UNICEL® DXC 800 V RUTINNÍM PROVOZU TŘÍLETÁ ... 2007-05.pdfinformační magazín číslo 5 - 2007 3 Obsah Automatický analyzátor UniCel® DxC 800 v rutinním provozu 4 Automatický

A U T O M A T I C K Ý A N A L Y Z Á T O R U N I C E L ® D X C 8 0 0 V R U T I N N Í M P R O V O Z U

T Ř Í L E T Á Z K U Š E N O S T S E S M Ě R N I C Í O I V D M D

P R Ů T O K O V Ý C Y T O M E T RC E L L L A B Q U A N T A S C M P L

informační magazín číslo 5 - 2007

i n f o r m a č n í m a g a z í n č í s l o 5 - 2 0 0 72

Akreditace klinických laboratoří v ČR

Jaké jsou možnosti prokazovat kvalitu laboratoří?Řada laboratoří u nás poskytuje kvalitní laboratorní služby včetně konzultační čin-nosti pro zdravotníky i pacienty. Kvalita jednotlivých činností koncem 20. a na počát-ku 21. století se prokazuje posouzením nezávislými experty podle určitých standardů či norem. Ve zdravotnictví obecně se uplatňuje několik přístupů. Jedním z průkazů kvality laboratorního stanovení je úspěšná účast v externím hodnocení kvality. Dále to je systém certifi kace dle ISO 9001, akreditace dle ISO 15189 případně 17025, dále je možná akreditace klinických laboratoří popřípadě celých zdravotnických zařízení systémem JCI standardů, akreditace klinických laboratoří dle CPA standardů (používá se především v UK) nebo CAP v klinických laboratořích. Tyto přístupy jsou meziná-rodní a srovnatelné na celém světě. K nim přistupují systémy s národní platností jako je audit klinických laboratoří prostřednictvím NASKL nebo akreditace zdravotnických zařízení SAK (Sdružená akreditační komise).

Jaký je mezinárodní přístup k akreditaci laboratoří?V zemích EU jsou země, kde je většina laboratoří akreditována (např. skandinávské státy) dle ISO 17025 a které se dle sdělení kolegů ze Švédska zatím nechystají přejít na normu 15189. Jiné země se akreditují dle národních standardů jako například v Holandsku. Ve Velké Británii existují oba způsoby akreditace systémem národního akreditačního orgánu a samostatně stojící organizace pro akreditaci laboratoří, zde však došlo k dohodě o propojení obou systémů. Řada laboratoří je akreditována dle ISO 15189.

Jaká je situace u nás?U nás byly nejprve laboratoře akreditovány dle ISO 17025. Byly to laboratoře zdra-votnických ústavů, následně referenční laboratoře a některá klinická pracoviště. Od zavedení normy ISO 15189 se klinické laboratoře akreditují podle této normy a počet těchto laboratoří postupně stoupá a v současné době jich je asi 30.

Jak může lékař rozpoznat kvalitní laboratoř?Rozlišení laboratoře kvalitní, se kterou by měl lékař či zdravotnické zařízení spolupra-covat, od ostatních se může jevit jako obtížné, avšak lze uvést několik základních kritérií. Jedním ze základních kritérií je schopnost laboratoře poskytovat poraden-skou a konzultační službu pro lékaře s informacemi nejen o spektru svých vyšetření, ale i o ostatních méně častých analýzách. Lékaři by měla laboratoř poskytnout infor-maci, které analyty vyšetřuje a které předává do jiných laboratoří k vyšetření. Lékař, pokud spolupracuje s některou laboratoří řadu let, by měl zvážit, zda mu změna laboratoře, která je někdy nabízena, přinese lepší kvalitu. Klíčovým kritériem je také rychlost provedení vyšetření pro pacienta. Moderní analytická technika umožňuje provést většinu laboratorních vyšetření tentýž den, a tak pacient nemusí čekat třeba

Problematika kvality práce laboratorního komple-mentu a certifi kace a akreditace laboratoří nabý-

vají v poslední době na významu. Položil jsem několik otázek na toto téma našemu přednímu

odborníkovi v oblasti laboratorní medicíny, Prof. MUDr. Tomáši Zimovi, DrSc. MBA, přednostovi

Ústavu klinické biochemie a laboratorní diagnosti-ky 1. LF UK a VFN, děkanovi 1. LF UK a předsedo-

vi České společnosti klinické biochemie.

týden na výsledek. Jedním ze způsobů prokazování kvality práce v laboratoři je postupné zavádění certifi -kace dle normy ISO 9001 a akreditace dle ISO 15189 nebo 17025. Jsou také akreditovány celá zdravotnická zařízení podle mezinárodních standardů.

Jaké myslíte, že jsou základní požadavky na zdravotnické laboratoře? Základní požadavky a kritéria pro laboratoře z hlediska klienta – lékaře, zdravotnického zařízení či pacienta jsou dostupnost a komplexnost služeb, rychlá odezva laboratoře, spolehlivost a správnost výsledků, informo-vanost a konzultace o prováděných činnostech, ale také analýza stížností a reklamací.

Jak pokračujete v zavádění systémů kvality na Vašem Ústavu?Od udělení akreditace dle ISO 17025 v roce 2004 se řada věcí změnila. Při pravidelných dozorových náv-štěvách jsme postupně rozšiřovali počet akreditova-ných metod nejen v klinické biochemii, ale také v séro-logii a molekulární biologii. Začali jsme také s implementací požadavků ISO 15189 do dalších labo-ratoří našeho Ústavu.

Na jaře 2007 nás čeká reakreditace. Při stanovení další strategie v oblasti kvality vycházíme z toho, že laboratoře v Ústavu jsou různého zaměření. Naším cílem je implementovat ISO 15189 do laboratoří klinic-ké mikrobiologie a ATB centra, laboratoří klinické imu-nologie a alergologie a klinicko-biochemické laborato-ře v areálu dětské kliniky na Karlově a tím významně rozšířit počet akreditovaných metod v širokém spektru laboratorní medicíny. V závislosti na typu laboratoře budeme zároveň udržovat akreditaci dle ISO 17025, popř. akreditaci podle obou norem souběžně.

ŠTĚPÁN TINTĚRA

[email protected]

i n f o r m a č n í m a g a z í n č í s l o 5 - 2 0 0 7 3

ObsahAutomatický analyzátor UniCel® DxC 800 v rutinním provozu 4Automatický biochemický analyzátor UniCel® DxC 800 je plně automatizovaný, analyzátor pro in vitro stanovení s kapacitou 1440 testů/hod. Zkušenosti z roč-

ního provozu analyzátorů UniCel® DxC800 v biochemickém úseku OKBHI NNH.

Šetřte svůj čas... 8Nabízíme jednoduché a účelné řešení preanalytické, analytické i postanalytic-ké fáze zpracování vzorků v klinické laboratoři. Analyzátory Beckman Coulter řady UniCel (biochemické a imunochemické analyzátory) používají shodné

kompatibilní stojánky na vzorky.

Vidíte do zkumavky? 8Funkce kontroly kvality a integrity vzorku a polychromatické korekce

analyzátorů UniCel® DxC 600/800

Analýzy bez prostojů 9Předepsaná údržba pro biochemické analyzátory řady UniCel DxC® Beckman

Coulter aneb kolik strávíte času údržbou ve vaší laboratoři.

Tříletá zkušenost se směrnicí o IVD MD 117. prosince 2006 uplynuly tři roky od data, kdy začala být v členských zemích EU a EFTA uplatňována Směrnice 98/79/ES o diagnostických zdravotnických prostředcích in vitro (IVD MD). Stejný stav měl nastat v ČR v den vstupu ČR

do EU 1. května 2004.

Diagnostický a prognostický význam thymidinkinázy (TK) u nádorových onemocnění 12

Průtokový cytometr CELL LAB QUANTA SC MPL 15Průtokové cytometry QUANTA SC MPL jsou určeny pro výzkumné aplikace. Kombinují měření objemu buněk Coulterovou metodou, rozptylu světla (Side Scatter) a fl uorescencí na třech fotonásobičích s použitím více zdrojů světla.

Na měření objemu nemá vliv tvar, barva a optické vlastnosti částic.

