PowerPoint Presentation

1Analiza uleiurilor volatile

1

2

Descriere. Structur.3Numeroase publicatii au prezentat date despre compozitia variata a uleiurilor volatile. Compusii majori ai uleiurilor esentiale de interes economic sunt sumarizate anterior. Analiza compozitionala detaliata este realizata prin cromatografia de gaz si spectrometria de masa. Uleiurile esentiale pot cuprinde mai mult de 60 de componente individuale. Componentii importanti pot constitui pana la 85% din uleiurile esentiale, in timp ce alti compusi pot fi prezenti doar ca urme. Compusii fenolici sunt responsabili mai ales pentru proprietatile antibacteriene ale uleiurilor esentiale. Componentii majori a numarului de uleiuri esentiale cu proprietati antibacteriene sunt prezenti in Tabelul 1 si structura chimica a lor este prezentata in Figura 1. Exista date care arata ca compusii minori joaca un rol critic in activitatea antibacteriana, posibil prin producerea de efecte sinergice intre alti compusi. Acest caz se intalneste la salvie si la anumite specii de Timus si Oregano.

4

Clasificare5Abilitatea de a acumula uleiuri esentiale nu este omniprezenta in plante dar sunt imprastiate in regnul plante. Totusi, in unele cazuri, sunt mai frecvente in anumite familii. Din punct de vedere taxonomic si sistematic, nu producerea uleiurilor esentiale este caracteristica distinctiva deoarece acesta este un grup heterogen de substante, dar atat componentele secretorii cat si grupurile de substante specifice, de exemplu mono si sesquiterpenele, fenilpropenele etc. Cu cat o substanta este dedusa in calea de biosinteza cu atat este mai specifica pentru un anumit taxon: monoterpenele sunt tipice pentru genul Mentha, mentolul fiind caracteristic doar pentru Mentha piperita si Mentha arvensis ssp. Piperascens, sesquiterpenele sunt comune in complexul Achilleamillefolium, dar doar Achillea roseo-alba si Achillea collina pot produce matricina ca precursor de camazulena.

Istoric6Prima investigare sistematica a compusilor din uleiurile esentiale poate fi atribuita chimistului francez M.J. Dumas (18001884) care a analizat unii compusi ce contin hidrocarburi, oxigen, sulf si azot. Cercetatorul francez M. Berthelot (1859) a caracterizat cateva substante naturale si produsii lor rearanjati de rotatiile optice. Totusi, cele mai importante investigatii au fost facute de catre O. Wallach, un asistent de-al lui Kekule. El a realizat ca, cateva terpene descrise sub diferite nume in conformitate cu sursele lor vegetale erau adesea identice din punct de vedere chimic. Atunci el a incercat sa izoleze constituenti unici din ulei vegetal si sa le studieze proprietatile de baza.

Utilizri 7Uleiurile esentiale au devenit o parte integrata din viata de zi cu zi. Ele sunt folosite intr-o mare varietate de moduri: ca arome pentru mancare, ca aditivi alimentari, ca agenti aromatizanti pentru industria tigarilor si in componenta cosmeticelor si parfumurilor. Mai mult decat atat, ele sunt folosite in odorizante si dezodorizante cat si in ramuri ale medicinei cum este farmacia, balneologia, masaj si homeopatia. O arie mult mai specializata va fi in domeniul aromaterapiei si aromacologie. In ultimii ani, importanta uleiurilor esentiale ca biocid si insecticid a condus la un studiu mult mai amanuntit a potentialului lor antimicrobian. Uleiurile esentiale sunt de asemenea surse naturale bune de substante cu potential comercial ca si compusi initiali pentru sinteze chimice. Uleiurile esentiale au fost cunoscute omenirii de sute de ani, chiar milenii. Actiunea importanta a uleiurilor esentiale a fost recunoscuta ca remediu cu mult inainte ca parfumurile sa fie folosite. Fara ingrijirile medicale de care ne bucuram in timpurile noastre, auto-vindecarea a fost singura obtiune pentru a combate parazitii sau suferinta corpului uman. Mai tarziu, uleiurile esentiale au fost folosite in prepararea primelor cosmetice, pudre si sapunuri. Cum a aparut industria producatoare de substante chimice sintetice, de-a lungul secolului 19, a crescut si 84 Handbook of Essential Oils si de asemenea si producerea de uleiuri esentiale datorita importantei lor in stilul nostru de viata.

