan Simplisia .................................................................... 13

2.4.2 Pemeriksaan Mutu Simplisia ....................................................... 15

2.5 Ekstrak ........................................................................................................... 15

2.6 Metode Ekstraksi .......................................................................................... 15

2.6.1 Cara dingin .................................................................................. 15

2.6.2 Cara Panas ................................................................................... 16

2.7 Pelarut ............................................................................................................ 16

2.8 Vacuum Rotary Evaporator ........................................................................ 18

2.9 Kromatografi ................................................................................................. 19

2.9.1 Kromatografi Kolom ................................................................... 19

2.9.2 Kromatografi Lapis Tipis ............................................................ 20

2.10 Nuclear Magnetic Resonance (NMR) ....................................................... 20

2.11 Enzim PfMQO .............................................................................................. 21

BAB III METODE PENELITIAN .................................................................... 24

xii


3.1 Tempat dan Waktu Penelitian ..................................................................... 24

3.2 Alat dan Bahan Penelitian ........................................................................... 24

3.2.1 Alat Penelitian ............................................................................. 24

3.2.2 Bahan ........................................................................................... 24

3.3 Prosedur Penelitian....................................................................................... 25

3.3.1 Determinasi Tanaman .................................................................. 25

3.3.2 Penyiapan Simplisia .................................................................... 25

3.3.3 Pembuatan dan Partisi Ekstrak .................................................... 25

3.3.4 Penentuan Parameter-Parameter Standarisasi ............................. 26

3.3.5 Isolasi Ektrak ............................................................................... 28

3.3.6 Uji Aktivitas Senyawa Terhadap Enzim PfMQO ........................ 30

BAB VI HASIL DAN PEMBAHASAN ............................................................ 33

4.1 Determinasi Tanaman .................................................................................. 33

4.2 Penyiapan Simplisia ..................................................................................... 33

4.3 Pembuatan Ekstrak ....................................................................................... 34

4.4 Pengukuran Kadar Air Ekstrak ................................................................... 35

4.5 Pengukuran Kadar Abu Ekstrak ................................................................. 35

4.6 Penapisan Fitokimia ..................................................................................... 36

4.7 Isolasi dan Pemurnian Senyawa ................................................................. 37

4.8 Uji Kemurnian Senyawa ............................................................................. 40

4.9 Identifikasi Isolat Murni .............................................................................. 42

4.10 Uji Aktivitas Ekstrak Daun Beluntas terhadap Enzim PfMQO ............. 44

BAB V PENUTUP ............................................................................................... 49

5.1 Kesimpulan ................................................................................................... 49

5.2 Saran............................................................................................................... 49

DAFTAR PUSTAKA .......................................................................................... 50

LAMPIRAN ......................................................................................................... 54

xiii


DAFTAR TABEL

Halaman

Tabel 3.1 Komposisi assay mix .......................................................................... 30

Tabel 3.2 Peta letak ekstrak Larutan Induk ........................................................ 31

Tabel 3.3 Peta letak ekstrak saat pengujian ........................................................ 31

Tabel 4.1 Hasil Perhitungan rendemen ekstrak .................................................. 35

Tabel 4.2 Hasil skrining fitokimia ekstrak etil asetat daun beluntas .................. 36

Tabel 4.3 Karakteristik isolat murni ................................................................... 42

Tabel 4.4 Perbandingan pergeseran kimia 1H-NMR ......................................... 43

Tabel 4.5 Hasil perhitungan % inhibisi ekstrak dan fraksi ................................. 46

Tabel 4.6 Hasil perhitungan % inhibisi subfraksi .............................................. 46

xiv


DAFTAR GAMBAR

Halaman

Gambar 2.1 Tanaman beluntas (Pluchea indica L) ............................................ 6

Gambar 2.2 Siklus transmisi malaria .................................................................. 9

Gambar 2.3 Proses glikolisis ............................................................................ 11

Gambar 2.4 Proses pembentukan asetil koenzim A ......................................... 12

Gambar 2.5 Proses siklus krebs ........................................................................ 12

Gambar 2.6 Proses transport elektron .............................................................. 13

Gambar 2.7 Vacuum rotary evaporator ........................................................... 19

Gambar 2.8 Diagram korelasi spektrum 1H-NMR ........................................... 22

Gambar 2.9 Peran enzim PfMQO ..................................................................... 23

Gambar 3.1 Skema KLT 2 dimensi .................................................................. 29

Gambar 4.1 Bagan kolom kromatografi I ekstrak etil asetat daun beluntas .....38 Gambar 4.2 Fraksi A-I kolom kromatografi I ekstrak etil asetat

daun beluntas ................................................................................ 38

Gambar 4.3 Hasil KLT kromatografi kolom I ekstrak etil asetat

daun beluntas ................................................................................ 38

Gambar 4.4 Bagan kolom kromatografi II fraksi G dan fraksi H..................... 39

Gambar 4.5 Subfraksi A-D kolom kromatografi II .......................................... 40

Gambar 4.6 Hasil KLT kolom kromatografi II ................................................ 40

Gambar 4.7 Hasil KLT 2 dimensi subfraksi A ................................................. 41

Gambar 4.8 Pola kromatogram isolat murni .................................................... 41

Gambar 4.9 Isolat murni subfraksi A ............................................................... 42

Gambar 4.10 Struktur molekul stigmasterol ...................................................... 43

Gambar 4.11 Reaksi enzimatis PfMQO ............................................................ 45

Gambar 4.12 IC50 isolat murni terhadap enzim PfMQO ................................... 47

xv


DAFTAR LAMPIRAN

Lampiran 1. Determinasi Tanaman ......................................................................... 54

Lampiran 2. Alur Kerja Penelitian ........................................................................... 55

Lampiran 3. Skema Penyiapan Ekstrak Daun (Pluchea indica (L) Less.) ......... 56

Lampiran 4. Skema Isolasi dan Pemurnian Senyawa ........................................... 57

Lampiran 5. Perhitungan Rendemen Ekstrak Daun Beluntas

(Pluche indica (L) Less.) .............................................................. 58

Lampiran 6. Perhitungan Parameter Ekstrak Etil Asetat Daun Beluntas

(Pluchea indica (L) Less.) ............................................................ 59

Lampiran 7. Hasil Skrining Fitokimia Ekstrak Etil Asetat Daun Beluntas

(Pluche indica (L) Less.) ...............................................................60

Lampiran 8. Perhitungan Pengenceran Ekstrak dan Fraksi Daun Beluntas

(Pluchea indica (L) Less.) pada Pengujian Aktivitas Inhibisi dan

IC50 Enzim PfMQO ....................................................................... 61

Lampiran 9. Perhitungan Pembuatan Assay Mix ..................................................... 62

Lampiran 10.Absorbansi dan Inhibisi (%) Pengujian IC50 Senyawa Murni

Ekstrak Etil Asetat Daun Beluntas (Pluche indica (L) Less.)........63

Lampiran 11.Hasil Spektrum 1H-NMR ..................................................................... 64

Lampiran 11.Dokumentasi Penelitian ....................................................................... 65

1 UIN Syarif Hidayatullah Jakarta

BAB I PENDAHULUAN

BAB I

PENDAHULUAN

1.1 Latar Belakang

Malaria merupakan salah satu masalah kesehatan masyarakat yang

dapat menyebabkan kematian terutama pada kelompok resiko tinggi yaitu

bayi, anak balita dan ibu hamil. Malaria adalah penyakit infeksi akut yang

disebabkan oleh protozoa dari genus plasmodium. Parasit ini ditularkan oleh

gigitan nyamuk Anopheles. Pada manusia terdapat empat spesies nyamuk

penyebab maria yaitu P. falciparum, P. vivax, P. ovale dan P. malaria (Puasa,

H, & Kader, 2018). Penderita malaria akan memiliki gejala seperti demam,

menggigil, berkeringat, sakit kepala, mual dan muntah. Penderita yang

menunjukkan gejala klinis harus menjalani tes labolatorium untuk

mengkonfirmasi status positif malaria (Kemenkes RI, 2016)

Data terbaru WHO pada tahun 2017 terdapat 219 juta kasus malaria dan

menyebabkan 435.000 orang meninggal dunia akibat penyakit malaria. Di

Indonesia sendiri apabila dilihat secara provinsi pada tahun 2015, tampak

bahwa wilayah timur Indonesia memiliki tingkat Annual Parasite Incidence

(API) yang tinggi yaitu Papua (31,93%), Papua Barat (31,29%), NTT (7,04%)

serta maluku (5,81%). Pada Sustainable Development Goals (SDGs), upaya

pemberantasan malaria tertuang dalam tujuan ketiga yaitu menjamin

kehidupan yang sehat dan mengupayakan kesejahteraan bagi semua orang,

dengan tujuan spesifik yaitu mengakhiri endemis AIDS, tuberkulosis,

malaria, penyakit neglected-tropical sampai dengan tahun 2030 (Kemenkes

RI, 2016).

Pemerintah Indonesia memandang malaria sebagai ancaman terhadap

status kesehatan masyarakat terutama pada rakyat yang masih hidup terpencil.

Hal ini tercermin dalam PP No. 2 tahun 2015 tentang Rencana Pembangunan

Jangka Menengah Nasional tahun 2015-2019 yang dimana malaria

merupakan salah satu penyakit yang harus ditanggulangi. Salah satu tantangan

terbesar dalam upaya pengobatan malaria adalah terjadi penurunan efikasi

pada penggunaan beberapa obat malaria.

2


Sejak tahun 2004 obat pilihan utama untuk malaria falciparum adalah

obat kombinasi derivat Artemisin yang dikenal dengan Artemisin-based

Combination Therapy (ACT). Terjadinya resistensi ACT pertama kali

dilaporkan di daerah perbatasan Thailand-Kamboja, dan pada tahun 2016

resistensi ACT sudah dilaporkan meluas khususnya di Asia Tenggara yaitu

Laos, Myanmar, Thailand dan Vietnam (WHO, 2018).

Di Indonesia sendiri terjadi resistensi penggunaan obat ACT di

Kecamatan Tapalang, Sulawesi Barat. Obat yang diberikan adalah artesunat-

amodiakuin (AS-AQ). Obat tersebut memiliki efek samping mual, muntah,

lemas dan sakit kepala serta AS-AQ diberikan dalam dosis terbagi dalam

sehari yang berpotensi menyebabkan dosis obat kurang optimal yang akhirnya

menyebabkan faktor resiko munculnya resistensi obat (Yusuf, 2014).

Penggunaan ACT dalam waktu yang lama dapat menyebabkan timbulnya

strain-strain yang resisten terhadap ACT khususnya komponen artemisin. Hal

ini terjadi karena adanya proses adaptasi dari parasit yang berkembang

sehingga timbul mutasi-mutasi pada satu atau lebih basa nukleotida pada gen-

gen tertentu. Adanya adaptasi dan mutasi ini akan meningkatkan kemampuan

parasit untuk mentoleransi kerja artemisin dan dapat berkembang menjadi

strain resisten yang stabil (Suwandi, 2015).

Beberapa strategi untuk mengatasi resistensi malaria adalah dengan

menemukan sumber obat baru yang lebih aman dan spesifik serta mencari

target obat baru yang efektif dalam melumpuhkan parasit yang invasif. Salah

satu tanaman obat yang memiliki potensi sebagai bahan obat adalah beluntas

(Pluchea indica L). Tanaman beluntas merupakan tumbuhan semak yang

bercabang banyak, berusuk halus, dan berbulu lembut yang biasanya

digunakan sebagai tanaman pagar. Secara tradisional tanaman beluntas

digunakan sebagai obat untuk menghilangkan bau badan, demam, batuk, diare

dan malaria. Air rebusan daun beluntas dari daun beluntas juga sering

digunakan sebagai obat kulit dan daun beluntas juga dikonsumsi sebagai

lalapan (Pratama, 2017).

Senyawa aktif yang terkandung dalam daun beluntas diantaranya adalah

alkaloid, minyak atsiri, flavonoid, fenol, tanin dan saponin (Pratama, 2017).

3


Senyawa yang terkandung dalam tanaman beluntas yang telah berhasil

diisolasi antara lain : flavonoid (apigenin, luteolin, krisoeriol dan kuersetin),

alkaloid (plucheol-A, plucheol-B, plucheoside-E, dan plucheoside-D1) dan

yang terakhir adalah senyawa fenol berupa plucheinol (Mohamad et al., 2018)

Menurut Mohamad et al., (2018), tanaman beluntas memiliki berbagai

potensi aktivitas farmakologi diantaranya sebagai antioksidan, analgesik,

antiinflamasi, antilarvasida, antibakteri, aktivitas diuretik, dan membantu

dalam penyembuhan diabetes mellitus. Tanaman beluntas juga telah

dilaporkan mempunyai aktivitas sebagai antimalaria (Pratama, 2017).

Salah satu target obat malaria yang terbaru adalah MQO (Malate

Quinone Oksidoreductase). MQO adalah enzim kunci yang terlibat di siklus

TCA, siklus fumarat dan rantai respirasi. Pada siklus TCA menghubungkan

rantai respirasi dengan mentransfer elektron dari malat ke ubiquinone untuk

memproduksi oksaloasetat dan ubiquinol. Karena P. falciparum MQO

(PfMQO) sangat penting pada sirkulasi darah, dan tidak terdapat pada genom

manusia, PfMQO dianggap sebagai target obat yang potensial. Rekombinan

bakteri sistem ekspresi PfMQO sebagai inhibitor poten dengan aktivitas

antimalaria berhasil dikembangkan untuk pertama kalinya (Hartuti et al.,

2018).

Dari berbagai macam tanaman yang tumbuh di Indonesia, salah satu

tanaman yang berkhasiat untuk pengobatan malaria adalah daun beluntas.

Dalam penelitian terdahulu menunjukkan fraksi dari ekstrak etil asetat daun

beluntas dengan konsentrasi 100 μg/ml memiliki persen inhibisi sebesar 91%

terhadap enzim PfMQO (Pratama, 2017). Sampai saat ini belum dilaporkan

adanya penelitian mengenai isolasi dan identifikasi senyawa metabolit

sekunder yang terkandung dalam fraksi aktif ekstrak daun beluntas yang

memiliki aktivitas inhibisi terhadap enzim PfMQO.

4


1.2 Rumusan Masalah

1. Apa hasil isolasi senyawa metabolit sekunder yang terdapat dalam fraksi

aktif ekstrak daun beluntas ?

2. Berapa nilai uji aktivitas antimalaria senyawa metabolit sekunder yang

telah diisolasi dari fraksi aktif ekstrak daun beluntas terhadap enzim

PfMQO ?

1.3 Tujuan Penelitian

1. Tujuan Umum

Secara umum penelitian ini bertujuan untuk mengetahui kandungan

senyawa metabolit sekunder yang terdapat dalam fraksi aktif ekstrak daun

beluntas yang aktif terhadap enzim PfMQO.

2. Tujuan Khusus

a. Mengisolasi dan mengidentifikasi senyawa metabolit sekunder yang

terdapat dalam fraksi aktif ekstrak daun beluntas.

b. Menguji aktivitas antimalaria senyawa hasil isolasi terhadap enzim

PfMQO.

1.4 Hipotesis

Senyawa metabolit sekunder yang terdapat dalam fraksi aktif ekstrak

daun beluntas memiliki aktivitas inhibisi terhadap enzim PfMQO.