Stanovení základních biologických charakteristik v laboratoři tkáňových kultur 18Buňka je základní strukturní a funkční jednotkou živé hmoty – hovoříme o tzv. buněčném principu organizace živých systémů. Každá buňka tak představuje hmotný, konečný, otevřený a hierarchicky uspořádaný systém, který je vysoce adaptivní, schopný autoregulace a autoreprodukce

Immunotech a.s. Beckman Coulter a jeho sponzorská činnost 22

Pozvánky na akce 23Pozvánka na přehlídku nabídky přístrojů fi rmy Beckman Coulter, Inspekce rotorů

do ultracentrifug a vysokovýkonných centrifug, Seminář DNA analýza IV

Kde se můžeme setkat (březen – červen 2007) 24

Konference/seminář s účastí společnosti Immunotech, a.s. formou stánku

Časopis vydává a distribuujeIMMUNOTECH a.s., Radiová 1, 102 27 Praha 10

Časopis připravujíMgr. Jiří Moos, CSc.Mgr. Pavel KružíkMgr. Patrik ŠafRNDr. Helena KurzweilováRNDr. Běla Říčařová, CSc.Ing. Petr SuchanMgr. Markéta KrupařováIng. Roman Šandrik, PhD.Ing. Kateřina ŤukováIng. Lukáš Palivec, PhD.

Do časopisu přispěliProf. MUDr. Tomáš Zima, DrSc. MBA, VFNRNDr. Štěpán TintěraIng. Ladislava Dubská, Nemocnice Na HomolceIng. Miroslav BischofIng. Petr ŠmídlProf. MUDr. Ondřej Topolčan, CSc., FN PlzeňMgr. Pavel KružíkMUDr. Tomáš Soukup, LF UK Hradec KrálovéMgr. Jiří Moos, CSc.Ing. Roman VlčekRNDr. Helena KurzweilováMgr. Hana MachováMgr. Markéta KrupařováIng. Petr Suchan - titulní foto

Grafi cká podobaNina Nováková

TiskárnaREPRO servis s. r. o.Starochuchelská 15/195, 159 00 Praha 5

Náklad čísla1400 výtisků

ÚvodAutomatický biochemický analyzátor UniCel® DxC 800 (obr. 1) je plně automati-zovaný analyzátor pro in vitro stanovení s kapacitou 1440 testů/hod. Na bioche-mický úsek OKBHI NNH byl tento analyzátor nainstalován v prosinci 2005, v led-nu 2006 následovala instalace druhého, stejného typu analyzátoru. Na analyzátorech se denně zpracovává v rutinním provozu cca 450-500 vzorků sér nebo plasem, cca 100 vzorků močí a asi 10-15 vzorků mozkomíšních moků, dal-ších 60-80 vzorků se zpracovává v odpolední a noční pohotovostní službě. Obslu-hu každého analyzátoru zajišťuje během řádné pracovní doby 1 laborantka.

Popis analyzátoruAnalyzátor se skládá z následujících částí: sektor pro manipulaci se vzorky, MC část (Modular Chemistry), CC část (Cartridge Chemistry), reakční karusel, dvo-jitý reagenční karusel a řídící PC.

Sektor pro manipulaci se vzorkyVzorky jsou do analyzátoru vsunovány ve vzorkových sektorech se čtyřmi pozicemi pro zkumavky, příp. kepíky. Vstupní pás je lineární, má prostor pro 25 stojánků a lze jej napojit na preanalytickou linku. Analyzátor může být vybaven propichovačem uzavře-ných zkumavek. Samozřejmou výbavou je čtečka čárových kódů pro načítání sektorů, práci s primárními zkumavkami a čtení čárového kódu na pozadí. V sektorech jsou vzorky vsunuty pomocí podavače do vzor-kového karuselu. Vzorkový karusel má deset pozic, z toho dvě pro statimové vzorky. Cel-

Automatický analyzátor UniCel® DxC 800 v rutinním

provozu

kem tedy může být najednou v analyzátoru 40 vzorků. Ze vzorkového karuselu jsou vzorky pipeto-vány do MC a CC části dvěma pipetory. Každý z nich je opatřen detektorem sraženin. Ihned po napipe-tování vzorku jsou sektory vysunuty do prostoru, odkud je lze vyjmout.

MC část (Modular Chemistry)V této části se provádějí rychlá statimová stanovení analytů na elektrodách nebo fotometricky (obr. 2). MC část umožňuje stanovení Na, K, Cl, Ca (ISE) (obr. 3), glukózy (kyslíkový senzor), albuminu (BCP), cel-kové bílkoviny (biuret), močoviny (vodivostní elda), fosforu (fosfomolybdátová metoda) a kreatininu (alkalický pikrát). Reagenční roztoky jsou dodávány ve dvoulitrových kanystrech, opatřených čárovým kódem, v kterém je zakódován název, šarže a objem (obr. 4). K měření elektrolytů se vzorek ředí pufrem. Elektrody pro měření draslíku, chloridů a vápníku jsou opatřeny výměnnými špičkami, které se v odpovídajících periodách jednoduchým způso-bem vymění a jakákoliv jejich další údržba (brouše-ní, leštění apod.) odpadá. Na základě naší roční zkušenosti lze konstatovat, že životnost jednotli-vých membrán je významně delší, než jakou garan-tuje výrobce. Dalším prvkem, který je v MC části určen k pravidelné obměně, je glukózový senzor. V podmínkách naší laboratoře byla životnost sen-zoru 8 měsíců.

Výsledky měření na MC části jsou k dispozici do 42 sec, pokud je analyzátor v chodu, pokud startu-je ze standby, pak jsou výsledky z této části změře-ny do 2 minut.

CC část (Cartridge Chemistry) (obr. 5)V této části analyzátoru probíhají fotometrická měření. Reagencie pro tuto část analyzátoru jsou

Obr. 1: UniCel® DxC 800, Beckman Coulter

Obr. 2: MC část (Modular Chemistry)


dodávány v reagenčních zásobnících, roz-dělených vnitřními přepážkami na tři oddělené prostory. Zásobníky jsou uchová-vány v dvojitém reagenčním karuselu s kapacitou 59 pozic (obr. 6). Reagenční karusel je chlazen na 2 – 8 °C. Ve vstupní části karuselu jsou umístěny dvě čtečky čárových kódů, každá z nich je určena pro jedno patro karuselu. Z čárového kódu je, podobně jako u MC roztoků, načten název a šarže reagencií. Počet testů je upřesněn po kontrole hladiny roztoků pomocí senzorů na reagenčních pipetorech. Vzhle-dem k tomu, že analyzátor je zcela otevřený sys-tém, lze používat i reagencie uživatelské (UDR). Tyto reagencie je třeba zadávat manuálně z kláves-nice řídícího PC. Z reagenčního karuselu jsou roz-toky pipetovány do kyvet reakčního karuselu pomocí dvou reagenčních jehel. Reakční karusel obsahuje 125 skleněných kyvet s optickou dráhou paprsku 0,5 cm a výškou 30 mm. Po každém pří-davku reagencie nebo vzorku do kyvety je obsah

kyvety promíchán vysokorychlostním zlaceným rotačním míchadlem. Mícha-dla jsou poté omyta a osušena v přísluš-né mycí cele. Reagenční jehly mají své mycí stanice umístěny přímo na konci pipetorů a proces mytí probíhá během pohybu jehly. Zdvojené reagenční jehly a časově úsporný způsob mytí umožnily zkrátit takt analyzátoru na 8 sekund.

Fotometr se skládá z xenonové pulzní lampy, silikon-diodového pole, mono-chromátoru a příslušné elektroniky. Jako doplňkový modul lze požadovat také modul NIPIA pro imunochemická sta-novení.

Promývací stanice kyvet se skládá ze čtyř jehel, zvedacího zařízení a pří-slušných hadiček. Mycí stanice odsává obsah kyvet po reakci, provádí pro-plach mycím roztokem a destilovanou vodou a nakonec setření vnitřního povrchu kyvet stírátkem. Pryžové stírátko je třeba pravidelně kontrolovat, při opotřebování je nutná výměna. Na našem pracovišti jej měníme přibližně v intervalu 4 týdnů.

