Upload
lamnga
View
213
Download
1
Embed Size (px)
Citation preview
UIN SYARIF HIDAYATULLAH JAKARTA
Uji Aktivitas Ekstrak Kulit Buah Manggis (Garcinia mangostana L.) sebagai Inhibitor RNA Helikase
Virus Hepatitis C
SKRIPSI
PUTRI SYAJARWATI 10810200032
FAKULTAS KEDOKTERAN DAN ILMU KESEHATAN PROGRAM STUDI FARMASI
JAKARTA JANUARI 2013
ii
UIN SYARIF HIDAYATULLAH JAKARTA
Uji Aktivitas Ekstrak Kulit Buah Manggis (Garcinia mangostana L.) sebagai Inhibitor RNA Helikase
Virus Hepatitis C
SKRIPSI Diajukan sebagai salah satu syarat untuk memperoleh gelar Sarjana Farmasi
PUTRI SYAJARWATI 10810200032
FAKULTAS KEDOKTERAN DAN ILMU KESEHATAN PROGRAM STUDI FARMASI
JAKARTA JANUARI 2013
v
HALAMAN PENGESAHAN
Skripsi ini diajukan oleh : Nama : Putri Syajarwati NIM : 108102000032 Program Studi : Farmasi Judul Skripsi : Uji Aktivitas Ekstrak Kulit Buah Manggis (Garcinia
mangostana L.) sebagai Inhibitor RNA Helikase Virus Hepatitis C
Telah berhasil dipertahankan di hadapan Dewan Penguji dan diterima sebagai bagian persyaratan yang diperlukan untuk memperoleh gelar Sarjana Farmasi pada Program Studi Farmasi Fakultas Kedokteran dan Ilmu Kesehatan, Universitas Islam Negeri (UIN) Syarif Hidayatullah Jakarta
DEWAN PENGUJI
Pembimbing I : Lina Elfita, M.Si, Apt ( )
Pembimbing II: A. Zaenal Mustopa, M.Si ( )
Penguji I : Ismiarni Komala, M.Sc., Ph.D., Apt ( )
Penguji II : Puteri Amelia, M.Farm., Apt ( )
Penguji III : Prof. Dr. Atiek Soemiati, M.Si., Apt ( ) Ditetapkan di : Jakarta Tanggal : 22 Januari 2013
Mengetahui, Dekan Fakultas Kedokteran dan Ilmu Kesehatan
UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
Prof. Dr.(hc). dr. M. K. Tadjudin, Sp. And
vi UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
ABSTRAK
Nama : Putri Syajarwati Program Studi : Farmasi Judul : Uji Aktivitas Ekstrak Kulit Buah Manggis (Garcinia
mangostana L.) sebagai Inhibitor RNA Helikase Virus Hepatitis C
Virus hepatitis C (HCV) merupakan penyebab penyakit hepatitis C yang mempunyai tingkat virulensi yang tinggi. Hingga saat ini belum ada vaksin dan obat untuk mencegah dan mengobati infeksi HCV. Terapi pengobatan saat ini adalah menggunakan pegylated interferon-α (IFN-α) dikombinasi dengan ribavirin, namun memiliki efektivitas yang rendah sekitar 40% – 50%. Upaya penemuan obat terhadap infeksi HCV diantaranya adalah dengan pencarian inhibitor terhadap enzim yang essensial untuk replikasi HCV, salah satunya adalah RNA helikase. Manggis (Garcinia mangostana L.) merupakan tanaman tropis yang banyak dibudidayakan di Indonesia dan dimanfaatkan sebagai obat tradisional. Penelitian ini bertujuan untuk menguji aktivitas ekstrak n-heksan, etil asetat, dan metanol kulit buah manggis sebagai inhibitor RNA helikase HCV. Aktivitas inhibisi dihitung berdasarkan pelepasan fosfat anorganik dengan metode kolorimetri ATPase. Kulit buah manggis diekstraksi menggunakan pelarut n-heksan, etil asetat, dan metanol. Ekstrak kasar kulit buah manggis dibuat seri pengenceran menggunakan metanol absolut dengan konsentrasi 100.000 ppm, 50.000 ppm, 25.000 ppm, 12.500 ppm, 6.250 ppm, 3.125 ppm, 1.562 ppm, 761 ppm, dan 391 ppm. Hasil penelitian menunjukkan bahwa pada konsentrasi 3.125 ppm ekstrak yang memiliki aktivitas penghambatan tertinggi terdapat pada ekstrak metanol yaitu sebesar 71,57%. Sedangkan, ekstrak n-heksan memiliki aktivitas 41,79%, dan ekstrak etil asetat memiliki aktivitas terendah yaitu sebesar 39,07%. Hasil ini menunjukkan bahwa ekstrak kulit buah manggis berpotensi sebagai inhibitor virus hepatitis C. Kata kunci : Kulit buah manggis (Garcinia mangostana L.), Virus hepatitis C, Uji
kolorimetri ATPase.
vii UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
ABSTRACT
Name : Putri Syajarwati Program Study : Pharmacy Title : Activity Test of Mangosteen (Garcinia mangostana L.)
Pericarp Extract as Inhibitor of Hepatitis C Virus RNA Helicase
Hepatitis C virus (HCV) is the cause of chronic hepatitis C disease that has a high level of virulence. To date, there is no prophylactic vaccine and medicine avalaible to prevent and treat HCV infection. The current treatment therapy is involves the administration of pegylated interferon-α (IFN-α) in combination with ribavirin, but it has a low effectiveness rate of about 40% - 50%. Infectious disease drug discovery efforts include the search HCV inhibitor to an enzyme essential for viral replication of HCV, in example RNA helicase. Mangosteen (Garcinia mangostana L.) is a tropical plant widely cultivated in Indonesia and has been used as traditional medicine. This study aims to examine the activity n-hexane, ethyl acetate, and methanol extracts of mangosteen pericarp as an inhibitor of HCV RNA helicase. Inhibitory activity was calculated based on the release of inorganic phosphate by the ATPase colorimetric assay. Pericarp of mangosteen was extracted using the n-hexane, ethyl acetate, and methanol. Crude extract dilution pericarp of mangosteen is made using absolute methanol with a concentration of 100.000 ppm, 50.000 ppm, 25.000 ppm, 12.500 ppm, 6.250 ppm, 3.125 ppm, 1.562 ppm, 761 ppm, and 391 ppm. The results indicated that the highest inhibitory activity at a concentration of 3.125 ppm was observed in methanol extracts, 71.57%. While n-hexane has activity 41.79%, and the lowest activity of the ethyl acetate extract is equal to 39.07%. These results indicate that pericarp of mangosteen extract has potential as inhibitor of the HCV. Keywords: Mangosteen (Garcinia mangostana L.) pericarp, Hepatitis C Virus,
ATPase Colorimetric Assay.
viii UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
KATA PENGANTAR
Alhamdulillahirabbil’alamin, puji syukur saya panjatkan kepada Allah SWT,
Zat Yang Maha Kasih dan Maha Penyayang yang telah melimpahkan rahmat dan
hidayah-Nya sehingga penulis dapat menyelesaikan skripsi ini. Penulisan skripsi ini
dilakukan dalam rangka memenuhi salah satu syarat untuk mencapai gelar Sarjana
Farmasi pada Fakultas Kedokteran dan Ilmu Kesehatan Universitas Islam Negeri
(UIN) Syarif Hidayatullah Jakarta.
Saya menyadari bahwa, tanpa bantuan dan bimbingan dari berbagai pihak,
dari masa kuliah sampai pada penyusunan skripsi ini, sangatlah sulit bagi saya untuk
menyelesaikan skripsi ini. Oleh karena itu, saya mengucapkan terima kasih kepada :
(1) Ibu Lina Elfita, M.Si., Apt. selaku pembimbing I dan Bapak Apon Zaenal
Mustopa, M.Si. selaku pembimbing II, yang memiliki andil besar dalam proses
penelitian dan penyelesaian tugas akhir saya ini, semoga segala bantuan dan
bimbingan ibu dan bapak mendapat imbalan yang lebih baik di sisi-Nya.
(2) Bapak Prof. Dr. dr.(hc). M. K. Tadjudin, Sp.And selaku Dekan Fakultas
Kedokteran dan Ilmu Kesehatan Universitas Islam Negeri (UIN) Syarif
Hidayatullah Jakarta
(3) Bapak Drs. Umar Mansur, M,Sc., Apt selaku ketua Program Studi Farmasi
Fakultas Kedokteran dan Ilmu Kesehatan Universitas Islam Negeri (UIN) Syarif
Hidayatullah Jakarta
(4) Bapak dan Ibu staf pengajar dan karyawan yang telah memberikan bimbingan
dan bantuan selama saya menempuh pendidikan di Program Studi Farmasi
Fakultas Kedokteran dan Ilmu Kesehatan Universitas Islam Negeri (UIN) Syarif
Hidayatullah Jakarta.
(5) Teman seperjuangan dalam penelitian Yuni, dan keluarga besar Laboratorium
Bakteriologi dan Virologi Molekuler LIPI, Ibu Rifqiyah, Pak Ridwan, Ibu Linda,
Aksar, Kak Bobby, Kak Meita, Bia, Krishna, dan Hary, yang telah banyak
membantu penulis dalam penelitian.
ix UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
(6) Teman-teman Farmasi angkatan 2008 dan sahabat-sahabat tercinta Berty, Sekar,
Sukma, dan Via yang berbagi suka, duka, keceriaan, dan semangat semasa kuliah
hingga penyelesaian tugas akhir ini.
(7) Adik-adik tersayang, Zaky, Hanna, Farih, yang tak henti memberikan dukungan
dan semangat.
(8) Kedua orang tua tercinta, Ayahanda H.Najmudin dan Ibunda Hj.Siti Maemunah
yang tak pernah letih mencurahkan kasih sayangnya dalam setiap doa dan
dukungan yang diberikan kepada penulis, untuk menyelesaikan tugas akhir ini
semoga segala amalan dan jerih payah keduanya mendapat balasan yang jauh
lebih baik disisi-Nya.
Akhir kata, semoga Allah SWT berkenan membalas segala kebaikan semua
pihak yang telah membantu. Penulis menyadari bahwa penulisan skripsi ini masih
jauh dari kata sempurna, untuk itu saran dan kritik tetap penulis harapkan untuk
menjadikan tulisan ini lebih baik. Penulis berharap semoga skripsi ini membawa
manfaat bagi pengembangan ilmu pengetahuan maupun sebagai tambahan informasi
untuk memperkaya ilmu di kemudian hari.
Jakarta, Januari 2013
Penulis
x UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
HALAMAN PERNYATAAN PERSETUJUAN PUBLIKASI TUGAS AKHIR UNTUK KEPENTINGAN AKADEMIS
Sebagai sivitas akademik Universitas Islam Negeri (UIN) Syarif Hidayatullah Jakarta, saya yang bertanda tangan di bawah ini :
Nama : Putri Syajarwati NIM : 108102000032 Program Studi : Farmasi Fakultas : Kedokteran dan Ilmu Kesehatan Jenis karya : Skripsi
demi perkembangan ilmu pengetahuan, saya menyetujui skripsi/karya ilmiah saya, dengan judul :
UJI AKTIVITAS EKSTRAK KULIT BUAH MANGGIS (Garcinia mangostana L.) SEBAGAI INHIBITOR RNA HELIKASE VIRUS HEPATITIS C
untuk dipublikasikan atau ditampilkan di internet atau media lain yaitu Digital Library Perpustakaan Universitas Islam Negeri (UIN) Syarif Hidayatullah Jakarta untuk kepentingan akademik sesuai dengan Undang-Undang Hak Cipta.
Demikian pernyataan persetujuan publikasi karya ilmiah ini saya buat dengan sebenarnya.