1.5 Manfaat penelitian

1. Hasil penelitian ini diharapkan dapat memberikan khasanah ilmu

pengetahuan dalam studi pengembangan obat antimalaria dengan

memberikan informasi mengenai aktivitas antimalaria dari ekstrak daun

beluntas.

2. Hasil penelitian ini dapat dijadikan sebagai pijakan dan referensi pada

penelitian-penelitian selanjutnya yang berhubungan dengan isolasi

senyawa metabolit sekunder yang memiliki aktivitas antimalaria serta

menjadi bahan kajian lebih lanjut.

3. Menjadi bahan masukan atau informasi yang bermanfaat bagi peneliti

lain dalam dalam studi pengobatan antimalaria dari bahan alam.


BAB II TINJAUAN PUSTAKA

BAB II

TINJAUAN PUSTAKA

2.1 Tanaman Beluntas

2.1.1 Taksonomi dan Morfologi Tanaman Beluntas

Tanaman beluntas diklasifikasikan (Dalimartha, 1999) berdasarkan

ilmu taksonomi tumbuhan sebagai berikut :

Kingdom : Plantae

Super Divisi : Spermatophyta

Divisi : Magnoliophyta

Kelas : Magnoliopsida

Sub kelas : Asteridae

Ordo : Asterales

Famili : Asteraceae

Genus : Pluchea

Spesies : Pluchea indica (L.)

Tanaman beluntas merupakan tanaman yang termasuk dalam herba

famili Asteraceae yang tumbuh secara liar di daerah kering di tanah yang

keras dan berbatu atau ditanam sebagai tanaman pagar. Tanaman beluntas

merupakan tanaman perdu tegak yang sering bercabang banyak dengan tinggi

0,5 – 2 meter. Daun tanaman beluntas berambut dan berwarna hijau muda.

Helaian daun beluntas berbentuk oval elips atau bulat telur terbalik dengan

pangkal daun runcing dan tepi daunnya bergerigi. Letak daun beluntas

berseling dan bertangkai pendek dengan panjang daun 2,5 – 9 cm. Bunga

tanaman beluntas merupakan bunga majemuk dengan bentuk bongkol kecil,

memiliki kepala sari berwarna ungu dan tangkai putik dengan 2 cabang ungu

yang menjulang jauh. Buah tanaman beluntas berbentuk gangsing, keras dan

berwarna cokelat. Ukuran buah beluntas sangat kecil dengan pancang 1 mm

(Mohamad et al., 2018).

6


Gambar 2.1 Tanaman beluntas Pluche indica (L.) Sumber : (Pratama, 2017)

2.1.2 Nama Daerah Tanaman Beluntas

Tanaman beluntas tersebar di berbagai wilayah Indonesia dengan nama

ilmiah : Pluche indica (L.). Nama daerah : beluntas (Melayu), baluntas,

baruntas (Sunda), luntas (Jawa), baluntas (Madura), lamutasa (Makasar),

lenabou (Timor). Sedangkan nama asing untuk tanaman beluntas adalah luan

yi (Cina), phatpai (Vietnam), dan marsh fleabane (Inggris) (Mohamad Irfan

Fitriansyah, 2018).

2.1.3 Kandungan Kimia Tanaman Beluntas

Senyawa organik pada tumbuhan dibagi menjadi dua, yaitu metabolit

primer dan metabolit sekunder. Metabolit primer adalah senyawa utama yang

diperlukan untuk proses pertumbuhan dan perkembangan meliputi

karbohidrat, lemak, protein, hormone, vitamin dan lain-lain. Sedangkan

metabolit sekunder diartikan sebagai senyawa non nutrisi yang dihasilkan

oleh tumbuhan dan dapat melindungi tanaman dari serangan serangga, jamur,

bakteri dan patogen lain. Di dalam satu tanaman memiliki berbagai macam

metabolit sekunder sehingga menyebabkan tanaman tersebut memiliki

beberapa macam khasiat terapi yang berbeda-beda sesuai dengan metabolit

sekunder yang terkandung di dalamnya (Hanani, 2010)

7


Boonruang et al., (2017) melakukan penelitian mengenai identifikasi

senyawa dari tanaman beluntas. Pada penelitian lain didapat senyawa

flavonoid (apigenin, luteolin, krisoeriol dan kuersetin). Dari penelitian lain

juga mengidentifikasi senyawa dari tanaman beluntas dan mendapatkan

senyawa alkaloid (plucheol-A, plucheol-B, plucheol-E dan plucheol-D1

(Goyal et al, 2013). Senyawa lain yang dihasilkan dari penelitian tersebut

adalah senyawa fenol (plucheinol). Secara keseluruhan daun beluntas

mengandung flavonoid, fenol, tanin, alakaloid, saponin dan minyak atsiri.

Bagian akar dari tanaman beluntas mengandung flavonoid dan tannin

(Dalimartha, 1999)

2.1.4 Manfaat Tanaman Beluntas

Secara tradisional tanaman beluntas digunakan sebagai obat untuk

menghilangkan bau badan, obat demam, obat batuk, obat malaria dan obat

untuk diare. Air rebusan dari daun beluntas juga sering digunakan sebagai

obat kulit dan daun beluntas dapat juga dikonsumsi sebagai lapan (Pratama,

2017)

Berdasarkan review aktivitas farmakologi beluntas yang dilakukan oleh

Mohamad et al., (2018) menyatakan bahwa tanaman beluntas memiliki

aktivitas biologis berupa antioksidan, antikolinesterase, diuretik,

antiinflamasi, diabetes mellitus dan larvasida. Aktivitas antioksidan dilakukan

dengan metode scavenging DPPH. DPPH adalah radikal stabil, yang dalam

bentuk radikalnya memberikan warna violet. Antioksidan akan bereaksi

dengan DPPH oleh mekanisme elektron donasi, yang menstabilkan DPPH

ditunjukkan oleh penurunan intensitas warna ungu DPPH dan perlahan

berubah menjadi kuning dan penurunan ini dapat diukur dengan

spektrofotometri terlihat pada λ 515 nm. Aktivitas antioksidan tertinggi

ditunjukkan oleh PI3 dengan IC50 DPPH aktivitas pemulungan 16,66 μg/ml.

Pramanik et al., (2009) melakukan penelitian pengobatan dengan

tanaman beluntas menunjukkan peningkatan yang signifikan dalam ekskresi

Na+, K+ dan Cl- pada tikus. Efek yang dihasilkan oleh tanaman beluntas

dengan dosis 300 mg/kg, sebanding dengan furosemide (20 mg/kg, p.o.).

dapat dikatakan bahwa itu adalah agen diuretik yang efektif. Ekstrak daun

8


beluntas juga dilaporkan dapat menghambat agregasi platelet dengan cara

menghambat pembentukan tromboksan sehingga juga berperan dalam efek

antiinflamasi dan juga dapat menghambat aktivitas PGH sintase karena

berkompetisi dengan asam arakhidonat pada sisi aktif PGH sintase sehingga

menghambat pembentukan PG (Sudirman et al., 2017).

Pada Penelitian Nurhalimah et al., (2015), menyatakan bahwa ekstrak

daun beluntas memiliki efek antibakteri terhadap bakteri Salmonella

typhimurium dengan dosis 600 mg/kgbb yang mempunyai efek sebanding

dengan loperamid HCl. Penelitian lain juga melaporkan bahwa sari daun

beluntas dengan konsentrasi 20 mg/100ml mampu menghambat pertumbuhan

bakteri Mycrobacterium tuberculosis (S. Amilah dan P.S. Ajiningrum, 2015).

2.2 Malaria

Malaria adalah penyakit menular yang disebabkan oleh parasite

plasmodium yang ditularkan melalui gigitan nyamuk anopheles betina. Istilah

malaria ini diambil dari dua kata bahasa Italia yaitu mal (buruk) dan area

(udara), yang berarti udara yang buruk karena dahulu banyak terdapat di

daerah rawa-rawa yang mengeluarkan bau busuk. Penyakit malaria juga

memiliki nama lain seperti demam roma, demam rawa, demam tropis, demam

pantai, demam charge, demam kurva dan paludisme (Prabowo, 2008).

2.2.1 Etiologi Malaria

Malaria disebabkan oleh protozoa dari kelas protozoa genus

Plasmodium. Dikenal macam spesies yaitu : P. falciparum, P. vivax, P. ovale,

P. malariae dan P. knowlesi. P. knowlesi ini belum banyak dilaporkan di

Indonesia. Dari kelima spesies Plasmodium, jenis spesies P. falciparum

merupakan penyebab infeksi berat bahkan dapat menimbulkan kematian

(Kementerian Kesehatan, 2017).

2.2.2 Penyebab Penyakit Malaria

Penyebab malaria adalah parasite plasmodium yang ditularkan melalui

gigitan nyamuk anopheles betina. Berdasarkan Kementerian Kesehatan

(2017) terdapat lima jenis malaria :

9


1. Malaria falciparum

Disebabkan oleh P. falciparum. Gejala demam timbul intermiten dan

dapat kontinyu. Jenis malaria ini paling sering menjadi malaria berat yang

menyebabkan kematian.

2. Malaria vivaks

Disebabkan oleh P. vivax. Gejala demam berulang dengan interval

bebas demam 2 hari. Telah ditemukan juga kasus malaria berat yang

disebabkan oleh P. vivax.

3. Malaria ovale

Disebabkan oleh P. ovale. Manifestasi klinis biasanya bersifat ringan.

Pola demam seperti pada malaria vivax.

4. Malaria malariae

Disebabkan oleh P. malariae. Gejala demam berulang dengan

interval bebas demam 3 hari.

5. Malaria knowlesi

Disebabkan oleh P. knowlesi. Gejala demam menyerupai P.

falciparum.

Gambar 2.2 Siklus transmisi malaria Sumber : (Eyasu, 2018)

Penyebab terbanyak di Indonesia adalah P. falciparum dan P. vivax.

Untuk P. falciparum menyebabkan suatu komplikasi yang berbahaya,

sehingga disebut juga dengan malaria berat ciri utama genus plasmodium

adalah adanya dua siklus hidup aseksual dan siklus seksual.

10


1. Fase aseksual

Fase aseksual dimulai ketika anopheles betina menggigit manusia

sporozoit yang terdapat dalam air liurnya ke dalam sirkulasi darah

manusia selama kurang lebih 30 menit. Setelah itu sporozoit akan

masuk ke dalam sel parenkhim hati dan berkembang biak membentuk

skizon hati yang mengandung ribuan merozoit hati. Siklus ini di sebut

siklus eksoeritorisiter yang berlansung sekitar 2 minggu. Pada akhir

fase mesozoid yang berasal dari skizon hati yang pecah akan masuk ke

dalam peredaran darah dan menginfeksi sel darah merah. Kemudian

parasit tersebut mengalami proses skizogoni yaitu berkembang dari

stadium tropozoid sampai skizon. Selanjutnya terjadi proses eritrositer

yaitu eritrosit yang terinfeksi skizon pecah dan merozoid yang keluar

akan menginfeksi sel darah merah lainya. Setelah terjadi 2-3 siklus

skizogoni darah sebagian merozoid yang menginfeksi sel darah merah

dan membentuk stadium seksual yaitu gametosit jantan dan betina

(Kementerian Kesehatan, 2017).

2. Fase seksual

Jika nyamuk anopheles betina mengisap darah manusia yang

mengandung parasit malaria, parasit bentuk seksual masuk ke dalam

perut nyamuk. Bentuk ini mengalami pematangan menjadi

mikrogametosit dan makrogametosit, yang kemudian terjadi

pembuahan membentuk zygote (ookinet). Selanjutnya, ookinet

menembus dinding lambung nyamuk dan menjadi ookista. Jika ookista

pecah, ribuan sporozoit dilepaskan dan bermigrasi mencapai kelenjar

air liur nyamuk. Pada saat itu sporozoit siap menginfeksi jika nyamuk

menggigit manusia (Kementerian Kesehatan, 2017).

2.2.3 Gejala Malaria

Gejala demam tergantung jenis malaria. Sifat demam akut (paroksismal)

yang didahului oleh stadium dingin (menggigil) diikuti demam tinggi

kemudian berkeringat banyak. Gejala ini biasanya ditemukan pada penderima

yang berasal dari daerah non endemik. Selain gejala tersebut, dapat ditemukan

gejala lain seperti nyeri kepala, mual, muntah, diare, pegal-pegal, dan nyeri

11


otot. Gejala tersebut biasanya ditemukan pada penderita yang tinggal di

daerah endemik (Kementerian Kesehatan, 2017).

2.3 Produksi Energi Pada Makhluk Hidup

1. Glikolisis

Proses glikolisis merubah glukosa menjadi piruvat dan akan

menghasilkan ATP. Glikolisis dimulai dengan satu molekul glukosa yang

memiliki 6 atom karbon pada rantainya (C6H12O6) dan akan dipecahkan

menjadi dua molekul piruvat yang masing-masing memiliki 3 atom karbon

(C3H3O3) yang merupakan hasil akhir bagi proses ini (Irawan, 2007).

proses glikolisis ini juga akan menghasilkan molekul 4 ATP dan 2 NADH

total akan dihasilkan 10 ATP pada tahap awal proses ini memerlukan 2

molekul ATP dan 2 molekul ATP untuk mentransfer 2 NADH ke

mitokondria. Sebagai hasil akhir, akan terbentuk 6 molekul ATP (Marks

et al., 2005).

Gambar 2.3 Proses glikolisis Sumber: (Sembiring, 2009)

2. Dekarboksilasi Oksidatif

Dekarboksilasi oksidatif adalah reaksi yang mengubah asam piruvat

dari hasil proses glikolisis menjadi asetil koenzim A dan karbon dioksida

di dalam mitokondria pada proses ini terbentuk 6 ATP (Tortora, 2009).

Gambar 2.4 Proses pembentukan asetil koenzim A Sumber: (Sembiring, 2009)

12


3. Siklus Kreb

Gambar 2.5 Proses siklus kreb

Sumber : (Ryan et al., 2018)

Siklus Kreb terjadi di dalam mitokondria. Molekul asetil-KoA yang

merupakan produk akhir dari proses konversi piruvat kemudian akan

masuk ke dalam siklus Kreb. Perubahan yang terjadi dalam siklus ini

adalah mengubah 2 atom karbon yang terikat di dalam molekul asetil-KoA

menjadi 2 molekul karbon dioksida (CO2), membebaskan koenzim A serta

memindahkan energi dari siklus ini ke dalam senyawa NADH, FADH2 dan

GTP. Untuk melanjutkan proses metabolisme energi, molekul NADH dan

FADH2 yang dihasilkan dalam siklus ini akan diproses kembali secara

aerobik di dalam membran sel mitokondria melalui proses electron

transpor chain atau rantai transpor elektron untuk menghasilkan produk

akhir berupa ATP dan air (Galambos et al., 2005).