Ovládací prvky analyzátoruAnalyzátor se ovládá prostřednictvím ovládacích tlačítek (RUN, STOP, PRIO-RITY), základní provozní funkce jsou řízeny prostřednictvím dotykové obra-zovky, lze používat i klávesnici a myš.

Software analyzátoru Software je velice logický, přehledný a snadno pochopitelný. Hlavní obslužná obrazovka informuje nejen o aktuálním stavu systému (STANDBY, RUNNING, STOPPED aj.) ale např. i o komunikační aktivitě mezi analyzátorem a LIS. Zobrazuje obsazenost analyzátoru sektory, včetně pře-hledu vzorků a fáze jejich zpracování. Podrobná informace o požadovaných testech u jednotlivých vzorků se zobrazí po kliknutí na příslušný vzorek. V horní části obrazovky je řada ikon, z kterých vycházejí provozní a progra-

Na základě naší roční zkušenosti lze konstatovat, že životnost jednotli-vých membrán je významně delší, než jakou garantuje výrobce.

Obr. 3: ISE modul

Obr. 4: Zásobní roztoky pro MC část

Obr. 5: CC část (Cartridge Chemistry)

Obr. 6: Dvojitý reagenční karusel


movací funkce: programování vzorku, databáze výsledků, přehled reagencií, databáze kontrol, systém setup, údržba, pokyny a nápověda.Programování vzorků - optimálním řešením je zpracovávání primárních zkumavek s čárovým kódem, napojení analyzátoru na LIS a obousměrný pře-nos dat. Napojení s laboratorním informačním systémem INFOLAB (ing. Paclt a Mgr. Stávek) je zcela bezproblémové. Manuální programování vyžaduje zadání stojánku a pozice, ID vzorku, typ vzorku a výběr požadovaných testů. Je třeba upozornit na to, že posun kurzoru mezi jednotlivými aktivními poli lze realizovat pomocí myši nebo tabelátorem, nelze použít ENTER. Ze stejné obrazovky, ze které se programují vzorky, lze manuálně programovat i prove-dení kontrol, pokud pro ně nepoužíváme čárové kódy. Software na této obra-zovce umožňuje dále zadat: RERUN (opakování měření všech nebo vybraných testů), CLEAR (smazání sektoru, pozice či vzorku), OPTION (např. zadání ruč-ního ředění, umožňuje modifi kovat počet opakování vzorku), BATCH (progra-mování vzorků v dávkách), přehled naprogramovaných vzorků aj.Databáze výsledků – umožňuje vyhledat, zobrazit a tisknout pacientské a kontrolní výsledky dle zvoleného kritéria. V paměti systému může být ucho-váno max. 150 000 výsledků. Po naplnění této kapacity začíná systém chro-nologicky přepisovat nejstarší výsledky. V této databázi lze také vyvolat k výsledkům odpovídající graf absorbance v závislosti na čase (ABS). To je vhodná pomůcka při odstraňování problémů u dokončených výsledků metod. Systém setup (nastavení systému) – zahrnuje 29 funkcí nastavení systému. Mnohé z nich se nastavují jen jednou, při instalaci systému (např. datum/čas, jazyk, alarm, výběr jednotek u originálních metod, nastavení čárového kódu, komunikace s LIS aj.), nebo se jejich nastave-ní nemusí vůbec provést (např. zadání hesla, kterým je možno chránit některé funkce analyzá-toru). S některými z nich se prů-běžně pracuje, mění se a dopl-ňují (např. konfi gurace nabídky metod, nastavení panelů, vytvo-ření programu pro uživatelské reagencie, nastavení referenč-ních/kritických rozsahů u metod aj.). Přehled reagencií (vkládání/kalibrace) - v této části menu je přehled všech reagencií, které jsou vloženy v analyzátoru. Pro reagencie v MC části jsou v pře-hledu uvedena v % množství roztoků, která v kanystrech zbý-vají, dále pak informace o době, po kterou je reagencie v analy-zátoru a kalibrační status. Pořa-

dí metod v této části přehledu je fi xní. Na dalších obrazovkách je přehled zásobníků v CC části, u každého zásobníku je uveden aktuální počet zbý-vajících testů, exspirace a kalibrační status. Tuto část inventury lze uspořádat podle požadavků uživatele, a to podle pořadí v karuselu, podle počtu zbývajících testů, podle doby exspirace reagencie nebo kalibrace. V naší laboratoři používáme setří-dění podle abecedy, neboť využíváme možnosti naplnit do analyzátoru více zásobníků pro jednu metodu a v abecedním seznamu je pak velmi pře-hledné, kolik testů pro danou metodu máme aktu-álně připraveno (obr. 7). Z této obrazovky se také aktivuje vkládání nového zásobníku a kalibrace metod. Velkou výhodou je, že vkládání dalších zásobníků lze provádět za chodu analyzátoru. S MC reagenciemi jsou spojeny i další roztoky: odpěňo-vací No Foam a koncentrát mycího roztoku Wash Concentrate Buffer II (příp. mazivo pro propicho-vač uzavřených zkumavek) (obr. 8).

Kalibrace: u kalibrátorů na bázi séra je nutné vložení kalibrační diskety. Pro kalibraci reagencie je třeba přiřadit kalibrátoru číslo stojánku/pozici nebo jeho ID. U uživatelských metod musíme pro kalibrátory vyčlenit příslušný počet pozic v sekto-rech. Kalibrace uživatelských metod, na rozdíl od originálních metod, nelze sdružovat, přestože je použit jeden kalibrátor. Pro kalibraci metod stano-vení enzymů dle IFCC je k dispozici Enzyme Vali-dator. Kontrola jakosti – QC menu umožňuje nadefi -novat 1-100 kontrolních materiálů názvem

Obr. 7: Inventura reagencií CC části

Kontrolní vzorek může být v ana-lyzátoru zpracován po manuálním zadání na sektor/pozici a po výběru testů, nebo automaticky, pokud jsou kontrolní materiály označeny čáro-vým kódem.


a šarží. Pro každou metodu se zadává cílová hod-nota a směrodatná odchylka. Pro jeden kontrolní materiál je možné konfi gurovat max. 175 metod. Frekvenci provádění kontrolních měření si určuje uživatel dle vlastního systému řízení kvality zavedeného v laboratoři. Hodnoty měření kont-rolních materiálů jsou ukládány v databázi ana-lyzátoru a lze je presentovat v podobě numeric-kého přehledu i v grafi cké podobě (obr. 9). V sumárním přehledu jsou také uvedeny základní statistické parametry (počet měření, průměr, směrodatná odchylka, variační koefi cient). Kont-rolní vzorek může být v analyzátoru zpracován po manuálním zadání na sektor/pozici a po výbě-ru testů, nebo automaticky, pokud jsou kontrolní materiály označeny čárovým kódem. Pro zpraco-vání kontrolních vzorků označených čárovým kódem je třeba aktivovat funkci Auto Generation of Control. Při aktivaci této funkce lze také akti-vovat funkci Multiple Cartridge. Pokud je tato funkce aktivována, provádí se kontrolní měření ze všech zásobníků, které jsou v daném okamžiku v analyzátoru umístěny. V opačném případě pro-bíhá kontrolní měření u metod, které mají osaze-no více zásobníků, jen ze zásobníku, který byl vložen dříve.