8

Activitate biologic9Folosirea uleiurile esentiale reprezinta un domeniu foarte promitator de tratament al tumorilor. Din 1990, proprietatile anticancer a uleiurilor esentiale si/sau compusii lor principali si/sau metaboliti au castigat din ce in ce mai mult interes., in masura in care aceste terapii naturale sunt acceptate peste tot in lume de catre pacienti. Unul dintre principalii compusi este d-limonene din coaja de portocala. Frunza proaspata de Streblus asper Lour (Moraceae) contine fitol (45.1%), a-farnesena (6.4%), acetat de trans-farnesil(5.8%), cariofilena (4.9%), si trans,trans-a-farnesena (2.0%) fiind testata impotriva celulelor care provoaca leucemia linfocitica la soareci aratand activitate antitumorala semnificativa.

entomo10Au fost extrase prin refluxare cel putin 20 de Kg de rizomi de turmeric (Curcuma longa L.), frunze de Citrus hystrix DC., frunze de Cymbopogon winterianus Jowitt si frunze de oregano (O. americanum). Una sau doua kg de material proaspat a fost taiat in bucati mici si pus intr-un balon de distilare cu aproximativ de cinci ori mai multa apa si 10 margele de sticla. Camera de distilare a fost incalzita intr-o baie de parafina lichida la 120 C si lasata sa fiarba pana cand distilarea este completa. Distilatul a fost colectat intr-o palnie in care partea apoasa a fost separata de uleiul volatil. Stratul de apa a fost uscat incet pana cand ramane doar stratul de ulei. Aceasta procedura a fost repetata pana cand s-a recuperat cel putin 20 ml de ulei. Acesta a fost colectat si pastrat intr-un cilindru la 4 C pana cand s-a cercetat activitatea lui impotriva tantarilor. Pentru evaluarea eficacitatii , fiecare ulei la fel ca si la DEET-ul a fost preparat in doua feluri : 25% (v/v) in etanol absolut cu si fara vanilina 5%.

Metode de microdilutie a masei fermentative11 Intr-un studiu s-au folosit metoda microdilutiei masei fermentative cu urmatoarele modificari: s-a folosit MHB in locul mesei fermentativ anterior folosite si in teste C. albicans, subculturile au fost realizate dupa o incubare de 48 de h. pentru majoritatea uleiurilor cea mai mare concentratie testata a fost 4 % si pentru unele chiar 8 %. Cea mai scazuta concentratie testata fost 0,008 %.

12Microorganismele au fost obtinute din colectiile de culturi a Departamentului de Microbiologie de la Universitatea Australiei de Vest si Centrul Australian de Vest pentru cercetare medicala si patologica. Organismele folosite au fost urmatoarele: Acinetobacter baumanii , Aeromonas veronii , Candida albican. Metoda dilutiei agarului a fost folosita cu urmatoarea modificare : o concentratie finala de 0.5 % (v/v)Tween-20(Sigma) a fost incorporata in agar dupa autoclavare pntru a spori solubilitatea uleiului. Pe scurt, o serie de dilutii duble din fiecare ulei, variind de la 2% (v/v) la 0.03% (v/v), a fost preparat in agar Mueller Hinton cu 0.5% (v/v) Tween-20. placile au fost uscate la 35C timp de 30min inainte de inoculare cu 12ml picaturi continand aproximativ 10 4 cfu din fiecare organism, folosind un replicator multipunct. Agarul Mueller Hinton, cu 0.5% (v/v) Tween-20 dar fara ulei, a fost folosit ca un control pozitiv de crestere. Placile inoculate au fost incubate la 35C timp de 48h. Minimuminhibitoryconcentrations(MICs) a fost determinat dupa 24 de h pentru bacterii si 48 de h pentru C. albicans. MIC a fost determinat la cea mai joasa concentratie de ulei care inhiba vizibil cresterea fiecarui organism de pe placa de agar. Prezenta a una sau doua colonii a fost neglijata.