4. Rantai Transpor Elektron

Pada proses transpor elektron, NADH dan FADH2 yang mengandung

elektron akan melepaskan elektron tersebut ke dalam akseptor utama yaitu

oksigen. Pada akhir dari proses ini, akan menghasilkan 3 molekul ATP

dari 1 molekul NADH dan 2 molekul ATP dihasilkan dari 1 molekul

FADH2. 1 molekul glukosa akan menghasilkan 6 NADH + 2 FADH2 +

13


2ATP, Total ATP yang akan terbentuk selama proses keseluruhan adalah

36 ATP. (Irawan, 2007).

Gambar 2.6 Proses transpor elektron Sumber: (Fisher et al., 2017)

2.4 Simplisia

Menurut Kemenkes (2017), simplisia adalah bahan alamiah yang

dipergunakan sebagai obat yang belum mengalami pengolahan apapun juga

dan kecuali dinyatakan lain, berupa bahan yang telah dikeringkan. Mutu

sediaan herbal sangat dipengaruhi oleh mutu simplisia yang digunakan. Oleh

karena itu, sumber simplisia, cara pengolahan dan penyimpanan harus dapat

dilakukan dengan cara yang baik dan benar.

2.4.1 Penyiapan Simplisia

a. Pengumpulan bahan baku

Kualitas bahan baku simplisia sangat dipengaruhi oleh beberapa

faktor, diantaranya : umur tumbuhan atau bagian tumbuhan pada waktu

panen, bagian tumbuhan dan lingkungan tempat tumbuh (Depkes RI,

2000).

b. Sortasi basah

Pada tahapan ini dilakukan pemisahan kotoran-kotoran atau bahan

asing lainnya yang terdapat pada simplisia sehingga tidak ikut terbawa

pada tahapan selanjutnya yang akan mempengaruhi hasil akhir (Depkes

RI, 2008).

14


c. Pencucian

Pencucian dilakukan untuk menghilangkan tanah dan pengotor

lainnya yang melekat pada simplisia. Pencucian dilakukan dengan

mengaliri simplisia menggunakan air bersih untuk menghilangkan

garam serta epifit yang menempel ditubuhnya (Pakpahan, 2017)

d. Perajangan

Pada tahap ini sampel dilakukan pemisahan bagian – bagian

tegakan dari sampel untuk mempermudah proses pengeringan,

pengepakkan dan penggilingan. Namun sebelumnya dilakukan

pengeringan pada bagian sampel secara utuh dengan diangin-anginkan

terlebih dahulu selama 3 hari (Depkes RI, 2008).

e. Pengeringan

Pengeringan bertujuan agar menghasilkan suatu simplisia yang

tidak mudah rusak, sehingga dapat disimpan dalam waktu yang lebih

lama. Dengan menurunkan kadar air dan menghentikan reaksi

enzimatik akan menghambat penurunan atau perusakan mutu simplisia.

Hal yang harus diperhatikan pada saat pengeringan antara lain : suhu

pengeringan, luas permukaan bahan. Bahan simplisia dapat dikeringkan

pada suhu 30°C sampai 90°C, tetapi suhu yang terbaik adalah tidak

melebihi suhu 60°C (Pakpahan, 2017).

f. Sortasi kering

Sortasi kering bertujuan untuk memisahkan benda-benda asing

seperti bagian-bagian tumbuhan yang tidak diinginkan dan pengotor

lain yang masih ada dan tertinggal pada simplisia kering (Depkes RI,

2000).

g. Pengepakan dan penyimpanan

Pengepakan simplisia dilakukan dengan menggunakan wadah

yang inert, tidak beracun, melindungi simplisia dari cemaran serta

mencegah adanya kerusakan. Sedangkan penyimpanan simplisia

sebaiknya ditempat dengan kelembaban yang rendah, terlindung dari

sinar matahari dan terhindar dari gangguan serangga maupun tikus

(Gunawan, 2004).

15


2.4.2 Pemeriksaan Mutu Simplisia

Pemeriksaan mutu simplisia dilakukan dengan cara pemeriksaan

organoleptik (makroskopik), pemeriksaan mikroskopik (anatomi histologi

simplisia), memisahkan bahan organik lainnya, pemeriksaan cemaran

mikroba, cemaran jamur dan cemaran pestisida (Gunawan, 2004).

2.5 Ekstrak

Ekstrak adalah sediaan kental yang diperoleh dengan mengekstraksi

senyawa aktif dari simplisia menggunakan pelarut yang sesuai, kemudian

semua atau hampir semua pelarut diuapkan dan massa atau serbuk yang

tersisa diperlakukan sedemikian hingga memenuhi baku yang telah ditetapkan

(Depkes RI, 2000).

2.6 Metode Ekstraksi

2.6.1 Cara dingin

a. Maserasi

Maserasi merupakan proses ekstraksi yang paling sederhana.

Proses pengekstrakan simplisia dengan menggunakan pelarut dengan

beberapa kali pengocokan atau pengadukan pada temperatur ruangan

(kamar). Cairan penyari akan menembus dinding sel dan masuk ke

dalam rongga sel yang mengandung zat aktif yang akan larut, karena

adanya perbedaan konsentrasi antara larutan zat aktif di dalam sel dan

diluar sel maka larutan terpekat didesak keluar (BPOM RI, 2006).

b. Perkolasi

Proses ekstraksi dengan pelarut yang baru sampai sempurna

(exhaustive extraction) yang umumnya dilakukan pada temperatur

ruangan. Proses terdiri dari tahapan pengembangan bahan, tahap

maserasi antara, tahap perkolasi sebenarnya (penetesan/penampungan

ekstrak), terus menerus sampai diperoleh ekstrak (perkolat) yang

jumlahnya 1-5 kali bertahan (Depkes RI, 2000).

16


2.6.2 Cara Panas

a. Refluks

Refluks adalah ekstraksi dengan pelarut pada temperatur titik

didihnya, selama waktu tertentu dan jumlah pelarut terbatas yang relatif

konstan dengan adanya pendingin balik. Pada metode refluks, sampel

dimasukkan bersama pelarut ke dalam labu yang dihubungkan dengan

kondensor. Pelarut dipanaskan hingga mencapai titik didih. Uap

terkondensasi dan kembali ke dalam labu (Seidel, 2006).

b. Sokletasi

Sokletasi adalah ekstraksi dengan menggunakan pelarut yang

selalu baru dan yang umumnya dilakukan dengan alat khusus sehingga

terjadi ekstrak kontinu dengan jumlah pelarut relatif konstan dengan

adanya pendingin balik (BPOM RI, 2006).

c. Digesti

Digesti adalah maserasi kinetik (dengan pengadukan kontinu)

pada temperatur yang lebih tinggi dari temperatur ruangan, yaitu secara

umum dilakukan pada temperatur 40-50ºC (BPOM RI, 2006).

d. Infundasi

Infundasi adalah proses penyarian yang umumnya dilakukan

untuk menyari zat kandungan aktif yang larut dalam air dari bahan-

bahan nabati. Proses ini dilakukan pada suhu 90ºC selama 15 menit

(Depkes RI, 2000).

e. Dekok

Dekok adalah infus pada waktu yang lebih lama dan temperatur

sampai titik didih air, yakni 30 menit pada suhu 90-100ºC (Depkes RI,

2000).

2.7 Pelarut

Pelarut merupakan zat yang digunakan sebagai media untuk melarutkan

zat lain. Jenis pelarut yang digunakan dalam prosedur ekstraksi sangat

menentukan senyawa aktif dari tanaman yang akan diperoleh. Sifat pelarut

yang baik untuk ekstraksi yaitu toksisitas dari pelarut yang rendah, mudah

menguap pada suhu rendah, dapat mengekstraksi komponen senyawa dengan

17


cepat (Tiwari et al., 2011). Berbagai pelarut yang digunakan dalam prosedur

ekstraksi antara lain :

1. Air

Air adalah pelarut universal, biasanya digunakan untuk

mengekstraksi produk tanaman dengan aktivitas antimikroba. Meskipun

pengobatan secara tradisional menggunakan air sebagai pelarut, tetapi

ekstrak tanaman dari pelarut organik telah ditemukan untuk

memberikan aktivitas antimikroba lebih konsisten dibanding dengan

ekstrak air (Tiwari et al., 2011).

2. Aseton

Aseton digunakan untuk melarutkan komponen senyawa

hidrofilik dan lipofilik dari tanaman. Keuntungan pelarut aseton yaitu

dapat bercampur dengan air, mudah menguap dan memiliki toksisitas

rendah (Tiwari et al., 2011).

3. Alkohol

Etanol lebih mudah untuk menembus membran sel untuk

mengekstrak sel, untuk mengekstrak bahan intraseluler dari bahan

tanaman. Metanol lebih polar dibanding etanol. Polifenol pada etanol

lebih tinggi dari pada di air. Sehingga aktivitas antioksidan pada pelarut

etanol lebih tinggi dibandingkan pelarut air. Senyawa flavonoid

terdeteksi dengan etanol 70% karena polaritasnya yang lebih tinggi

daripada etanol murni (Tiwari et al., 2011).

4. Kloroform

Terpenoid lakton telah diperoleh dengan ekstraksi berturut-turut

menggunakan n-heksan, kloroform dan methanol dengan konsentrasi

aktivitas tertinggi terdapat dalam fraksi kloroform. Senyawa tannin dan

terpenoid ditemukan dalam fase air, tetapi lebih sering diperoleh dengan

pelarut semipolar (Tiwari et al., 2011).

5. Eter

Eter pada umumnya digunakan secara selektif untuk ekstraksi

kumarin dan asam lemak (Tiwari et al., 2011).

18


6. N-heksan

N-heksan mempunai karakteristik sangat tidak polar, volatile,

mempunyai bau khas yang dapat menyebabkan pingsan. N-heksan

biasanya digunakan sebagai pelarut untuk ekstraksi minyak nabati

(Tiwari et al., 2011).

7. Etil Asetat

Etil asetat adalah senyawa organic dengan rumus empris

CH3COOC2H5. Senyawa ini merupakan ester dari ethanol dan asam

asetat. Senyawa ini berwujud cairan tidak berwarna dan memiliki aroma

khas. Etil asetat adalah pelarut polar menengah yang mudah menguap,

tidak beracun dan tidak higroskopis. Sifat fisika etil asetat memiliki

berat 88,105 g/mol, densitas 0,897 g/mol, titik leleh -83,6, titik didih

77,1 °C dan titik nyala -4 °C (Palwa, 2016).

2.8 Vacuum Rotary Evaporator

Vacuum rotary evaporator adalah alat yang berfungsi untuk

memisahkan suatu larutan dari pelarutnya sehingga dihasilkan ekstrak dengan

kandungan kimia tertentu sesuai yang diinginkan. Cairan yang ingin diuapkan

biasanya ditempatkan dalam suatu labu yang kemudian dipanaskan dengan

bantuan penangas, dan diputar. Uap cairan yang dihasilkan didinginkan oleh

suatu pendingin (kondensor) dan ditampung pada suatu tempat (receiver

flask). Setelah pelarutnya diuapkan, akan dihasilkan ekstrak yang dapat

berbentuk ekstrak kental atau cair (Prijono, 1999).

Prinsip kerja alat ini didasarkan pada titik didih pelarut dan adanya

tekanan yang menyebabkan uap dari pelarut terkumpul di atas, serta adanya

kondensor (suhu dingin) yang menyebabkan uap ini mengembun dan

akhirnya jatuh ke tabung penerima (receiver flask).

19


Gambar 2.7 Vacuum rotary evaporator Sumber : (Pratama, 2017)

2.9 Kromatografi

Kromatografi menurut Union of Pure and Applied Chemistry (IUPAC)

adalah suatu metode yang digunakan dalam pemisahan komponen–komponen

dalam suatu sampel yang terdistribusi dalam dua fasa yaitu fasa diam fasa

gerak. Fasa diam dapat berupa padat, cair, atau gel. Sedangkan fase geraknya

berupa gas atau cairan (Rubiyanto, 2016).

2.9.1 Kromatografi Kolom

Kromatografi kolom adalah kromatografi yang menggunakan kolom

sebagai alat untuk memisahkan komponen-komponen dalam campuran. Alat

tersebut berupa pipa gelas yang dilengkapi suatu kran di bagian bawah kolom

untuk mengendalikan aliran zat cair (Pakpahan, 2017).

Kromatografi kolom merupakan salah satu metode kromatografi yang

dapat digunakan untuk fraksinasi ini merupakan cara yang terbaik untuk

pemisahan campuran dalam jumlah besar (lebih dari 1 g). Campuran yang

akan dipisahkan pada kromatografi kolom adalah berupa pita pada bagian atas

kolom penjerap yang berada dalam tabung kaca, tabung logam, atau bahkan

tabung plastik. Pelarut eluen dibiarkan mengalir melalui kolom karena aliran

yang disebabkan oleh gaya berat atau didorong dengan tekanan (Pakpahan,

2017)

Prinsip kerja kromatografi kolom adalah cuplikan senyawa di bawa oleh

zat cair mengalir melalui fase diam sehingga terjadi interaksi berupa adsorbsi

senyawa–senyawa oleh padatan dalam kolom. Hasil yang di peroleh berupa

fraksi–fraksi senyawa yang ditampung pada bagian bawah kolom. Untuk

20


dapat hasil yang maksimal perlu pemilihan fase diam dan fase gerak yang

tepat. Faktor yang diperhatikan saat memilih fase diam dan fase gerak adalah

polaritas dan kelarutan (Rubiyanto, 2016).

2.9.2 Kromatografi Lapis Tipis

Kromatografi lapis tipis (KLT) merupakan salah satu metode

pemisahan dengan menggunakan peralatan sederhana yaitu dengan

menggunakan plat kaca atau plat alumunium. Ukuran plat kromatografi

biasanya 20 x 20 cm. Penjerap yang paling umum digunakan adalah silika

gel. Kromatografi lapis tipis (KLT) dapat dipakai dengan dua tujuan.

Pertama, dipakai sebagai metode untuk mencapai hasil kualitatif,

kuantitatif, dan preparatif. Kedua, dipakai untuk menjajaki sistem pelarut

dan sistem penyangga yang akan dipakai dalam kromatografi kolom atau

kromatografi cair kinerja tinggi. Analisis dari KLT dapat membantu

menentukan pelarut terbaik yang akan dipakai dan berapa perbandingan

antar pelarut yang akan digunakan sebagai fase gerak pada kromatografi

kolom (Tsurayya, 2017).

Dalam mengidentifikasi noda-noda dalam kromatografi sangat

lazim menggunakan harga Rf (Retordation Factor) yang didefinisikan

sebagai:

𝑅𝑓 =𝐽𝑎𝑟𝑎𝑘 𝑡𝑖𝑡𝑖𝑘 𝑝𝑢𝑠𝑎𝑡 𝑏𝑒𝑟𝑐𝑎𝑘 𝑑𝑎𝑟𝑖 𝑡𝑖𝑡𝑖𝑘 𝑎𝑤𝑎𝑙

𝐽𝑎𝑟𝑎𝑘 𝑔𝑎𝑟𝑖𝑠 𝑑𝑒𝑝𝑎𝑛 𝑝𝑒𝑙𝑎𝑟𝑢𝑡 𝑑𝑎𝑟𝑖 𝑡𝑖𝑡𝑖𝑘 𝑎𝑤𝑎𝑙

2.10 Nuclear Magnetic Resonance (NMR)

Spektroskopi NMR merupakan salah satu metode spektroskopi yang

sangat bermanfaat dalam penentuan struktur yang didasarkan pada momen

magnet dari inti atom. Inti yang paling penting untuk penentuan struktur

senyawa organic yaitu ¹H dan ¹³C. spectrum ¹H NMR didasarkan pada

pengukiuran absorbs radiasi elektromagnetik pada daerah frekuensi radio 4-

600 MHz atau panjang gelombang 75-0,5 m oleh inti atom yang berputar

didalam medan magnet. Spektrum ¹H NMR dapat membedakan jenis proton

dan mengungkapkan berapa banyak jenis proton yang ada di dalam suatu

molekul.