Uživatelsky defi novaná metodaAnalyzátor UniCel® DxC 800 je otevřený systém, v software (sys-tem setup) lze defi novat až 100 uživatelských metod pro metodi-ky endpoint, kinetické, metody kalibrovatelné i metody nevy-žadující kalibraci. Je třeba nasta-vit následující parametry:■ název metody (max. 4 alfanu-

merické znaky)■ typ reakce (endpoint, kinetika)■ jednotky, přesnost, směr reakce,

matematický model (lineární, nelineární)

■ primární vlnová délka (výběr z 10 vlnových délek: 340, 380, 410, 470, 520, 560, 600, 650, 670 nebo 700 nm)

■ sekundární vlnová délka (výběr ze stejných vlnových délek)■ počet kalibrátorů (0-6), hodnoty kalibrátorů, doba platnosti kalibrace■ reagenční objemy (celkem 200-327 ul) (dávkování reagencií: čas přidání

vzorku: 0, primární pipetování reagencie: -180 sec, pipetování druhé rea-gencie: lze od -180 do 738 sec, reálně jsou reagencie pipetovány v 8 sec intervalech, dávkování třetí reagencie: -172,9 až 738 sec

■ objem vzorku (3-40 ul)■ časy odečtu pro blank (start:-180 až 1704 s, konec: 180-1720 s)■ časy odečtu pro reakci (start:1 až 1704 s, konec: 9 až 1720 s)■ použitelná rozmezí výsledků■ chybové detekční limity

ÚdržbaV software analyzátoru je instalován elektronický deník údržby. Je to vhodná pomůcka pro sledování toho, jaká údržba má být provedena, kdy je nutné ji provést, a zároveň lze zaznamenat, kým byla údržba provedena. Intervaly prováděné údržby jsou stanovené pro analyzátor, na kterém se zpracuje cca 400 vzorků denně. Údržba je plánována v následujících intervalech: každý týden, měsíc, dva měsíce, tři měsíce, čtyři měsíce, šest měsíců.

Velmi se nám osvědčilo skutečně pravidelnou údržbu provádět. Rozhodně poctivé provádění týdenní, měsíční a dvouměsíční údržby je doporučeníhod-né. Výměnu špičky u vápníkové a draslíkové elektrody provádíme dle potřeby. Také výměna glukózového senzoru je prováděna ad hoc.

ZávěrNa základě zkušeností z ročního provozu analyzátorů Uni®Cel DxC 800 v bio-chemickém úseku OKBHI NNH můžeme konstatovat, že se jedná o velice vydařený produkt fi rmy Beckman Coulter, spolehlivé, robustní a výkonné zařízení, které si pro snadnou obsluhovatelnost a programovatelnost získalo oblibu nejen u laborantek, ale i u provozních chemiků v naší laboratoři. Dodávky reagencií od fi rmy Immunotech a.s. jsou řešeny obratem, také ser-visní podpora je na výborné úrovni.

ING. LADISLAVA DUBSKÁ,

OKBHI-NEMOCNICE NA HOMOLCE,

ROENTGENOVA 2, 150 30 PRAHA 5,

E-MAIL: [email protected],

FOTO: VLADIMÍR STUDNIČKA, NNH

Obr. 8: Systémové roztoky

Obr. 9: Grafi cké znázornění QC


abízíme jednoduché a účelné řešení preanalytické, analytické i postanalytické fáze zpracování vzorků v klinické laboratoři. Analyzá-tory Beckman Coulter řady UniCel® (biochemické a imunochemické

analyzátory) používají shodné kompatibilní stojánky na vzorky (obr. 1). Do těchto stojánků lze současně vkládat primární i sekundární zkumav-ky a různý typ materiálu (sérum, plasma, moč, likvor). Biochemické

a imunochemické vzorky se vkládají do stojánků přímo bez třídění. Sto-jánky se vzorky se následně centrifugují v centrifuze SPINCHRON DLX. Odpadá ruční manipulace se zkumavkami před a po centrifugaci. Vzorky ve stojánku se po centrifugaci přímo vkládají do imunochemického analyzátoru UniCel® DxI 800. Po aspiraci příslušných objemů se stojánky se zkumavkami, které jsou uvol-něny z imunochemického analyzátoru, vloží přímo do biochemického analyzáto-ru UniCel® DxC. Doba zádrže vzorků v jednotlivých analyzátorech je minimální. Imunochemický analyzátor UniCel® DxI 800 uvolní stojánek se 4 zkumavkami

do 2 minut, biochemický analyzátor uvolní stojánek po 10 minutách. Biochemický analyzátor UniCel® DxC může být vybaven automatizovaným propichováním uzávěrů (Obr. 2). Odpadá manuální odstranění zátek u statimových i rutinních vzorků.

Analyzátory Beckman Coulter lze napojit na řídící SW DataManagement REMISOL 2000, který komunikuje s LIS/NIS jen jedním napojením. Sys-tém umožňuje aktivně sledovat vzo-rek v reálném čase, vyhodnocovat kontrolní vzorky, provádět autovalida-ci výsledků podle analytických a lékař-ských kritérií a další řadu funkcí.

Redukuje se pracnost, šetří se čas a zvyšuje se kvalita vydávaných výsled-ků a bezpečnost práce. Snižuje se cel-kový čas TAT.

MIROSLAV BISCHOF

[email protected]

Šetřte svůj čas..

Každý vzorek při zapnutí této funkce je automa-ticky analyzován za účelem zjištění hemolýzy, ik-terických vzorků a lipémie. V protokolu výsledku jsou zahrnuty numerické hodnoty (indexy) pro relativní koncentrace (rozsahy) uvedených inter-ferencí. Hodnoty jsou automaticky odesílány pří-mo do LIS či do SW DataManagement REMISOL 2000, kde lze nastavit pravidla pro další analytic-ké či lékařské automatické hodnocení (autovali-daci) výsledků. Hodnoty se tisknou v pacientském protokolu pod oblastí pro speciální výpočty. Funk-ce Auto Serum Index slouží pro účely posouzení integrity vzorku; hodnoty nemají diagnostický význam.

Pro měření se používá reagencie DIL1, která je v analyzátoru a vkládá se jako ostatní reagencie. Analyzátor změří vzorek s reagencií při 5 různých vlnových délkách 340, 410, 470, 600 a 670 nano-metrů a vyhodnotí automaticky příslušný index pro hemolýzu (hemoglobin), ikteritu (bilirubin) a lipémii.

Vzorky jsou shodné jako pro rutinní stanovení. Doporučuje se čerstvé sérum nebo plasma, které je odděleno co nejdříve od červených krvinek. Doporučený limit je do dvou hodin. Oddělené sérum nebo plasma se nemá skladovat déle než 8 hodin při teplotě +15 °C až +30 °C. Pokud nejsou měření provedena do 8 hodin, sérum nebo plasma se může skladovat při teplotě +2 °C až +8 °C. Pokud nejsou měření provedena do 48 hodin nebo

Funkce kontroly kvality a integrity vzorku a poly-chromatické korekce analy-zátorů UniCel® DxC 600/800

Vidíte do zkumavky?

Funkce kontroly kva-lity a integrity vzorku umožňuje obsluze pra-covat s primárními či sekundárním zkumav-kami v plně automati-zovaném režimu, bez nutnosti manuálnívizuální kontroly.Obr. 2

Obr. 1


budou vzorky skladovány déle než 48 hodin, musí být vzorky zamraženy a uchovány při -15°C až -20°C. Zamražené vzorky se mohou po rozmražení analyzovat jen jednou.

Polychromatické korekceSystém dále provádí automatickou polychroma-tickou korekci pro eliminaci vlivu analyzátoru, vzorku (př. interference), reagencie, chromoforu. Používá měření absorbance chromoforu při více vlnových délkách.

ShrnutíFunkce kontroly kvality a integrity vzorku umož-ňuje obsluze pracovat s primárními či sekundár-ním zkumavkami značenými čárovým kódem/bez kódů v plně automatizovaném režimu, bez nut-nosti manuální vizuální kontroly stavu kvality séra či plasmy a zcela eliminovat subjektivní hod-nocení obsluhou. Snižují se tím náklady, šetří se čas, neopakují se měření, minimalizuje se mož-nost vydání výsledků ovlivněných jednotlivými interferencemi. Způsob zpracování vzorků je standardizovaný a poskytuje vždy stejně kvalitní výsledky.

MIROSLAV BISCHOF

[email protected]

Údržba jakéhokoli biochemického analyzátoru je nezbytná pro zajištění stálé při-pravenosti systému pro optimální měření a provoz a redukuje tím zároveň i ser-visní zásahy. Každý výrobce doporučuje optimální postupy údržby a jejich frek-venci tak, aby zajistil nejvyšší kvalitu měření a stálou připravenost systému pro měření. Každá údržba vyžaduje svůj čas a příslušný zásah obsluhy. Četnost údržby dále závisí na vytíženosti systému v čase a počtu zpracovávaných vzorků.