Dibuat di : Jakarta Pada Tanggal : 22 Januari 2013
Yang menyatakan,
(Putri Syajarwati)
xi UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
DAFTAR ISI
Halaman HALAMAN JUDUL ...................................................................................... ii HALAMAN PERNYATAAN ORISINALITAS ......................................... iii HALAMAN PERSETUJUAN PEMBIMBING .......................................... iv HALAMAN PENGESAHAN ........................................................................ v ABSTRAK ...................................................................................................... vi ABSRTACT .................................................................................................... vii KATA PENGANTAR .................................................................................... viii HALAMAN PERSETUJUAN PUBLIKASI KARYA ILMIAH ............... x DAFTAR ISI ................................................................................................... xi DAFTAR TABEL .......................................................................................... xiii DAFTAR GAMBAR ...................................................................................... xiv DAFTAR LAMPIRAN .................................................................................. xv DAFTAR ISTILAH ....................................................................................... xvi
BAB 1. PENDAHULUAN ............................................................................. 1 1.1 Latar Belakang ......................................................................................... 1 1.2 Rumusan Masalah .................................................................................... 2 1.3 Hipotesis .................................................................................................. 2 1.4 Tujuan Penelitian ..................................................................................... 3 1.5 Manfaat Penelitian ................................................................................... 3
BAB 2. TINJAUAN PUSTAKA .................................................................... 4 2.1 Manggis.................................................................................................... 4
2.1.1 Klasifikasi ...................................................................................... 4 2.1.2 Nama Daerah ................................................................................. 4 2.1.3 Penyebaran Geografi ...................................................................... 4 2.1.4 Deskripsi ........................................................................................ 5 2.1.5 Kandungan ..................................................................................... 6 2.1.6 Kegunaan ....................................................................................... 6
2.2 Ekstraksi ................................................................................................... 7 2.2.1 Metoda Ekstraksi ........................................................................... 7 2.2.2 Parameter Ekstrak .......................................................................... 9
2.3 Virus Hepatitis C...................................................................................... 9 2.4 RNA Helikase Virus Hepatitis C ............................................................. 12 2.5 Kolorimetri ATPase ................................................................................. 15 2.6 SDS-PAGE .............................................................................................. 15
BAB 3. METODOLOGI ................................................................................ 17 3.1 Tempat dan Waktu Penelitian .................................................................. 17 3.2 Alat dan Bahan ......................................................................................... 17
xii UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
3.2.1 Alat ................................................................................................. 17 3.2.2 Bahan ............................................................................................. 17
3.3 Prosedur Penelitian .................................................................................. 18 3.3.1 Pengambilan Sampel ................................................................... 18 3.3.2 Determinasi Sampel .................................................................... 18 3.3.3 Pembuatan Simplisia ................................................................... 18 3.3.4 Pembuatan Ekstrak Kulit Buah Manggis .................................... 18 3.3.5 Penapisan Fitokimia .................................................................... 19 3.3.6 Penetapan Parameter Spesifik dan Non Spesifik ........................ 20 3.3.7 Produksi RNA Helikase HCV .................................................... 21 3.3.8 Konfirmasi Kemurnian Enzim RNA Helikase HCV
dengan SDS-PAGE ..................................................................... 23 3.3.9 Uji Aktivitas Enzim RNA Helikase HCV .................................. 24 3.3.10 Uji Aktivitas Inhibisi terhadap RNA Helikase HCV .................. 24
BAB 4. HASIL DAN PEMBAHASAN ......................................................... 26 4.1 Determinasi Sampel ................................................................................. 26 4.2 Rendemen Ekstrak ................................................................................... 26 4.3 Penapisan Fitokimia ................................................................................. 28 4.4 Parameter Standar Ekstrak ....................................................................... 31 4.5 Produksi RNA Helikase Virus Hepatitis C .............................................. 31 4.6 Aktivitas Inhibisi Ekstrak Garcinia mangostana L. terhadap
RNA Helikase Virus Hepatitis C ............................................................ 35
BAB 5. KESIMPULAN DAN SARAN ......................................................... 40 5.1 Kesimpulan. ........................................................................................... 40 5.2 Saran ........................................................................................... 40
DAFTAR PUSTAKA ..................................................................................... 41 LAMPIRAN .................................................................................................... 45
xiii UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
DAFTAR TABEL
Halaman Tabel 2.1 Inhibitor RNA Helikase HCV .......................................................... 14 Tabel 4.1 Rendemen Ekstrak Kulit Buah Mangis ............................................ 27 Tabel 4.2 Hasil Penapisan Fitokimia Ekstrak Kulit Buah Manggis................. 28 Tabel 4.3 Parameter Standar Ekstrak ............................................................... 31 Tabel 4.4 Aktivitas Inhibisi Ekstrak Kulit Buah Manggis terhadap RNA
Helikase HCV .................................................................................. 36
xiv UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
DAFTAR GAMBAR
Halaman Gambar 2.1 Struktur Virus Hepatitis C ............................................................ 10 Gambar 2.2 Peta Genomik RNA Helikase HCV ............................................. 13 Gambar 2.3 Mekanisme Kerja RNA Helikase HCV ....................................... 13 Gambar 4.1 SDS-PAGE RNA Helikase HCV ................................................. 34 Gambar 4.2 Aktivitas Inhibisi Ekstrak Kulit Buah Manggis terhadap RNA Helikase HCV ............................................................................. 37
xv UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
DAFTAR LAMPIRAN
Halaman Lampiran 1. Hasil Determinasi Garcinia mangostana L .............................. 45 Lampiran 2. Alur Penelitian .......................................................................... 46 Lampiran 3. Skema Kerja Penyiapan Ekstrak Kulit Buah Manggis ............. 47 Lampiran 4. Skema Kerja Produksi Enzim RNA Helikase HCV ................. 48 Lampiran 5. Skema Kerja Analisis Kemurnian Enzim RNA Helikase
HCV dengan SDS-PAGE ......................................................... 49 Lampiran 6. Skema Kerja Uji Aktivitas Enzin RNA Helikase HCV ........... 50 Lampiran 7. Skema Kerja Uji Aktivitas Inhibisi Ekstrak Kulit Buah
Manggis terhadap RNA helikase HCV .................................... 51 Lampiran 8. Komposisi larutan-larutan yang digunakan dalam
SDS-PAGE ............................................................................... 52 Lampiran 9. Komposisi Reagen, Dapar, dan Medium yang digunakan ...... 53 Lampiran 10. Perhitungan Rendemen Ekstrak Kulit Buah Manggis .............. 54 Lampiran 11. Perhitungan Parameter Ekstrak Kulit Buah Manggis. .............. 55 Lampiran 12. Perhitungan Pengenceran Ekstrak Kulit Buah Manggis .......... 57 Lampiran 13. Hasil Uji Aktivitas Inhibisi Ekstrak Kulit Buah Manggis
terhadap Enzim RNA Helikase HCV ....................................... 59 Lampiran 14. Perhitungan Persentase Inhibisi Ekstrak Kulit Buah
Manggis terhadap Enzim RNA Helikase HCV ........................ 60 Lampiran 15. Kurva Standar Fosfat (Uji ATPase) ......................................... 61 Lampiran 16. Contoh Perhitungan Aktivitas RNA Helikase HCV ................ 62 Lampiran 17. Grafik Aktivitas Enzim RNA Helikase HCV ........................... 63 Lampiran 18. Gambar Alat Penelitian ............................................................ 64
xvi UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
DAFTAR ISTILAH
APS : Ammonium Per Sulfat ATP : Adenosin Trifosfat IPTG : Isopropyl-β-D-Thiogalaktopiranosidase IV : Inner volum HCV : Hepatitis C Virus LB : Media Luria - Bertani MOPS : 4-asam morfolinopropana sulfonat OD : Optical Density SDS-PAGE : Sodium Dodecyl Sulfate Polyacrylamide Gel Electrophoresis TEMED : N,N,N’,N’-tetrametiletilendiamin W : Washing
1 UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
BAB 1
PENDAHULUAN
1.1 Latar Belakang
Virus hepatitis C (HCV) menginfeksi lebih dari 170 juta orang di seluruh
dunia. HCV mengakibatkan peradangan hati, sirosis hati, dan kanker hati
(hepatocellular carcinoma) (Lee et al, 2010). Pasien yang menderita hepatitis C
akut dapat berkembang menjadi infeksi kronis. Hal ini yang menyebabkan
kematian ratusan ribu penderita setiap tahun (Kawo et al, 2012). Menurut data
Kementerian Kesehatan Republik Indonesia, pada tahun 2010 jumlah penderita
hepatitis C di Indonesia cukup tinggi sekitar 30 juta jiwa (Kemenkes RI, 2010).
Hingga saat ini belum ada vaksin dan obat untuk mencegah dan
mengobati infeksi HCV. Terapi pengobatan saat ini untuk hepatitis C kronis
adalah pegylated interferon-α (IFN-α) dikombinasi dengan nukleosida analog
ribavirin. Akan tetapi terapi ini memiliki tingkat efektivitas sekitar 40% – 50%
terhadap infeksi HCV. Kombinasi ini memiliki efek samping seperti flu, anemia,
dan depresi, yang sering menyebabkan penghentian terapi. Dengan demikian,
diperlukan penelitian untuk menemukan agen baru dengan indeks terapi tinggi
dan efek samping minimal untuk mengobati infeksi HCV kronis (Lee et al, 2010,
Ravikumar et al, 2011).
Upaya penemuan obat penyakit infeksi HCV diantaranya adalah dengan
pencarian inhibitor terhadap enzim yang essensial untuk replikasi virus HCV
salah satunya adalah RNA helikase. RNA helikase berperan dalam pembukaan
untai ganda RNA. RNA helikase memiliki tiga aktivitas yaitu, aktivitas ikatan
RNA (RNA binding), pengikatan ATPase (RNA-stimulated ATPase), dan
pembukaan rantai RNA. Proses pembukaan untai ganda RNA virus sebagai
materi genetik apabila tidak dilakukan, maka proses translasi informasi genetik
tidak dapat berjalan, sehingga siklus hidup HCV terhenti. Hal ini menujukkan
bahwa dengan penghambatan enzim RNA helikase HCV, maka dapat
dikembangkan potensi penemuan obat anti HCV (Utama et al, 2000).
2
UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
Perkembangan ilmu pengetahuan dan teknologi saat ini menjadikan obat
herbal cukup menjadi perhatian untuk dikembangkan menjadi bagian dari
pengobatan formal di Indonesia (Wasito, 2011). Manggis (Garcinia mangostana
L.) merupakan tanaman tropis yang memiliki aktivitas biologis yang menarik
dengan aplikasi terapi yang potensial. Manggis banyak dibudidayakan di hutan
hujan tropis seperti Indonesia, yang secara tradisional digunakan untuk
pengobatan sakit perut, diare, astringent, disentri, infeksi luka, nanah, maag
kronis, keputihan dan gonore (kencing nanah) (Moongkarndi et al, 2003).
Spesies Garcinia dikenal kaya metabolit sekunder, seperti santon. Santon
ditemukan dalam kulit buah, buah utuh, kulit kayu, dan daun manggis (Chaverri
et al, 2008). Pada kulit buah manggis terdapat senyawa tanin, santon, isoflavon,
flavon, dan senyawa bioaktif lainnya (Yu et al, 2006). Senyawa bioaktif yang
terkandung dalam ekstrak kulit buah manggis telah diteliti memiliki aktivitas
sebagai anti oksidan, anti tumor, anti inflamasi, anti alergi, anti bakteri, anti fungi,
anti virus, dan anti malaria (Chaverri et al, 2008). Sedangkan penelitian terdahulu
mengenai anti virus yaitu ekstrak etanol sampel Garcinia mangostana L.
memiliki potensi sebagai inhibitor HIV-1 protease (Chen et al, 1996) dan
inhibitor HIV-1 reverse transkriptase (Chin et al, 2008). Berdasarkan hal tersebut,
maka penelitian ini dilakukan untuk menguji aktivitas ekstrak kulit buah manggis
(Garcinia mangostana L.) sebagai inhibitor RNA helikase virus hepatitis C.
1.2 Rumusan Masalah
Belum diketahui apakah ekstrak kulit buah manggis (Garcinia
mangostana L.) memiliki aktivitas sebagai inhibitor RNA helikase virus hepatitis
C.
1.3 Hipotesis
Ekstrak kulit buah manggis (Garcinia mangostana L.) mampu berperan
sebagai inhibitor enzim RNA helikase virus hepatitis C.
3
UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
1.4 Tujuan Penelitian
Mengetahui aktivitas ekstrak kulit buah manggis (Garcinia mangostana
L.) sebagai inhibitor RNA helikase virus hepatitis C.
1.5 Manfaat Penelitian
Manfaat dari penelitian ini diharapkan dapat memberikan informasi
mengenai pemanfaatan bahan alam, khususnya kulit buah manggis (Garcinia
mangostana L.) sebagai inbitor RNA helikase virus hepatitis C.
4 UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
BAB 2
TINJAUAN PUSTAKA
2. 1. Manggis (Garcinia mangostana L.)
2.1.1 Klasifikasi Tanaman
Menurut United States Departement of Agricultural, klasifikasi dari
Manggis (Garcinia mangostana L. ) adalah sebagai berikut :
Kingdom : Plantae
Sub Kingdom : Tracheobionta
Super Divisi : Spermatophyta
Divisi : Magnoliophyta
Kelas : Magnoliopsida
Sub Kelas : Dilleniidae
Ordo : Theales
Famili : Clusiaceae
Genus : Garcinia
Spesies : Garcinia mangostana L.
2.1.2 Nama Daerah
Manggis dalam bahasa Belanda disebut manggistan, Perancis
mangoustan, sedangkan dalam bahasa Inggris adalah mangosteen. Di Indonesia
sendiri di Aceh dikenal dengan nama manggoita, Batak dikenal dengan nama
manggisto, manggus, atau manggusta, di Jawa manggis, di Sunda disebut
manggu, dan secara keseluruhan di Indonesia dikenal dengan nama manggis
(Heyne, 1987).
2.1.3 Penyebaran Geografi
Manggis tersebar di Asia Tenggara, yaitu dari Indonesia ke Timur
sampai Nugini dan Kepulauan Mindanao (Filipina), dan ke Utara melalui
Semenajung Malaysia ke bagian selatan Thailand, Myanmar, Vietnam, dan
5
UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
Kamboja. Hanya dalam 2 abad terakhir tanaman ini tersebar ke negara-negara
tropis lainnya, termasuk Sri Lanka, India Selatan, Amerika Tengah, Brazil, dan
Australia (Verheij, 1997). Di Indonesia, ditanam diseluruh Nusantara, di Jawa
dapat ditemukan hampir semua desa di bawah ketinggian 1500 m diatas
permukaan laut (Heyne, 1987).
2.1.4 Deskripsi
Manggis merupakan pohon yang bersifat dioesis, tingginya 6 - 25 m,
berbatang lurus, bercabang-cabang simetris, membentuk tajuk piramid
beraturan, sesuai dengan model arsitektur Attims. Semua bagian tanaman
mengeluarkan getah kuning jika dilukai. Daunnya berhadapan, dengan
tangkainya yang memeluk pucuk, sehingga pasangan teratas menutupi kuncup
terminalnya, lembaran daun berbentuk lonjong atau jorong, berukuran (15-25)
cm x (17-13) cm, menjangat dan tebal, pinggirannya rata, bagian ujungnya
loncos (cuspidate), lembaran sebelah bawah berwarna hijau-kuning, dengan urat
tengah yang hijau muda, menonjol pada kedua belah daun, dan memiliki banyak
samping yang menonjol dan berjarak sama. Bunga-bunganya menyendiri atau
tidak berpasang-pasangan, berada di ujung ranting, bergagang pendek dan tebal,
berdiameter kira-kira 5,5 cm; daun kelopak 4 helai, tersusun dalam 2 pasang;
daun mahkota 4 helai juga, tebal dan berdaging, berwarna hijau-kuning, dengan
pinggiran kemerah-merahan; benang sari semu biasanya banyak, berseri 1 – 2,
panjangnya kira-kira 0,5 cm; bakal buah tak bertangkai, berbentuk agak bulat,
beruang 4 – 8. Buahnya bertipe buah buni yang bulat dan berkulit licin,
berdiameter 4 – 7 cm, sewaktu matang berubah menjadi lembayung tua, dengan
daun kelopak yang tetap menempel dan tetap dihiasi oleh cuping kepala putik;
daging buah tebalnya kira-kira 0,9 cm, berwarna lembayung; 0 – 3 ruang berisi
biji yang berkembang sempurna, terbungkus oleh aril yang berwarna putih
(Verheij, 1997).
6
UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
2.1.5 Kandungan
Kulit buah manggis kaya akan pektin, dan juga berisi tanin, katekin,
rosin, dan zat warna hitam (Verheij, 1997). Yu et al, 2007 menyebutkan bahwa
kulit buah manggis mengandung senyawa tanin, santon, isoflavon, flavon, dan
senyawa bioaktif lainnya, sedangkan dalam penelitian Pasaribu et al, 2012
dilaporkan bahwa ekstrak etanol kulit buah manggis mengandung alkaloid,
flavonoid, saponin, tanin, dan steroid/triterpenoid. Metabolit sekunder khas
yang melipah pada kulit buah manggis adalah santon (Yu et al, 2007). Menurut
Chaverri et al, 2008 pada manggis terdapat konstituen utama santon seperti α-
mangostin, β-mangostin, γ-mangostin, gartanine, garcinone E, 8-
deoxygartanine. Sedangkan pada penelitian lain juga disebutkan bahwa
konstituens utama yang diperoleh dari kulit buah manggis adalah
tetrahydroxanthone, garcimangosxanthone (Zhang et al, 2010).
2.1.6 Kegunaan
Kulit Buah Manggis memiliki banyak kegunaan, yaitu sebagai
astringen, berupa obat dalam bentuk seduhan ataupun dikeringkan dan digerus
menjadi serbuk. Sebagai obat luar antara lain injeksi annal pencuci perut. Obat
seduhan digunakan untuk mengobati diare, disentri kronis, peradangan saluran
kemih kronis, pendarahan usus, dan sebagai obat cacing. Penggunaan luar untuk
wasir, terhadap borok, terhadap tonsil bengkak, tumor rongga mulut dan
kerongkongan, pembentukan ludah berlebihan, beser putih (flour albus) dan
sebagainya (Heyne, 1987). Sedangkan berdasarkan penelitian, santon yang
merupakan kandungan utama kulit buah manggis, dilaporkan memiliki aktivitas
sebagai anti oksidan, anti inflamasi, anti kanker ( kanker payudara, kanker hati,
kanker darah, dan kanker paru-paru), anti tumor, anti alergi, anti bakteri, anti
fungi, anti virus, dan anti malaria (Zhang et al, 2010, Wang et al, 2011,
Chaverri et al, 2008).
7
UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
2.2 Ekstraksi
2.2.1 Metoda Ekstraksi
Ekstraksi adalah proses penarikan komponen/zat aktif suatu simplisia
dengan menggunakan pelarut tertentu. Pemikiran metode ekstraksi senyawa
bukan atom dipergunakan oleh beberapa faktor, yaitu sifat jaringan tanaman,
sifat kandungan zat aktif serta kelarutan dalam pelarut yang digunakan. Prinsip
ekstraksi adalah melarutkan senyawa polar dalam pelarut polar dan senyawa non
polar dalam senyawa non polar. Secara umum ekstraksi dilakukan secara
berturut-turut mulai dengan pelarut non polar (n-heksan) lalu pelarut yang
kepolarannya menengah (diklor metan atau etil asetat) kemudian pelarut yang
bersifat polar (metanol atau etanol) (Chaudri, 2001).