21


Beberapa hal yang perlu diperhatikan dalam menginterpretasikan

spektrum ¹H NMR adalah luas puncak yang dinyatakan dengan integrasi yang

menunjukkan jumlah inti ¹H pada puncak tersebut. Pemecahan puncak yang

menerangkan lingkungan dari sebuah proton tetangganya, serta geseran kimia

yang menunjukkan jenis proton tersebut. Spektrum ¹H biasanya diperoleh

dengan cara sampel senyawa yang akan dianalisis dilarutkan dalam pelarut

inert yang tidak memiliki ¹H. sebagai contoh CCL4 atau pelarut hydrogen

yang digantikan oleh pelrut deuterium, seperti CDCl3 (deuterikloroform) dan

CD3COCD3 (heksadeuterioaseton). Struktur NMR memberikan informasi

mengenai lingkungan dan struktur gugusan yang berdekatan dengan setiap

atom hidrogen (Tsurayya, 2017).

Gambar 2.8 Diagram korelasi spektrum 1H-NMR Sumber : (Pavia, 2001)

2.11 Enzim PfMQO

Enzim atau fermen (dalam bahasa yunani, en = di dalam dan zyme =

ragi) adalah senyawa organik yang tersusun atas protein, dihasilkan oleh sel,

dan berperan sebagai biokatalisator dalam reaksi kimia. Enzim adalah

biokatalisator organik yang dihasilkan organisme hidup di dalam

protoplasma, yang terdiri atas protein atau suatu senyawa yang berikatan

dengan protein, berfungsi sebagai senyawa yang mempercepat proses reaksi

22


tanpa habis bereaksi dalam suatu reaksi kimia. Hampir semua enzim

merupakan protein (Pratama, 2017).

Enzim adalah protein yang berfungsi sebagai katalisator, senyawa yang

meningkatkan kecepatan reaksi kimia. Enzim berikatan dengan substrat.

Dengan adanya enzim, molekul awal yang disebut substrat akan dipercepat

perubahannya menjadi molekul lain yang disebut produk (Marks et al., 2000).

Enzim dapat diproduksi oleh mikroba atau bahan lainnya seperti hewan dan

tanaman. Enzim juga dapat diisolasi dalam bentuk murni (Pratama, 2017)

Gambar 2.9 Peran enzim PfMQO Sumber : (Hartuti et al., 2018b)

Malate Quinon Oxidoreductase (MQO) adalah enzim kunci yang

terlibat di siklus TCA, siklus fumarat dan rantai respirasi. Pada siklus TCA

menghubungkan rantai respirasi dengan mentransfer elektron dari malat ke

ubiquinone untuk memproduksi oksaloasetat dan ubiquinol. Karena P.

falciparum MQO (PfMQO) sangat penting pada sirkulasi darah, dan tidak

terdapat pada genom manusia, PfMQO dianggap sebagai target obat yang

potensial. Rekombinan bakteri sistem ekspresi PfMQO sebagai inhibitor

poten dengan aktivitas antimalaria berhasil dikembangkan untuk pertama

kalinya (Hartuti et al., 2018). Hartuti et al., untuk pertama kalinya berhasil

mengembangkan sistem ekspresi rekombinan yang aktif dari jenis MQO

mitokondria, sistem screening dan diidentifikasi sebagai inhibitor ampuh.

23


PfMQO dapat ditargetkan oleh molekul kecil, dan dengan demikian, secara

kimia PfMQO tervalidasi sebagai target obat untuk pengembangan obat

antimalaria baru (Hartuti et al., 2018).


BAB III METODE PENELITIAN

BAB III

METODE PENELITIAN

3.1 Tempat dan Waktu Penelitian

Penelitian ini dilakukan di Laboratorium Fakultas Ilmu Kesehatan

Universitas Islam Negeri Syarif Hidayatullah Jakarta yang diantaranya

Laboratorium Penelitian 1, Laboratorium Farmakognosi Fitokimia, dan

Laboratorium Riset Fakultas Kedokteran dan Laboratorium Biologi Fakultas

Kedokteran . Penelitian ini dilakukan pada bulan Januari sampai November

2019.

3.2 Alat dan Bahan Penelitian

3.2.1 Alat Penelitian

Alat-alat yang digunakan terdiri dari tabung reaksi (Pyrex), pipet tetes,

Erlenmeyer, beaker glass, gelas ukur, spatula, batang pengaduk, kaca arloji,

cawan penguap, vial, kurs porselen, timbangan analitik, lumping, alu, blender,

hot plate, kapas, kertas saring, rotary evaporator, Lampu Uv, baskom, botol

maserasi, botol kaca 600 mL, kolom kromatografi, oven, spektrofotometri

Uv-Vis, Microtubes, Pipet Tips, Microplate, Micropipet, tip, pipa kapiler,

chamber KLT

3.2.2 Bahan

1. Bahan Uji

Bahan uji yang digunakan dalam penelitian ini adalah daun

tanaman beluntas (Pluchea indica L.) yang diperoleh dari Balai

Penelitian Tanaman Rempah dan Obat (BALITRO) Bogor.

2. Bahan Kimia

Bahan kimia yang digunakan dalam penelitian ini antara lain : n-

heksan, etil asetat, asam sulfat 2N, pereaksi Meyer, perekasi

Dragendorf, HCl, FeCl3 10%, kloroform, asam asetat anhidrat, 2N,

H2SO4, NaOH, etanol 70%, aquadest, silica gel 60 GF254 dengan

ukuran pori 0.063-0.2 mm, kalium sianida (KCN), decylubiquinone

(d-uQ),dimetil sulfoksida (DMSO) 100%, 2-[4-(2-hydroxyetyl)

piperazin-1-yI] ethanesulfonic acid (HEPES) (pH 7.0), substrat malate,

25


2-6 dikloroindophenol (DCIP), dan Enzim MQO P. falciparum.

3.3 Prosedur Penelitian

3.3.1 Determinasi Tanaman

Determinasi tanaman beluntas dilakukan di Herbarium Bogoriense

Bidang Botani, Puslit Biologi, Lembaga Ilmu Pengetahuan Indonesia (LIPI),

Bogor.

3.3.2 Penyiapan Simplisia

Daun beluntas segar diperoleh dari Balai Penelitian Tanaman Rempah

dan Obat Bogor (Balitro), kemudian dilakukan sortasi basah untuk

memisahkan kotoran-kotoran lalu dicuci menggunakan air mengalir dan

dikering anginkan. Simplisia yang telah kering silakukan sortasi kering lalu

dihaluskan dengan menggunakan blender. Simplisia selanjutnya ditimbang

dan diekstraksi dengan pelarut n-heksan dan etil asetat.

3.3.3 Pembuatan dan Partisi Ekstrak

Simplisia yang telah dihaluskan dan ditimbang kemudian dilakukan

ekstraksi dengan cara maserasi bertingkat dengan menggunakan pelarut n-

heksan dan etil asetat. Pertama simplisia ditimbang terlebih dahulu lalu

dimasukkan ke dalam botol gelap direndam dengan pelarut n-heksan sampai

simplisia terendam dan dilebihi 3 cm. Perendaman dilakukan 3 x 24 jam

sambil sesekali botol dikocok. Hasil maserasi kemudian disaring

menggunakan kapas dan kertas saring. Ampas dilakukan maserasi kembali

dengan menggunakan pelarut n-heksan selama 3 x 24 jam dan disaring

kembali, proses ini diulang hingga 3 kali. Setelah proses selesai, ampas

dikeluarkan dari botol lalu dikering anginkan selama kurang lebih 30 menit.

Ampas dimasukkan kembali kedalam botol gelap dan direndam dengan

pelarut etil asetat selama 3 kali 24 jam dan disaring dengan menggunakan

kapas dan kertas saring. Proses ini diulang hingga 3 kali.

Larutan maserat dari n-heksan dan etil asetat dipekatkan dengan vaccum

rotary evaporator hingga diperoleh ekstrak kental dan dihitung persen

rendemennya. Ekstrak kental kemudian disimpan didalam refrigrator suhu

4°C. Untuk menghitung rendemen ekstrak digunakan rumus sebagai berikut

:

26


% Rendemen ekstrak = bobot ekstrak kental yang diperoleh (g)

𝑏𝑜𝑏𝑜𝑡 𝑠𝑖𝑚𝑝𝑙𝑖𝑠𝑖𝑎 𝑦𝑎𝑛𝑔 𝑑𝑖𝑒𝑘𝑠𝑡𝑟𝑎𝑘𝑠𝑖 (𝑔) 𝑥 100%

3.3.4 Penentuan Parameter-Parameter Standarisasi

1. Parameter Spesifik

a. Skrining Fitokimia Ekstrak

Skrining fitokimia ini dilakukan untuk mengetahui kandungan

metabolit sekunder yang terdapat didalam ekstrak etil asetat daun

beluntas. Skrining fitokimia ekstrak etil asetat daun beluntas antara lain

penentuan golongan alkaloid, flavonoid, saponin, triterpenoid, steroid,

tanin, polifenol dan kuinon.

a) Penentuan Golongan Alkaloid

Sebanyak 0,5 g ekstrak dilarutkan dalam HCl 1% dan

disaring. Filtrat dibagi menjadi 2 bagian, 1 bagian ditetesi dengan

pereaksi Mayer dan bagian lainnya ditetesi dengan pereaksi

Dragendorf. Hasil positif ditunjukkan dengan terbentuknya

endapan putih dengan pereaksi Mayer dan endapan merah dengan

pereaksi Dragendorf (Ahmad, Singh, dan Pandey, 2013).

b) Penentuan Golongan Flavonoid

Sebanyak 0,5 g ekstrak dilarutkan dalam 2 ml etanol 70%

dan ditambahnkan 3 tetes larutan NaOH. Terjadi perubahan warna

dari warna kuning menjadi tidak berwarna pada penambahan asam

sulfat menunjukkan adanya senyawa flavonoid (Triwari et al,

2011)

c) Penentuan Golongan Saponin

Sebanyak 0,5 g ekstrak dimasukkan kedalam tabung reaksi,

ditambahkan 10 ml air panas, didinginkan dan kemudian dikocok

vertical selama 10 detik. Adanya pembentukan busa sitinggi 1-10

cm yang stabil selama tidak kurang dari 10 menit menunjukkan

positif golongan saponin. Pada penambahan 1 tetes HCl 2N, busa

tidak hilang (Putri, Warditiani, & Larasanti, 2013).

27


d) Penentuan Golongan Triterpenoid dan Steroid

Ekstrak dilarutkan dalam 0,5 ml kloroform, kemudian

ditambahkan 0,5 ml asam asetat anhidrida dan ditetesi dengan 2

ml asam sulfat pekat. Hasil uji positif untuk triterpenoid bila

terbentuk cincin kecoklatan atau violet. Hasil uji positif untuk

steroid bila terbentuk warna hijau kebiruan (Simamere, 2014).

e) Penentuan Golongan Tanin dan Polifenol

Sebanyak 1,5 g ekstrak dilarutkan dalam 5 mL air aquadest

kemudian diteteskan larutan besi (III) klorida 10%. Jika terjadi

perubahan warna menjadi biru kehitaman, biru tua atau hitam

kehijauan menunjukkan adanya tanin dan polifenol (Simamere,

2014).

f) Penentuan Golongan Kuinon

Sebanyak 0,5 g ekstrak dilarutkan dalam 10 ml air dan

dipanaskan diatas penangas air kemudian ditambahkan beberapa

tetes natrium hidroksida 1 N. Jika terjadi perubahan warna menjadi

merah menunjukkan adanya kuinon (Noer, 2016).

2. Parameter Non Spesifik

a. Penetapan Kadar Air Ekstrak

Kadar air dalam suatu ekstrak menurut Departemen Kesehatan RI

dapat ditentukan dengan metode gravimetric, krus porselen kosong

dikonstankan dengan pemanasan pada suhu 105°C selama 2 jam lalu

didinginkan didalam desikator. Kemudian 1 g ekstrak ditimbang dengan

wadah yang sudah ditara. Ekstrak dikeringkan pada suhu 105°C selama

5 jam lalu didinginkan didalam desikator lalu ditimbang kembangi.

Proses diulangi sampai berat ekstrak menjadi konstan atau 2

penimbangan 2 kali berturut-turut perbedannya tidak lebih dari 0,25%.

Kadar air dihitung dalam persen dibagi dengan bobot awal (Depkes RI,

2010).

28


b. Penetapan Kadar Abu Ekstrak

Kadar abu dalam suatu ekstrak dapat ditentukan dengan

menimbang seksama sebanyak 1 g ekstrak (W1) dimasukkan kedalam

krus silikat yang sebelumnya telah dipijarkan dan ditimbang (W0).

Setelah itu ekstrak dipijarkan menggunakan tanur secara perlahan-lahan

(dengan suhu dinaikkan secara bertahap hingga 600±25°C hingga arang

habis. Kemudian ditimbang sampai bobot menjadi tetap (W2) (Arifin,

Anggraini, Handayani, dan Rasyid, 2006). Berikut perhitungannya :

% Kadar abu total = W2−W0

𝑊1 𝑥 100%

W0 = Berat krus kosong

W1 = Berat ekstrak awal

W2 = Berat cawan + ekstrak setelah dioven

3.3.5 Isolasi Ektrak

1. Fraksinasi menggunakan Kromatografi Kolom

Pemisahan senyawa dari fraksi etil asetat ekstrak daun beluntas

dilakukan dengan menggunakan kromatografi kolom. Kromatografi

kolom dilakukan dengan dua tahapan. Kolom kromatografi pertama

memiliki ukuran panjang 70 cm dan diameter 3 cm sedangkan kolom

kromatografi kedua memiliki ukuran panjang 30 cm dan diameter 2,5

cm. Fase diam yang digunakan adalah silica gel 60 GF254 dengan

ukuran pori 0.063-0,2 mm yang bersifat polar dan fase geraknya adalah

kombinasi kepolaran bertingkat n-heksan dan etil asetat dimulai dari n-

heksan 100%, 9:1, 8:2, 7:3, dan 6:4 lalu dibilas dengan menggunakan

metanol.

Adapun penyiapan kolom kromatografi antara lain menyiapkan

kolom kromatografi. Bagian dasar kolom disumbat dengan

menggunakan kapas. Kolom dialiri dengan pelarut n-heksan dan kapas

ditekan-tekan menggunakan batang pengaduk sampai tidak ada udara

yang terjerat. Ditimbang silica gel seberat 10 kali berat ekstrak kental

etil asetat daun beluntas kemudian dimasukkan kedalam beaker glass

dan ditambahkan pelarut n-heksan sampai terbentuk seperti bubur dan

diaduk sampai terbentuk suspensi. Suspensi silica gel dimasukkan

29


kedalam kolom kromatografi yang terlah berisi n-heksan sedikit demi

sedikit sambil diketuk-ketuk. Pelarut yang mengalir ditampung dan

dimasukkan kembali kedalam kolom kromatografi hingga silika gel

menjadi padat. Lalu kolom yang berisi n heksan didiamkan selama 1

malam.