Všechny analyzátory Beckman Coulter jsou vyvíjeny pro zjednodušení a minimalizaci údržby a zvyšují produktivitu a automatizaci celého laborator-ního procesu zpracování vzorku. Analyzátory Beckman Coulter UniCel® DxC vyžadují minimální údržbu a jejich design byl navržen pro maximální komfort obsluhy. Byl také zohledněn požadavek na minimální čas pro zajištění správné funkce a udržení funkčnosti systémů při plném zatížení v klinickém provozu. Ovládací software je navržen tak, aby automaticky sledoval a vyhodnocoval jednotlivé kroky údržby.

Uvádíme specifi cké frekvence údržby a průměrný čas potřebný pro každou údržbu analyzátorů UniCel® DxC 600 a 800. Frekvence je odvozena od průměr-ného zpracování 400 vzorků za jeden den. V tabulce je uvedeno množství času, které stráví obsluha při provádění údržby. Všechny uváděné hodnoty jsou v minutách a vteřinách.

Denní údržba Není požadována.

Předepsaná údržba pro biochemické analyzá-tory řady UniCel® DxC Beckman Coulter aneb kolik strávíte času údržbou ve vaší laboratoři.

Analýzy bez prostojů

Údržba 1 x za týden DxC 600 DxC 800

Kontrola reagenčních tras 0:25 0:25

Výměna stírátka kyvet 1:20 1:20

Čištění modulu ALBm a TPm - 3:30

Čištění povrchu dávkovacích jehel 2:20 2:20

Čištění průtokové cely a modulů 1:20 1:20

Čištění dávkovací jehly CC (čas do tisku protokolu)

0:30 0:30

Kontrola chloridové kalibrační hodnoty SPAN

0:40 0:40

Celkový čas údržby 1 x za týden 6:35 10:05

Týdenní údržba

Systém monitoruje provádění údržby (kdo, kdy, historii) a zobra-zuje dobu do další údržby či počet vzorků, které lze analyzovat do další údržby.


Údržba každé dva měsíce

Procedura DxC 600 DxC 800

Výměna ostří propichovadla zátek (jen s CTS fcí) *

6:00 6:00

Kontrola/výměna vzduchových fi ltrů 1:30 1:30

Celkový čas procedur každé 2 měsíce 7:30 7:30

* Jen pro analyzátory verze PRO vybavené funkcí propichování uzávěrů zkumavek (Close Tube Sampling).

Neměníme lampu u fotometru. Garantujeme životnost minimálně 5 let.

ShrnutíUvedené údaje prokazují reálnou úsporu času nutnou pro údržbu a připrave-nost analyzátorů řady Unicel® DxC. Výrazně se snížil čas na údržbu a přípravu systému pro provoz a reálný „postkalibrační čas“. Denní údržba se zcela zrušila. Potřebný čas na týdenní údržbu se zredukoval na 6 minut 35 vteřin u analyzá-toru DxC® 600 a 10 minut 5 vteřin u analyzátoru DxC® 800.

Část údržeb je plně automatizována. Systém monitoruje provádění údržby (kdo, kdy, historii) a zobrazuje dobu do další údržby či počet vzorků, které lze analyzovat do další údržby.

Snížily se předvším nároky na zaškolení a připravenost obsluhy. To vše přiná-ší snížení nákladů, snížení prostojů analyzátorů a obsluhy a celkové snížení TAT laboratoře.

Nečekáte na výsledky. Měříte, kdy potřebujete.MIROSLAV BISCHOF

[email protected]


KAŽDÉ TŘI MĚSÍCE

Výměna injekčního pístu 5:30 5:30

Celkový čas procedur každé tři měsíce 5:30 5:30

KAŽDÉ ČTYŘI MĚSÍCE

Vyčištění reagenčních tras MC modulu 8:00 24:50

Celkový čas procedur každé čtyři měsíce 8:00 24:50

KAŽDÝCH ŠEST MĚSÍCŮ

Výměna špičky CALC elektrody 5:30 5:30

Výměna špičky K elektrody 5:30 5:30

Výměna AccuSense™ Glucose Oxygen sensoru

5:10 5:10

Celkový čas procedur každých šest měsíců 16:10 16:10

Periodická údržba


Čištění měřících modulů (MC) 3:35 3:55

Čištění elektrody BUNm - 6:20

Čištění mixérů 0:30 0:30

Kalibrace lamp modulů a senzorů 0:10 0:10

Celkový čas měsíční údržby 4:15 10:55

Měsíční údržba

www.beckman.cz

Partnerklinických

laboratoří


7. prosince 2006 uplynuly tři roky od data, kdy začala být v členských zemích EU a EF-TA uplatňována Směrnice 98/79/ES o dia-gnostických zdravotnických prostředcích in vitro (IVD MD). Stejný stav měl nastat v ČR v den vstupu ČR do EU 1. května 2004.

Tříletá zkušenost se směrnicí o IVD MD

e skutečnosti k tomu došlo s nepa-trným zpožděním 7. července 2004

ve formě nařízení vlády č. 453/2004 Sb. Je nemalou zásluhou tehdejšího

předsedy asociace CZEDMA a vedoucího pracovníka Immunotech a.s., že díky jeho

expertní spolupráci s legislativním odborem MzČR při tvorbě české transpozice máme k dis-pozici právní předpis bez závažných omylů, chyb a nejasností.

Řada uživatelů IVD MD očekávala, že výrobky označené CE budou, podobně jako Tornádo Lou z Limonádového Joe, „jiné, lepší!“. Byli pak do jisté míry zklamáni, neboť tomu tak na první pohled nebylo. Jaká ovšem byla a je skutečnost? Zůsta-neme-li u literární nadsázky, pak tyto výrobky, řečeno Cyranem, „uvnitř tají elegance květ“. Co je tím míněno? Aby mohl výrobce prohlásit výrobek za shodný, musí splnit řadu podmínek daných Směrnicí, jako jsou:■ aplikace relevantních harmonizovaných norem,■ vypracování přesně defi novaného souboru

technické dokumentace, návaznosti na mezi-národně uznávané referenční materiály nebo referenční metody, označování výrobků,

■ poskytování přesně stanovených informací uživateli

■ a jedna z nejdůležitějších podmínek - ověření funkční účinnosti výrobku.

V neposlední řadě Směrnice ukládá výrobcům zavést a udržovat systém úplné poprodejní sle-dovatelnosti výrobků a zavádí dozor nad kvalitou IVD MD a bezpečností jejich používání. V rámci tohoto dozoru je výrobce povinen informovat uživatele, a v řadě případů i státní orgány dozoru v zemích EU a EF-TA, o rizicích nežádoucích příhod spojených s použitím určitého IVD MD, o přijatých nápravných opat-řeních a o jejich výsledcích.

Nejdůležitější změnou kvality v případě shodného IVD MD je však skutečnost, že Směrnice jas-ně stanoví, že výrobce přebírá plnou odpovědnost za správnou funkci IVD MD, dodržel-li uživatel pokyny výrobce k jeho skladování a použití.

Proč je stále třeba, více než tři roky po uvedení Směrnice v život, hovořit o omylech s ní spojených? Jedná se zejména o některé, stále se opakující požadavky uživatelů

ohledně dokumentace poskytované výrobci. Velmi často jsou vyžadovány dokumenty, které v rámci platné legislativy vůbec neexistují – certifi kát (značky) Nepotvrzení o značce CE, prohlášení o tom, že výrobky splňují předpisy pro použití při poskytování zdravotní péče apod. Žádný takový dokument není Směrnicí ani NV 453 defi nován. Navíc Směrnice nezná pojem distributor, nýbrž pouze výrobce a jeho oprávněný zástupce v případě, že sídlo výrobce není v jednom ze členských států EU. Pokud tedy není distri-butor výslovně oprávněn výrobcem jednat jeho jménem v určitých legisla-tivních záležitostech, má jakékoli potvrzení distributora o IVD MD z hlediska našeho právního řádu pro uživatele pochybnou validitu. Z tohoto důvodu je Immunotech a.s. společností Beckman Coulter, Inc. zmocněn jednat v ČR ve smyslu našeho právního řádu jejím jménem.

