Como observar cromossomos:Um Guia de Tcnicas emCitogentica Vegetal,Animal e Humana
Marcelo GuerraDepartamento de Botnica
Universidade Federal de Pernambuco
e
Maria Jos de SouzaDepartamento de Gentica
Universidade Federal de Pernambuco
Como observar cromossomos:Um Guia de Tcnicas emCitogentica Vegetal,Animal e Humana
Dados Internacionais de Catalogao na Publicao (CIP)(Cmara Brasileira do Livro, SP, Brasil)
Guerra, MarceloComo observar cromossomos : um guia de tcni-
casem citgentica vegetal, animal, e humana /Marcelo Guerra, Maria Jos de Souzas. --Ribeiro Preto, SP : Fundao de PesquisasCientficas de Ribeiro Preto, 2002.
Bibliografias.
1. Citogentica 2. Cromossomos I. Souza, MariaJos. II. Ttulo.
ISBN: 85-87528-38-6
02-3218 CDD-572.8072
ndices para catlogo sistemtico:1. Citogentica : Tcnicas de laboratrio :
Cincias da vida 572.8072
Todos os direitos desta edio reservados Fundao de Pesquisas Cientficas de Ribeiro Preto.
Editor Chefe: Prof. Dr. Francisco A. Moura DuarteEditor Associado: Prof. Dr. David De JongSupervisora de Produo: Eneida Oliveira BanksEngenheiro de Sistemas: Domingos YamadaComputao Grfica: Jos Meneghetti JniorRevisora Tcnica: Margareth P. Monteiro de BarrosCoordenador de Produo Grfica: Edmundo Cruz CanadoSupervisora de Editorao Grfica: Fabiana Pereira da SilvaCapa: Fabiana Pereira da Silva
2002, Impresso no Brasil
FUNPEC - Editora
Rua Hudson, 655 / Jardim Canad14024-000 Ribeiro Preto, SPTel./Fax: (16) 620-1251e-mail: [email protected]
APRESENTAO
Este livro comeou como um roteiro para aulas prticas ministradas
independentemente por ambos os autores. Ao longo de muitos anos, o
texto foi modificado, ajustando-se melhor s tcnicas j bem estabelecidas
e incorporando-se novas, servindo tambm de referncia para a rotina dos
estagirios e ps-graduandos dos nossos laboratrios. Finalmente, foi
reorganizado como um guia prtico de tcnicas em citogentica. Desde o
incio at a sua forma final, os procedimentos tcnicos foram sempre
testados, criticados e aperfeioados por nossos alunos, aos quais somos
imensamente gratos pelas inmeras sugestes, principalmente queles que
trabalharam intensamente conosco na fase final de redao deste texto,
contribuindo, inclusive, com muitas das fotos apresentadas.
Na parte relativa Citogentica Vegetal, o autor gostaria de destacar a
colaborao fundamental de Ana Emlia Barros e Silva, que como amiga e
tcnica do laboratrio, checou e discutiu todos os protocolos, preparo de
solues, etc, alm de revisar o texto final vrias vezes, e de Reginaldo de
Carvalho, que gentilmente preparou todas as pranchas dessa rea. Na
Citogentica Animal, a autora particularmente grata s colegas Tania T.
Rieger, pela leitura e contribuies sugeridas, e Rita de Cssia de Moura,
pela elaborao de alguns desenhos, bem como s tcnicas Francisca
Tavares Lira e Cirlene Maria da Silva pelo constante apoio nas diferentes
fases deste trabalho. Gostaramos ainda de agradecer doutoranda Ana
Christina Brasileiro pela reviso do portugus de todo o livro.
PREFCIO
A anlise cromossmica sempre foi um dos campos mais excitantes daCitologia e da Gentica, tanto quando relacionada a estudos taxonmicos eevolutivos, quanto a estudos estruturais, no melhoramento gentico, nacaracterizao de germoplasmas ou na anlise clnica. Apesar da revoluoprovocada pela Gentica Molecular, a anlise cromossmica continua sendoa nica maneira de observar todo o genoma de um eucariota na forma deblocos individualizados de material gentico, passveis de seremmensurados, diferenciados em sub-unidades e manipulados de diversasmaneiras. Em nenhuma outra instncia, o material gentico to claramenteobservado. Com a introduo das tcnicas moleculares, os chamados corposcorados da Citologia, esto cada vez mais brilhantemente corados, em corese pseudo-cores as mais variadas.
A obteno de bons resultados, depende basicamente do perfeitodomnio de diferentes tcnicas de colorao. Com isso, a Citogentica alia ainformao obtida sobre o material gentico, estampada em uma simplesfoto, a uma esttica prpria da rea, capaz de impressionar iniciantes eprofissionais experientes. O fascnio da Citogentica evidente at nostrabalhos rotineiros. Em aulas prticas, por exemplo, mesmo professoresmais experientes no conseguem ser muito objetivos na anlise de umalmina bem preparada de mitose em cebola. So sempre possudos pelodesejo de olhar mais e mais, uma e outra clula. Uma metfase bonita, bemespalhada e corada com hematoxilina, Giemsa ou DAPI uma paisagemdifcil de tirar da memria por horas ou mesmo dias.