Prosedur Ekstraksi : (Tiwari et al, 2011)
1. Plant tissue homogenization (Homogenisasi Jaringan Tumbuhan)
Homogenisasi Jaringan Tumbuhan menggunakan pelarut telah banyak
digunakan dalam penelitian. Simplisia kering maupun basah, dihaluskan
menjadi serbuk, sejumlah tertentu pelarut dimasukkan dan dikocok selam 5-
10 menit atau didiamkan hingga 24 jam kemudian ekstrak disaring dan
filtratnya dikeringkan dalam vakum.
2. Exhautive extraction
Merupakan metoda umum yang lain ekstraksi berturut-turut
menggunakan peningkatan polaritas pelarut, dari pelarut yang tidak polar
(heksan) menjadi pelarut polar (metanol). Untuk memastikan berbagai macam
polaritas senyawa dapat diekstraksi. Beberapa penelitian menggunakan
ekstraksi soxlet dari simplisia kering menggunakan pelarut organik. Metoda
ini tidak dapat digunakan pada senyawa termolabil, karena pemanasan yang
berkepanjangan dapat menyebabkan degradasi senyawa.
3. Ekstrasi soxlet
Ekstraksi soxlet hanya digunakan pada senyawa yang memiliki
kelarutan tertentu dan adanya pengotor yang larut dalam suatu pelarut.
8
UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
Apabila senyawa yang diinginkan memiliki kelarutan kelarutan yang tinggi
dalam pelarut maka dapat menggunakan filtrasi sederhana dengan
memisahkan senyawa dari pengotor yang tidak larut. Metode ini tidak dapat
digunakan pada senyawa termolabil, karena pemanasan yang berkepanjangan
dapat menyebabkan degradasi senyawa.
4. Maserasi
Serbuk simplisia diberi pelarut dalam wadah tertutup dan dilakukan
pengadukan hingga senyawa terekstrak dalam pelarut. Metode ini sesuai
digunakan untuk senyawa termolabil.
5. Dekok
Metode ini digunakan untuk senyawa yang larut dalam air dan stabil
dalam pemanasan. Simplisia direbus dalam air selama 15 menit.
6. Infus
Simplisia dimaserasi dengan waktu singkat menggunakan air dingin
atau mendidih.
7. Digesti
Digesti merupakan jenis maserasi yang menggunakan suhu hangat
selama proses ekstraksi.
8. Perkolasi
Prosedur ini paling sering digunakan mengekstraksi senyawa aktif
dalam simplisia. Pelarut ditambahkan untuk membasahi simplisia dan
didiamkan selama 4 jam dalam perkolator yang tertutup. Sejumlah tertentu
pelarut ditambahkan kembali hingga simplisia terendam dalam perkolator dan
didiamkan selama 24 jam , selanjutnya perkolator dibuka dan cairan dibiarkan
menetes perlahan.
9. Sonikasi
Prosedur ini menggunakan gelombang ultrasonik dengan frekuensi
antara 20-2000 kHz, hal ini menyebabkan peningkatan permeabilitas dinding
9
UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
sel. Kelemahan dari prosedur ini adalah terjadinya efek yang merusak
senyawa aktif dari simplisia dengan pembentukan radikal bebas.
2.2.2 Parameter Ekstrak
1. Susut pengeringan
Susut pengeringan adalah pengukuran sisa zat setelah pengeringan pada
temperatur 105°C selama 30 menit atau sampai berat konstan yang dinyatakan
sebagai nilai persen (%). Tujuannya untuk memberikan batasan maksimal
(rentang) tentang besarnya senyawa yang hilang pada proses pengeringan. Nilai
untuk susut pengeringan jika tidak dinyatakan lain adalah kurang dari 10%
(Depkes RI, 2000).
2. Kadar Abu
Untuk penentuan kadar abu, bahan dipanaskan pada temperatur dimana
senyawa organik dan turunannya terdestruksi dan menguap sehingga hanya tersisa
unsur mineral dan anorganik. Tujuannya adalah untuk memberikan gambaran
tentang kandungan mineral internal dan eksternal yang berasal dari proses awal
sampai terbentuknya ekstrak. Nilai untuk kadar abu sesuai dengan yang tertera
dalam monografi (Depkes RI, 2000).
2.3 Virus Hepatitis C
Hepatitis merupakan penyebab peradangan hati. Hepatitis dapat
disebabkan oleh virus hepatotropik (hepatotropic virus), yang terutama
mempengaruhi sel-sel hati, mekanisme autoimun, atau gangguan sistemik
lainnya. Virus hepatotropik meliputi virus hepatitis A (HAV), virus hepatitis B
(HBV), hepatitis B terkait virus delta (HDV), virus hepatitis C (HCV), dan
hepatitis E virus (HEV). Meskipun semua virus tersebut menyebabkan hepatitis
akut, namun berbeda dalam modus penularan dan masa inkubasi; mekanisme,
derajat, dan kronisitas kerusakan hati; dan kemampuan untuk masuk ke keadaan
karier (Porth, 2009).
10
UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
HCV adalah penyebab paling umum dari hepatitis kronis, sirosis, dan
kanker hepatoseluler di dunia. Sekitar 3,9 juta orang Amerika memiliki antibodi
terhadap HCV, dan 70% dari orang-orang ini memiliki bukti infeksi kronis yang
ditentukan oleh adanya DNA dalam serum darah. Sebelum tahun 1990,
penularan HCV tejadi melalui transfusi darah, hubungan seksual, dapat juga
ditularkan melalui jarum suntik, sedangkan penularan dari ibu ke janinnya
terjadi sekitar 4,6% - 10% (Porth, 2009).
HCV adalah virus RNA beruntai tunggal yang memiliki sifat mirip
dengan Flavivirus, sebuah genus dari keluarga Flaviviridae seperti demam
kuning dan virus ensefalitis St Louis. Genom ini berisi reading frame tunggal
terbuka yang menyandikan poliprotein dari sekitar 3000 asam amino. Virus ini
secara genetik tidak stabil, yang menyebabkan beberapa genotip dan sub tipe.
Keanekaragaman genotip berperan pada patogenisitas virus, yang
memungkinkan terjadinya kesulitan dalam pengembangkan obat dan penemuan
vaksin ( Porth, 2009).
Gambar 2. 1. Struktur virus hepatitis C (HCV) (Solga et al, 2007)
11
UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
Masa inkubasi untuk infeksi HCV berkisar 2 - 26 minggu (rata-rata, 6
sampai 12 minggu). Anak-anak dan orang dewasa yang terinfeksi biasanya
tidak menunjukkan gejala (60% sampai 70%) atau memiliki gejala yang tidak
spesifik ditandai dengan kelelahan, malaise, anoreksia, dan penurunan berat
badan. Jaundice (penyakit kuning) jarang terjadi, dan hanya 25% sampai 39%
orang dewasa memiliki gejala ini. Gejala ini biasanya berlangsung selama 2
sampai 12 minggu. Gagal hati fulminan jarang terjadi dan hanya beberapa kasus
telah dilaporkan. Sebagian kecil dari orang-orang yang baru terinfeksi HCV
akan sembuh dari infeksi, tetapi sebagian besar (60% sampai 85%) terus
berkembang menjadi hepatitis kronis (Porth, 2009).
Pengobatan pada penderita hepatitis C kronis adalah kombinasi
pegylated interferon (alfa-2b atau alfa-2a) ditambah ribavirin (Porth, 2009).
Ribavirin adalah analog guanin yang di fosforilasi dalam sel oleh enzim sel
penjamu. Meskipun mekanisme kerjanya belum sepenuhnya jelas, ribavirin
tampaknya menggangu sintesis guanin trifosfat, menghambat capping mRNA
(RNA perantara) virus, dan menghambat polimerase RNA. Ribavirin trifosfat
menghambat replikasi sejumlah besar virus DNA dan RNA, termasuk influenza
A dan B, parainfluenza, respiratoty syncytial virus, paramiksovirus, HCV, dan
HIV-1 (Katzung, 2010).
Pengobatan dengan pegylated interferon dan ribavirin memerlukan biaya
yang besar, dan memiliki efek samping, gejala seperti flu merupakan gejala
yang umum terjadi. Efek samping yang lebih serius, yang meliputi gejala
kejiwaan (depresi), disfungsi tiroid, dan depresi sumsum tulang. Transplantasi
hati adalah pilihan pengobatan untuk penyakit hati stadium akhir akibat virus
hepatitis. Meskipun terkadang terjadi infeksi baru, penyakit ini tampaknya
berkembang lebih lambat (Porth, 2009).
12
UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
2.4 RNA Helikase Virus Hepatitis C
Helikase merupakan protein pertama kali ditemukan pada Escherichia coli
pada tahun 1976. Selanjutnya RNA dan DNA helikase dengan fungsi yang
beragam telah ditemukan di semua organisme. Helikase dapat mengikat dan
menghidrolisis untai komplemeter dari untai ganda asam nukleat, atau
mengkatalisis homolog DNA rekombinan. Fungsi helikase juga diperlukan untuk
replikasi, dan rekombinasi genom. Demikian pula, fungsi helikase memfasilitasi
proses metabolisme RNA seperti transkripsi, biogenesis ribosom, translasi,
penyambungan RNA (RNA splicing), tranportasi RNA (RNA transport), dan
degradasi RNA (RNA degradation) (Patel and Donmez, 2006).
Virus hepatitis C adalah virus RNA beruntai tunggal yang diklasifikasikan
ke dalam genus Hepacivirus, famili Flaviviridae. HCV memiliki genom 9,6 kb
yang menyandikan poliprotein tunggal. HCV terdiri dari empat protein struktural
(C, E1, E2, dan p7) dan enam protein nonstruktural (NS2, NS3, NS4A, NS4B,
NS5A dan NS5B) (Lee et al., 2010). Protein non struktural tersebut berfungsi
dalam reaksi enzimatis yang berperan dalam replikasi virus. NS1 berinteraksi
dengan NS4 dibutuhkan untuk replikase RNA. NS2A bersifat hidrofobik
berfungsi dalam perakitan virion (partikel virus baru) dan pelepasan partikel
virus. NS2B membentuk kompleks dengan NS3 berperan sebagai kofaktor bagi
serin protease dari NS3. Protein NS3 mengkodekan RNA helikase yang berperan
dalam replikase virus. NS5A merupakan daerah yang sensitif terhadap interferon,
sedangkan NS5B berperan dalam aktivitas RNA-dependent RNA polimerase
(RdRp) (Tellinghuisen et al, 2007).
13
UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
Gambar 2.2. Peta genomik RNA helikase HCV
(Tellinghuisen et al, 2007)
Gambar 2.4. Mekanisme kerja RNA helikase HCV
(Utama et al, 2005)
Protein resisten IFN
RNA Polimerase
NS2 NS3 NS4A NS5B NS5A NS4B
Protein transmembran
Metalloprotease Serin protease RNA helikase
Kofaktor
C E1 E2
Nukleokapsid
Pelindung
Glikoprotein
P7
Protein Nonstruktural Protein Struktural 5’ 3’
14
UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
Mekanisme kerja RNA helikase HCV secara umum adalah pertama-
tama helikase akan berikatan pada ujung 3’ RNA utas ganda. Tahap kedua, ATP
akan berikatan pada sisi aktif RNA helikase dan dihidrolisis pada gugus fosfat
terluar menghasilkan ADP dan fosfat anorganik (Pi). Pada proses hidrolisis
ATP ini mengeluarkan energi yang cukup besar dan digunakan untuk
memisahkan RNA utas ganda menjadi utas tunggal. Pemisahan RNA utas ganda
dilakukan dengan pemutusan ikatan hidrogen yang mengikat kedua utas
tersebut. Pembukaan ikatan utas ganda tersebut sangat berperan dalam replikasi
dan kelangsungan hidup HCV, apabila tidak berlangsung maka siklus hidup
HCV terhenti (Utama et al, 2005).
RNA helikase HCV saat ini menjadi target obat yang essensial untuk
infeksi virus hepatitis C. Oleh karena itu terjadi pengembangan riset dalam
mencari agen yang berperan sebagai inhibitor RNA helikase. Berikut tabel riset
mengenai agen yang digunakan sebagai inhibitor RNA helikase HCV.
Tabel 2.1. Inhibitor RNA helikase HCV
No Inhibitor Persen
Inhibisi
Pustaka
1 Protein kapang endofit CgKTm SF 89,45% Paturohman, 2011
2 Ekstrak metanol buah tanaman
mangrove Avicennia marina (Forsk)
Vierb.
76,705 % Kusumawati, 2011
3 Mikroalga BTM 11 81,205 % Putri, 2011a
4 Bakteriosin asam laktat S34 64,20 % Putri, 2011b.
5 Ekstrak rimpang temulawak
(Curcuma zanthorrhiza Roxb.)
73,60 % Setianingsih, 2011
15
UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
2.5 Kolorimetri ATPase
Uji kolometrik digunakan untuk menganalisis bahan yang umumnya tidak
berwarna, misalnya untuk mengukur konsentrasi protein dalam suatu sampel yang
tidak menyerap cahaya. Pereaksi yang digunakan adalah pereaksi yang berwarna
seperti malachite green dan amonium molibdat. Uji ATPase dilakukan dengan
mengukur konsentrasi fosfat yang terurai dari ATP menjadi ADP dan P, yang
dihasilkan dari reaksi enzim ATPase. Prinsip uji kolorimetrik adalah perubahan
warna yang muncul karena suatu zat warna tidak berwarna ditambah dengan
pereaksi sehingga produknya berwarna (Utama et al, 2000).
2.6 SDS - PAGE
SDS-PAGE (Sodium dedocyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis)
adalah suatu teknik yang banyak digunakan dalam biokimia, forensik, genetika,
dan biologi molekuler untuk memisahkan protein sesuai dengan mobilitas
elektroforesis (fungsi dari panjang rantai polipeptida atau bobot molekul). Sampel
elektroforesis gel SDS memiliki muatan identik per satuan massa akibat
pengikatan sampel dengan SDS dan di fraksinasi berdasarkan ukuran (Deyl,
1983).
Prinsip elektroforesis gel SDS poliakrilamid adalah protein yang akan
dianalisis dicampur dengan SDS yang merupakan sebuah deterjen anionik.
Soodium dodesil sulfat mendenaturasi struktur tersier, sekunder dan ikatan non-
sulfida. Elektroforesis gel SDS poliakrilamid menerapkan muatan negatif untuk
setiap protein dalam proporsi dengan massanya. Pemanasan sampel pada suhu
kurang lebih 60°C memecah molekul dan membantu SDS untuk mengikat
sampel. Penanda berupa pewarna dapat ditambahkan ke dalam larutan protein
untuk memungkinkan eksperimen dalam melihat migrasi protein melalui gel
selama elektroforesis dijalankan. Pewarna berukuran lebih kecil dibandingkan
ukuran protein (Laemmeli, 1970)
16
UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
Medan Listrik listrik diterapkan di seluruh gel, menyebabkan protein
bermuatan negatif bermigrasi di gel menuju anoda. Setiap protein akan bergerak
secara berbeda melalui matriks gel. Protein pendek akan lebih mudah melalui
pori-pori pada gel, sedangkan yang lebih besar akan memiliki sulit melalui pori.