GC-MS13Analiza compusilor uleiurilor volatile a fost derulata pe un sistem a Hewlett-Packard GCMS. Coloana HP-20 M din polietilen glicol a fost cuplata direct cu spectometrul de masa.Ca gaz, s-a folosit heliu (1ml/min). Programul folosit a fost izoterm, la 70C, 4 min i apoi a urmat o cretere cu 4C pn la 180C+ 10 minute la aceast temperatur. Temperatura la injectare a fost 250C i temperatura detectorului a fost de 280C. Ionizarea probei a fost realizat n modul EI (70 eV).Indicii liniari de retentie pentru toti compusii au fost determinati prin coinjectarea mostrelor cu o solutie care contine seria omoloaga a C8-C22 n-alcani . Constituentii individuali au fost identificati cu ajutorul indicilor lor de retentie i prin compararea spectrului de mas fie cu spectrele cunoscute ale diversilor compusi sau cu cele din baza de date Wiley.

14 Practic nu exista dovezi stiintifice privind actiunea directa a uleiurilor esentiale, in aplicarea lor pe piele prin masaj asupra unor organe interne specifice mai degraba decat prin miros care duce la sistemul limbic din creierul mijlociu si apoi prin calea simpatica si parasimpatica. Aceasta arata, in ciuda unor dovezi, ca anumite componente din uleiurile esentiale pot fi absorbite ori prin piele ori prin plamani.AROMATHERAPY15Aromaterapia este definita ca utilizarea extractelor din plantele aromatice si uleiuri esentiale in masaj si alte tratamente. Multe parfumuri s-au aratat a avea un efect asupra starii de spirit, in general, mirosurile placute genereaza amintiri fericite, sentimente pozitive si o stare generala de bine. Multi vapori ai uleiurilor esentiale s-au dovedit a diminua variaia negativ contingenta (NVC), undele cerebrale la voluntari umani i acestea sunt considerate a fi sedativ. Altele cresc CNV si sunt considerate stimulatoare. Un individ cu anosmie a prezentat schimbari in fluxul sangvin cerebral dupa inhalarea anumitor uleiuri esentiale, la fel ca si oamenii capabili sa simta miros, aratand ca uleiul a avut efecte pozitive asupra creierului in ciuda inabilitatii pacientului de a mirosi. Exista unele dovezi cum ca unele uleiuri esentiale (ex. nucsoara) care pot scadea tensiunea arteriala ridicata. Uleiurile esentiale aplicate extern pot reduce/elimina acneea (ex. Arborele de ceai).acestea se intampla, totusi, folosind efecte chimice convenionale ale uleiurilor eseniale, mai degrab dect aromoterapie.

ConcluZii16 Cea mai important caracteristic a uleiurilor volatile, care confer de altfel i valoarea economic deosebit, o constituie mirosul specific. Acesta st la baza utilizrii lor n parfumerie, n produsele cosmetice i n industria alimentar. Multe uleiuri volatile au caliti terapeutice deosebite, o parte dintre acestea fiind cunoscute i folosite nc din antichitate. Un numar de uleiuri esentiale si cateva din componentele lor individuale prezinta activitate antibacteriana impotriva patogenilor dezvoltati in mancare. Compusii fenolici sunt cei mai activi si pare ca principala lor actiune este de membrana permeabila. Organismele Gram pozitive sunt in general mult mai sensibile la uleiurile esentiale decat organismele Gram negative. Efecte organoleptice de nedorit pot fi limitate printr-o selectie atenta a uleiurilor esentiale potrivit fiecarui tip de mancare.

Bibliografie17Kulisic T., Radonic A., Katalinic V., Milos M. 2004. Use of different methods for testing antioxidative activity of oregano essential oil, Food Chemistry. 85: 633640Sara Burt , 2004 , International Journal of Food Microbiology , Essential oils: their antibacterial properties and potential applications in foods, 94: 223 253Apiwat Tawatsin, Steve D. Wratten, R. Roderic Scott, Usavadee Thavara, Yenchit Techadamrongsin, , 2001, Journal of Vector Ecology, Repellency of Volatile Oils from Plants against Three Mosquito Vectors, No. 1: 76-82 K.A. Hammer, C.F. Carson, T.V. Riley, 1999, Antimicrobial activity of essential oils and other plant extracts, Journal of Applied Microbiology, 86: 985990Timothy B. Adams, Hugo Bovill, Alexander Pauli, Maria M. Kettenring & co, 2010, Handbook of essential oils, 6: 151-185Vassya Bankova, Milena Popova, Boryana Trusheva, 2014, Propolis volatile compounds: chemical diversity and biological activity, Bankova et al. Chemistry Central Journal, 8:28

