“UN MODELO DE SEÑALES INTRACELULARES MEDIADAS POR

RAS”

MAURA CÁRDENAS GARCÍACentro de Química BUAP

Estructura de la presentación

Herramientascomputacionales

Transducción de señales

Oligonucleótidos queforman triple

hélice

Modelos Computacionales

propuestos

Resultados experimentales

Transducción de señales

División celular

Crecimiento

EnvejecimientoMuerte celular Diferenciación

El control central de las señales paracrinas esta dado por las

señales endocrinas u hormonalesLas células de las glándulas de secreción interna:

-Hipófisis-Tiroides-Islotes de páncreas-Suprarrenales-Ovarios-Testículos

Características de los receptores

• Reconoce a la señal química

• Activa la secuencia de eventos que conducen a la respuesta celular.

Naturaleza química de la señal extracelular

• Lípidos, por ejemplo los esteroides y las prostaglandinas.

• Péptidos, por ejemplo algunos factores de crecimiento.

• Aminas, por ejemplo trifluoroacetil azobenceno.

• Iones, por ejemplo oxido nítrico y monóxido de carbono.

Localización de los receptores

• Receptores membranales

• Receptores citoplásmicos

• Receptores nucleares

Receptores membranales

• Receptores que tienen un dominio transmembranal, por ejemplo EGFR, PDGFR, TGFβR o TNFαR.

• Receptores con dos dominios transmembranales, por ejemplo receptores para insulina.

• Receptores de siete dominios transmembranales, por ejemplo hormonas como adrenalina, vasopresina, angiotensina II, bradikinina y bombesina, neurotransmisores como noradrenalina, dopamina y serotonina.

• Receptores formados por dos o mas subunidadestransmembranales, que se expresan básicamente en células del sistema inmune, por ejemplo interferon, interleucinas o GM-CSF.

• Receptores de las moléculas de adhesión por ejemplo integrina. La integrina posteriormente se une a a-actina, talina, fimbrina, vinculina o tensina.

ααααααααγγγγγγγγββββββββ

olores

2000 receptores de siete dominios transmembranales distintos

sabores

hormonas

Factores de crecimiento

neurotransmisores

luz

Receptores citoplásmicos

• Por edición alternativa de los genes correspondientes se generan algunas formas “solubles” o no membranales de los receptores para angiotensina II, IL-1, IL2, Il4 e IL-6, TNFα, IFγ y GH.

• Receptores citoplásmicos, por ejemplo los receptores para esteroides, se dividen en receptores para:

a) Glucocorticoidesb) Mineral corticoidesc) Andrógenos y estrógenos

Receptores nucleares

• Los receptores de las hormonas tiroideas, retinoides, vitamina D y ecdisona, en ausencia de ligando, se encuentran en el núcleo en sitios específicos de DNA.

Receptor

Mecanismos o Sistemas de transducción

• Sistema de la adenilato ciclasa.

• Sistema de fosfoinositidos-calcio.

• Sistema de la proteína cinasa activada por mitógeno MAPK.

• Sistema de activación de los factores de transcripción STAT.

• Sistema de la esfingomielinasa-ceramida

• Sistema de receptores que funcionan como canales iónicos.