Setelah mencapai waktu yang ditentukan, protein akan bermigrasi berdasarkan
ukuran. Protein yang lebih kecil akan bermigrasi jauah di bawah gel, sedangkan
yang lebih besar akan lebih dekat ke titik asal. Oleh karena itu, protein dapat
dipisahkan berdasarkan ukuran atau bobot molekulnya. Glikoprotein tertentu
berperilaku sebaliknya pada gel SDS.
Pewarna yang digunakan dalam teknik ini terdiri atas dua macam yaitu
Comassie Brilliant Blue biasanya dapat mendeteksi pita protein dengna
konsentrasi 50 mg protein. Pewarnaan perak (Silver Staining) meningkatkan
sensitivitas pewarnaan biasanya 50 kali. Banyak variabel yang dapat
mempengaruhi intensitas warna. Setiap protein memiliki karakteristik pewarnaan
sendiri (Hempelmann, 1984).
17 UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
BAB 3
METODOLOGI PENELITIAN
3.1 Tempat dan Waktu
Penelitian ini dilaksanakan di Laboratorium Pharmacy Drug and
Research (PDR), Laboratorium Pharmacy Natural Analyzing (PNA), dan
Laboratorium Pharmacy Medicinal Chemitry (PMC) Program Studi Farmasi
Fakultas Kedokteran dan Ilmu Kesehatan UIN Syarif Hidayatullah Jakarta,
Laboratorium Bakteriologi dan Virologi Molekuler, Pusat Penelitian
Bioteknologi LIPI Cibinong Bogor, pada bulan Juni sampai dengan September
2012.
3.2 Alat dan Bahan
3.2.1 Alat
Alat yang digunakan dalam penelitian ini adalah rotary evaporator
(Eyela), autoklaf tipe vertikal (mode TA – 630), ultrasentrifus (Sorvall RC - 26
plus), microplate reader (Multiscan EX Thermo), microtiter plate (Polycarp),
pipet mikro (Gilson), Laminar Air Flow (ESCO), sonikator (LabSonic), shaker
incubator (N-Biotek), freezer -20°C (Sansio), SDS-PAGE [ATTO], hot plate
magnetic stirrer (Cimarec), timbangan analitik (Acis), tabung 1,5 mL
(Eppendorf), tabung 50 mL (Falcon), spatula, erlenmeyer (Pyrex), gelas ukur
(Duran), corong (Duran), dan kertas saring.
3.2.2 Bahan
Kulit buah manggis, n-heksan teknis, etil asetat teknis, metanol teknis,
bakteri E. coli BL21 (DE3) pLysS - RNA helikase HCV rekombinan (koleksi
Andi Utama, Puslit Bioteknologi LIPI), akuades, media Luria-Bertani (LB),
ampisilin, IPTG (Isopropyl-β-D-Thiogalaktopiranosidase) 0,3 M, dapar B (Tris
HCl 10 mM pH 8,5, NaCl 100 mM, dan Tween 20 0,25%), resin TALON,
18
UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
dapar elusi (imidazola 400 mM dalam bufer B), Tris-HCl 1,5 M pH 8,8,
akrilamid 30%, sodium dedosil sulfat (SDS) 10%, TEMED, amonium persulfat
(APS) 10%, comassie blue, loading dye, adenosin trifosfat (ATP) 0,1 mM, 4-
asam morfolinopropana sulfonat (MOPS) 0.1 mM, MgCl2 1 mM, larutan
malachite green, polivinil alkohol 2,3%, amonium molibdat, natrium sitrat, dan
metanol absolut.
3.3 Prosedur Penelitian
3.3.1 Pengambilan Sampel
Buah manggis (Garcinia mangostana L.) diperoleh dari Kecamatan
Wanayasa, Kabupaten Purwakarta, Provinsi Jawa Barat. Adapun bagian yang
digunakan dalam penelitian ini adalah kulit buah (pericarp) manggis.
3.3.2 Determinasi Sampel
Determinasi buah manggis (Garcinia mangostana L.) dilakukan di
Herbarium Bogoriense Bidang Botani, Pusat Penelitian Biologi, LIPI Cibinong.
3.3.3 Pembuatan Simplisia
Buah manggis (Garcinia mangostana L.) sebanyak 5 kg disortir dan
dibersihkan dari kotoran yang melekat dengan air mengalir, lalu ditiriskan agar
terbebas dari sisa air cucian. Kemudian bagian kulit buahnya (pericarp),
dirajang tipis, dan diangin-anginkan di udara terbuka hingga kering. Simplisia
yang sudah kering kemudian digiling dan diayak untuk mendapatkan serbuk
halus, lalu simplisia disimpan pada wadah yang kering dan tertutup rapat.
3.3.4 Pembuatan Ekstrak Kulit Buah Manggis (Garcinia mangostana L.)
Sejumlah 490 gram serbuk simplisia kulit buah manggis (Garcinia
mangostana L.) dimaserasi dengan 5 x 800 mL n-heksan teknis yang telah
didestilasi, selama 3 hari. Hasil maserasi disaring dan filtrat yang diperoleh
19
UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
dipekatkan dengan rotary evaporator pada suhu lebih kurang 45°C, sehingga
diperoleh ekstrak kental n-heksan. Ampas n-heksan yang diperoleh diuapkan di
udara terbuka hingga kering, kemudian dilakukan kembali maserasi berturut-
turut dengan pelarut etil asetat dan metanol. Kemudian filtrat diuapkan dengan
rotary evaporator hingga diperoleh ekstrak kental n-heksan, etil asetat, dan
metanol yang kemudian ditimbang dan dihitung rendemennya terhadap berat
simplisia awal (Materia Medika, 1989).
Rendemen = ( ) ( ) x 100%
3.3.5 Penapisan Fitokimia
1. Identifikasi Alkaloid
Ekstrak ditambahkan dengan 5 mL ammonia 30%, digerus dalam mortir,
lalu tambahkan 20 mL kloroform dan digerus kembali dengan kuat, campuran
tersebut disaring dengan kertas saring, filtrat berupa larutan organik di ambil
(sebagai larutan A), sebagian dari larutan A (10 mL) diekstraksi dengan 10 mL
larutan HCl 1:10 dengan pengocokan dalam tabung reaksi, ambil larutan bagian
atasnya (larutan B). Larutan A diteteskan beberapa tetes pada kertas saring dan
disemprot atau ditetesi dengan pereaksi Draggendorff, terbentuk warna merah
ataupun jingga pada kertas saring menunjukan adanya senyawa alkaloid.
Larutan B dibagi dalam 2 tabung reaksi, ditambahkan masing-masing pereaksi
Dragendrorff dan Mayer, terbentuk endapan merah bata dengan pereaksi
Dragendrorff dan endapan putih dengan pereaksi Mayer menunjukan adanya
senyawa golongan alkaloid (Farnsworth, 1966).
2. Identifikasi Flavonoid
Ekstrak ditambahkan 100 mL air panas, kemudian dididihkan selama 5
menit dan disaring dengan kertas saring. Sebanyak 5 mL filtrat yang didapat
ditambahkan serbuk atau lempeng magnesium dan 1 mL HCl pekat serta 5 mL
amil alkohol, kemudian dikocok dengan kuat, dibiarkan hingga memisah.
20
UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
Terbentuknya warna dalam larutan amil alkohol menunjukkan adanya senyawa
flavonoid (Farnsworth, 1966).
3. Identifikasi Saponin
Ekstrak ditambahkan 10 mL akuades dalam tabung reaksi. Kemudian
diguncang selama 1 - 2 menit. Adanya saponin diindikasikan oleh terbentuknya
buih setinggi 1 cm yang stabil selama 30 menit (El Kamali et al, 2010).
4. Identifikasi Tanin
Ekstrak dilarutkan dalam 20 mL akuades. Filtrat sebanyak 2 mL
ditambahkan 3 tetes FeCl3 10%. Terbentuknya warna biru kehitaman atau hijau
kehitaman mengindikasikan adanya tanin. Cara yang lain adalah 2 mL filtrat
ditambahkan 1 mL larutan brom, apabila terdapat endapan maka positif
mengandung tanin (Adegboye et al, 2008).
5. Identifikasi Steroid
Ekstrak dilarutkan dalam 3 mL CHCl3 kemudian disaring. H2SO4
ditambahkan ke dalam filtrat. Terbentuknya cincin coklat kemerahan
menandakan positif adanya steroid (Magadula and Tewtrakul, 2010).
6. Identifikasi Kumarin
Ekstrak dilarutkan dalam air panas. Setelah dingin, larutan dibagi ke
dalam dua tabung reaksi yaitu tabung 1 sebagai blanko dan tabung 2 ditambah
0,5 mL NH3 10%. Adanya pijaran yang kuat dibawah sinar UV menunjukkan
adanya kumarin dan turunannya (Indrayani et al, 2006).
3.3.6 Penetapan Parameter Spesifik dan Non Spesifik Ekstrak Kulit Buah
Garcinia mangostana L.
1. Pemeriksaan organoleptik
Pemeriksaan organoleptik dilakukan menggunakan pancaindra untuk
mendeskripsikan bentuk, warna, dan bau dari ekstrak kulit buah manggis.
21
UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
2. Susut Pengeringan
Ekstrak kulit buah manggis ditimbang dengan seksama sebanyak 1 gram
dan dimasukkan ke dalam botol timbang dangkal bertutup yang sebelumnya
telah dipanaskan pada suhu 105°C selama 30 menit dan telah ditara. Ekstrak
diratakan dalam botol timbang dengan menggoyang-goyangkan botol,
hingga merupakan lapisan setebal lebih kurang 5 mm sampai 10 mm,
kemudian dimasukkan ke dalam oven, dibuka tutupnya. Pengeringan
dilakukan pada suhu penetapan 105°C hingga diperoleh bobot tetap lalu
ditimbang. Sebelum setiap pengeringan, botol dibiarkan dalam keadaan
tertutup mendingin dalam eksikator hingga suhu kamar (Depkes RI, 2000).
3. Kadar Abu
Ekstrak ditimbang seksama sebanyak 2 gram, dimasukkan ke dalam
krus silikat yang telah dipijarkan dan ditara, lalu ekstrak diratakan.
Dipijarkan perlahan-lahan hingga arang habis, dinginkan, lalu ditimbang.
Jika arang tidak dapat hilang, ditambahkan air panas, disaring dengan
menggunakan kertas saring bebas abu. Dipijarkan sisa abu dan kertas saring
dalam krus yang sama. Filtrat dimasukkan ke dalam krus, diuapkan,
dipijarkan hingga bobot tetap lalu ditimbang. Ditimbang kadar abu terhadap
bahan yang telah dikeringkan di udara (Depkes RI, 2000).
3.3.7 Produksi RNA helikase virus hepatitis C (HCV) (Utama et al, 2000)
Media LB (Luria –Bertani) dibuat dengan volume 10 mL dan 400 mL
(lampiran 9a). Perkultur dibuat dalam media LB sebanyak 10 mL. Media LB
diberi ampisilin (100 µg/mL) sebanyak 10 µL dan dihomogenkan. Lalu
diinokulasikan bakteri E. coli BL21 (DE3) pLysS-RNA helikase rekombinan,
kemudian diinkubasi dalam shaker incubator pada temperatur 37 °C dengan
kecepatan 200 rpm selama semalam.
Hasil prekultur diinokulasikan ke dalam 400 mL medium LB yang telah
diberi ampisilin (100 µg/mL) sebanyak 410 µl, kemudian diinkubasi dalam
22
UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
shaker incubator pada temperatur 37 °C dengan kecepatan 150 rpm, selama 30
menit atau hingga OD600 (optical density) mencapai ± 0,3. Selanjutnya
ditambahkan 0,3 M IPTG (Isopropyl-β-D-Thiogalaktopiranosidase), kemudian
diinkubasi dalam shaker incubator pada temperatur 37°C dengan kecepatan 150
rpm selama 3 jam atau hingga OD600 mencapai ± 1.
Hasil kultur disentrifugasi pada temperatur 4°C dengan kecepatan 4.000
rpm selama 10 menit. Pelet diresuspensi dengan sisa medium LB cair,
kemudian disentrifugasi kembali. Pelet yang terbentuk disimpan dalam
temperatur -20°C.
Pelet hasil sentrifugasi selanjutnya dikeringbekukan (freeze-thawing)
sebanyak tiga kali. Pelet diresuspensi dengan dapar B kemudian disonikasi
sebanyak 3 kali pengulangan dengan amplitudo 40; siklus 0,5; selama 15 detik,
dengan interval waktu 1 menit. Suspensi sel disentrifugasi pada temperatur 4°C
dengan kecepatan 10.000 rpm selama 20 menit.
Supernatan yang diperoleh kemudian dipurifikasi dengan kromatografi
afinitas. Supernatan ditambahkan dengan 300 µL resin TALON (resin
ekuilibrasi), kemudian diinkubasi pada rotator cold room (4°C) selama 3 jam,
kemudian disentrifugasi pada suhu 4°C dengan kecepatan 3500 rpm selama 7
menit. Supernatan yang terbentuk diambil sebagai inner volume (IV) disimpan
pada temperatur 4°C untuk SDS-PAGE. Pelet diresuspensi dengan 10 mL
larutan dapar B dan disentrifugasi pada temperatur 4°C dengan kecepatan 3500
rpm selama 5 menit. Supernatan diambil sebagai washing 1. Pelet yang
terbentuk kemudian diresuspensi kembali dengan 10 mL larutan dapar B dan
disentrifugasi pada temperatur 4°C dengan kecepatan 3500 rpm selama 5 menit.
Supernatan diambil sebagai washing 2. Hasil washing 1 (W1) dan washing 2
(W2) kemudian disimpan pada temperatur 4°C dan digunakan pada SDS-
PAGE.
Pelet kemudian dielusi untuk melepaskan enzim yang terikat pada resin
dengan menambahkan 150 µL larutan dapar elusi dan diinkubasi pada rotator
23
UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
cold room (4°C) selama satu malam. Kemudian disentrifugasi pada temperatur
4 °C dengan kecepatan 3.000 rpm selama 1 menit. Supernatan yang diperoleh
diambil sebagai elusi 1 (E1) sedangkan pelet ditambahkan 75 µL larutan dapar
elusi kembali, kemudian diinkubasi pada rotator cold room (4°C) selama 1 jam.
Kemudian disentrifugasi kembali pada temperatur 4 °C dengan kecepatan 3.000
rpm selama 1 menit. Supernatan yang diperoleh diambil sebagai elusi 2 (E2).
3.3.8 Konfirmasi kemurnian enzim RNA helikase HCV dengan SDS – PAGE
Plat kaca yang digunakan terdiri dari short plate & spacer plate
dibersihkan dengan alkohol 70%. Short plate ditempatkan di depan kaca spacer
plate dan diberi casting frame pada bagian tengah dengan dikunci dengan
menggunakan casting stand. Selanjutnya dibuat larutan gel separating
(lampiran 8a). Larutan tersebut dimasukan di antara celah short plate & spacer
plate sampai dua pertiga bagian, kemudian sepertiganya diisi dengan akuades.
Kemudian ditunggu hingga terbentuk gel selama ± 20 menit. Selanjutnya
larutan gel stacking dibuat sesuai prosedur (lampiran 8b). Akuades pada gel
separating dibuang dan diisikan dengan larutan stacking, kemudian dipasang
comb, ditunggu hingga terbentuk gel selama ± 20 menit.