3. Pemurnian Kristal

Hasil subfraksi kolom kromatografi kedua dilakukan pemurnian

terhadap kristal yang diperoleh. Prosedur pemurnian dilakukan dengan

menambahkan pelarut n-heksan pada subfraksi kemudian dikocok

secara perlahan hingga komponen lain dapat larut tanpa melarutkan

kristal. Komponen yang terlarut dalam n-heksan ditarik dengan

menggunakan pipet tetes yang telah disumbat dibagian ujung dengan

kapas secara perlahan sehingga yang tersisa hanya kristal.

4. Uji Kemurnian Senyawa

Uji kemurnian senyawa dilakukan dengan menggunakan plat

KLT 2 dimensi dengan ukuran 5 cm x 5 cm. sejumlah Kristal dilarutkan

dengan etil asetat kemudian ditotolkan pada plat KLT. Plat KLT dielusi

dengan fase gerak n-heksan : etil asetat (8:2). Kemudian plat KLT

dielusi kembali pada sisi lainnya dengan fase gerak yang sama.. bercak

dilihat dibawah lampu UV 254 nm.

Gambar 3.1 Skema KLT 2 Dimensi

30


5. Identifikasi Senyawa Murni

Penentuan struktur senyawa murni dilakukan dengan

menggunakan instrument 1H-NMR yang dilakukan di LIPI, Serpong.

Senyawa isolat dilarutkan dengan pelarut khusus untuk NMR yaitu

CDCl3. Kemudian dianalisa dengan menggunakan JEOL 1H-NMR pada

frekuensi 500 Mhz.

3.3.6 Uji Aktivitas Senyawa Terhadap Enzim PfMQO

1. Pembuatan Larutan Assay PfMQO

Komposisi dari assay mix untuk pengujian ekstrak beluntas

terhadap enzim PfMQO adalah sebagai berikut :

Tabel 3.1 Komposisi assay mix No. Nama Bahan Volume

yang

Diambil

Konsentrasi

Awal

Konsentrasi

Akhir

1. Hepes pH 7.0 20 µl 50 mM 50 mM

2. KCN 20 µl 1 M 1 mM

3. d-UQ 8,3 µl 60 mM 25 µM

4. DCIP 200 µl 12 mM 120 µM

5. PfMQO

membrane stock

3,1 µl 2,78 µg/ml 0,43 µg/ml

6. Substrat

Malate*

5 µl 400 mm 10 mM

*) Substrat malate ditambahkan setelah bahan 1 sampai 5 dicampur dan

di ukur pada panjang gelombang 600 nm selama tiga menit dengan

spektrofotometri UV- Vis.

Pembuatan assay mix terdiri dari larutan 50 mM HEPES sebanyak

20 µl, ditambahkan KCN 1 M 20 µl, lalu ditambahkan d-UQ 8,33 µl,

200 µl DCIP dan terakhir di tambahkan enzim PfMQO membran stock

sebanyak 3,1 µl. Kemudian di mixing selama 15 detik dua kali dan

diinkubasi pada suhu 37⁰C selama 3 menit selanjutnya serapan diukur

pada panjang gelombang 600 nm dengan Spektrofotometer

(Thermoscientific Multiscan Go) sebagai background. Setelah 3 menit

ditambahkan 5 µl dari 400 mM substrat malate lalu diukur selama 10

menit.

31


2. Enzim MQO

Membran enzim diperoleh dari BPPT, Serpong hasil penelitian

Inaoka.

6. Penyiapan Ekstrak

Ekstrak ditimbang secara seksama seberat 2-8 mg, dimasukkan ke

dalam tabung lalu tambahkan DMSO 100% sebanyak ekstrak yang

diambil agar konsentrasi ekstrak didalam tube 10 mg/ml. Lalu divortex

dan disonikasi agar ektrak dan DMSO homogen. Masukan 100 µl

ekstrak dari dalam tabung ke dalam V plate yang sudah disediakan.

Dengan pada posisi 1 dan 12 dimasukkan DMSO 100% dan posisi 2-11

dimasukkan ekstrak. Seperti tabel dibawah.

Tabel 3. 2 Peta Letak Ekstrak Larutan Induk 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12

A

DM

SO

100%

Ekstrak 100 µl

DM

SO

100%

B

C

D

E

F

G

H

Dimasukkan 2 µl dari larutan induk ke dalam plate uji yang

memiliki 96 well plate. Seperti tabel dibawah.

Tabel 3. 3 Peta Letak Ekstrak Saat Pengujian 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12

A

DM

SO

100%

tanpa

subst

rat

mal

at

DM

SO

10

0%

den

gan

substrat m

alat

B

C Ekstrak 2 µl D

E F

G Ekstrak 2 µl H

Setelah itu tambahkan 193 µl (untuk volume 2 µl). Plate reader

dihomogenkan terlebih dahulu selama 15 sec (2x) lalu diukur pada

spektrofotometer (Thermoscientific Multiscan Go) dengan suhu 37°C

pada panjang gelombang 600 nm. Diukur selama 3 menit. Lalu setelah

3 menit ditambahkan 5 µl dari 400 mM sodium malate lalu diukur

32


kembali pada spektrofotometer(Thermoscientific Multiscan Go) selama

10 menit pada panjang gelombang 600 nm dan suhu 37°C.

7. Pengujian IC50

Setiap seri konsentrasi larutan uji dimasukkan sebanyak 2 µl

kedalam 96 well plate kemudian ditambahkan 193 µl assay mix dan

dilakukan sebanyak 2 kali pengulangan. Konsentrasi isolat murni yang

digunakan adalah 100 ppm, 20 ppm, 10 ppm, 1 ppm dan 0,1 ppm.

8. Perhitungan Aktivitas Enzim

Persen inhibisi dari ekstrak beluntas terhadap enzim PfMQO

dapat dihitung dengan menggunakan rumus :

(Pratama, 2017)


BAB VI HASIL DAN PEMBAHASAN

BAB VI

HASIL DAN PEMBAHASAN

4.1 Determinasi Tanaman

Determinasi tanaman dilakukan untuk memastikan identitas dari

tanaman beluntas tersebut. Proses determinasi tanaman tersebut dilakukan di

Herbarium Bogoriense, Bidang Botani, Pusat Penelitian Biologi, Lembaga

Ilmu Pengetahuan Indonesia (LIPI) Cibinong, Bogor. Hasil dari determinasi

sampel tanaman menyatakan bahwa sampel merupakan Pluchea indica (L)

Less. (lampiran 1)

4.2 Penyiapan Simplisia

Tanaman beluntas yang digunakan pada penelitian ini berasal dari Balai

Penelitian Tanaman Rempah dan Obat Bogor dan dipanen pada awal bulan

Februari. Bagian tanaman yang digunakan adalah daun karena pada penelitian

terdahulu telah dilakukan uji antimalaria daun beluntas dan memiliki aktivitas

yang cukup tinggi. Tanaman ini banyak tumbuh liar di daerah kering di tanah

yang keras dan berbatu dan biasanya dijadikan sebagai tanaman pagar oleh

masyarakat.

Sebanyak 12 kg daun beluntas segar dilakukan sortasi basah untuk

memisahkan kotoran-kotoran atau bahan-bahan asing lainnya dari bahan

simplisia seperti tanah, kerikil, rumput, batang, daun yang telah rusak serta

kotoran lain yang harus dibuang.. Setelah dilakukan sortasi basah, sampel

kemudian dicuci dengan menggunakan air bersih yang mengalir dan

dilakukan dalam waktu yang sesingkat mungkin. Pencucian ini dilakukan

untuk menghilangkan tanah dan kotoran lain yang melekat pada simplisia

(Prasetyo & Inoriah, 2013).

Setelah bersih, sampel kemudian dikering anginkan pada suhu kamar

dan terhindar dari sinar matahari langsung selama 7 hari. Pengeringan dibantu

dengan kipas angin untuk mempercepat pengeringan dan sampel setiap 3-5

kali sehari di bolak-balik agar proses pengeringan berjalan merata dan

sempurna. Tujuan dari pengeringan adalah untuk mendapatkan simplisia yang

34


tidak mudah rusak sehingga dapat disimpan dalam waktu yang lebih lama.

Dengan mengurangi kadar air dan menghentikan reaksi enzimatik maka dapat

mencegah penurunan mutu atau perusakan simplisia. Simplisia yang telah

kering lalu dilakukan sortasi kering untuk memisahkan sisa kotoran yang

masih tertinggal serta adanya ranting atau bunga yang tertinggal kemudian

sampel dihaluskan dengan menggunakan blender sampai menjadi serbuk dan

kemudian ditimbang. Hasil timbangan serbuk simplisia yang didapat 1,7 kg.

Serbuk simplisia kemudian disimpan dalam wadah kering, bersih, tertutup

rapat dan terlindung dari sinar cahaya matahari (Prasetyo & Inoriah, 2013).

4.3 Pembuatan Ekstrak

Proses ekstraksi dilakukan dengan cara dingin yaitu dengan cara

maserasi bertingkat. Cara ini bertujuan untuk meminimalisir terjadinya

pemanasan yang dapat menyebabkan terjadinya kerusakan pada senyawa

yang tidak tahan panas. Keuntungan dari cara ini yaitu pengerjaan dan

peralatan yang digunakan mudah dan sederhana serta tidak akan terbentuknya

emulsi yang akan menghambat proses pemisahan. Sedangkan kerugiannya

yaitu membutuhkan banyak pelarut dan penyariannya tidak berlangsung

maksimal. Maserasi bertingkat ini bertujuan untuk memaksimalkan proses

ektraksi dimana senyawa akan terekstraksi berdasarkan kepolarannya.

Ekstraksi yang pertama sebanyak 1,7 kg serbuk simplisia kering daun

beluntas dimaserasi dengan 15 L pelarut n-heksan selama 3 hari, maserasi

dilakukan sebanyak 3 kali. Pelarut n-heksan ini merupakan jenis pelarut non

polar sehingga n-heksan dapat melarutkan senyawa-senyawa yang bersifat

non polar (Rachmawati et al., 2014). Hasil maserasi disaring dan filtrat yang

diperoleh dipekatkan dengan menggunakan vacuum rotary evaporator pada

suhu 40°C dan diperoleh ekstrak kental n-heksan sebanyak 24,09 gram. Hasil

dari ampas n-heksan kemudian dikering anginkan selama 1 jam dan

dimaserasi dengan etil asetat sebanyak 15 L. Etil asetat merupakan pelarut

yang bersifat semi polar sehingga dapat melarutkan senyawa yang bersifat

semi polar pada dinding sel (Rachmawati et al., 2014). Hasil maserasi disaring

dan filtrat yang diperoleh dipekatkan dengan menggunakan vacuum rotary

evaporator pada suhu 40°C dan diperoleh ekstrak kental etil asetat sebanyak

35


37,46 gram. Setiap ekstrak dihitung rendemen yang diperoleh dengan

membandingkan antara ekstrak kental yang diperoleh dengan simplisia awal

(Depkes RI, 2000).

Tabel 4.1 Hasil Perhitungan Rendemen Ekstrak

Fraksi Berat Ekstrak

(gram)

Rendemen

n-Heksan 24,09 1,41 %

Etil asetat 37,46 2,20 %

Nilai rendemen yang dihasilkan dapat disebabkan oleh beberapa faktor

yaitu metode ekstraksi, ukuran partikel sampel, kondisi dan waktu

penyimpanan, lama waktu ekstraksi, perbandingan jumlah sampel dan jumlah

pelarut yang digunakan (Isma, 2017). Rendemen etil asetat lebih besar

dibandingkan dengan n-heksan. Hal tersebut menunjukkan bahwa senyawa

yang terkandung dalam daun beluntas lebih banyak yang bersifat semi polar

dibandingkan senyawa non polar. Prinsip pelarutan yang dipakai pada metode

ini like dissolve like yang dimana pelarut polar akan melarutkan senyawa

yang bersifat polar dan pelarut non polar akan melarutkan senyawa yang

bersifat non polar (Pakpahan, 2017).

4.4 Pengukuran Kadar Air Ekstrak

Pengukuran kadar air ekstrak ini bertujuan untuk memberikan batasan

minimal atau rentang tentang besarnya kandungan air didalam bahan.

Menurut Depkes RI (2008) menyatakan bahwa batas kadar air yang

ditetapkan adalah ≤ 10%. Berdasarkan hasil yang didapat ekstrak daun

beluntas sudah memenuhi persyaratan dimana kadar air ekstrak tersebut

sebesar 7,86 %. Pengaturan kadar air yang sesuai dengan standar bertujuan

untuk menghindari pertumbuhan jamur yang cepat pada ekstrak. Semakin

sedikit kadar air suatu ekstrak maka akan semakin kecil kemungkinan ekstrak

terkontaminasi oleh jamur (Hidayati et al., 2018).

4.5 Pengukuran Kadar Abu Ekstrak

Pengukuran kadar abu ditujukan untuk mengetahui jumlah bahan

anorganik atau bahan mineral yang tersisa setelah proses pengabuan.

Pengukuran kadar abu ini dapat memberikan gambaran kandungan mineral

internal dan eksternal yang berasal dari proses awal sampai terbentuknya

36


ekstrak. Hasil kadar abu ekstrak etil asetat daun beluntas adalah 2,56 %. Sifat

fisik bahan atau ekstrak dapat dipengaruhi oleh adanya kadar senyawa

anorganik ataupun mineral yang ada pada ekstrak (Hidayati et al., 2018).

4.6 Penapisan Fitokimia

Penapisan fitokimia bertujuan untuk mengetahui senyawa yang

terkandung dalam tanaman berdasarkan golongannya. Hasil uji penapisan

fitokimia ekstrak etil asetat dari daun beluntas dapat dilihat pada tabel berikut.

Tabel 4.2 Hasil skrining fitokimia ekstrak etil asetat daun beluntas

No. Golongan

Kimia

Hasil Keterangan Penelitian

(Pratama, 2017)

1 Alkaloid (-) Tidak terbentuk

endapan

(+)

2 Flavonoid (+) Perubahan warna

dari warna

kuning menjadi

tidak berwana

(+)

3 Saponin (+) Terbentuk busa (+)

4 Triterpenoid

dan Steroid

(+)

(Steroid)

Terbentuk warna

hijau gelap

(+)

5 Tanin dan

Polifenol

(+) Terbentuk warna

biru tua

(+)

6 Kuinon (+) Larutan warna

merah

(-)

Keterangan (+) = positif, (-) = negatif

Hasil penapisan fitokimia menunjukkan bahwa ekstrak etil asetat daun

beluntas mengandung golongan senyawa flavonoid, saponin, steroid, tanin,

polifenol dan kuinon. Flavonoid memiliki gugus hidroksi yang tidak

tersubstitusi sehingga bersifat polar. Flavonoid dalam tumbuhan terikat pada

gula sebagai glikosida dan aglikon flavonoid, gula yang terikat pada flavonoid

mudah larut dalam air. Flavonoid juga merupakan golongan terbesar dari

senyawa fenol (Noer, 2016).