Dalším zdrojem nedorozumění je vyžadování prohlášení o shodě, někdy dokonce v ověřeném překladu. Směrnice i NV 453 stanoví, že posoudil-li výrobce kladně shodu IVD MD s podmínkami Směrnice, je povinen vystavit ES prohlášení o shodě (EC Declaration of Conformity).

Prohlášení o shodě je interní dokument výrobce, který není určen k uživa-telům. Výrobce je povinen jej předložit pouze státním orgánům dozoru a/nebo notifi kovaným osobám, a to nikoli automaticky, nýbrž pouze na vyžádání v odůvodněných případech. Dále je stanoveno, že se toto prohlá-šení vystavuje v jednom z úředních jazyků některého členského státu EU.

Metodický pokyn SÚKL ZP-19 z 1. října 2004 jasně stanoví, že prohlášení o shodě není dokumentem, který by měl mít poskytovatel zdravotní péče

v držení, a dále že dokladem shodnosti výrobku je pro poskytovatele značka shody CE.

Dalším občas prezentovaným „mýtem“ je hledání a nalézání vazeb mezi Směrnicí a některými harmoni-zovanými normami, zejména normou pro akreditaci laboratoří – ISO EN 15189 a normou pro poskytované EHK – ISO EN 14136.

Ve skutečnosti zde žádná přímá ani mandatorní vazba neexistuje a ani existovat nemůže. Směrnice je právní předpis, který je prostě pro výrobce závazný a tím pádem jsou pro výrobce závazné všechny harmonizované nor-my, které jsou na jeho činnost apliko-vatelné.

Naproti tomu laboratoř, která se neřídí normou ISO EN 15189, může zcela legálně působit v rámci poskyto-vání zdravotní péče. Tím není samo-


zřejmě řečeno, že „zákazníci“ a/nebo plátci nemohou dát přednost laborato-ři, která je nějakým průkazným způsobem akreditována nebo certifi kována.

Směrnice se nevztahuje ani na poskytovatele EHK, i když se o EHK zmiňu-je v tom smyslu, že výsledky EHK přispívají k poprodejnímu sledování IVD MD, což znamená, že jsou jedním ze zdrojů dat pro výrobce. Rozhodně však není EHK nástrojem či prostředkem dozoru nad kvalitou IVD MD. Tato role je legislativně vymezena pouze příslušným statním orgánům a notifi kovaným osobám.

Směrnice stanoví, že materiály (vzorky) používané v EHK nejsou IVD MD, z čehož přímo vyplývá, že nemohou být používány pro kontrolu kvality IVD MD. Je to důsledkem toho, že v jiné části Směrnice se uvádí, že materiály pro kontrolu kvality IVD MD musí být rovněž IVD MD a musí mít značku CE. Míní se tím ty materiály pro kontrolu (kontrolní vzorky), které poskytuje uživate-lům jako součást soupravy sám výrobce IVD (pak se na ně vztahuje značka CE soupravy) nebo materiály pro kontrolu jakosti daného IVD (nebo určité, přes-ně specifi kované skupiny IVD MD), které jako takové byly vyrobeny a označe-ny. Výrobce takovýchto materiálů musí v informaci pro uživatele uvést, pro jaké, naprosto konkrétní a jasně specifi kované výrobky je takovýto kontrolní materiál určen a ručí za to, že s těmito IVD MD správně funguje. Je tedy zřejmé, že běžné materiály pro EHK nemohou být používány pro kontrolu kvality IVD MD (zejména správnosti a návaznosti), což také není jejich účel. To je možné pouze v těch případech, kdy výrobce takovéhoto kontrolního materiálu deklaruje, pro jaké systémy (IVD MD) je určen, ověří jeho funkční

způsobilost pro tento účel, vystaví ES prohlášení o shodě a označí svůj produkt značkou shody CE.

Tento legislativní požadavek není samoúčelný, nýbrž refl ektuje požadavek na přiměřenou komu-tabilitu kalibrátorů a kontrolních materiálů. O co se vlastně jedná? Výrobce IVD MD v je povinen specifi kovat, pro jaký typ vzorku je jeho výrobek určen. Zpravidla se jedná o nativní lidské sérum, lidskou plazmu, popř. moč či jinou tělní tekutinu. Je zřejmé, že takovýto požadavek je pro jakékoli kontrolní vzorky používané v širším měřítku vel-mi obtížně splnitelný, zvláště uvědomíme-li si, že v některých, zejména imunoanalytických systé-mech, mohou být problematické i „pooly“. A to nehovořím o stabilizaci, lyofi lyzaci, mrazení a podobně. V řadě typů stanovení nemusí být, a také patrně není, komutabilita kontrolních materiálů významný problém. Jako příklad je možné uvést řadu základních parametrů z oboru klinické biochemie, neboť se jedná o stanovení jednoduchá (což samozřejmě v žádném případě nesnižuje význam). Opačným příkladem jsou imunochemická stanovení, založená na principu interakce antigenu s jednou nebo dvěma proti-látkami. Tato interakce může být významně ovliv-něna i malými odchylkami prostředí, ve kterém probíhá a proto je k hodnocení kvality takových-to výrobků přistupovat kriticky a obezřetně.

PETR ŠMÍDL

[email protected]

Je tedy zřejmé, že běžné materi-ály pro EHK nemohou být použí-vány pro kontrolu kvality IVD MD (zejména správnosti a návaznos-ti), což také není jejich účel.

Diagnostický a prognostický význam thymidinkinázy (TK)

u nádorových onemocněníÚvodEnzymatická aktivita thymidinkinázy (TK) je nezbytná pro proces zabudová-ní thymidinu do buněčné DNA. De novo je syntéza thymidinfosfátu kataly-zována za normální situace pomocí thymidylátsyntetázy, a to z deoxyuri-dinmonofosfátu za přítomnosti kyseliny listové a vitaminu B12. Fyziologickou funkcí TK v organismu je fosforylace thymidinu, při které dochází k přeměně deoxythymidinu na deoxythymidinmonofosfát, který se v přítomnosti ade-nozintrifosfátu mění na trifosfátovou formu potřebnou pro syntézu DNA, čímž je umožněna syntéza DNA náhradní (záchrannou) cestou. Proto se zvý-šená produkce TK pozoruje u intenzivně se dělících tkání a TK je považována za významný marker buněčné proliferace. Cílem studie bylo ověřit diagnos-tický a prognostický význam TK u nádorových onemocnění.

Materiál a metodikaThymidinkináza byla měřena pomocí radioreceptorové analýzy (RRA) za uži-tí diagnostické soupravy fi rmy Immunotech (Praha) (3). Sérové hodnoty TK byly měřeny u 1087 nemocných s nádorovým onemocněním (355 nemoc-

ných s hematologickou malignitou, 732 pacientů se solidními tumory). Všechny odběry byly prove-deny za standardních podmínek z kubitální žíly v ranních hodinách. Až do laboratorní analýzy byly všechny vzorky skladovány při -20 °C.

Sérové hodnoty nádorových markerů byly kore-lovány s klinickým stavem nemocných. Nemocní s nádory prsu a kolorekta byli systematicky sledo-váni v průběhu follow up a nádorové markery byly u těchto nemocných odebírány v pravidelných intervalech 3-5 měsíců. Diagnostický význam thymidinkinázy byl retrospektivně vyhodnocen u 68 nemocných s nádorem prsu a u 48 nemoc-ných s kolorektálním karcinomem, u kterých byla v průběhu dispenzarizace zaznamenána progrese onemocnění (lokální recidiva či vzdálené meta-stázy).


Sérové hodnoty TK a klinické stavy (remise, progrese) byly nezávisle na sobě vyhodnoceny 2 lékaři. Hodnoty TK byly také stanoveny u kontrol-ní skupiny probandů (100 zdravých kontrol, 100 nemocných s bakteriální infekcí, 100 nemocných s imunoalteračním onemocněním). Statistická analýza (základní deskriptivní statistika, výpočet specifi cit a senzitivit) byla provedena pomocí statistického softwaru S.A.S, verze 6.2.