Gel dipindahkan dari casting frame dengan cara menekan cams pada
casting frame. Gel cassette sandwich ditempatkan pada electrode assembly
dengan posisi short plate menghadap dalam, lalu ditempatkan ke dalam
clamping frame, kemudian ditutup kedua camp levers pada clamping frame.
Lower inner chamber dimasukan ke dalam tank elektroforesis lalu diisi dengan
working solution (Dapar Elektroforesis SDS 1X pH 8.3).
Masing-masing sampel yang diperoleh pada produksi RNA helikase
HCV (inner volum, whasing, dan elusi enzim) diambil 4 µl lalu dicampur
dengan 2 µl loading dye (lampiran 8c). Campuran didenaturasi di water bath
pada suhu 95˚ C selama 15 menit. Marker protein (BIORAD®) sebanyak 4
µl/gel dimasukan ke dalam well. Masing-masing sampel yang sudah dicampur
24
UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
dengan loading dye, dimasukan ke dalam well sebanyak 5 µl/well. Gel
dielektroforesis pada 40 mA selama 90 menit. Gel diangkat lalu direndam
dalam Commasie Blue G-250 Staining Solution (lampiran 8d) selama 1 jam
sambil digoyang-goyang di atas rocker. Gel dibilas dengan Commasie Blue G-
250 Destaining Solution (lampiran 8e) ± 20 menit, dilakukan dua kali. Gel
dibilas dengan H2O sampai bau asamnya hilang dan disimpan pada suhu 4°C.
3.3.9 Uji Aktivitas Enzim RNA Helikase Virus Hepatitis C (Utama et al, 2000)
Uji aktivitas enzim RNA helikase dilakukan dengan metoda ATPase
kolorimetri. Sebanyak 50 µL campuran reaksi yang mengandung 5 µL dapar
MOPS 10 mM (pH 6,6), 1 µL ATP 0,1 M, 0,5 µL MgCl 1 mM, 38,5 µL H2O,
dan 5 µL RNA helikase HCV, dimasukkan ke dalam microtiter plate 96-well.
Campuran reaksi tersebut diinkubasi pada suhu ruang selama 45 menit. Sekitar
10 menit sebelum masa inkubasi selesai dibuat larutan pewarna yang terdiri dari
0,081% malachite green, H2O, 5,7% amonium molibdat dalam 6 M HCl, dan
2,3% polivinil alkohol dengan perbandingan 2:2:1:1 (lampiran 9d). Setelah
masa inkubasi selesai larutan pewarna dimasukkan ke dalam microtiter plate
96-well sebanyak 100 µL setiap sumur, kemudian di inkubasi selama 5 menit.
Setelah masa inkubasi selesai, pewarnaan dihentikan dengan menambahkan 25
µL Na sitrat. Hasil reaksi diukur pada panjang gelombang 620 nm dengan
referensi 405 nm.
3.3.10 Uji Aktivitas Inhibisi Ekstrak Kulit Buah Manggis terhadap RNA
helikase HCV (Utama et al, 2000)
Uji aktivitas inhibisi ekstrak kulit buah manggis terhadap RNA
helikase dilakukan dengan menggunakan ATPase kolorimetri. Sebelum
dilakukan pengukuran absorbansi, terlebih dahulu ekstrak kulit buah manggis
pada fase n-heksan, etil asetat, dan metanol masing-masing dilarutkan
menggunakan metanol absolut dengan beberapa konsentrasi yaitu 100.000
25
UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
ppm, 50.000 ppm, 12.500 ppm, 6.250 ppm, 3.125 ppm, 1.562 ppm, 781 ppm,
391 ppm.
Pada pengukuran absorbansi enzim RNA helikase ini dilakukan
dengan menambahkan 5 µL ekstrak kulit buah manggis dengan berbagai
konsentrasi pada setiap sumur dalam campuran reaksi. Volum akhir reaksi
adalah 50 µL yang terdiri dari 45 µL campuran reaksi (5 µL dapar MOPS 10
mM (pH 6,6), 1 µL ATP 0,1 M, 0,5 µL MgCl 1 mM, 38,5 µL H2O, dan 5 µL
RNA helikase HCV). Reaksi kemudian dimasukkan ke dalam microtiter plate
96-well. Kemudian diinkubasi pada suhu ruang selama 45 menit. Sekitar 10
menit sebelum masa inkubasi selesai dibuat larutan pewarna yang terdiri dari
0,081% malachite green, H2O, 5,7% amonium molibdat dalam 6 M HCl, dan
2,3% polivinil alkohol dengan perbandingan 2:2:1:1. Setelah masa inkubasi
selesai larutan pewarna dimasukkan ke dalam microtiter plate 96-well
sebanyak 100 µL setiap sumur, kemudian di inkubasi selama 5 menit. Setelah
masa inkubasi selesai, pewarnaan dihentikan dengan menambahkan 25 µL Na
sitrat. Hasil reaksi diukur pada panjang gelombang 620 nm dan 405 nm.
Nilai absorbansi yang diperoleh digunakan untuk menghitung
presentasi inhibisi ekstrak kulit buah manggis terhadap RNA helikase HCV.
Perhitungan persen penghambatan sampel ekstrak kulit buah manggis
terhadap RNA helikase dilakukan berdasarkan perhitungan :
% inhibisi = – x 100 %
Dimana :
A = serapan enzim RNA helikase tanpa adanya senyawa inhibitor
I = serapan enzim RNA helikase dengan adanya senyawa inhibitor.
26 UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
BAB 4
HASIL DAN PEMBAHASAN
4.1 Determinasi Sampel
Determinasi buah manggis dilakukan di Herbarium Bogoriense Bidang
Botani, Pusat Penelitian Biologi, LIPI Cibinong. Hasil determinasi menyatakan
bahwa sampel buah manggis yang diperoleh dari Kecamatan Wanayasa,
Kabupaten Purwakarta, Provinsi Jawa Barat, merupakan spesies Garcinia
mangostana, famili Clusiaceae, keterangan hasil determinasi dapat dilihat pada
lampiran 1.
4.2 Rendemen Ekstrak
Ekstraksi yang digunakan adalah dengan cara maserasi. Ekstraksi dengan
cara maserasi digunakan untuk senyawa-senyawa yang tidak tahan pemanasan.
Keuntungan dari teknik ini adalah peralatan yang digunakan sederhana,
sedangkan kerugiannya adalah pengerjaanya lama, pelarut yang digunakan
banyak, serta proses penyarian yang kurang sempurna.
Maserasi terhadap kulit buah manggis dilakukan dengan cara bertingkat
dari pelarut non polar hingga polar, yaitu n-heksan, etil asetat, dan metanol. Hal
ini bertujuan untuk menarik senyawa-senyawa yang bersifat non polar hingga
polar yang terdapat pada kulit buah manggis.
Sejumlah 490 gram serbuk simplisia kulit buat manggis diekstraksi
menggunakan pelarut n-heksan teknis sebanyak 5 x 800 mL, masing -masing
selama 3 hari. Hasil maserasi disaring dan filtrat yang diperoleh dipekatkan
dengan rotary evaporator pada suhu lebih kurang 45°C, sehingga diperoleh
ekstrak kental n-heksan. Terhadap ampas n-heksan kemudian dilakukan kembali
maserasi berturut-turut dengan pelarut etil asetat dan metanol. Kemudian filtrat
diuapkan dengan rotary evaporator hingga diperoleh ekstrak kental n-heksan,
etil asetat, dan metanol (Materia Medika, 1989).
27
UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
Tabel 4.1 Hasil rendemen ekstrak kulit buah manggis
Ekstrak Bobot ekstrak kering Rendemen
n-heksan 5,20 gram 1,06 %
Etil asetat 47,40 gram 9,67 %
Metanol 42,18 gram 8,61 %
Rendemen yang diperoleh dari proses ekstraksi terlihat pada tabel 4.1.
Hasil perhitungan rendemen menunjukkan bahwa pelarut etil asetat memiliki
nilai persentase rendemen tertinggi dibanding pelarut n-heksan dan metanol,
dimana pelarut n-heksan memiliki nilai rendemen yang paling rendah. Berat
ekstrak kering yang diperoleh menunjukkan bahwa pelarut yang digunakan
mampu melarutkan bahan alami terseleksi dari padatannya.
Dari hasil penelitian ini memperlihatkan bahwa pelarut etil asetat lebih
banyak melarutkan senyawa atau zat yang mempunyai potensi bioaktif. Prinsip
pelarutan yang dipakai pada metode ini adalah like dissolve like, dimana
prinsipnya adalah pelarut polar akan melarutkan senyawa polar dan pelarut non
polar akan melarutkan senyawa non polar sesuai dengan pernyataan Melki
(2003). Sehingga dapat dikatakan bahwa kulit buah manggis memiliki senyawa
semi polar dan senyawa polar yang lebih banyak dibandingkan senyawa non
polar.
Pelarut yang digunakan bersifat volatil, sehingga pada saat filtrasi
(penyaringan) diduga terdapat bagian pelarut yang menguap yang menyebabkan
perbedaan jumlah rendemen yang dihasilkan. Faktor-faktor lain yang
berpengaruh terhadap proses ekstraksi adalah lama ekstraksi, suhu, dan jenis
pelarut yang digunakan (Ismet, 2007).
28
UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
4.3 Penapisan Fitokimia
Penapisan fitokimia yang dilakukan terhadap ekstrak kulit buah Garcinia
mangostana bertujuan untuk mengetahui kandungan metabolit sekunder yang
terdapat dalam ekstrak pada masing-masing pelarut. Menurut Pasaribu et al,
2012, dilaporkan bahwa ekstrak etanol kulit buah manggis mengandung alkaloid,
flavonoid, saponin, tanin, dan steroid/triterpenoid.
Hasil identifikasi yang telah dilakukan memperlihatkan perbedaaan pada
setiap pelarut yang digunakan. Hal ini diduga dikarenakan pelarut yang
digunakan berbeda tingkat kepolarannya, sehingga berbeda pula senyawa yang
terekstrak. Sesuai pernyataan Ismet (2007) yang menyatakan bahwa salah satu
faktor yang mempengaruhi ekstraksi adalah jenis pelarut yang digunakan. Hasil
penapisan fitokimia pada masing-masing ekstrak dapat dilihat pada tabel 4.2.
Tabel 4.2 Hasil Penapisan Fitokimia Ekstrak Kulit Buah Manggis
Ekstrak n-heksan Etil asetat Metanol
Alkaloid + + +
Flavonoid + + +
Steroid + + -
Tanin - - +
Saponin - - +
Kumarin - + +
Identifikasi senyawa alkaloid memberikan hasil positif pada ketiga
ekstrak. Hasil ini ditunjukkan dengan adanya endapan merah bata pada masing-
masing ekstrak dengan penambahan pereaksi Dragendorff, dan juga
menghasilkan endapan putih ketika bereaksi dengan Mayer. Alkaloid merupakan
golongan zat tumbuhan sekunder terbesar. Alkaloid mencakup senyawa yang
bersifat basa yang mengandung satu atau lebih atom nitrogen. Alkaloid sering
beracun bagi manusia dan banyak memiliki aktivitas fisiologi sehingga secara
29
UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
luas digunakan dalam bidang pengobatan sebagai anti mikroba, anti diare, dan
antelmintik (obat cacing) (Harborne, 1987, Tiwari, 2011).
Pada identifikasi senyawa flavonoid diperoleh hasil yang positif pada
ketiga ekstrak. Uji flavonoid positif ditandai dengan terbentuknya warna pada
lapisan amil alkohol. Pada ekstrak n-heksan dan etil asetat terbentuk warna
kekuningan, sedangkan pada ekstrak metanol terbentuk warna jingga pada
lapisan amil alkohol. Flavonoid merupakan golongan terbesar dari senyawa fenol
(Harborne, 1987). Flavonoid memiliki aktivitas anti mikroba dan anti diare,
golongan senyawa ini dapat larut dalam etanol, metanol, dan aseton (Tiwari,
2011).
Steroid merupakan tripterpen yang kerangka dasarnya sistem cincin
siklopentana perhidropenantrena (Harborne, 1987). Secara farmakologi steroid
memiliki aktivitas sebagai anti diare (Tiwari, 2011). Hasil identifikasi steroid
terdapat pada ekstrak n-heksan dan etil asetat, ditandai dengan terbentuknya
cincin coklat kemerahan pada sampel dalam kloroform yang ditambahkan asam
sulfat. Sedangkan pada ekstrak metanol menunjukkan hasil yang negatif karena
tidak terbentuk cincin merah. Menurut Tiwari, 2011, senyawa golongan
steroid/triterpenoid dapat larut dalam air, etanol, metanol, kloroform, dan eter.
Namun hasil identifikasi menunjukkan ekstrak metanol tidak terdapat steroid, hal
ini dapat dikarenakan steroid/triterpenoid terkandung dalam jumlah yang sedikit,
sehingga hanya terekstrak oleh n-heksan dan etil asetat.
Tanin terdapat luas dalam tumbuhan berpembuluh, dalam angiospermae
terdapat khusus dalam jaringan kayu. Menurut batasannya, tanin dapat bereaksi
dengan proteina membentuk kopolimer yang tak larut dalam air (Harborne,
1987). Hasil identifikasi tanin menunjukkan hasil positif pada ekstrak metanol,
dengan terbentuknya warna biru kehitaman pada ekstrak yang diberi FeCl3.
Sedangkan pada n-heksan dan etil asetat menunjukkan hasil yang negatif. Hal ini
sesuai dengan pernyataan Tiwari, 2011 yang menyebutkan bahwa tanin
30
UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
merupakan golongan senyawa yang dapat larut dalam air dan metanol, sehingga
pada penelitian ini tanin hanya terdapat pada ekstrak metanol.
Saponin merupakan senyawa yang bersifat seperti sabun, serta dapat
dideteksi berdasarkan kemampuannya membentuk busa dan menghemolisis sel
darah (Harborne, 1987). Identifikasi senyawa saponin positif pada ekstrak
metanol. Ekstrak metanol yang ditambahkan akuades kemudian dikocok selama
1 menit, memperlihatkan hasil yang positif yang ditandai dengan terbentuknya
busa yang stabil. Tiwari, 2011 yang menyebutkan bahwa saponin merupakan
golongan senyawa yang dapat larut dalam air dan metanol, sehingga pada
penelitian ini tanin hanya terdapat pada ekstrak metanol. Saponin memiliki efek
farmakologi sebagai anti diare, anti kanker, dan antelmintik (obat cacing).
Kumarin merupakan senyawa fenol, yang memiliki aktivitas farmakologi
sebagai antivirus dengan berinteraksi dengan DNA eukariot (Tiwari, 2011).
Identifikasi kumarin menujukkan hasil positif pada ekstrak kulit buah manggis
pada fase etil asetat dan metanol. Sampel yang berpendar berwarna kebiruan
yang diamati pada sinar UV menunjukkan ekstrak etil asetat dan metanol
mengandung kumarin.
31
UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
4.4 Parameter Standar Ekstrak
Parameter standar yang diidentifikasi dari kulit buah manggis dapat
dilihat dari tabel 4.3.
Tabel 4.3 Parameter Standar Ekstrak
Jenis Karakteristik Ekstrak
n-heksan
Ekstrak
etil asetat
Ekstrak
metanol
Menurut literatur
Parameter Spesifik :
a.Organoleptik
- Bentuk
-Warna
Parameter Non
spesifik :
a.Susut pengeringan
b. Kadar abu
Ekstrak
kental
Kuning
0,5%
0,4%
Ekstrak
kental
Kuning
2,1%
0,7%
Ekstrak
kental
Coklat
9,3%
2,2%
max10% (DepkesRI,2000)
-
4.5 Produksi RNA Helikase Virus Hepatitis C
Produksi denganRNA helikase HCV dilakukan dengan tujuan untuk
mendapatkan enzim RNA helikase yang murni yang digunakan sebagai
komponen dalam penentuan aktivitas inhibisi terhadap aktivitas ATPase.