PP

ATP ADP + Pi

H2OPO-4

PK

P

P

P

P

P

TCFTCFSRESREPP

PPPP

TATATATA TRETRE TATATATA

cc--fosfos cc--junjun

PKCPKC

PKAPKA

MEKKMEKK

JNKKJNKK

JNKJNK

HH--RasRas

MEKMEK

RafRaf--11

ααααααααββββββββ

γγγγγγγγAC

AC

αα αααα ααββ ββββ ββ

γγ γγγγ γγPLCPLC

MAPKMAPK

PHPDK1

PKA

Ser473

PKB PH

SGK

S6KDominio

autoinhibitorio

Sitio de reclutamiento ERK

PKCαααα

RSK

Dominio C

Thr308

Src (Yes, Lyn, Blk)Dominio de

cinasa

SH3 SH2 LckSH4

Dominio de

cinasa

SH3 SH2 FynSH4

Interdominio BSH2Syk SH2

Dominio homologo a JAK

JAK1, JAK2,

TYK2, JAK3 Pseudodominio

de cinasa

Dominio de union a integrinas

Dominio de union a paxilina

Fak

Region de union a CD4/CD8

Region de union a CD εεεε,γγγγ,δδδδ/TCRζζζζ

Estabilidad química de los aminoácidos fosforilados

(+) aminoácidos más estables; (-) aminoácidos menos estables

Naturaleza de los aminoácidos

O-Fosfatos + -

Fosfoserina + -

Fosfotreonina + +

Fosfotirosina + +

N-Fosfatos

Fosfoarginina - -

Fosfohistidina - +

Fosfolisina - +

Acil-Fosfatos

Fosfoaspartato - -

Ácido Básico

Estabilidad en:

H--- C — CH2--OH

C —OO -

NH3+

H--- C------------ C-----CH3

C —OO - H

NH3+ OH

H--- C — CH2---

C —OO -

NH3+

---OH

Ser

Tyr

Thr

H--- C — CH2—PO2-

C —OO -

NH3+

3

Fosfoserina

H--- C — CH2---

C —OO -

NH3+

His

N

NH

1 2

34

5

H--- C — CH2---C

C —OO -

NH3+

AspO

O -

H2N—P---O-

O

O -

Fosforamidato

ββββARK

GE

PP

PKA

ββββARK

pH

GRK

PP

Alta afinidadBaja afinidad

Desensibilización

Fosforilación

Resensibilización

Desfosforilación

Internalización

AMPc

Dinamina

AAA

A

A

A

Señales extracelulares

Cinasas y Fosfatasas de proteínas

Fosforilación y defosforilación

Actividad de factores de transcripción

Unión a DNA

Localización celular

Oligomerización Unión a correguladores

Estabilidad proteíca

Estructura de la cromatina

A.

CaM

PP1

PP2B

PP2A

Pro R

39%

49%

Subunidad catalítica (C) Subunidades reguladoras (R)

Inhibidor-1, DARP-32,

inhibidor-2, subunidad de

unión al retículo

sarcoplásmico y glucógeno,

subunidad miofibrilar.

B 19 kDa isoformas αααα y ββββ

-----------------------------------------------------

RC

A

C

B’’

B’

B

B’’’

PR65 αααα, ββββ, γγγγ o δδδδ

PR61 αααα, ββββ, γγγγ, δ δ δ δ o ττττ

PR72, PR130,

PR59 o PR48

PR93/SG2NA

PR110/estrintina

PR65

α α α α o ββββ

PP2Ac

α α α α o ββββ

A

C

B’’

B’

B

B’’’estriatina

SG2NA

Caspasa-3

PTPA

nucleorodoxina

Proteína t intermedia y pequeña del polioma

HSF2

JAK2

CKIIααααCAMK4

FAK1 y 2

Bcl-2

p70s6K

I1PP2A

I2PP2A

Tap42αααα

vimetina

Receptor de TGFββββ

HIV1

adenovirusa

APC Ciclina G

PKR

SRC (Hox)