VýsledkyTabulka 1 uvádí základní deskriptivní statistiku hodnot kontrolní skupiny. Výsledky jsou shrnuty na obrázcích 1 až 4. Obrázek 1 uvádí senzitivity při 95% specifi citě pro hematologické malignity (56 nemocných leukemií, 68 s Hodgkinovým lym-fomem, 36 s non-Hodgkinovým lymfomem, 40 s mnohočetným myelomem a 155 s myelody-splastickým syndromem). Obrázek 2 ukazuje stej-né parametry pro předoperační hodnoty u solid-ních nádorů (300 nemocných s nádorem prsu, 300 nemocných s nádorem kolorekta, 97 nemoc-ných s nádorem děložního čípku a 35 nemocných s nemalobuněčným plicním karcinomem-NSCLC). Kromě jednorázového stanovení TK u předope-račních hodnot byly hodnoty TK systematicky sledovány v průběhu follow up. Na obrázku 3 a 4 jsou uvedeny mediány koncentrací TK a senzitivi-ty TK pro predikci progrese 9, 6 a 3 měsíce před klinickou manifestací a v době klinické manifes-tace progrese, která byla prokázána pomocí vyšetřovacích metod (zobrazovací, endoskopic-ké). Úsečky v grafu vyjadřují minimální a maxi-mální naměřenou koncentraci TK. Obrázek 3 uvá-dí tyto hodnoty naměřené pro nádory prsu, obrázek 4 pro nádory kolorekta.

DiskuseV naší laboratoři se zabýváme systematickým měřením hodnot thymidinkinázy již od r. 1990

(4). TK je stanovována především u hematologických malignit (5, 6). Proble-matikou solidních nádorů se v současné době zabývá omezený počet auto-rů, většina prací s touto tematikou pochází z let 1994-98 (7, 8, 9, 10). Např. Thomas a kol. již popsal význam TK u kolorektálního karcinomu a Robertson a kol. a Kaušitz a kol. popsali korelaci mezi hladinami TK a stadiem onemoc-nění u karcinomu prsu. Byl také pospán význam stanovení TK v průběhu follow up (7, 8, 9). Později se výzkum zaměřil více na onkofetální a mucinóz-ní nádorové markery a na význam stanovení TK se téměř pozapomnělo (11, 12, 13, 14, 15).

Na základě výsledků naší studie můžeme konstatovat, že TK je sekundární diagnostický nádorový marker a primární význam má jen u některých hema-tologických malignit (4, 5). Na základě našich zkušeností můžeme konstato-vat, že hodnoty tohoto markeru korelují se závažností tohoto onemocnění. Zdá se být velmi dobrým diagnostickým a prognostickým nádorovým mar-kerem pro monitoraci průběhu vývoje onemocnění. Pomocí TK je možno predikovat progresi nádorového onemocnění 3 měsíce před klinickou mani-festací, v některých případech dokonce 6-9 měsíců před klinickou manifes-tací relapsu. To se zdá být výhodou i přes nízkou orgánovou specifi tu, ale na rozdíl od ostatních nádorových markerů má TK primární význam jako mar-ker buněčné proliferace u nádorových onemocnění (2, 16, 17).

Skupina N Medián Min.-Max.

Zdraví probandi 100 4 1-6

Nemocní s bakteriální infekcí 100 10 4-15

Nemocní s imunoalteračním onemocněním

40 28 2-56

Tabulka 1: Základní deskriptivní statistika TK (IU/L) u kontrolní skupiny

Obr. 1: Senzitivity TK (IU/L) při 95% specifi citě u hematologických malignit (n=355)

Obr. 2: Předoperační hodnoty TK (IU/L) a senzitivity při 95% specifi citě u pacientů se solidními nádory

Pomocí thymidinkinázy je možno predikovat progresi nádorového onemocnění 3 měsíce před klinickou manifestací, v některých případech dokonce 6-9 měsíců před klinickou manifestací relapsu.


ZávěrThymidinkináza je sekundárním nádorovým markerem, který je užitečný pře-devším pro monitoraci follow up nádorových onemocnění. Elevace hodnot tohoto markeru musí být interpretována vždy při podrobné znalosti klinické-ho stavu nemocného, protože musí být vyloučeny nespecifi cké elevace séro-vých hodnot (zánětlivá a imunoalterační onemocnění).

Literatura1. Chuanjing Wu, Rong-Jiang Yang, Ji Zhou, Shing Bao, Li Zou, Pinggan Zhang, Yongrong Mao, Jianping Wu, Qimin He. Production and characterisa-tion of a novel chicken IgY antipody raised against C-terminal peptide from human thymidine kinase 1. Journal of Immunological Methods, 277, 2003, 157-169.2. Wu J, Mao Y, He L, Wang N, Wu C, He Q, Skog S. A new cell proliferating marker: cytosolic thymidine kinase as compared to proliferating cell nuclear antigen in patients with colorectal carcinoma.Anticancer Res 20(6C):4815-20, 2000.3. Topolcan O, Holubec L Jr, Finek J, Stieber P, Holdenrieder S, Lamerz R, Holu-bec Sen L, Svobodova S, Visokai V, Lipska L. Changes of thymidine kinase (TK) during adjuvant and palliative chemotherapy. Anticancer Res. 2005 May-Jun; 25(3A):1831-3. 4. Lejcko J., Jungerova J., Topolcan O., Koza V.: Thymidine kinase at malignant lymphogranuloma and Non-Hodgkin Lymphoma. Prakt. Lék. (Praha), 72, 1992, č. 5, 171-173.5. Poley S., Stieber P., Nussler V. et al.: Serum thymidine kinase in non-Hodgkin lymphomas with special regard to multiple myeloma. Anticancer Res. 17 (4B) 1997: 3025-9. 6. Christiansen I., Gildlof C., Kalkner K.M. et al: Elevated serum levels of soluble ICAM-1 in non-Hodgkin’s lymphomas correlate with tumour burden, disease activity and other prognostic markers. Br J Haematol. 92 (3) 1996: 639-46. 7. Thomas WM, Robertson JF, McKenna PG, O‘Neill KL, Robinson MH, Hard-castle JD. Serum thymidine kinase in colorectal neoplasia. Eur J Surg Oncol. 1995 Dec; 21(6):632-4. 8. Robertson JF, O‘Neill KL, Thomas MW, McKenna PG, Blamey RW. Thymidine kinase in breast cancer. Br J Cancer. 1990 Oct; 62(4): 663-7. 9. Kausitz J., Kuliffay P., Pecen L. et al.: Correlation of cytosolic concentrati-ons of ER, PS2, Cath-D, TPS, TK and cAMP in primary breast carcinomas. Neoplasma,41, 1994, 331-336 10. Roman S., Christensen I. J., Chinot O. et al.: Prognostic value of cytosolic

thymidine kinase activity as a marker of prolifera-tion in breast cancer. Int.J.Cancer, 61, 1995, 7-12 11. Chester SJ, Maimonis P, Vanzuiden P, Finkles-tein M, Bookout J, Vezeridis MP. A new radioim-munoassay detecting early stages of colon can-cer: a comparison with CEA, AFP, and Ca 19-9. Dis Markers. 1991 Sep-Oct; 9 (5) : 265-71. 12. Haglund C, Kuusela P, Roberts P, Jalanko H. Tumour marker CA 125 in patients with digestive tract malignancies. Scand J Clin Lab Invest. 1991 May; 51 (3): 265-270. 13. Kuusela P, Haglund C, Roberts PJ. Comparison of a new tumour marker CA 242 with CA 19-9, CA 50 and carcinoembryonic antigen (CEA) in diges-tive tract diseases. Br J Cancer. 1991 Apr; 63 (4): 636-40. 14. Kornek G, Depisch D, Temsch EM, Scheithauer W. Comparative analysis of cancer-associated antigen CA-195, CA 19-9 and carcinoembryonic antigen in diagnosis, follow-up and monitoring of response to chemotherapy in patients with gastrointestinal cancer. J Cancer Res Clin Oncol. 1991; 117 (5): 493-6. 15. Ial‘chenko NA, Lagutin VD, Lavik NN, Musin II. [The clinical information value of an immunoen-zyme study of the tumor markers CA-19-9, CEA and AFP in cancer of the stomach, pancreas, colon and rectum] Vopr Onkol. 1991; 37(9-10): 921-4.16. O‘Neill KL, Buckwalter MR, Murray BK. Thymi-dine kinase: diagnostic and prognostic potential.: Expert Rev Mol Diagn: 1(4): 428-33, 2001. 17. Tanigawa N, Katoh Y, Fujii H, Shimomatsuya T, Aotake T, Yamakawa M. Prediction of prognosis of patients with gastrointestinal cancer based on thymidine uptake. Gan To Kagaku Ryoho. 21 (3): 388-94, 1994.