Ekspresi RNA helikase dilakukan dengan cara mengultur bakteri
Escherichia coli BL21 (DE3) pLysS-RNA helikase HCV. Tahapannya dimulai
dengan pre kultur yang dilakukan dalam medium cair Luria-Bertani (LB) yang
merupakan media yang sesuai dengan bakteri Escherichia coli, karena
mengandung zat kompleks (tripton, yeast extract, dan natrium klorida) untuk
pertumbuhan bakteri. Media LB terlebih dahulu diberikan ampisilin yang
berfungsi sebagai selection marker terhadap pertumbuhan E. coli BL21 (DE3)
pLysS-RNA helikase HCV rekombinan yang juga mengandung gen resisten
32
UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
ampisilin, sehingga hanya bakteri E. coli BL21 (DE3) pLysS-RNA helikase
HCV rekombinan yang membawa gen RNA helikase HCV saja yang dapat
tumbuh. Prekultur diinkubasi dalam inkubator goyang pada temperatur 37°C
dengan kecepatan 200 rpm selama semalam, kondisi ini merupakan kondisi
optimum untuk pertumbuhan bakteri (Pelzar & Chan,1986).
Tahap berikutnya merupakan pemindahan kultur pada medium LB yang
lebih besar, medium yang telah diberi ampisilin kemudian ditambahkan pre
kultur dan diinkubasi kembali pada temperatur 37°C dengan kecepatan 200 rpm
hingga nilai OD600 (optical density) mencapai 0,3 atau pada saat bakteri mencapai
fasa logaritmik, fase ini merupakan fasa awal dimana bakteri Escherichia coli
tumbuh. Pada fasa ini, kultur ditambahkan IPTG (Isopropyl-β-D-
Thiogalaktopiranosidase) sebagai penginduksi untuk menghasilkan ekspresi
berlebih pada kultur, sehingga dihasilkan jumlah enzim RNA helikase yang lebih
besar hingga fase awal stasioner dimana nilai OD600 mencapai 1 (Utama et al,
2000).
Bakteri E. coli dipanen dengan cara sentrifugasi pada temperatur 4°C
dengan kecepatan 4.000 rpm selama 10 menit untuk memisahkan sel E. coli
dengan media LB. Setelah disentrifugasi sel E. coli akan mengendap sebagai
pelet, sedangkan medium LB akan terpisah menjadi supernatan. Pelet yang
terbentuk kemudian disimpan dalam freezer dengan temperatur -20°C untuk
menjaga stabilitas RNA helikase HCV yang terekspresi secara intraseluler dalam
pelet.
RNA helikase yang terkandung dalam pelet harus dipurifikasi terlebih
dahulu sebelum menjadi target analisis. Untuk memurnikannya sel pelet
dipecahkan dengan cara mekanik, yaitu dengan cara freeze-thaw dan sonikasi.
Freeze-thaw atau pengeringbekuan dilakukan menempatkan sel pada temperatur
-20°C dan suhu ruang secara bergantian, masing-masing selama 20 menit
sebanyak tiga kali pengulangan. Freeze-thaw menyebabkan terbentuknya kristal
es pada sel pelet sehingga akan melunakkan dinding sel bakteri yang
33
UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
mempermudah dalam pelisisan sel. Tahap selanjutnya merupakan sonikasi yang
dilakukan menggunakan sonikator. Proses sonikasi akan merusak organel sel
namun tidak merusak integritas (kemampuan) fungsionalnya. Pada tahap
sonikasi, enzim RNA helikase HCV disuspensikan terlebih dahulu dengan dapar
B (10 mM Tris HCl pH 8,5, 100 mM NaCl dan 0,25% Tween 20). Tris HCl
berfungsi sebagai dapar untuk mempertahankan pH enzim RNA helikase
sehingga stabilitasnya terjaga, natrium klorida berperan untuk menghilangkan
kontaminan dan asam nukleat yang berikatan tidak spesifik dengan RNA
helikase (Vanz et al, 2008). Sedangkan tween 20 merupakan detergen non-ionik
yang dapat menghancurkan lipid bipolar pada membran sel. Rusaknya lipid
bipolar akan menyebabkan disosiasi membran sel dengan bagian hidrofobik dari
RNA helikase yang sebelumnya menempel pada lipid bipolar tersebut (Sigma
aldrich, 2008).
Enzim selanjutnya dimurnikan dengan kromatografi afinitas (metal
affinity). Metode ini didasarkan pada pengikatan spesifik logam Co2+ yang
dimiliki resin TALON dengan label 6xHis-tag yang terdapat pada ujung RNA
helikase. RNA helikase yang telah diikat oleh resin TALON dipisahkan dengan
metabolit intraseluler lainnya melalui sentrifugasi pada temperatur 4°C kecepatan
3500 rpm selama 7 menit. Sentrifugasi ini menghasilkan pelet yang mengandung
RNA helikase dan supernatan yang mengandung metabolit intraselular. Pelet
ditambahkan dapar elusi (imidazol dalam dapar B) ditambahkan untuk
menghilangkan protein selain enzim RNA helikase. Imidazol yang terdapat
dalam dapar elusi ini memutuskan ikatan antara RNA helikase dengan resin
TALON. Imidazol berperan sebagai analog residu His yang terdapat pada enzim
yang telah diikat oleh logam Co2+. Sentrifugasi pada temperatur 4°C kecepatan
3500 rpm selama 7 menit digunakan untuk memisahkan imidazol dengan enzim
yang telah murni. Penggunaan kecepatan tersebut untuk menghindari kerusakan
enzim dan mencegah penurunan aktivitasnya (Sambrook & Russel, 2001).
34
UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
Kemurnian enzim RNA helikase HCV dapat dikonfirmasi dengan
menggunakan SDS-PAGE, berdasarkan protein target yang dituju. Elektroforesis
dilakukan menggunakan gel akrilamid dengan konsentrasi 8%. Hasil SDS-PAGE
pada gambar 4.1 menunjukkan pita protein tunggal dengan bobot 54 kDa.
sehingga dapat dikatakan bahwa RNA helikase telah berhasil dipurifikasi dan
sesuai dengan hasil seperti yang dilaporkan Utama et al, 2000 yang menyatakan
bahwa bobot molekul RNA helikase adalah sebesar 54 kDa. Pada lajur pertama
berupa marker BIORAD® yang digunakan. Inner volum (IV) merupakan
supernatan hasil sentrifugasi pada proses pemecahan sel yang belum dimurnikan
dengan resin TALON sehingga banyak mengandung metabolit interseluler yang
menyebabkan penumpukan pita protein. Washing 1 dan washing 2 merupakan
hasil pencucian binding resin TALON tidak terdapat pita protein, karena
supernatan hanya terdapat dapar B.
Gambar 4.1. SDS – PAGE RNA helikase HCV
Keterangan : M = Marker, E1 = Elusi 1, E2 = Elusi 2, IV = Inner Volum, W1 = washing 1, W2 = washing 2
54 kDa
M E1 E2 IV W1 W2
50 kDa
75 kDa
100 kDa
150 kDa
250 kDa
35
UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
4.6 Aktivitas Inhibisi Ekstrak Kulit Buah Manggis Terhadap RNA Helikase
Virus Hepatitis C
Aktivitas ekstrak kulit buah Garcinia mangostana terhadap RNA helikase
virus hepatitis C dilakukan dengan metoda Kolorimetri ATPase. Ekstrak pada
masing-masing pelarut hasil maserasi yaitu n-heksan, etil asetat, dan metanol,
dibuat seri pengenceran menggunakan metanol absolut dengan konsentrasi
100.000 ppm, 50.000 ppm, 25.000 ppm, 12.500 ppm, 6.250 ppm, 3.125 ppm,
1.562 ppm, 761 ppm, 391 ppm, kemudian diuji dengan metoda ATPase.
Uji kolorimetri ATPase digunakan untuk menguji enzim yang
aktivitasnya bergantung pada adanya ATP sebagai sumber energi, yang
melibatkan pengukuran serapan senyawa organik yang dilepaskan ATP oleh
enzim RNA helikase. Prinsip ujinya adalah pengukuran fosfat bebas yang
terbentuk dari hasil reaksi antara RNA helikase dengan ATP yang menghasilkan
ADP dan Pi (fosfat anorganik).
Pengujian ekstrak kulit buah manggis yang telah diencerkan
menggunakan larutan master mix yang terdiri dari air suling, MOPS, MgCl2, dan
ATP. Air suling berfungsi sebagai pelarut, MOPS (asam 4-morfolinopropana
sulfonat) berperan sebagai dapar dalam larutan master mix. MgCl2 yang
digunakan berfungsi sebagai kofaktor RNA helikase, dan ATP merupakan
substrat atau donor energi yang berperan dalam pengujian ATPase kolorimetri
(Utama et al, 2000).
Larutan pewarna diberikan untuk memvisualisasi reaksi pada pengujian.
Larutan perwarna malachite green yang terdiri dari ammonium molibdat akan
berikatan dengan fosfat anorganik yang terhidrolisis menghasilkan kompleks
fosfomolibdat dan malachite green. Warna yang terbentuk sebanding dengan
konsentrasi fosfat anorganik yang dihasilkan dari reaksi RNA helikase dan ATP.
Semakin banyak fosfat anorganik yang bereaksi dengan larutan pewarna semakin
keruh warna yang dihasilkan (Chan et al, 1986).
36
UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
Pengukuran absorbansi dilakukan menggunakan microplate reader
Multiscan EX. Absorbansi diukur pada dua panjang gelombang, yaitu panjang
gelombang 620 nm dan 405 nm. Panjang gelombang 620 optimum untuk
penyerapan warna kebiruan, sedangkan panjang gelombang 405 nm optimum
untuk penyerapan warna kekuningan. Warna kebiruan merupakan kompleks yang
dihasilkan larutan pewarna dan fosfat organik yang terbentuk dari hidrolisis ATP,
sedangkan warna kekuningan terbentuk dari larutan pewarna yang tidak
berikatan dengan fosfat anorganik. Kedua panjang gelombang ini digunakan agar
perhitungan reaksi antara RNA helikase dengan ATP lebih akurat. Perhitungan
konsentrasi fosfat anorganik yang terinhibisi oleh sampel menggunakan
perbandingan kedua panjang gelombang tersebut (Chan et al, 1986). Reaksi
enzimatis yang terbentuk dihentikan dengan penambahan Na sitrat. Penambahan
Na sitrat bertujuan untuk mencegah terbentuknya reaksi enzimatis yang
berlebihan.
Tabel 4. 4. Aktivitas inhibisi ekstrak kulit buah manggis terhadap RNA helikase HCV
Konsentrasi
(ppm)
% inhibisi
Ekstrak n-
heksan
% inhibisi
Ekstrak etil
asetat
% inhibisi
Ekstrak
metanol
3.125 41.79 39.07 71.57
1.562 33.98 27.26 68.70
781 20.73 20.78 58.75
391 10.45 15.58 22.17
Gambar 4.2. Aktivitas inhibisi ekstterhadap
Uji aktivitas inhibisi ekstrak kulit buah manggis dalam pelarut metanol
absolut digunakan beberapa konsentrasi. Konsentrasi yang diuji dimulai dari
konsentrasi 100.000 ppm
3.125 ppm, 1.562 ppm, 761 ppm, hing
pada konsentrasi 100.000 ppm hingga 6.250 ppm tidak menghasilkan nilai
absorbansi, dikarenakan terlalu larutan uji terlalu pekat. Sehingga konsentrasi
yang digunakan adalah pada 3.125 ppm hingga 391 ppm.
Hasil uji aktivitas inhi
tabel 4.4. Pada tabel dapat dilihat bahwa ekstrak kulit buah manggis (
mangostana L.) mampu menghambat RNA helikase virus hepatitis C secara
vitro menggunakan uji kolometri ATPase. Ku
inhibisi yang berbeda pada ketiga ekstrak
heksan memiliki persentasi inhibisi sebesar 41,79%, sedangkan etil asetat dan
metanol memiliki persentasi inhibisi sebesar 39,07% dan 71,57
Aktivitas enzim RNA helikase dapat dilihat pada lampiran 17. Dalam
grafik tersebut terlihat aktivitas enzim yang tidak ditambahkan inhibitor adalah
pada uji aktivitas ekstrak
0
10
20
30
40
50
60
70
80
3.125 ppm
UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
ktivitas inhibisi ekstrak kulit buah manggis terhadap RNA helikase HCV
Uji aktivitas inhibisi ekstrak kulit buah manggis dalam pelarut metanol
absolut digunakan beberapa konsentrasi. Konsentrasi yang diuji dimulai dari
100.000 ppm, 50.000 ppm, 25.000 ppm, 12.500 ppm, 6.250 ppm,
3.125 ppm, 1.562 ppm, 761 ppm, hingga 391 ppm. Hasil yang terlihat bahwa
pada konsentrasi 100.000 ppm hingga 6.250 ppm tidak menghasilkan nilai
absorbansi, dikarenakan terlalu larutan uji terlalu pekat. Sehingga konsentrasi
yang digunakan adalah pada 3.125 ppm hingga 391 ppm.
ivitas inhibisi ekstrak kulit buah manggis dapat dilihat pada
tabel 4.4. Pada tabel dapat dilihat bahwa ekstrak kulit buah manggis (Garcinia
L.) mampu menghambat RNA helikase virus hepatitis C secara
menggunakan uji kolometri ATPase. Kulit buah manggis memiliki aktivitas
inhibisi yang berbeda pada ketiga ekstrak. Pada konsentrasi 3.125 ppm ekstrak
heksan memiliki persentasi inhibisi sebesar 41,79%, sedangkan etil asetat dan
metanol memiliki persentasi inhibisi sebesar 39,07% dan 71,57%.
Aktivitas enzim RNA helikase dapat dilihat pada lampiran 17. Dalam
grafik tersebut terlihat aktivitas enzim yang tidak ditambahkan inhibitor adalah
pada uji aktivitas ekstrak n-heksan adalah 565,9 pmol fosfat/mL/menit/pmol
1.562 ppm 781 ppm 391 ppm
n-heksan
etil asetat
metanol
37
UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
Uji aktivitas inhibisi ekstrak kulit buah manggis dalam pelarut metanol
absolut digunakan beberapa konsentrasi. Konsentrasi yang diuji dimulai dari
, 50.000 ppm, 25.000 ppm, 12.500 ppm, 6.250 ppm,
ga 391 ppm. Hasil yang terlihat bahwa
pada konsentrasi 100.000 ppm hingga 6.250 ppm tidak menghasilkan nilai
absorbansi, dikarenakan terlalu larutan uji terlalu pekat. Sehingga konsentrasi
bisi ekstrak kulit buah manggis dapat dilihat pada
Garcinia
L.) mampu menghambat RNA helikase virus hepatitis C secara in
lit buah manggis memiliki aktivitas
Pada konsentrasi 3.125 ppm ekstrak n-
heksan memiliki persentasi inhibisi sebesar 41,79%, sedangkan etil asetat dan
Aktivitas enzim RNA helikase dapat dilihat pada lampiran 17. Dalam
grafik tersebut terlihat aktivitas enzim yang tidak ditambahkan inhibitor adalah
pmol fosfat/mL/menit/pmol
38
UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
protein sedangkan setelah ditambahkan ekstrak n-heksan 3.125 ppm aktivitas
enzim menjadi 305,9 pmol fosfat/mL/menit/pmol protein. Sedangkan pada uji
aktivitas ekstrak etil asetat dan metanol, aktivitas enzimnya adalah 575,3 pmol
fosfat/mL/menit/pmol protein, dan setelah ditambahkan ekstrak etil asetat dan
metanol aktivitas enzim berkurang menjadi 325,7 dan 137,2 pmol
fosfat/mL/menit/pmol protein. Hal ini menunjukkan bahwa jika pada enzim
ditambahkan inhibitor, maka enzim akan mengalami penurunan aktivitas. Nilai
aktivitas enzim ini berbanding terbalik dengan nilai persentasi inhibisi, semakin
tinggi persen inhibisi oleh ekstrak yang digunakan, maka akan semakin rendah
aktivitas enzim, begitu pula sebaliknya, semakin rendah persen inhibisi oleh
ektrak yang digunakan, maka semakin tinggi aktivitas enzimnya. Hal ini
dikarenakan dengan semakin tinggi persen inhibisi, maka fosfat yang dihambat
semakin besar sehingga aktivitas enzim akan pengalami penurunan.