18Kulisic T., Radonic A., Katalinic V., Milos M. 2004. Food Chemistry. 85: 633640Folosirea diferitelor metode pentru testarea activitii antioxidante a uleiului esenial de oregano

Introducere19Cativa compusi nevolatili cum ar fi carnosol, quercetina, acidul cafeic si acidul rosmarinic sunt bine cunoscute ca fiind buni captatori de radicali liberi dar, unii compusi volatili din uleiurile esentiale poseda, de asemenea , potential ca agenti naturali in conservarea alimentelor. Un numar de studii asupra activitatii antioxidante a uleiurilor esentiale din numeroase plante aromatice au raportat ca uleiul esential de oregano, bogat in thimol si carvacrol, au un considerabil efect antioxidant in procesul de oxidare al unturii.

20Cercettorii au examinat activitatea antioxidanta a extractului de hexan din oregano crescut in Bulgaria, precum i mecanismul de actiune a thimolului si carvacrolului pur.Scopul studiului prezent a fost de a examina proprietatile antioxidante a uleiului esential de oregano prin folosirea a trei metode diferite, si anume, testul decolorarii b-carotenului (BCB), metoda captarii radicalilor cu DPPH si testul speciilor reactive a acidului thiobarbituric (TBARS).

Materiale21Oregano (Origanum vulgare L., ssp. hirtum) a fost colectat din centrul regiunii Dalmatia in octombrie 2001.Materialul vegetal a constat n tulpini i flori. Uscarea la aer a oreganoului a fost facuta intr-un loc umbros, la temperatura camerei, timp de 10 zile. Materialul vegetal a fost folosit imediat dupa uscare, pentru izolarea uleiului esential. 100 g de material vegetal uscat a fost supus unei hidro-distilari timp de 3 ore folosind un aparat modificat de tipul Clevenger. Uleiul esential obtinut a fost uscat cu sulfat de sodiu anhidru si depozitat n prezena azotului in flacoane sigilate la -20 C pana la folosire.Uleiul esential de oregano (0,5 g) a fost fractionat pe o coloana de silicagel. A fost folosit pentan (50 ml) pentru a obtine o fractionare, care a continut doar fracii CH si dietil eter (50 ml) a fost folosit pentru a obtine o fractionare a compusilor nepolari (CHO).

22Aceste fractii au fost concentrate la 0,5 ml si supuse la cromatografia in strat subtire (TLC) pe placi de silicagel pentru a verifica rezultatele separarii coloanelor cromatografice. Ca faze mobile, au fost folositi diferiti solventi : n-hexan pentru fractionarea CH si acetatul de n-hexan:etil 85:15 (v/v) pentru fractionarea CHO. Doua procente acid sulfuric- vanilina a fost folosit ca reactivi. Fractiile obtinute prin cromatografie de coloana au fost de asemenea supuse la analiza GC/MS si au fost confirmate rezultatele Pentru a obtine o fractionare a compusilor fenolici, a fost dizolvat 1 g de ulei esential in 5 ml de pentan si a fost extras cu solutie de hidroxid de sodiu (20 %) in apa. In acest fel, compusii fenolici au fost indepartati de pe stratul cu pentan. Faza apoasa, care contine saruri de sodiu cu compusi fenolici a fost neutralizata cu solutie de acid hidrocloric (10%) in apa. In final, izolarea compusilor fenolici a fost realizata de extractia cu pentan (5:5 ml) fiiind urmat de TLC.

GCMS23Analiza compusilor uleiurilor volatile a fost derulata pe un sistem a Hewlett-Packard GCMS. Coloana HP-20 M din polietilen glicol a fost cuplata direct cu spectometrul de masa.Ca gaz, s-a folosit heliu (1ml/min). Programul folosit a fost izoterm, la 70C, 4 min i apoi a urmat o cretere cu 4C pn la 180C+ 10 minute la aceast temperatur. Temperatura la injectare a fost 250C i temperatura detectorului a fost de 280C. Ionizarea probei a fost realizat n modul EI (70 eV).Indicii liniari de retentie pentru toti compusii au fost determinati prin coinjectarea mostrelor cu o solutie care contine seria omoloaga a C8-C22 n-alcani . Constituentii individuali au fost identificati cu ajutorul indicilor lor de retentie i prin compararea spectrului de mas fie cu spectrele cunoscute ale diversilor compusi sau cu cele din baza de date Wiley.