Durante o processo evolutivo das espcies, os caritipos setransformaram seguindo regras prprias, muitas das quais aindadesconhecidas, gerando uma imensa diversidade cromossmica em nmero,forma, tamanho, capacidade de pareamento meitico, contedo deheterocromatina, etc. Os vrios exemplos apresentados no texto, ilustramno apenas o efeito final de determinadas tcnicas de colorao como tambmfornecem uma amostra da diversidade revelada com essas tcnicas. As fotosforam quase sempre tiradas de trabalhos nossos j publicados, mostrandoassim o que possvel produzir com essas tcnicas.
O estudo da variabilidade cariotpica e do seu significado tem sido nossotema de pesquisa h cerca de 30 anos. Este livro o resultado dessaexperincia em pesquisa, em aulas prticas e na orientao de alunos nosmais diversos ramos da citogentica. Os protocolos apresentados tm sidoutilizados em aulas prticas de diferentes cursos de graduao e ps-graduao ministrados pelos autores na Universidade Federal de Pernambucoe em outras Universidades. A citogentica humana foi restrita, neste texto,
s tcnicas bsicas, tanto por no ser a rea de pesquisa dos autores, quantopor ser uma rea j to especializada que possui guias particulares nosquais tem sido bastante exploradas.
O texto est dividido em duas partes praticamente independentes: acitogentica vegetal e a citogentica animal e humana. Cada uma dessaspartes de autoria exclusiva de apenas um dos autores e por isso tem estilode apresentao prprio, apesar da intensa troca de idias e sugestes. Oscaptulos finais da parte de citogentica vegetal, sobre o preparo de solues,revelao de filmes e sugestes gerais para o dia-a-dia do laboratrio, seaplicam igualmente bem na citogentica animal e so recomendados aqualquer pesquisador iniciante. O texto foi escrito para servir de guia prticopara aqueles interessados em desenvolver essas tcnicas em seuslaboratrios. Por essa razo, so descritas no apenas as etapas de cadatcnica mas tambm os detalhes de como fazer cada uma delas e os cuidadosque devem ser tomados. Para os iniciados na rea, uma leitura atenta atravsdas tcnicas e recomendaes provavelmente revelar algumas observaesimportantes.
O livro certamente incompleto, uma vez que apresentamos apenasaquelas tcnicas utilizadas rotineiramente em nossos laboratrios. Em casocontrrio, faramos um texto muito volumoso e sem muita experincia. Oleitor interessado em outras tcnicas deve consultar outras obras, algumasdas quais recomendamos no captulo final. Das tcnicas atuais, a grandeausente a de hibridizao in situ, na qual a nossa experincia no toextensa que nos permita tratar vontade as vrias etapas envolvidas e porisso preferimos apenas recomendar livros recentes de autores com vastaexperincia na rea. Esperamos que as tcnicas apresentadas possam ajudarestudantes e pesquisadores iniciantes a descobrir mais sobre esse fantsticomundo guardado dentro das clulas.
MARCELO GUERRA E MARIA JOS DE SOUZA
NDICE
Parte I - Citogentica Vegetal 15
1 Como coletar material para anlise citogentica 171.1 Obteno de tecido com atividade mittica intensa 171.2 Pr-tratamento com antimitticos 191.3 Fixao das clulas 201.4 Estocagem do material 20
2 Como analisar cromossomos mitticos 232.1 A escolha da tcnica e do corante adequados 232.2 Tcnicas de esmagamento seguido de colorao 252.2.1 Colorao com Giemsa 252.2.2 Controle da colorao Giemsa 282.2.3 Colorao com hematoxilina a 1% 292.3 Tcnicas de colorao seguida de esmagamento 312.3.1 Colorao com hematoxilina actica a 1% 312.3.2 Colorao com orcena actica a 2% 322.3.3 Preparao de lminas permanentes com corantes acticos 332.3.4 Colorao Feulgen 332.4 Representao do caritipo na forma de cariograma
ou idiograma 362.4.1 Construo de um cariograma 362.4.2 Construo de um idiograma 37
3 Como analisar cromossomos meiticos 393.1 Observaes gerais para a preparao das lminas 393.2 Tcnicas de colorao seguida de esmagamento 413.2.1 Colorao com carmim actico a 2% 413.2.2 Colorao com hematoxilina actica a 1% 433.3 Tcnicas de esmagamento seguido de colorao 443.3.1 Colorao com Giemsa 443.3.2 Colorao com hematoxilina actica a 1% 453.4 Anlise de clulas do tapete e da mitose polnica 46
4 Como corar diferencialmente algumasregies cromossmicas 49
4.1 Preparao de lminas com digesto enzimtica 494.2 Bandeamento C Observao da heterocromatina constitutiva 504.3 Dupla-colorao com os fluorocromos CMA e DAPI 524.4 Tripla-colorao CMA/DA/DAPI 554.5 Colorao sequencial CMA-DAPI com contracorantes
(CMA/DA-DAPI/AMD) 564.6 Colorao com Hoechst 33258, quinacrina ou iodeto
de propdeo 56
4.7 Colorao com nitrato de prata: observao de nuclolose RONs 57
4.8 Descolorao de lminas coradas com prata 58
5 Como preparar as solues mais utilizadas nacitogentica vegetal 61
5.1 Fixador Carnoy 3:1 - 20 ml 615.2 Colchicina a 0,1% ou 0,5% - 50 ml 615.3 8-Hidroxiquinolena (8HQ) 0,002M - 300 ml 615.4 HCl 1N e 5N - 300 ml 625.5 Carmim actico a 2% - 100 ml 625.6 Hematoxilina actica 1% - 100 ml 625.7 Orcena actica a 2% - 100 ml 625.8 Soluo corante de Giemsa (soluo estoque) - 66