Kulit buah manggis dikenal kaya metabolit sekunder, seperti santon.
Santon merupakan senyawa yang memiiliki aktivitas antioksidan ditemukan
dalam kulit buah manggis (Chaverri et al, 2008, Yu et al, 2007). Santon
merupakan senyawa polar (Zarena et al, 2011), sehingga diduga terkandung
dalam ekstrak metanol. Dalam penelitian ini, santon diperkirakan memiliki
aktivitas sebagai antivirus yang berperan sebagai inhibitor RNA helikase virus
hepatitis C.
Penelitian Chen et al, 1996 meunjukkan bahwa ekstrak etanol dari
Garcinia mangostana L. memiliki potensi dalam menghambat HIV-1 protease.
Dalam penelitian ini dinyatakan bahwa hasil purifikasi ekstrak Garcinia
mangostana L. diperoleh dua senyawa aktif. Senyawa aktif tersebut dianalisis
dan diperoleh mangostin yang memiliki IC50 5,12 +/- 0,41 microM dan gamma-
magostin dengan IC50= 4,81 +/- 0,32 microM. Selain itu, penelitian lain juga
menyatakan ekstrak Garcinia mangostana L. berpotensi sebagai HIV-1 reverse
transkriptase, meskipun tidak signifikan (Chin et al, 2008). Selain antivirus,
Garcinia mangostana L. juga memiliki aktivitas sebagai penghambat kanker
39
UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
payudara, anti tumor , anti inflamasi seperti yang dijabarkan oleh Chaverri et al,
2008. Hasil penelitian sebelumnya memberikan gambaran Garcinia
mangostana memiliki potensi besar sebagai anti virus.
Dalam mekanismenya sebagai inhibitor RNA helikase, terdapat dua
kemungkinan yang terjadi : (1) inhibitor menempel pada RNA helikase tidak
pada sisi aktifnya, namun terjadi perubahan konformasi bentuk enzim yang
mengakibatkan berkurangnya interaksi enzim dengan substrat
(Borowski et al. 2008). (2) inhibitor berikatan pada sisi aktif enzim (RNA
binding-site) sehingga ATP tidak dapat berikatan dengan enzim yang
menyebabkan enzim tidak memiliki cukup energi untuk membuka untai ganda
RNA (Yamashita et al. 2012).
40 UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
BAB 5
KESIMPULAN DAN SARAN
5.1 Kesimpulan
1. Ekstrak kulit buah manggis (Garcinia mangostana L.) memiliki potensi
sebagai inhibitor RNA helikase virus hepatitis C.
2. Aktivitas penghambatan yang tertinggi pada konsentrasi 3.125 ppm terdapat
pada ekstrak metanol, yaitu sebesar 71,57%. n-heksan memiliki aktivitas
41,79%, sedangkan aktivitas terendah pada ekstrak etil asetat yaitu sebesar
39,07%.
5.2 Saran
1. Perlu dilakukan penelitian lebih lanjut mengenai pemurnian ekstrak kulit buah
manggis (Garcinia mangostana L.) sehingga dapat diketahui senyawa aktif yang
berkhasiat menghambat aktivitas virus hepatitis C.
2. Perlu dilakukan penelitian lebih lanjut dari ekstrak kulit buah manggis (Garcinia
mangostana L.) untuk mengetahui aktivitas penghambatan terhadap virus
hepatitis C secara in vivo.
41 UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
DAFTAR PUSTAKA
Adegboye, M. F., Akinpelu, D. A., Okoh, A. I. (2008). The Bioactive and Phytochemical properties of Garcinia kola (Heckel) Seed Extract on Some Pathogens. African Journal of Biotechnology Vol. 7 (21) : 3934-3938. Borowski P et al. (2008). Viral NS3 helicase activity is inhibited by peptides reproducing the Arg-rich concerved motif of the enzyme (motif VI). Biochemical Pharmacology 76: 28-38 Chaudri R.D. (2001). Herbal Drugs Industry. Easther Publisher G-59, Greater Kailash. New Delhi India: 373-387. Chaverri, J. P., Rodriguez, N. M., Ibarra, M. O., Rojas, J. M.,. (2008). Medicinal properties of mangosteen (Garcinia mangostana). Food Chem Toxicol 46 : 3227 – 3229. Chan, K. M., Delfert D., Junger K. D. (1986). A direct colorimetric assay for Ca2+ stimulated ATPase activity. Analytical Biochemistry157: 375-380. Chen, S.X., Wan, M., Loh B. M., (1996). Active constituents againts HIV-1 protease for Garcinia mangostana. Planta medica 62 : 381 – 382. Chin, Y. W., and Kinghorn, A. D. (2008). Structural Characterization, Biological Effect, and Synthetic Studies on Xanthones from Mangosteen (Garcinia mangostana) A Popular Botanical Dietary Suplement. Mini Rev Org Chem 5(4): 355–364 Departemen Kesehatan RI. (1989). Materia Medika Indonesia jilid I. Direktorat Jendral Pengawasan Obat dan Makanan : Jakarta Departemen Kesehatan RI. (2000). Parameter Standard Umum Ekstrak Tumbuhan Obat. Direktorat Jendral Pengawasan Obat dan Makanan : Jakarta. Deyl, Z. (1983). Electrophoresis : A survey of techniques and application. New York : Elsevier. El-Kamali, H. H., El-Amir, M. Y. (2010). Antibacterial and phytochemical Screening of Ethanolic Extracts Obtained from Selected Sudenese Medical Plants. Research Journal of Biological Sciences 2(2) : 143-146. Farnsworth, N. R. (1969). Biological and phytocemical screening of plants. Journal Pharmaceutical Science.
42
UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
Harborne, J.B. (1987). Metode fitokimia : penuntun cara modern menganalisis tumbuhan. Bandung : ITB Hempelmann, E., Schuulze, M., Gotze, O. (1984). Free SH-groups are important for the polychromatic staining of proteins with silver nitrat. Neuhof V (ed) Electrophoresis 84 Verlag Chemie Weinheim 1984 : 328-330. Heyne, K. (1987). Tumbuhan Berguna Indonesia. Jilid III. Jakarta : Yayasan Sarana Wana Jaya. Indrayani L., Soetjipto H., Sihasale L. (2006). Skrining Fitokimia dan Uji Toksisitas Ekstrak Daun Pecut Kuda (Stachytarpheta jamaicensis L. Vahl) terhadap Larva Udang Artemia salina Leach [skripsi]. Berk Penel Hayati : 12 (57-61) Ismet, M. S., Soedhama, D., Aktani, U. (2007). Penapisan Senyawa Bioaktif Spons Aaptos aaptos dan Petrosia sp. dari Lokasi yang Berbeda. Prosiding Konferensi Sains Kelautan dan Perikanan Indonesia I : IPB Dramaga Katzung, Bertram G. (2010). Farmakologi Dasar & Klinik ed 10. Jakarta : EGC Kawo, A.H. et al. (2012). Sero Prevalence Study of Hepatitis C Virus Infection Among Blood Donors Attending Selected Blood Banks in some Local Government Areas in Kano, Nigeria. Journal of public Health and Epidemiology vol 4(6) : 178 -183. Kementrian Kesehatan Republik Indonesia. (2010). Menkes Meluncurkan program pendataan penyakit hepatitis C tahap II. http://www.depkes.go.id/index.php/berita/press-release. Diakses tanggal 13 Juni 2012. Kusumawati, I.S. (2011). Isolasi dan Identifikasi Pendahuluan Bahan Bioaktif sebagai Inhibitor RNA Helikase Virus Hepatitis C dari Ekstrak Metanol Buah Tanaman Mangrove Avicennia marina (Forsk) Vierb [skripsi]. Depok : Universitas Pancasila. Laemmli, UK. (1970). Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage. Nature 227 : 680-685. Lee, J.C. et al. (2011). Anti- hepatitis of Acacia confusa Extract Via Suppressing Cyclooxygenase - 2. Antiviral Research 89 : 35 - 42. Magadula, J., Tewtrakul,S. 2010. Anti – HIV – 1 Protease Activities of Crude extract of some Garcinia Species Growing in Tanzania. African Journal of Biotechnology Vol. 9 (12) : 1848-1852.
43
UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
Melki. (2010). Efektivitas ekstrak mangrove sebagai antibiotic pada penyakit vibrosis udang windu [tesis]. Bogor : Institut Pertanian Bogor. Moongkarndi, P. et al. 2004. Antiproliferation, Antioxidation and Induction of Apoptosis by Garcinia mangostana (mangosteen) on SKBR3 Human Breast Cancer Cell Line. Journal of Ethnopharmacology 90 : 161 – 166. Pasaribu, F., Sitorus, P., Bahri, S. (2012). Uji ekstrak etanol kulit buah manggis (Garcinia mangostana L.) terhadap penurunan kadar glukosa darah. Journal of Pharmaceutics and Pharmacology Vol 1 : 1-8 Patel, S. S. and Donmez, I. (2006). Mechanism of Helicases. The Journal of Biological Chemistry vol 281 No 27 pp : 18265 – 18268. Paturohman, M. (2011). Optimasi Pemurnian Protein Kapang Endofit CgKTm SF sebagai Inhibitor RNA Helikase Virus Hepatitis C [skripsi]. Bogor : Institut Pertanian Bogor. Pelczar, M.J. dan Chan E. C. S. (1988). Dasar – Dasar Mikrobiologi 2. Hadietomo et al., penerjemah. Jakarta : UI Press. Terjemahan dari: Element of Microbiology. Porth, C. M., Matfin, G. (2009). Pathophysiology : Concept of Altered Health States Eighth ed. Wolters Kluwer Health : Lippincott Williams & Wilkins. Putri, P. H. (2011a). Isolasi dan Pemurnian Bahan Aktif dari Mikroalga BTM 11 sebagai Inhibitor RNA Helikase Virus Hepatitis C [skripsi]. Bogor : Institut Pertanian Bogor. Putri, S. F. (2011b). Isolasi dan Purifikasi Inhibitor RNA Helikase Virus Hepatitis C dari Bakteriosin Bskteri Asam Laktat [skripsi]. Bogor : Institut Pertanian Bogor. Ravikumar, Y. S. et al. (2011). Inhibition of Hepatitis C Virus Replication by Herbal Extract : Phyllanthus amarus as Potent Natural Source. Virus Research 158 : 89–97. Sambrook J, Russell DW. (2001). Molecular Cloning: a laboratory manual. New York. Cold Spring Harbor Laboratory Press. 2344 hlm. Setianingsih, D. (2011). Isolasi dan Identifikasi Awal Senyawa Aktif dari Ekstrak Rimpang Temulawak (Curcuma zanthorrhiza Roxb.) sebagai Inhibitor RNA Helikase Virus Hepatitis C [skripsi]. Depok : Universitas Pancasila. SIGMA-ALDRICH. (2008). Detergents and solubilization reagents. Biofiles 3(3): 1-36.
44
UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
Solga, S., Poordad, FF., Rai, R., Norwitz, L., Kalloo, A.N. (2007). Rational design of dual-functional aptamers that inhibit the protease and helicase activities of HCV NS3. J. Biochem. 137 : 339-347 Tellinghuisen T. L., Evans M.J., Hahn T., You S., dan Rice C.M. (2007). Studying hepatitis C virus: making the best of a bad virus. J. Virology 81(17): 8853-8867 Tiwari, P., Kumar, B., Kaur, M., Kaur, G., Kaur, H. (2011). Phytochemical screening and extraction : a review. International Pharmaceutica Sciencia Vol. 1 Issue 1 United State Departement of Agriculture. (2012). Plants profile Garcinia mangostana L. http://plants.usda.gov/java/nameSearch Diakses tanggal 23 Juli 2012. Utama A et al. (2005). Skrining inhibitor RNA helikase terhadap virus Japanese Encephalitis. Poster Program Kompetitif LIPI. Utama, A. et al. (2000). Identification and characterization of the RNA helicase activity of japanese enchepalitis virus NS3 protein. FEBS Letter 456:74-78 Verheij, E.M.W, dan Coronel, R.E. (1997). Sumber Daya Nabati Jilid 2. Jakarta : PT Gramedia Pustaka Utama. Wang, J., Sanderson, B.J.S., Zhang, W. (2011). Cytotoxic effect of xanthone from pericarp of the tropical fruit mangosteen (Garcinia mangostana Linn.) on human melanoma cells. Food and Chemical Toxicology 49 : 2385 -2391. Wasito, Hendri. (2011). Obat Tradisional Kekayaan Alam Indonesia. Yogyakarta: Graha Ilmu. Yamashita, A et al. (2012). Inhibition of hepatitis C virus replication and viral helicase by ethyl acetate extract of the marine feather star Alloeocomatella polycladia. Marine Drugs 10: 744-761. Yu, L., Zhao, M., Yang, B., Zhao, Q., Jiang, Y. (2007). Phenolic from hull of Garcinia mangostana fruit and their antioxidant activities. Food Chemistry 104 : 176 - 181. Zang, Y., Song, Z., Hao, J., Qiu, S., Xu, Z. (2010). Two new prenylated xanthones and a new prenylated tetrahydroxanthone from pericarp of Garcinia mangostana. Fitoterapia 81 : 595 – 599. Zarena, A. S., Sachindra, N. M., Sankar, K. U. (). Optimisation of ethanol modified supercritical carbon dioxide on the extract yield and antioxidant activity from Garcinia mangostana L. Food Chemistry 130 : 203 – 208.