E4

Paxilina

Cdc6

CG-NAP

P107/Rb

Proteína t pequña SV40

Señales Intracelulares mediadas por Ras

0 7

1

5

6

43

3

4

19

34

89

77 76

83

85

75

39

60

50 41

110103

104

111

117118

61

51

48

47 10

12

14

80

35

18

25

23

24

74

31

46

78

40

72

73

42

52

56

59

95

22

57

62

66

70

93

113

120

94

37

122

112

27

15

30

90

79

97

99

114

119

84

1681

2021

28

26 13

63

36

86

115

96

52

8887

6564

55

98

92 101

106 100 108

107

105

109

69 67 68

49

96

54 58

53

8

2

38

9

110

45

44

17

82

121

33

32

91

116

71

29

102

G16-12 h

S6-8 h

G23-4 h

M 1h

Factores de crecimiento

p15p15

p53

p21p27 TGF 3Rb

E2F

E2FP Rb

ERK

TGF 3

CDK 4, 5

Ciclina D

PCNA

p107&E2F

Ciclina E

CDK2

PCiclina BCdc2MAPK

MPM2K

p107&E2F

Ciclina E

CDK2

Ciclina BCdc2

Ciclina BCdc2

Ciclina HCDK7

Cdc25A

Mik1

Wee1

PP1

Cdc25A

P Ciclina BCdc2

P P

P14-3-3 σ

Cdc2

Ras

Raf

Myc

ARF

MDM2 ARF

CDC25

P P P

PP2A

EGFR

Raf PI3KRal-GDS

14-3-3σσσσ

AKT/PKB

AP1

AC

ARFATM

ATR

BAD

BaxcAMP

Cdc2 CDC25C

cFos

cJun

cMyc

Chk1

R7DTM

PGi PGq

PKC

PLCββββ

DG

Shc

Grb2

Ras

MKK1

ERK PDK

PKA

R7DTM

E2FElk1

GADD45

JNK

MDM2

p21

p300p53

PAK

PML

Rac

Sos

PtdIns(3,4,5)P3MEK JNKKRalRho

PLD1RalBp1

PC PA Cdc42/Rac

G2DDC

DNAPK

Vías de señalización a modelar

• Raf1

• PI3K

• RalGDS

• Ciclo celular

Oligonucleótidos que forman una triple hélice

Oligonucleotidos terapeúticos

• Oligonucleótidos que forman triple hélice

DNA y/o RNA

• Ribozimas RNA

• Antisentido

DNA o RNA

Herramientas Computacionales

Modelos computacionales de sistemas biológicos

Brigthman y Fell, 2000; Bhalla y Iyengar 1999

Activación por EGF y NGF, y su relación con MAPK cinasas. Ca2+, PKC, PKA, CaM y sistema CaMKI

Paralelo distribuido, emergente El comportamiento de las proteínas depende de sus variables fisicoquímicas como la concentración y la afinidad. Los cambios de estas variables se representan con respecto al tiempo continuo, mediante ecuaciones diferenciales.

Modelos continuos

Paton et al., 1995;

Fisher, et al., 2000

González-Pérez et al, 2003.

Señalización intracelular Paralelo distribuido, emergente La célula se considera como una colección de agentes que trabajan en paralelo y se comunican entre ellos a través de mensajes

Sistemas distribuidos (agentes)

Bray, 1990;

Bray y Lay, 1994;

Bray, 1995;

Pritchard y Dufton, 2000;

Paton, 1993

Redes proteicas, señalización intracelular

Paralelo distribuido, emergente Las redes proteicas de señalización se ven como neuronas artificiales. Como una neurona artificial, una proteína recibe un valor de entrada, produce una salida, y un valor de activación

Redes neuronales artificiales

Holcombe, 1994

Doi et al, 2004

Vías metabólicas Secuencial concurrente La célula se considera como gráfico conectado con dos tipos de nodos. Un tipo representa elementos o moléculas de señalización y el otro representa transiciones como la activación

Redes de Petri

Marijuan, 1994;

Levy, 1992; Wurthner et al., 2000

Redes proteicas, señalización intracelular

Paralelo La interacción entre las proteínas se modela como matriz, donde el estado de un elemento de la matriz depende de los estados de los elementos vecinos

Autómatas celulares

Lagunez-Otero, 1998;

Takai- Igarashi y Kaminuma, 1998

Señalización intracelular Paralelo secuencial Las interacciones entre los componentes de las redes de señalización se modelan usando reglas de producción

Sistemas expertos

Kauffman, 1991;

Edwards, 1995;

Karp y Paley, 1994;

Armas et al 2000

Redes genéticas, interacción entre genes

Paralelo Se consideran dos estados para cada gen, y la interacción entre ellos. El estado de cada gen depende de una función booleana particular

Redes booleanas

ReferenciasSistema biológico modeladoForma de procesar la información

Idea relacionada con la aproximación

Aproximación computacional

Kauffman. Redes Booleanas. Redes Genéticas

Takai-Igarashi y Kaminuma. Paraelo secuencial

Marijuan. Autómatas celulares.