Determinarea activitatii antioxidante cu testul decolorarii B-carotenului(BCB) 24Activitatea antioxidanta a compusilor volatili din oregano a fost determinata in conformitate cu versiunea putin modificata a metodei BCB.S-a adaugat B-caroten intr-un vas care fierbea, impreuna cu acid linoleic si Tween 40, toate dizolvate in cloroform. Dupa evaporarea prin uscare sub vacuum la 50 C de catre un evaporator rotativ, a fost adaugata apa distilata (50 ml) si amestecul a fost amestecat timp de 1 min intr-un sonificator pentru a forma o emulsie (A). Apoi s-a amestecat solutie etanolica stoc din fiecare antioxidant cu cate 5 ml din emulsia A. De asemenea s-a preparat o solutie control din etanol si emulsie. S-a preparat o a doua emulsie (B) format din acid linoleic, Tween 40 si apa oxigenata. Pentru calibrarea aparatului s-a folosit etanol impreuna cu 5 ml din emulsia B. Citirile a fost facute imediat (t= 0) si la intervale de 15 min timp de 120 de min la 470 nm. Cuvele au fost tinute la 50C pe tot parcursul timpului dintre inregistrari, toate determinaririle fiind facute in duplicat.

Determinarea activitatii antioxidante cu ajutorul metodei 2,2-difenil-1-picrilhidrazil25Activitatea antioxidanta a uleiului volatil de oregano a fost masurata urmarind abilitatea de donarea a hidrogenului, folosind radicalul stabil DPPH.O soluie stoc metanolic de antioxidant a fost plasat intr-o cuva i s-a adaugat DPPH. S.a masurat imediat absorbanta i a apoi s-a repetat dupa o ora la 517 nm. Metanolul a fost folosit pentru calibrarera aparatului. Absorbanta DPPH stoc a fost masurata zilnic. Toate probele au fost analizate in triplicat. Procentajul inhibitiei radicalului DPPH de catre probe a fost calculat folosind formula % inhibitie = ((AC(0) - AA(t) )/AC(0) ) x 100Unde AC(0) este absorbanta controlului la t=0 min AA(1) este absorbanta antioxidantului la t=1 h

25Determinarea activitii antioxdante cu testul reactivului acid tiobarbituric26S-a utilizat un test TBARS modificat, ce coninea omogenate de glbenu ca mediul de cultur, pentru a afla poteniala capacitate antioxidant.Pe scurt, 0,5 ml de omogenat tisular 10 % i 0.1 de probe pentru testat, preparate chiar nainte de folosire, au fost introduse ntr-un tub i s-a completat cu ap distilat pn la 1 ml. S-a adugat n ap 0,05 ml de dihidroclorur de 2-amidinopropan pentru a induce peroxidarea lipidelor. S-au mai adugat 1.5 ml de acid acetic 20 % i 1.5 ml ml de acid tiobarbituric 0.8 % n SDS 1.1 %. S-a vortexat i apoi s-a nclzit la 95C pentru 60 min.Dup rcire, la fiecare tub s-au adugat cte 5 ml de butan-1-ol, s-a vortexat i apoi s-a centrifugat la 1200 g pentru 10 min. S-au efectuat citiri la spectrofotometru la 532 nm. Toate valorile s-au bazat pe procentajul indexului antioxidant (AI):AI% = (1- AT / AC) x 100

27

RezultateCompoziia chimic a uleiului esenial de oregano28

29

30

Concluzii31n concluzie, puterea antioxidant depinde de metoda aleas, de concentraie i de natura proprietilor fizico-chimice ale compuilor studiai.n acest studiu, s-a confirmat c aceleai probe de antioxidant prezint diverse valori antioxidante, n funcie de concentraie i de parametrul analizat.Aadar, uleiul esenial de oregano poate fi utilizat ca o potenial resurs de antioxidani pentru industria alimentar.

32V mulumesc!