Saponin memiliki glikosil yang berfungsi sebagai gugus polar dan

gugus steroid sebagai gugus non polar. Etil asetat merupakan pelarut

semipolar yang mampu menarik senyawa dengan rentang polaritas lebar dari

polar hingga nonpolar (Putri, Warditiani, & Larasanti, 2013). Tanin

merupakan golongan golongan senyawa aktif tumbuhan yang bersifat fenol,

mempunyai rasa sepat dan mempunyai kemampuan menyamak kulit. Kuinon

37


adalah senyawa berwarna dan mempunyai kromofor dasar seperti pada

kromofor benzokuin yang terdiri atas dua gugus karbonil yang terkonjugasi

dengan dua ikatan rangkap karbon-karbon (Noer, 2016)

Hasil negatif ditunjukkan pada uji alkaloid dan berbeda dengan

penelitian sebelumnya dimana ekstrak etil asetat daun beluntas memiliki

kandungan alkaloid (Pratama, 2017). Hal ini dimungkinkan bahwa

kandungan alkaloid yang tertarik hanya sedikit sehingga tidak dapat terdeteksi

dengan menggunakan skrining fitokimia. Alkaloid memiliki basa nitrogen

pada rantai sikliknya dan mengandung berbagai konstituen sehingga alkaloid

bersifat semipolar dan dapat tertarik oleh pelarut semi polar (Putri et al.,

2013).

4.7 Isolasi dan Pemurnian Senyawa

Pemisahan senyawa dilakukan dengan teknik kromatografi kolom

sebanyak dua kali untuk mendapatkan sneyawa dengan pemisahan yang baik.

Teknik kromatografi kolom merupakan pemisahan tahap awal terhadap

senyawa pada ekstrak etil asetat daun beluntas. Prinsip kerja pemisahan

kromatografi kolom ini berdasarkan tingkat kepolarannya, molekul senyawa

non polar akan begerak turun terlebih dahulu kemudian diikuti dengan

senyawa semi polar dan senyawa polar. Kromatografi kolom pertama

berukuran panjang 70 cm dan berdiameter 3 cm dengan ekstrak yang

digunakan sebanyak 15 gram dan fase diam menggunakan silica gel GF254

dengan ukuran pori 0.063 – 0.2 mm sebanyak 150 gram. Sedangkan fase

gerak yang digunakan adalah n-heksan : etil asetat dengan perbandingan

(100%, 9:1, 8:2, 7:3, dan 6:4).

Dari hasil fraksinasi pertama dihasilkan eluen sebanyak 144 vial. Hasil

eluen kemudian diamati pada KLT dengan fase gerak n-heksan : etil asetat

(8 :2) dan diamati pola bercak yang dihasilkan dibawah lampu UV dengan

panjang gelombang 254 nm. Fraksi yang mirip disatukan berdasarkan pola

bercak dan didapatkan sebanyak 9 fraksi.

38


Gambar 4.1 Bagan kolom kromatografi 1 ekstrak etil asetat daun beluntas

Gambar 4.2 Fraksi A-I kromatografi kolom 1 ekstrak etil asetat daun beluntas

Gambar 4.3 Hasil KLT kromatografi kolom 1 ekstrak etil asetat daun beluntas

Keterangan : Hasil pemantauan KLT dengan fase diam silica gel GF254 fase

gerak n-heksan : etil asetat (8:2) dilihat pada lampu UV 254

Ektrak kental etil asetat

daun beluntas sebanyak 15 g

Kolom kromatografi I dengan fase gerak

100 % n-heksan, n-heksan :etil asetat

(9:1, 8:2, 7:3 dan 6:4)

F.A

(39-41)

F.B

(42-44)

F.C

(45-48)

F.D

(49-51)

F.E

(52-53)

F.F

(54-57)

F.G

(58-63)

F.H

(64-70)

F.I

(71-144)

39


Setelah melihat hasil fraksinasi pertama, maka dilanjutkan dengan

fraksinasi kedua menggunakan kromatografi kolom berukuran panjang 30 cm

dan diameter 2.5 cm untuk mendapatkan subfraksi murni. Fraksi yang

digunakan yaitu fraksi G dan H dengan alasan diduga merupakan senyawa

major dari ekstrak etil asetat daun beluntas. Berat fraksi G dan H adalah 1,25

gram. Eluen yang digunakan adalah n-heksan 100 % sebanyak 300 ml lalu

dilanjutkan dengan n-heksan : etil asetat (9:1) sebanyak 300 ml, dilanjutkan

dengan n-heksan : etil asetat (8:2) sebanyak 500 ml dan terakhir menggunakan

eluent n-heksan etil asetat (6:4) sebanyak 250 ml.

Hasil pemisahan kromatografi kolom kedua menghasilkan 82 vial.

Kemudian ditotolkan pada KLT dengan fase gerak n-heksan : etil asetat (8:2)

dan diamati pola bercaknya dibawah lampu UV dengan panjang gelombang

254 nm. Dihasilkan 4 fraksi yang selanjutnya dilakukan pengujian terhadap

enzim PfMQO.

Gambar 4.4 Bagan kolom kromatografi II fraksi G dan fraksi H

F.G & F.H sebanyak 1,25 g dikolom

kromatografi II dengan fase gerak 100% n-

heksan, n-heksan:etil asetat (9:1, 8:2 dan 6:4)

SF.B

(31-42)

SF.C

(44-71)

SF.A

(24-30)

SF.D

(72-82)

SF.A

berat 98 mg

Rekristalisasi

Penambahan pelarut n-heksan

Kristal jarum putih, berat 13,5 mg

40


Gambar 4.5 Subfraksi A-D ekstrak daun beluntas

Gambar 4.6 Hasil KLT kromatografi kolom II



Dari hasil subfraksi didapat subfraksi A yang telah terlihat di klt dengan

peak yang sangat pekat dan ketika divial terlihat bongkahan seperti kaca

berwarna kecoklatan dengan bobot 98 mg. Subfraksi A kemudian dilakukan

rekristalisasi menggunakan pelarut yang tidak dapat melarutkan kristal dalam

penelitian ini digunakan n-heksan untuk selanjutnya dilakukan analisa lebih

lanjut.

4.8 Uji Kemurnian Senyawa

Pemurnian senyawa dilakukan dengan metode rekristalisasi. Pelarut

yang digunakan yaitu pelarut yang tidak melarutkan senyawa yaitu n-heksan.

Senyawa tersebut tidak akan larut sempurna dan tersisa hanya kristal ketika

ditambahkan beberapa tetes pelarut n-heksan. Kemudian diuji kemurniannya

SF.A SF. B SF.C SF.D

41


menggunakan KLT 2 dimensi. KLT dua dimensi digunakan untuk menguji

kemurnian suatu senyawa dilihat dari pola bercak yang dihasilkan pada

kromatografi secara dua arah dengan ukuran 5 x 5 cm.

Gambar 4.7 Hasil KLT 2 dimensi subfraksi A



Senyawa dikatakan murni apabila memiliki bercak tunggal setelah

dilakukan pengujian dengan KLT dua dimensi. Hasil KLT dua dimensi

senyawa subfraksi A menunjukkan bercak tunggal dengan nilai Rf 0,45

(berada dalam rentang Rf analisis kuantitatif yaitu 0,2-0,8) dengan eluen n-

heksan : etil asetat (8:2) (Wulandari, 2011).

Bercak yang dihasilkan diamati di bawah lampu UV pada panjang

gelombang 254 nm. Untuk menampakkan bercak yang tidak berwarna dan

tidak berfluoresensi dapat diamati dengan menggunakan pereaksi godin

(reagen A : 1% vanilin dilarutkan dalam etanol : 3% HClO3 dalam aquadest,

1:1 dan reagen B : 10% H2SO4) dan dilanjutkan dengan pemanasan.

(a) (b)

Gambar 4.8 Pola kromatogram isolat murni

(a) lampu UV 254 nm (b) bercak tampak dengan pereaksi godin

42


Tabel 4.3 Karakteristik isolat murni

Karakteristik

Bentuk : Kristal jarum

Warna : Putih bening

Bau : Khas

Bobot : 13,5 mg

Eluent : n-heksan : etil asetat (8:2)

Rf : 0,45

Gambar 4.9 Isolat murni subfraksi A

4.9 Identifikasi Isolat Murni

Analisa KLT pada isolat murni dilakukan dengan menotolkannya pada

plat KLT yang dielusi dengan fase gerak n-heksan : etil asetat (8:2). Hasil

yang didapat bahwasannya tidak tampak bercak yang terlihat atau

berfluoresensi, hal tersebut menunjukkan bahwa senyawa yang telah diisolasi

tidak memiliki ikatan rangkap terkonjugasi. Setelah penyemprotan pereaksi

godin dan kemudian dilakukan pemanasan, terlihat perubahan warna bercak

menjadi ungu dengan nilai Rf 0,45. Hasil ini menunjukkan bahwa senyawa

tersebut merupakan senyawa golongan steroid.

Analisa struktur dengan 1H-NMR memungkinkan untuk mengetahui

kedudukan proton di dalam suatu struktur molekul suatu senyawa senyawa.

Data yang dihasilkan dari pengujian menggunakan 1H-NMR yaitu berupa

pergeseran kimia yang dianggap sebagai ciri dari bagian tertentu dari struktur

molekul suatu senyawa sehingga dapat membantu mengidentifikasi setiap

gugus suatu senyawa. Selain itu spektrum 1H-NMR dapat menginformasikan

mengenai lingkungan kimia dan jumlah atom hydrogen dalam setiap

lingkungan, dan struktur gugus yang berdekatan dengan setiap atom hidrogen

(Rugayah, Rudiyansyah, & Jayuska, 2017).

Analisa 1H-NMR pada isolat murni dari daun beluntas menunjukkan

sinyal yang khas untuk golongan steroid dimana tidak adanya sinyal diatas δH

5 ppm dan terlihat sinyal yang menumpuk dibawah δH 2 ppm yang khas untuk

43


steroid. Selanjutnya terdapat sinyal proton olefinik pada δH 5 ppm dan

terdapat sinyal proton teroksigenasi pada δH 3 ppm yang lazim ditemukan

pada golongan senyawa steroid (Mayanti, 2019).

Sinyal pada δH 5,34 (1H, d); 5,14 (1H, dd); dan 5,01 (1H, dd)

merupakan sinyal untuk proton metin olefinik yang menunjukkan adanya dua

ikatan rangkap dimana salah satu ikatan rangkapnya terikat pada C kuartener

sp3 sehingga hanya muncul tiga sinyal proton metin. Sinyal pada δH 3,52 (1H,

m) spesifik untuk proton teroksigenasi. Sinyal pada δH 0,6 – 1,1 ppm diduga

sebagai sinyal untuk gugus metil. Sinyal lainnya pada δH dibawah 2 ppm

merupakan sinyal untuk proton sikloheksana (Mayanti, 2019).

Tabel 4.4. Perbandingan pergeseran kimia 1H-NMR

δH (ppm)

Stigmasterol

(Suttiarporn, 2015)

Isolat Murni Gugus Fungsi

0.69 (s) 0.692 (s) 3H

0.76 (d)

0.80 (d) 0.799 (d) 3H

0.85 (d)

1.00 (s) 1.006 (s) 3H

1.01 (d) 1.010 (d) 3H

3.51 (m) 3.514 (m) 1H

5.00 (dd) 5.002 (dd) 1H

5.15 (dd) 5.149 (dd) 1H

5.33 (d) 5.342 (d) 1H

Gambar 4.10 Struktur molekul stigmasterol (Sumber : Rajput, 2012)

A

44


Dari hasil analisa 1H-NMR menunjukkan bahwasannya isolat murni

yang dihasilkan dari ekstrak etil asetat daun beluntas merupakan senyawa

golongan steroid yaitu stigmasterol. Pada penelitian sebelumnya

menunjukkan bahwa senyawa major dari ekstrak metanol akar beluntas

dengan metode kromatografi kolom yaitu beta-sitosterol dan senyawa

minornya adalah stigmasterol (Gomes, Saha, Chatterjee, & Chakravarty,

2007). Stigmasterol tersusun dari atom C, O dan H dimana gugus OH terikat

pada atom C3 cincin A sedangkan atom C saling terikat membentuk rantai

siklik maupun nonsiklik (Jannah & Sudarma, 2013).

4.10 Uji Aktivitas Ekstrak Daun Beluntas terhadap Enzim PfMQO

Uji inhibisi ekstrak daun beluntas terhadap enzim PfMQO ini bertujuan

untuk mengetahui adanya senyawa yang beraktivitas antimalarial dalam

menghambat enzim PfMQO. Dalam pengujian ini digunakan alat

spektrofotometer (Thermoscientific Multiscan Go) dengan panjang

gelombang 600 nm dan suhu 37°C. Panjang gelombang 600 nm merupakan

panjang gelombang penyerapan maksimum untuk warna biru.

Sampel yang digunakan berupa ekstrak, fraksi, subfraksi dan isolat

murni yang dimasukkan kedalam tube ukuran 1,5 ml dan diencerkan dengan

pelarut DMSO sehingga diperoleh konsentrasi akhir 10 mg/ml. DMSO

merupakan pelarut yang dapat melarutkan senyawa polar maupun nonpolar.

Sampel kemudian dimasukkan sebanyak 100 µl kedalam V-plate untuk

memudahkan dalam pengambilan sampel ke well plate 96.

Sampel daun beluntas yang telah diencerkan pada V-plate dimasukkan

sebanyak 2 µl kedalam well plate 96 yang nantinya akan dicampur dengan

larutan assay mix. Larutan assay mix ini terdiri 50 mM HEPES pH 7.0, 120

mM DCIP, 1 mM KCN, 2,77 µg/ml enzim PfMQO, 60 mM decylubiquinone

dan 400 mM substrat malate. Sebelum penambahan substrat malate, assay mix

dibaca menggunakan spektrofotometer (Thermoscientific Multiscan Go)

selama 3 menit dan dijadikan sebagai background.Pada reaksi ini dibuat

larutan kontrol positif dan kontrol negatif. Dimana larutan kontrol positif

terdiri dari DMSO, assay mix, dan tanpa substrat malate sedangkan larutan

kontrol negatif terdiri dari DMSO, assay mix dan substrat malate.

45


HEPES merupakan larutan penyangga yang paling baik untuk penelitian

biologi dan molekulnya bersifat zwitterionic. Kisaran pH dari HEPES yang

optimal pada pH 6.8-8.2 yang bertujuan untuk mempertahankan pH pada

larutan assay mix. Derajat pH ini perlu diatur sedemikian rupa agar aktivitas

enzimnya stabil (Isma, 2017).

Penggunaan DCIP ini digunakan untuk melihat inhibisi enzim PfMQO

berdasarkan prinsip uji kolorimetri. DCIP ini merupakan reagen yang

digunakan untuk mengukur zat pereduksi. DCIP berwarna biru dalam bentuk

teroksidasi namun setelah tereduksi akan menjadi tidak berwarna. Karena

DCIP berkurang menjadi tidak berwarna, peningkatan transmitasi cahaya

dapat diukur menggunakan spektrofotometer. Pada proses reaksi, enzim

PfMQO akan mengkatalis oksidasi malate menjadi oksaloasetat dan secara

bersamaan juga terjadi reduksi ubiquinone menjadi ubiquinol sehingga

terjadi reduksi terhadap DCIP dan terjadi perubahan warna (Hartuti, 2018).