Doi. Redes de Petri. Vías metabólicas.

Bray. Redes Neuronales.

Dufton. Redes Neuronales.

Paton y Fisher. Sistemas distribuidos. (Agentes).

Brigthman. Modelos Continuos.

Bhalla. Modelos Continuos.

Herramienta seleccionada

Sistema experto

Sistemas dinámicos

Son aquellos en los cuales el estado del sistema se determina por su estado inicial e influencias externas que lo modifican. El espacio de tiempo en que ocurra esto puede ser continuo, o una secuencia discreta de momentos

Estado 1 Estado 2 Estado Final

∆∆∆∆t1 ∆∆∆∆t2

. . .

Características de los sistemas expertos

• Búsqueda heurística

• Lógica y razonamiento

• Lenguajes y herramientas de programación específicos

• Representación del conocimiento

Nivel 1

Nivel 2

Nivel 3

Nivel 4

Estructura de los sistemas expertos

Módulo deExplicaciones

Interfaz de entrada/ salida

Mecanismo de

inferencia

Base de conocimientos

Memoria de trabajo

Modulo de aprendizaje

Entrada

Salida

Primer Modelo

E N I F F F F F F F F F F F F F F F F

0 0 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1

1 0 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1

3 0 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1

4 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1

37 0 0 1 0 1 0 1 0 1 0 0 1 0 1 0 0 1

27 0 0 0 1 1 0 0 0 0 1 0 0 0 0 1 0 0

26 0 0 0 1 1 1 1 0 0 1 1 1 0 0 1 1 1

28 0 0 0 0 1 0 0 1 1 1 1 1 0 0 0 0 0

9 0 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1

29 0 0 0 0 1 0 0 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1

2 0 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1

5 0 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1

7 0 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1

13 0 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1

8 0 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1

10 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1

12 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1

34 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1

Element Final States

25 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1

24 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1

11 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1

22 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1

40 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1

15 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1

16 1 1 0 0 1 1 0 0 1 1 0 0 1 1 0 0 1 1 0 0 1 1 0 0 1 1 0 0 1 1 0 0 1 1 0 0

6 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1

39 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1

14 1 0 1 1 1 0 1 1 1 0 1 1 1 0 1 1 1 0 1 1 1 0 1 1 1 0 1 1 1 0 1 1 1 0 1 1

19 1 1 0 1 1 1 0 1 1 1 0 1 1 1 0 1 1 1 0 1 1 1 0 1 1 1 0 1 1 1 0 1 1 1 0 1

30 0 0 0 0 1 1 1 1 1 1 1 1 0 0 0 0 1 1 1 1 1 1 1 1 0 0 0 0 1 1 1 1 1 1 1 1

35 0 0 0 0 0 0 0 0 1 1 1 1 0 0 0 0 0 0 0 0 1 1 1 1 0 0 0 0 0 0 0 0 1 1 1 1

21 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1

36 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1

38 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1

18 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1

20 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1

23 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1

26 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1 1

Sistema experto

Proteína

Factor de transcripción

bZipAP1

Resultados experimentales

Triplex

Desnaturalización térmica

Dicroismo circular

Movilidad en gel

AB

C D

Internalización del oligonucleótido

Curva de crecimientolínea celular de cáncer de mama MCF7

µµµµM Adriamicina

s/n

0.5

1

5

10

15DE

NS

IDA

D Ó

PT

ICA

TIEMPO (h)

A B

µµµµg oligo/ml MCs/n

c/a s/o0.0250.05

124

DE

NS

IDA

D Ó

PT

ICA

TIEMPO (h)

B

Índice mitótico relativo

C

G1:69S:9

G2/M:22

M1M2

M3

G1:73S:10

G2/M:17

M1M2

M3

A

8hC/A

8hC/AO

12hC/A

12hC/AO

16hC/A

16hC/AO

8hC/A

8hC/AO

12hC/A

12hC/AO

16hC/A

16hC/AO

Hibridación tipo Westernempleando anti 14-3-3σσσσ

C/A Con adriamicinaC/AO Con adriamicina y oligonucleótido

Genoma FuncionalProcarionte

Cuando se tiene la secuenciacompleta de un genoma, que nos

dice?