46
UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
Lampiran 2. Alur Penelitian
Ekspresi enzim RNA helikase
virus hepatitis C
Pembuatan seri pengenceran
ekstrak dengan metanol absolut
Analisis kemurnian
enzim RNA helikase HCV dengan SDS
PAGE
Sejumlah 490 gram serbuk simplisia kulit
buah manggis
Purifikasi enzim RNA helikase
virus hepatitis C
Uji aktivitas enzim RNA
helikase virus hepatitis C
Maserasi bertingkat dengan pelarut
n-heksan, etil asetat, dan metanol
Skrining Fitokimia Ekstrak
Ekstrak kental n-heksan, etil asetat,
dan metanol
% inhibisi
Uji aktivitas inhibisi ekstrak
dengan kolorimetri ATPase
Enzim RNA helikase virus
hepatitis C terpurifikasi
47
UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
Lampiran 3. Skema Kerja Penyiapan Ekstrak kulit buah manggis (Garcinia mangostana L)
Maserasi dengan 5 x 800 mL pelarut metanol, masing-masing selama 3 hari
Filtrasi
Residu Filtrat 2
Evaporasi
Filtrasi
Filtrat 3 Residu
Ekstrak n -heksan
Evaporasi
Ekstrak etil asetat
Ekstrak etil asetat
Residu
Maserasi dengan 5 x 800 mL pelarut etil asetat, masing-masing selama 3 hari
Filtrasi
Filtrat 1
Evaporasi
Maserasi dengan 5 x 800 mL pelarut n - heksan, masing- masing selama 3 hari
Serbuk kulit buah manggis sebanyak
490 gram
Buah manggis sebanyak 5 kg,
dibersihkan dengan air mengalir
Dikumpulkan bagian kulit
buah (perikarp) manggis
Dirajang dan diangin-anginkan di udara terbuka
Dihaluskan denga
blender
48
UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
Lampiran 4. Skema Kerja Produksi Enzim RNA Helikase Virus Hepatitis C
Induksi IPTG
Afinitas kromatografi
Uji aktivitas enzim RNA helikase dengan kolorimetri ATPase
SDS PAGE
Enzim RNA helikase terpurifikasi
Kultur E.coli BL21(DE3)pLysS - RNA helikase rekombinan dalam media LB
Koleksi pelet, disimpan pada suhu -20 °C
Sonikasi
Fraksi terlarut
Freeze-thawing
49
UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
Lampiran 5. Skema Kerja Analisis Kemurnian Enzim RNA helikase HCV dengan SDS - PAGE
Commasie blue staining
Hasil SDS PAGE
Destain for commasie blue
Denaturasi
Preparasi gel ( stacking dan separating)
Running SDS PAGE
Sample + loading dye
50
UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
Lampiran 6. Skema Kerja Uji Aktivitas Enzin RNA Helikase HCV
Inkubasi selama 45 menit dalam suhu ruang
Tambahkan larutan pewarna (0,081% malachite green, H2O, 5,7% amonium molibdat dalam 6
M HCl, dan 2,3% polivinil alkohol dengan perbandingan 2:1:1:2)
Inkubasi selama 5 menit dalam suhu ruang
Pengkuran pada panjang gelombang 620 nm dan 405 nm
Tambahkan 25 µL Na Sitrat
Campuran Reaksi (5 µL MOPS 10 mM (pH 6,6), 1 µL ATP 0,1 M, 0,5 µL
MgCl 1 mM, 38,5 µL H2O, dan 5 µL RNA helikase HCV)
51
UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
Lampiran 7. Skema Kerja Uji Aktivitas Inhibisi Ekstrak Kulit Buah Manggis terhadap RNA helikase HCV
Inkubasi selama 45 menit dalam suhu ruang
Tambahkan larutan pewarna (0,081% malachite green, H2O, 5,7% amonium molibdat dalam 6
M HCl, dan 2,3% polivinil alkohol dengan perbandingan 2:1:1:2)
Inkubasi selama 5 menit dalam suhu ruang
Pengkuran pada panjang gelombang 620 nm dan
405 nm
Tambahkan 25 µL Na Sitrat
Campuran Reaksi (5 µL MOPS 10 mM (pH 6,6), 1 µL ATP 0,1 M, 0,5 µL MgCl 1 mM,
38,5 µL H2O, dan 5 µL RNA helikase HCV) ditambahkan dengan 5 µL ekstrak kulit buah manggis
Pengenceran Ekstrak Kulit Buah Manggis dengan metanol absolut dengan konsentrasi 100.000 ppm, 50.000 ppm, 12.500 ppm, 6.250 ppm, 3.125 ppm, 1.562 ppm, 781
ppm, 391 ppm
52
UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
Lampiran 8. Komposisi Larutan-Larutan yang Digunakan dalam SDS-PAGE
Larutan-larutan Komposisi
A Larutan separating
8%
• H2O 7,25 mL
• 1,5 M Tris-Cl pH 8,8 containing 0.4% SDS 3,75 mL
• 30% Akrilamid 4 mL
• 10% Amonium Persulfat 0,05 mL
• TEMED 0,015 mL
B Larutan stacking
3,9%
• H2O 3,05 mL
• 0,5 M Tris-Cl pH 6,8 containing 0.4% SDS 1,25 mL
• 30% Akrilamid 0,65 mL
• 10% Amonium Persulfat 0,025 mL
• TEMED 0,005 mL
C Dapar sampel SDS
2X (Loading Dye)
• 4x Tris Cl/SDS pH 6,8 25 mL
• Gliserol 20 mL
• SDS 4 g
• β- mercaptoethanol (2-ME) 2 mL
• Bromphenol blue 1 mg
• H2O sampai 100 mL
D Commasie Blue G-
250 Staining
Solution (500 mL)
• 45% H2O 225 mL
• 45% Metanol 225 mL
• 10% Asam asetat glacial 50 mL
• 0,05% Commasie brilliant blue 250 mg
E Commasie Blue G-
250 Destaining
Solution (1000 mL)
• 50% H2O 500 mL
• 10% Asam asetat glacial 100 mL
• 40% Metanol 400 mL
53
UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
Lampiran 9. Komposisi Reagen, Dapar, dan Medium yang digunakan
Larutan, dapar, medium Komposisi dan Cara Pembuatan
A Media LB (Luria-Bertani) cair
Media LB dibuat sebanyak 10 mL untuk prekultur dan 400 mL untuk kultur. Media LB dibuat dengan cara melarutkan sejumlah 0,25 g dan 10 g masing-masing ke dalam 10 mL dan 400 mL akuades. Semua disterilisasi pada suhu 121o C selama 15 menit.
B Dapar B Dapar dibuat dengan komposisi Tris-HCl 10 mM, NaCl 100 mM, dan Tween 20 0,25%. Dicampur menjadi satu dan diaduk hingga homogen.
C Dapar Elusi Sebanyak 0,2724 g imidazol dilarutkan dalam 10 mL dapar B kemudian dihomogenkan
D Adenosin 5’ trifosfat (ATP) 0,1 M
Sebanyak 0,3 g adenosine 5’ triphosphate disodium salt dilarutkan dalam nuclease free water sambil diukur pH 7,0. Sebanyak 500 µL dialikuot ke dalam 1,5 mL tabung mikrosentrifus. Disimpan pada -20°C.
E Ampisilin 100 mg/mL
Amphicillin sodium salt sebanyak 2 gram dilarutkan dalam 2 mL akuades kemudian dihomogenkan. Larutan disaring dengan filter 0,2 µm. Alikuot 1 mL ke dalam tabung 1,5 mL. Disimpan pada -20°C
F Malachite green 0,081%
Sebanyak 0,081 malachite green oxalate salt dilarutkan dalam akuades hingga mencapai volume 100 mL dan dihomogenkan. Selanjutnya larutan disaring dengan kertas saring
G Polivinil alkohol 2,3%
Sebanyak 2,3 g polivinil alkohol dilarutkan dalam akuades hingga mencapai volume 100 mL kemudian dihomogenkan dengan pemanasan
H Ammonium molibdat 5,7% dalam HCl 6 N
Sebanyak 5,7 g ammonium molibdat tetrahidrat dilarutkan dalam HCl 6 N hingga mencapai volume 100 mL kemudian dihomogenkan
I Natrium Sitrat 30%
Sebanyak 3 g citric acid trisodium salt dihydrate dilarutkan dalam akuades hingga mencapai 100 mL kemudian dihomogenkan
54
UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
Lampiran 10. Perhitungan Rendemen Ekstrak Kulit Buah Manggis
Rendemen = ( ) ( ) X 100%
Ekstrak n-heksan kulit buah Manggis
Rendemen = , X 100% = 1,061%
Ekstrak etil asetat kulit buah Manggis
Rendemen = , X 100% = 9,673%
Ekstrak metanol kulit buah Manggis
Rendemen = , X 100% = 8,608%
55
UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
Lampiran 11. Perhitungan Parameter Ekstrak Kulit Buah Manggis
1. Susut pengeringan = ( ) ( ) x 100%
Ekstrak Berat sampel awal Berat sampel akhir
n – heksan 1,0002 0,9952
Etil asetat 1,0003 0,9795
Metanol 1,0003 0,9073
Ekstrak n-heksan kulit buah Manggis
Susut pengeringan = , – , , X 100% = 0,50%
Ekstrak etil asetat kulit buah Manggis
Susut pengeringan = , , , X 100% = 2,08%
Ekstrak metanol kulit buah Manggis
Susut pengeringan = , , , X 100% = 9,30%
56
UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
(Lanjutan)
2. Kadar abu = ( ) ( ) x 100%
Ekstrak Berat sampel awal Berat sampel akhir
n – heksan 2,0004 0,008
Etil asetat 2,0432 0,0145
Metanol 2,0103 0,0437
Ekstrak n-heksan kulit buah Manggis
Kadar abu = , , X 100% = 0,39%
Ekstrak etil asetat kulit buah Manggis
Kadar abu = , , X 100% = 0,71%
Ekstrak metanol kulit buah Manggis
Kadar abu = , , X 100% = 2,17%
57
UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
Lampiran 12. Perhitungan Pengenceran Ekstrak Kulit Buah Manggis
Pembuatan larutan Ekstrak Kulit buah manggis dibuat larutan stock dengan
melarutkan sejumlah ekstrak dengan metanol absolut. Larutan Stock yang dibuat
adalah :
Konsentrasi = = . , = 100.000 ppm
Larutan Stock yang diperoleh kemudian diencerkan menjadi beberapa pengenceran.
Rumus Pengenceran :
V1 x N1 = V2 x N2
Dimana, V1 = volume yang diambil dari larutan stock
N1 = konsentrasi larutan stock
V2 = volume larutan yang akan dibuat
N2 = konsentrasi larutan yang akan dibuat
Pengenceran 2x (50.000 ppm)
V1 x N1 = V2 x N2
V1 x 100.000 ppm = 1 mL x 50.000 ppm
V1 = 0,5 mL
Artinya 0,5 mL sampel dari larutan stock + 0,5 mL metanol
Pengenceran 4x (25.000 ppm)
V1 x 50.000 ppm = 1 mL x 25.000 ppm
V1 = 0,5 mL
Artinya 0,5 mL sampel dari pengenceran 2x + 0,5 mL metanol
Pengenceran 8x (12.500 ppm)
V1 x 25.000 ppm = 1 mL x 12.500 ppm
V1 = 0,5 mL
Artinya 0,5 mL sampel dari pengenceran 4x + 0,5 mL metanol
58
UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
(Lanjutan)
Pengenceran 16x (6.250 ppm)
V1 x 12.500 ppm = 1 mL x 6.250 ppm
V1 = 0,5 mL
Artinya 0,5 mL sampel dari pengenceran 8x + 0,5 mL metanol
Pengenceran 32x (3.125 ppm)
V1 x 6.250 ppm = 1 mL x 3.125 ppm
V1 = 0,5 mL
Artinya 0,5 mL sampel dari pengenceran 16x + 0,5 mL metanol
Pengenceran 64x (1.562 ppm)
V1 x 3.125 ppm = 1 mL x 1.562 ppm
V1 = 0,5 mL
Artinya 0,5 mL sampel dari pengenceran 32x + 0,5 mL metanol
Pengenceran 128x (761 ppm)
V1 x 1.562 ppm = 1 mL x 761 ppm
V1 = 0,5 mL
Artinya 0,5 mL sampel dari pengenceran 64x + 0,5 mL metanol
Pengenceran 256x (391 ppm)
V1 x 761 ppm = 1 mL x 391 ppm
V1 = 0,5 mL
Artinya 0,5 mL sampel dari pengenceran 128x + 0,5 mL metanol
59
UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
Lampiran 13. Hasil Uji Aktivitas Inhibisi Ekstrak Kulit Buah Manggis terhadap Enzim RNA Helikase Virus Hepatitis C
Ekstrak Konsentrasi
(ppm)
Absorbansi
tanpa
inhibitor
(enzim)
Absorbansi
dengan
inhibitor
(enzim +
inhibitor)
%Inhibisi
n-heksan Kontrol negatif 1.20 1.15 3.78
3.125 0.65 41.79
1.562 0.75 33.98
781 0.91 20.73
391 1.03 10.45
Etil asetat Kontrol negatif 1.22 1.17 3.96
3.125 0.69 39.07
1.562 0.84 27.26
781 0.92 20.78
391 0.98 15.58
Metanol Kontrol negatif 1.22 1.17 3.96
3.125 0.30 71.57
1.562 0.33 68.70
781 0.45 58.75
391 0.90 22.17
60
UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
Lampiran 14. Perhitungan Persentase Inhibisi Ekstrak Kulit Buah Manggis terhadap Enzim RNA Helikase Virus Hepatitis C
Cara Perhitungan :
% inhibisi = – x 100
A = absorban enzim tanpa adanya senyawa inhibitor
I = absorban enzim dengan adanya senyawa inhibitor.
Contoh perhitungan pada ekstrak metanol dengan konsentrasi 3.125 ppm :
% inhibisi = . – . . x 100
= 75,553307%
Absorbansi aktivitas inhibisi dikurangi dengan kontrol negatif
= 75,53307% - 3.963888 %
= 71,569182%
61
UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
Lampiran 15. Kurva Standar Fosfat (Uji ATPase)
Data :
Konsentrasi K2HPO4 (mM)
Absorbasi 620 nm dengan referensi 405 nm
0.0 0.1 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0
0.000 0.102 0.239 0.417 0.622 0.834 1.022
Grafik :
0
0.2
0.4
0.6
0.8
1
1.2
0 0.2 0.4 0.6 0.8 1
Abs
620
/405
nm
[K2HPO4] (mM)
y = 1.020x + 0.010 R2 = 0.9989
62
UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
Lampiran 16. Contoh Perhitungan Aktivitas RNA Helikase Virus Hepatitis C
Diketahui : y = 1,020x + 0,010 (kurva standar dilihat di lampiran 14)
Sampel didilusi 40x
OD pada 620 nm = 1,21933
Masa inkubasi 45 menit
1 well terdapat 5 µL enzim RNA helikase
Konsentrasi enzim RNA helikase = 18,32 µg/ µL
1 pmol = 0,05
Ditanya : Aktivitas enzim RNA helikase
Jawab : y = 1,020x + 0,010
1,21933 = (1,020x) + 0,010
x = 1,18562 mM fosfat
Banyaknya fosfat yang dilepaskan dari sampel = 1,18562 mM fosfat x 40
= 47,4248 x 10-6 mol fosfat/mL
Fosfat yang dilepaskan dalam 45 menit = , x 10-6 mol fosfat/mL
= 1,05388 x 10-6 mol fosfat/mL/menit
Banyaknya enzim dalam 1 well = 18,32 µg/µL x 5 µL
= 91,6 µg = 1832 pmol protein
Aktivita enzim RNA helikase = , / /
= 575,263 pmol fosfat/mL/menit/pmol protein
63
UIN Syarif Hidayatullah Jakarta
Lampiran 17. Grafik Aktivitas Enzim RNA Helikase HCV
0.0
100.0
200.0
300.0
400.0
500.0
600.0
700.0
3.125 ppm 1.562 ppm 781 ppm 391 ppm enzim tanpa senyawa inhibitor
Akt
ivit
as E
zim
(pm
ol fo
sfat
/mL/
men
it/p
mol
pro
tein
)
Konsentrasi Ekstrak Kulit Buah Manggis
Aktivitas Enzim RNA Helikase HCV
n-heksan
etil asetat
metanol