Pada reaksi enzimatik dibutuhkan akseptor elektron dan digunakan

decylubiquinone. Pada saat terjadi reduksi dan oksidasi decylubiquinone ini

akan berperan sebagai penangkap elektron. Elektron yang dihasilkan selama

proses oksidasi ini akan digunakan untuk melakukan reduksi merubah

ubiquinone menjadi ubiquinol (Isma, 2017)

Gambar 4.11 Reaksi enzimatis PfMQO (Sumber : Isma, 2017)

Untuk menghambat terusan reaksi dari proses enzimatik maka

dibutuhkan KCN. KCN ini berfungsi sebagai penghambat elektron hasil

reaksi yang nantinya akan masuk ke kompleks IV. Bahan terakhir berupa

malate yang berfungsi sebagai substrat. Jumlah substrat yang dimasukkan

adalah 5 µl. Semakin besar konsentrasi substrat maka akan mempercepat

suatu reaksi. Pada suatu batas konsentrasi substat tertentu, semua sisi aktif

46


enzim telah dipenuhi dengan substrat, dimana dalam keadaan ini

bertambahnya konsentrasi substrat tidak menyebabkan bertambah besarnya

konsentrasi kompleks enzim-substrat, sehingga jumlah hasil reaksinya pun

tidak bertambah besar (Irawati, 2016).

Tabel 4.5 Hasil perhitungan % inhibisi ekstrak dan fraksi

No Sampel % Inhibisi

1 Ekstrak 72.59

2 Fraksi A 18.70

3 Fraksi B 9.35

4 Fraksi C 14.37

5 Fraksi D 85.00

6 Fraksi E 90.41

7 Fraksi F 92.34

8 Fraksi G 77.27

9 Fraksi H 48.14

10 Fraksi I 72.40

Berdasarkan data diatas dapat diketahui bahwa persen inhibisi daun

beluntas yang paling besar adalah fraksi F dengan persen inhibisi 92.34 %.

Suatu senyawa dikatakan aktif jika nilai inhibisi terhadap enzim PfMQO

mencapai lebih dari 50% (Wang, Liu, Zhang, Shao, & Zhang, 2019). Fraksi F

merupakan hasil kolom kromatografi dengan perbandingan eluen n heksan :

etil asetat (8:2). Pada tahap selanjutnya dilakukan uji subfraksi gabungan dari

Fraksi G dan Fraksi H.

Tabel 4.6 Hasil perhitungan % inhibisi subfraksi

No Sampel % Inhibisi

1 Subfraksi A 85.24

2 Subfraksi B 73.68

3 Subfraksi C 82.13

4 Subfraksi D 101.3

Dari hasil diatas diketahui bahwa persen inhibisi terbesar adalah

subfraksi D yaitu sebesar 101.33%. Subfraksi D merupakan hasil kolom

kromatografi dengan perbandingan eluen n-heksan : etil asetat (6:4).

Pada penelitian ini senyawa murni dari subfraksi A yang telah berhasil

diisolasi selanjutnya dilakukan uji IC50 untuk mengetahui kemampuan

senyawa menghambat 50% aktivitas enzim PfMQO. Aktivitas inhibisi isolat

murni ini dilakukan dengan membuat larutan induk 10.000 ppm yang

47


dilarutkan dalam DMSO. Pengujian isolat murni yang telah dibuat larutan

induknya dibuat 5 seri konsentrasi dengan final konsentrasi 100 ppm, 20 ppm,

10 ppm, 1 ppm dan 0,1 ppm. Dasar pengambilan seri konsentrasi ini

berdasarkan hasil uji aktivitas ekstrak dimana subfraksi A memiliki inhibisi

85, 24 % pada konsentrasi 100 ppm sehingga diambil konsentrasi yang lebih

rendah untuk melihat aktivitas inhibisinya. Hasil data absorbansi di hitung

menggunakan rumus % inhibisi dan diolah menggunakan aplikasi GraphPad

ver.8 untuk memperoleh nilai IC50 dengan x sebagai log konsentrasi dan y

sebagai % inhibisi.

IC50 merupakan konsentrasi yang dapat membunuh 50% Plasmodium

setelah diberi sampel uji dimana klasifikasinya IC50 ≤ 10 µg/mL sangat baik

aktivitasnya, 10-50 µg/mL aktivitas sedang dan > 50 µg/mL sangat lemah

aktivitasnya (Puspaningtyas, 2018).

Gambar 4.12 IC50 isolat murni terhadap enzim PfMQO

Dari data tersebut senyawa murni yang berhasil diisolasi memiliki

aktivitas menghambat enzim PfMQO sebesar 7,435 µg/mL dimana nilai

aktivitas tersebut termasuk kedalam klasifikasi yang sangat baik. Semakin

kecil nilai IC50 berarti semakin tinggi aktivitas inhibisinya (Rahmayani,

2013).

Isolat murni yang diperoleh dari fraksi etil asetat daun beluntas yang

diduga merupakan senyawa stigmasterol memiliki aktivitas antimalaria

terhadap enzim PfMQO. Enzim PfMQO merupakan target obat antimalaria

48


yang terbaru sehingga sampai saat ini belum ada laporan senyawa

stigmasterol memiliki aktivitas terhadap enzim PfMQO. Pada penelitian

sebelumnya telah dilakukan uji aktivitas antimalaria terhadap sel P.

falciparum menggunakan metode Desjardins dimana senyawa stigmasterol

yang telah diisolasi dengan metode kromatografi kolom dari ekstrak metanol

tumbuhan Peperomia pellucida memiliki IC50 sebesar 5,24 µg/mL (Bialangi,

2018). Stigmasterol yang telah diisolasi dari akar Bixa orellana juga memiliki

aktivitas antimalaria terhadap strain K1 P dengan IC50 sebesar 5 µg/mL yang

dimana strain tersebut telah resisten terhadap klorokuin (Zhai, 2014). Hasil

dari pengujian IC50 senyawa stigmasterol pada penelitian ini lebih besar

dibandingkan dengan penelitian sebelumnya dengan metode yang berbeda

dikarenakan keterbatasan alat sehingga pada saat penambahan substrat malate

pada saat uji membutuhkan sedikit waktu tambahan dan enzim akhirnya

sudah mulai bekerja dan berikatan dengan substrat.


BAB V PENUTUP

BAB V

PENUTUP

5.1 Kesimpulan

1. Senyawa hasil isolasi dari ekstrak etil asetat daun beluntas merupakan

senyawa golongan steroid yaitu stigmasterol.

2. Senyawa hasil isolasi ekstrak etil aseta daun beluntas memiliki aktivitas

antimalaria dengan nilai IC50 sebesar 7,435 µg/mL terhadap enzim

PfMQO.

5.2 Saran

1. Perlu dilakukan karakteristik isolat murni dengan menggunakan

metode lainnya seperti HPLC, Spektrofotometri FTIR,

Spektrofotometri UV-Vis untuk menunjang data kemurnian senyawa

yang telah diisolasi.

2. Perlu dilakukan pengujian secara in vivo terhadap P. falciparum untuk

memastikan aktivitas inhibisi terhadap parasit tersebut.

3. Perlu adanya isolasi fraksi D, E dan F untuk mengetahui senyawa dari

fraksi tersebut dikarenakan memiliki aktivitas inhibisi yang cukup

besar.


DAFTAR PUSTAKA

Ahmad, T., Singh, S. B., & Pandey, S. (2013). Phytochemical Screening and

Physicochemical Parameters of Crude Drugs: A Brief Review. International

Journal of Pharma Research and Review, 2, 53-60.

Arifin, H., Anggraini, N., Handayani, D., & Rasyid, R. (2006). Standarisasi Ekstrak

Etanol Daun Eugenia cumini Merr. J. Sains Tek. Far, 11(2), 88-93.

Bialangi, N. (2018). Isolation of Steroid Compounds from Suruhan (Peperomia

pellucida L. Kunth) and Their Antimalarial Activity. 30(8), 1751–1754.

https://doi.org/https://doi.org/10.14233/ajchem

Boonruang, S., Prakobsri, K., Pouyfung, P., Srisook, E., Prasopthum, A.,

Rongnoparut, P., & Sarapusit, S. (2017). Inhibition of human cytochromes

P450 2A6 and 2A13 by flavonoids, acetylenic thiophenes and sesquiterpene

lactones from Pluchea indica and Vernonia cinerea. Journal of Enzyme

Inhibition and Medicinal Chemistry, 32(1), 1136–1142.

https://doi.org/10.1080/14756366.2017.1363741

BPOM RI. (2006). Monografi Ekstrak Tumbuhan Obat Indonesia, Jilid 2.

Direktorat Standarisasi Obat Tradisional, Kosmetik, dan Produk Komplemen.

Jakarta.

Dalimartha, S. (1999). Beluntas (Pluchea indica L. Less). Atlas Tumbuhan Obat

Indonesia. 1.

Depkes RI. (2000). Parameter Standar Umum Ekstrak Tumbuhan Obat. Jakarta:

Departemen Kesehatan Republik Indonesia,.

Depkes RI. (2008). Farmakope Herbal Indonesia. Departemen Kesehatan Republik

Indonesia, Jakarta, 1, 124

Eyasu, M. (2018). Antimalarial Drug Resistance: In the Past, Current Status and

Future Perspectives. British Journal of Pharmacology and Toxicology, 6(1),

1–15. https://doi.org/10.19026/bjpt.6.5186

Fisher, N., Antoine, T., Ward, S. A., & Biagini, G. A. (2017). Encyclopedia of

Malaria. 1–14. https://doi.org/10.1007/978-1-4614-8757-9

Galambos, S. A., Terry, P. C., Moyle, G. M., & Locke, S. A. (2005). Psychological

Predictors of Injury Among Elite Athletes. British journal of sports medicine,

39(6), 351-354.

Gomes, A., Saha, A., Chatterjee, I., & Chakravarty, A. K. (2007). Viper and cobra

venom neutralization by b -sitosterol and stigmasterol isolated from the root

extract of Pluchea indica Less . ( Asteraceae ). 14, 637–643.

https://doi.org/10.1016/j.phymed.2006.12.020

Goyal, P. K., Aggarwal, R. R., & Info, A. (2013). A review on phytochemical and

biological investigation of plant genus Pluchea. Indo American Journal of

Pharmaceutical Research, 3(4), 3373–3392. Retrieved from

https://pdfs.semanticscholar.org/56cf/bfa39edb67ebf4a5b6639c385aa95ee2

c0ab.pdf

Gunawan, D., & Mulyani, S. (2004). Ilmu Obat Alam (Farmakognosi). Jilid, 1, 31-

Hanani, E. (2010). Herbal Indonesia Berkhasiat.Trubus InfoKit 8: 560

51


Hartuti, E. D., Inaoka, D. K., Komatsuya, K., Miyazaki, Y., Miller, R. J., Xinying,

W., … Kita, K. (2018a). Biochemical studies of membrane bound

Plasmodium falciparum mitochondrial L-malate:quinone oxidoreductase, a

potential drug target. Biochimica et Biophysica Acta - Bioenergetics,

1859(3), 191–200. https://doi.org/10.1016/j.bbabio.2017.12.004

Hidayati, D. N., Sumiarsih, C., & Mahmudah, U. (2018). Standarisasi Non Spesifik

Ekstrak Etanol Daun dan Kulit Batang Berenuk (Crescentia cujete Linn). 19–

23.

Irawati, R. (2016). Karakterisasi Ph, Suhu dan Konsentrasi Substrat Pada Enzim

Selulase Kasar Yang Diproduksi Oleh Bacillus circulans.[skripsi]. UIN

Maulana Malik Ibrahim Malang.

Isma, M. L. (2017). Uji Aktivitas Fraksi Aktif Ekstrak Kulit Batang Garcinia

dioica Blume Terhadap Enzim Malate: Quinone Oxidoreductase dari

Plasmodium falciparum (PfMQO).[skripsi].UIN Syarif Hidayatullah Jakarta.

Jannah, H., & Sudarma, I. M. (2013). Analisis Senyawa Fitosterol dalam Ekstrak

Buah Buncis ( Phaseolus vulgaris L .). 6(2), 70–75.

Kemenkes RI. (2016). Pusat Data Dan Informasi Penyakit Malaria 2016. 1–7.

ISSN 2442-7659.

Kementerian Kesehatan. (2017). Buku Saku Tatalaksana Kasus Malaria. 1–38.

Marks, D. B., Marks, A. D., & Smith, C. M. (2000). Biokimia Kedokteran Dasar:

Sebuah Pendekatan Klinis. Terjemahan oleh Brahm U. Pendit

Mayanti, T. (2019). Isolasi Senyawa Steroid dari Akar Tumbuhan Asam Kandis

(Garcinia cowa Roxb . ex DC) Sebagai Obat Penurun Demam (Steroid

Compounds from Root Plant of Acid (Garcinia cowa Roxb . ex DC) for Fever

Relief). 37(1), 51–57.

Mohamad, R. B. I. (2018). Profil Fitokimia dan Aktivitas Farmakologi Baluntas

(Pluchea indica L.). Farmaka, 16(Md), 57–64. Retrieved from :

http://jurnal.unpad.ac.id/farmaka/article/download/17554/pdf

Noer, S. (2016). Uji kualitatif fitokimia daun Ruta angustifolia. 9(3), 200–206.

Nurhalimah, H., Wijayanti, N., & Widyaningsih, T. D. (2015). Efek Antidiare

Ekstrak Daun Beluntas ( Pluchea indica L .) Terhadap Mencit Jantan Yang

Diinduksi Bakteri Salmonella thypimurium. Antidiarrheal Effects Beluntas

Leaf Extract ( Pluchea indica L . ) against Male Mice Induced by Bacteria

Salmonella typhimurium. Jurnal Pangan Dan Agroindustri, 3(3), 1083–1094.

Pakpahan, N. F. (2017). Uji Aktivitas Inhibisi Fraksi Aktif Ekstrak Kulit Buah

Manggis (Garcinia mangostana L.) Terhadap Enzim Malate Quinone

Oxidoreductase (MQO) dari Plasmodium falciparum.[skripsi].UIN Syarif

Hidayatullah Jakarta

Pavia, D. L. (2001). Introduction To Spectroscopy (third edit). Bellingham,

Washington: Westren Washington University.

Prabowo, A. (2008). Malaria Mencegah dan Mengatasinya. Jakarta: Puspa Swara.

Pramanik, K. C., Biswas, R., Mitra, A., Bandyopadhyay, D., Mishra, M., &

Chatterjee, T. K. (2009). Tissue culture of the plant Pluchea indica (L.) Less.

and evaluation of diuretic potential of its leaves. Oriental Pharmacy and

Experimental Medicine, 7(2), 197–204.

https://doi.org/10.3742/opem.2007.7.2.197

Prasetyo, & Inoriah, E. (2013). Pengelolaan Budidaya Tanaman Obat-Obatan

52


(Bahan Simplisia) (1st ed.). Bengkulu: Badan Penerbitan Fakultas Pertanian

UNIB.