Genomica Procarionte: desde 1996 a la fecha

Haemophilus influenzaefue la primerasecuencia bacterianapublicada(1.83Mb),1995.

Bacteria 182 (506)

Archeae20 (27)

Industry ???

Hemophilus

influenzae

Methanococcus

jannaschii

(Archaea)

Leptospira interrogans

(Bacteria)

Lactococcus

lactis (Bacteria)

1. Se tiene la secuencia.

2. Interpretación: de la secuancia de nucleotidos a los genes potenciales y la predicción de la función

3. Comparación de genomas.

4. Vías metabólicas.

Como se obtiene una secuencia?

• Se sub-clona el DNA genómico en plásmidos.

• Las clonas deben ser de 6 a 8 veces el tamaño del genoma, para asegurarse que estetodo.

• Se obtiene la secuencia de cada fragmento.

• Se eliminan repeticiones y se obtiene la secuancia completa.

Procesamiento de datos

Reuniendo todo

Existen diferentes programas que nos permiten leer una secuencia “GCG” de la Universidad de Wisconsin. El Staden originalmente diseñado porRodger Staden y modificado por otros en el Centro Sanger para la investigación genómica. Este últimoes gratis para las institutciones academicas.

Secuencia

*Continuidad

*Discontinuidad

*Uso de PCR

Software que nos permite identificar genes bacterianos

Glimmer: es un sistema que nos permite identificar genes de bacterias, archaea, y virus. Glimmer (Gene Locator and Interpolated Markov Modeler) usa modelos de Markov interpolados (IMMs) para identificar posibles genes (The institute for genomic research, TIGR).

GeneMark: es un programa que tambien utiliza modelos de Markov paraidentificar regiones codificantes y no codificantes (European Bioinformatics group EMBL-EBI).

EasyGene – Permite identificarposibles genes mediante estadisticasignificativa. Creado por Thomas Schou Larsen y Anders Krogh. BMC Bioinformatics 2003, 4:21 (Center for biological sequence analysis).

Predicción de la función genética

De la secuencia de DNA a la secuencia de aminoacidos y a la secuancia proteíca:

Traducción de la secuancia de DNA a la de aminoacidos considerando el uso preferencial de codones. Comparar la proteina obtenida con lasreportadas o almacendas empleando BLAST Basic local alignment tool. National Center for Biotechnology Information, National Library of Medicine, National Institutes of Health, Bethesda, MD 20894.

Interpretación de resultados: claros, probables, indicativos y desconosidos.

Realidad: La función de aproximadamente el 40% de las proteinas bacterianas no se conose.

CluSTr (Clusters of SWISS-PROT y TrEMBL)

http://www.ebi.ac.uk/clustr/

Pfam

Pfam es una gran colección de alineamientos múltiplesmodelos de Markov organizan el familias y dominiosproteícos. Nos permite

*Visualizar alineamientos múltiples.*Ver arquitecturas proteícas.*Examinar distribuciones entre especies. *Interactuar con otras bases de datos. *Ver estructuras de proteinas conocidas.

PRINTS

PRINTS es compendio de huellas de proteínas. Una huella es un grupo de motivos o secuencias conservadasusadas para caracterizar a una familia de proteínas.

ProDom

ProDom es un compendio de familias de dominiosprotéicos generados automaticamente de las bases de secuencias SWISS-PROT y TrEMBL .

Rfam

Rfam es una colección de alineamientosmultiples de secuencias y modelos de covariancia, de familias de RNA no codificante.

Veer y bajar alineamientos multiples de secuencias.

Determinar familias. Examinar distribución de especies en miembros de la familia.

InterProDataflow scheme

ABC transporters en Escherichia coli K-12 M1655

ABC transporters en Pseudomonas aeruginosa

Two-component system - Escherichia coli K-12 MG1655

Two-component system - Bacillus subtilis