Pratama, P. I. (2017). Aktivitas Inhibisi Fraksi Aktif Ekstrak Daun Beluntas

(Pluchea indica (L) Less.) Terhadap Target Obat Antimalaria Plasmodium

falciparum Malate Quinone Oxidoreductase (PfMQO). [skripsi]. UIN Syarif

Hidayatullah Jakarta

Prijono, D. (1999). Prospek dan Strategi Pemanfaatan Insektisida Alami dalam

PHT. Dalam: Nugroho BW, Dadang, dan Prijono D, penyunting. Bahan

Pelatihan Pengembangan dan Pemanfataan Insektisida Alami. Bogor: Pusat

Kajian Pengendalian Hama Terpadu, IPB. hal, 1-7

Puasa, R., H, A. A., & Kader, A. (2018). Identifikasi Plasmodium Malaria Didesa

Beringin Jaya Kecamatan Oba Tengah Kota Tidore Kepulauan. Jurnal Riset

Kesehatan, 7(1), 21. https://doi.org/10.31983/jrk.v7i1.3056

Puspaningtyas. (2018). Studi Fitokimia Irvingia malayana Sebagai Antimalaria

dari Hutan Meru Betiri dalam Rangka Drug Discovery. 1(2), 104–118.

Putri, Warditiani, & Larasanti. (2013). Skrining Fitokimia Ekstrak Etil Asetat Kulit

Buah Manggis( Garcinia mangostana L .).

Rachmawati, S. H., Lestari, S. D., Studi, P., Hasil, T., Pertanian, F., Sriwijaya, U.,

& Ogan, I. (2014). Volume III, Nomor 01, November 2014. III(November),

1–7.

Rahmayani, U. (2013). Uji Aktivitas Antioksidan Ekstrak Kasar Keong Bakau (

Telescopium telescopium ) dengan Pelarut yang Berbeda terhadap Metode

DPPH ( Diphenyl Picril Hidrazil). 2(4): 36-45. http://ejournal-

s1.undip.ac.id/index.php/jmr

Rubiyanto, D. (2016). Teknik Dasar Kromatografi (2nd ed.). Yogyakarta:

Deepublish.

Rugayah, Rudiyansyah, & Jayuska, A. (2017). Karakteristik Senyawa Triterpenoid

dari Daun Jabon (Anthocephalus cadamba (Roxb.) Miq). 6(2).

Ryan, D. G., Murphy, M. P., Frezza, C., Prag, H. A., Chouchani, E. T., O’Neill, L.

A., & Mills, E. L. (2018). Coupling Krebs cycle metabolites to signalling in

immunity and cancer. Nature Metabolism, 1(1), 16–33.

https://doi.org/10.1038/s42255-018-0014-7

S. Amilah dan P.S. Ajiningrum. (2015). Uji Efektivitas Daya Hambat Sari Daun

Pegagan (Centella asiatica) dan Daun Beluntas (Pluchea indica Less)

Terhadap Pertumbuhan Mycobacterium tuberculosis. Journal of Science,

8(2), 6–11.

Seidel, V. (2006). Initial and bulk extraction. In: Sarker SD, Latif Z, & Gray AI,

editors. Natural Products Isolation. 2nd ed. Totowa (New Jersey) Humana

Press Inc., 31-35

Sembiring. (2009). Biologi (vii). Jakarta: Pusat Perbukuan, Departemen Pendidikan

Nasional.

Simamere, E. S. (2014). Skrining Fitokimia Ekstrak Etanol Daun Gatal (Laportea

decumana (Roxb.) Wedd) Eva. 11(01), 98–107.

Sudirman, R. S., Usmar, Rahim, A., & Bahar, M. A. (2017). Aktivitas Anti-

inflamasi Ekstrak Etanol Daun Beluntas ( Pluchea indica L .) pada Model

Inflamasi Terinduksi CFA ( Complete Freund ’ s Adjuvant ). Jurnal Farmasi

Galenika, Vol 3(2), 191–198.

https://doi.org/10.22487/j24428744.2017.v3.i2.8921

53


Suwandi, J. F. (2015). Gen PfATP6 dan Resistensi Plasmodium falciparum

Terhadap Golongan Artemisinin PfATP6 Gene and Plasmodium falciparum

Resistance Againts Artemisinin Derivate.

Tiwari, P., Kumar, B., Kaur, M., Kaur, G., & Kaur, H. (2011). Phytochemical

Screening and Extraction: A Review. Internationale pharmaceutica sciencia,

1(1), 98-106.

Tsurayya, N. (2018).Isolasi Senyawa Xanton dari Ekstrak Etil Asetat Kulit Batang

Garcinia dioica Blume dan Uji Aktivitasnya terhadap PfMQO (Target Obat

Malaria).[skripsi].UIN Syarif Hidayatullah Jakarta.

Wang, C., Liu, X., Zhang, M., Shao, H., & Zhang, M. (2019). Efficient Enzyme-

Assisted Extraction and Conversion of Polydatin to Resveratrol From

Polygonum cuspidatum Using Thermostable Cellulase and Immobilized β -

Glucosidase. 10(March). https://doi.org/10.3389/fmicb.2019.00445

World Health Organization .2018.WHO Status Report on Artemisinin Resistance

and ACT Efficacy. World Health Organization.

https://www.who.int/malaria/areas/drug_resistance/updates/en/ - Diakses

Mei 2019. World Health Organization .2018.World Malaria report 2018. World Health

Organization. https://www.who.int/malaria/publications/world-malaria-

report-2018/en/ - Diakses Mei 2019

Wulandari, L. (2011). Kromatografi Lapis Tipis (1st ed.). Jember: PT. Taman

Kampus Presindo.

Yusuf, Y. (2014). Faktor Resiko Munculnya Plasmodium spp . Resisten Di

Kecamatan Tapalang , Sulawesi Barat. Jurnal Bionature, 15(April), 41–44.

Zhai, B. (2014). Antimalarial Evaluation of the Chemical Constituents of Hairy

Root Culture of Bixa orellana L. 756–766.

https://doi.org/10.3390/molecules19010756

54


LAMPIRAN

Lampiran 1. Determinasi Tanaman

55


Lampiran 2. Alur Kerja Penelitian

Determinasi tanaman

Penyiapan simplisia

Simplisia

Ekstraksi

Rekristalisasi

Uji % inhibisi ekstrak

Kolom Kromatografi I

Kolom kromatografi II

Uji % inhibisi fraksi

Senyawa Murni

KLT 2 dimensi

H-NMR Uji IC50 PfMQO

Uji % inhibisi subfraksi

56


Lampiran 3. Skema Penyiapan Ekstrak Daun Beluntas (Pluchea indica (L) Less.)

Sampel basah daun

beluntas 12 kg

Serbuk simplisia 1,7 kg

Maserasi dengan pelarut n-heksan

Maserasi dengan

pelarut etil asetat

Filtrat

Residu Filtrat

Evaporasi

Ektrak kental n-heksan

daun beluntas 24,095 g


daun beluntas 37,467 g

Evaporasi

• Sortasi basah

• Pencucian

• Pengeringan

• Sortasi kering

• Penghalusan

% Inhibisi ekstrak etil asetat

daun beluntas 72, 59%

57


Lampiran 4. Skema Isolasi dan Pemurnian Senyawa


daun beluntas sebanyak 15 g

Kolom kromatografi I dengan fase gerak

100 % n-heksan, n-heksan :etil asetat

(9:1, 8:2, 7:3 dan 6:4)

F.A

39-41

18,70 %

F.B

42-44

9,35 %

F.C

45-48

14,37 %

F.D

49-51

85 %

F.E

52-53

90,41 %

F.F

54-57

92,34 %

F.G

58-63

77,27 %

F.H

64-70

48,14 %

F.I

71-144

72,40 %

F.G & F.H sebanyak 1,25 g dikolom

kromatografi II dengan fase gerak 100% n-

heksan, n-heksan:etil asetat (9:1, 8:2 dan 6:4)

SF.B

31-42

73,68 %

SF.C

44-71

82,13 %

SF.A

24-30

85,24 %

SF.D

72-82

101,33 %

SF.A

berat 98 mg

Rekristalisasi

Penambahan pelarut n-heksan

Kristal jarum putih, berat 13,5 mg

H-NMR KLT 2

Dimensi

Uji IC50 PfMQO

58


Lampiran 5. Perhitungan Rendemen Ekstrak Daun Beluntas (Pluchea indica (L)

Less.)

𝑅𝑒𝑛𝑑𝑒𝑚𝑒𝑛 (%) =Berat ekstrak kental

Berat simplisia total (serbuk)𝑥 100%

1. Rendemen ekstrak n-heksan

Bobot ekstrak kental = 24,095 gram

Bobot serbuk simplisia yang diekstraksi = 1.700 gram

𝑅𝑒𝑛𝑑𝑒𝑚𝑒𝑛 (%) =24,095

1.700𝑥 100% = 1,417 %

2. Rendemen ekstrak etil asetat

Bobot ekstrak yang didapat = 37,467 gram

Bobot serbuk simplisia yang diekstraksi = 1.700 gram

𝑅𝑒𝑛𝑑𝑒𝑚𝑒𝑛 (%) =37,467

1.700𝑥 100% = 2,2 %

59


Lampiran 6. Perhitungan Parameter Ekstrak Etil Asetat Daun Beluntas (Pluchea

indica (L) Less.)

1. Perhitungan Kadar air ekstrak etil asetat

% 𝐾𝑎𝑑𝑎𝑟 𝑎𝑖𝑟 =Berat awal − Berat akhir

Berat awal𝑥 100%

Berat awal = 1,0275 gram

Berat akhir = 0,9467 gram

𝑅𝑒𝑛𝑑𝑒𝑚𝑒𝑛 (%) =1,0275 − 0,9467

1,0275𝑥 100% = 7,86 %

2. Perhitungan Kadar abu ekstrak etil asetat

% 𝐾𝑎𝑑𝑎𝑟 𝑎𝑏𝑢 =W2 − W0

W1𝑥 100%

W0 = berat krus kosong

= 25,9343 gram

W1 = berat ekstrak awal

= 1,0168 gram

W2 = berat krus + ekstrak setelah dioven

= 25,9604 gram

% 𝐾𝑎𝑑𝑎𝑟 𝑎𝑏𝑢 =29,9896 − 29,9864

1,027𝑥 100% = 2,56 %

60


Lampiran 7. Hasil Skrining Fitokimia Ekstrak Etil Asetat Daun Beluntas (Pluchea

indica (L) Less.)

Uji Kontrol (-) Sampel Keterangan

Alkaloid

-

Flavonoid

+

Saponin

-

+

Triterpenoid

dan Steroid

+

Tanin dan

Polifenol

+

Kuinon

-

+

61


Lampiran 8. Perhitungan Pengenceran Ekstrak dan Fraksi Daun Beluntas

(Pluchea indica (L) Less.) pada Pengujian Aktivitas Inhibisi dan

IC50 Enzim PfMQO

Dibuat larutan induk dari sampel ekstrak dan fraksi dilarutkan dalam DMSO 100%

dengan konsentrasi 10.000 ppm

Ket. V1= Volume yang diambil

M1= Konsentrasi awal

V2= Volume yang akan dibuat

M2= Konsentrasi yang akan dibuat

Perhitungan pengenceran :

A. Pembuatan larutan induk

X = 5 𝑚𝑔

500 µ𝑙= 10.000 𝑝𝑝𝑚

B. Pembuatan 5 seri konsentrasi dengan pengenceran dari larutan induk

10.000 ppm

Konsentrasi 100 ppm

V1.10.000 ppm= 200 µL .100 ppm

V1 = 2 µL

Konsentrasi 10 ppm

V1.10.000 ppm = 100 µL.

1.000 ppm

V1 = 10 µL + 90 µL DMSO

Volume yang diujikan

V1. 1.000 ppm = 200 µL . 10 ppm

V1 = 2 µL

Konsentrasi 1 ppm

V1.1.000 ppm =100 µL.100 ppm

V1 = 10 µL + 90 µL DMSO


V1. 100 ppm = 200 µL . 1 ppm

V1 = 2 µL

Konsentrasi 20 ppm

V1.10.000 ppm =100 µL.

2.000 ppm

V1 = 20 µL + 80 µL DMSO


V1.2.000 ppm = 200 µL .20 ppm

V1 = 2 µL

Konsentrasi 0.1 ppm

V1.100 ppm = 100 µL.10 ppm

V1 = 10 µL + 90 µL DMSO


V1. 10 ppm = 200 µL . 0,1 ppm

V1 = 2 µL

V1 . M1 = V2 . M2

62


Lampiran 9. Perhitungan Pembuatan Assay Mix

Hepes 20 mL, konsentrasi 50 mM KCN 20 µL, konsentrasi 1 M

20.000µL . 50mM = 20.000µL . C2 20µL .1000mM = 20.000µL . C2

C2 = 50 mM C2 = 1 mM

d-UQ 8,3 µL,konsentrasi 60 mM DCIP 200 µL, konsentrasi 12Mm

8,3µL . 60mM = 20.000µL . C2 200µL . 12mM = 20.000µL . C2

C2 = 25 µM C2 = 120 µM

PfMQO 3,1 µL, konsentrasi 2,778 Malate 5µL, konsentrasi 400 µM

µg/mL

3,1µL . 2,778µg/mL = 20.000µL . C2 5µL . 400 µM = 20.000µL . C2

C2 = 0,43 µg/mL C2 = 10 mM

No Bahan Volume Konsentrasi

awal

Konsentrasi akhir

1 HEPES 20 mL 50 mM 50 mM

2 KCN 20 µL 1 M 1 mM

3 d-UQ 8,3 µL 60 mM 25 µM

4 DCIP 200 µL 12 mM 120 µM

5 PfMQO membran

stock

3,1 µL 2,788

µg/ml

0,43 µg/mL

6 Substrat Malate* 5 µL 400 Mm 10 mM

Volume Total 20,236 mL

63


Lampiran 10. Absorbansi dan Inhibisi (%) Pengujian IC50 Senyawa Murni Ekstrak

Etil Asetat Daun Beluntas (Pluchea indica (L) Less.)

Konsentrasi

µg/mL

Log Konsentrasi Absorbansi % Inhibisi

100 2.00 -0.146 94.48

20 1.30 -0.3 67.2

10 1.00 -0.379 53.06

1 0.00 -0.494 32.62

0.1 -1.00 -0.607 12.53

IC50 isolat murni

64


Lampiran 11. Hasil Spektrum 1H-NMR

Spektrum H-NMR Isolat Murni

CDCl3, 500 Mhz

65


Lampiran 12. Dokumentasi Penelitian

Sampel daun beluntas

Proses pengeringan sampel

Penimbangan simplisia

Penghalusan simplisia

Simplisia

Destilasi pelarut

Proses maserasi

Proses penyaringan

66


Filtrat hasil maserasi

Ekstrak kental n-heksan

Pengeringan residu n-heksan

Ekstrak kental atil asetat

Kolom kromatografi I

Hasil KLT UV 254 nm

Kolom Kromatografi II

Proses KLT di chamber

67


Proses pemurnian isolat murni

Vial

V-Plate

Spektrofotometer

(Thermoscientific Multiscan Go)

Sebelum pengujian PfMQO

Sesudah pengujian PfMQO

Documents

UIN SYARIF HIDAYATULLAH JAKARTA ISOLASI DAN …repository.uinjkt.ac.id/dspace/bitstream/123456789/49545/1/Giyan R… · Salah satu target obat malaria yang terbaru adalah MQO (Malate