PROF. MUDR. ONDŘEJ TOPOLČAN, CSC.,

ODDĚLENÍ IMUNOCHEMICKÉ DIAGNOSTIKY,

FN PLZEŇ, DR. E. BENEŠE 13, 305 99 PLZEŃ,

E-MAIL: [email protected]

Obr. 3: Hodnoty TK (IU/L) a senzitivity při 95% specifi citě pro predikci progrese 9,6 a 3 měsíce před klinickou manifestací relapsu a v čase klinické manifestace (čas 0) u nemocných s nádorem prsu.

Obr. 4: Hodnoty TK (IU/L) a senzitivity při 95% specifi citě pro predikci progrese 9,6 a 3 měsíce před klinickou manifestací relapsu a v čase klinické manifestace (čas 0) u nemocných s nádorem kolorekta.


Průtokové cytometry QUANTA SC MPL jsou určeny pro výzkumné aplikace. Kombinují měření objemu buněk Coulterovou metodou, rozptylu světla (Side Scatter) a fl uorescencí na třech fotonásobičích s použitím více zdrojů světla. Na měření objemu nemá vliv tvar, barva a optické vlastnosti částic.

Průtokový cytometr CELL LAB QUANTA SC MPL

olitelně je možno použít argonový laser (488 nm) nebo rtuťovou výboj-

ku (excitace při 366, 405 a 435 nm) . Cytometr QUANTA SC MPL je vybaven

podavačem a aspiruje z destiček různých formátů (24, 96 nebo 384 jamek) nebo mik-

rozkumavek. Minimální aspirovaný objem je 25 μL, maximální 300 μL. Software umožňuje

předdefi novat míchání vzorků nebo přidání rea-gencie přístrojem v objemu 1-250 μL včetně inku-bace před aspirací. Aspirační jehla je automaticky omývána před každou další aspirací vzorku.

Analyzátor je vhodný pro měření absolutních počtů buněk a stanovení buněčného cyklu, apop-tózy, životnosti buněk, měření povrchových a intra-celulárních znaků apod.

Pro tyto aplikace jsou vyvinuty kompletní labora-torní postupy včetně přípravy vzorků a nastavení přístroje:■ DNA Cell Cycle Analysis with 4’, 6-Diamidino-2-

Phenylindole (DAPI) or Propidium Iodide (PI) Nuclear Stains

■ Evaluation of Cellular Viability with Propidium Iodide or 7-Amino-Actinomycin D

■ Evaluation of Apoptosis with Annexin V and Propidium Iodide or 7-Amino-Actinomycin D

■ Green Fluorescent Protein (GFP)■ Measurement of Active Caspase-3 in Apoptotic Cells Using Beckman Coulter‘s

Cell Lab Quanta™ SC■ Cell Cycle Analysis with Dual Measurement of Cyclin A2 Expression and DNA

Content■ Determination of P44/42 Mitogen-Activated Protein Kinase (MAPK) Phos-

phorylation Using the Beckman Coulter Quanta™ SC Flow Cytometer■ Fluorescence Concentration Measurement Using the Beckman Coulter Quan-

ta™ SC■ 3-Color Compensation Using Beckman Coulter‘s Cell Lab Quanta™ SC Flow

Cytometr System■ Enumeration of Mitotic Cells with Dual Measurements of Histone H3 Phos-

phorylation and DNA Content■ Cytokine Expression in Serum of Coronary Disease Patients Using the Human

Cardiovascular 7Plex FlowCytomix Multiplex Bead Assay

Souprava Human FlowCytomix Cardiovascular 7plex Multiplex kit (Obj. číslo BMS711FF) je určena pro stanovení sCD40L, IL-6, IL-8, MCP-1, P-selektinu, t-PA a VCAM-1.

Tyto aplikační listy vám na požádání zašleme v pdf formátu ([email protected]). Popsané postupy jsou použitelné i na dalších typech průtokových cytometrů.

Průtokové cytometry Cell Lab QUANTA SC MPL, QUANTA SC a QUANTA před-stavují ucelenou řadu analyzátorů pro výzkumná pracoviště. Základní verze cytometru QUANTA, která je vhodná pro laboratoře pracující s tkáňovými kul-turami, je vybavena dvěma fotonásobiči, laserem 488 nm nebo rtuťovou lam-pou, popř. oběma světelnými zdroji současně.

Beckman Coulter IOTest® iTox3Tyto reagencie jsou určeny pro stanovení subpopulací lymfocytů periferní krve, kostní dřeně nebo lymfatických uzlin laboratorního potkana v kombinaci IOTest® Anti-Rat CD3-FITC/CD4-PC7/CD8-APC (reagencie pro stanovení sub-populací lymfocytů T) a IOTest® Anti-Rat CD3-FITC/CD45RA-PC7/CD161a-APC (reagencie pro stanovení lymfocytů T, B a buněk NK).

IOTest® Anti-Rat CD3-FITC / CD4-PC7 / CD8-APC

obj. číslo A32909, 50 testů CD3 CD4 CD8

klon 1F4 OX-38 OX-8

izotyp IgM IgG2a IgG1

IOTest® Anti-Rat CD3-FITC / CD45RA-PC7 / CD161a-APC

obj. číslo A32910, 50 testů CD3 CD45RA CD161

klon 1F4 OX-33 10/78

izotyp IgM IgG1 IgG1

Obě kombinace konjugovaných monoklonálních protilátek jsou použitelné na průtokových cytometrech FC 500 s dvěma lasery. Při přípravě vzorků se používá metoda bez promývání s využitím lyzačního činidla VersaLyse. Po při-dání kalibračních partikulí Flow-COUNT Fluorospheres je možné stanovovat absolutní počty subpopulací lymfocytů.

Tato tříbarevná konfi gurace (FITC/PC7/APC) výrazně usnadňuje analýzu na průtokovém cytometru bez potřeby nastavování kompenzací. Navíc je možné podle potřeby přidat další monoklonální protilátku značenou PE, např. pro sta-novení aktivačních znaků (CD25-PE).

Doplňující reagencie

Reagencie Klon Velikost Obj.číslo

Anti-Rat CD45-PE, IOTest® OX-1 50 testů A36700

7-AAD Viability Dye 150 testů A07704

VersaLyse Lysing Solution 100 testů A09777

IOTest3 Fixative Solution 100 testů A07800

Flow-COUNT Fluorospheres 200 testů 7547053

Pracoviště s vysokou kapacitou mohou využít pro stanovení z plné krve průtokový cytometr FC 500 MPL (Multi Platform Loader). Přístroj v této verzi automaticky aspiruje z mikrozkumavek s objemem 1,4 ml uložených v držáku pro 96 jamkovou destič-ku. Pro měření vzorků s větším objemem jsou vhodné standardní zkumavky 12 x 75 mm v držáku pro 40 zkumavek.

Automatizovaná příprava vzorků s Beckman Coulter Biomek® NXPAutomatizovanou přípravu vzorků je možné zabez-pečit pomocí přístroje Biomek® NXP. Tento systém umožňuje automatické pipetování, ředění a dávko-vání reagencií a vzorků. Biomek® NXP umožňuje pracovat s formátem destiček - 96, 384 a také s běžnými formáty zkumavek. Biomek® NXP lze dále volitelně doplnit dalším příslušenstvím jako například detektorem pro měření absorbance, fl uo-rescence a luminiscence DTX 800/880, dále třepač-kou, termostatem a případně skladem vzorků.

Využití tak nachází nejen při přípravě vzorků pro průtokovou cytometrii, ale především pro DNA/RNA purifi kaci, pro PCR a sekvenční clean-up a další. Biomek® NXP je optimalizován pro přípravu a purifi kaci DNA/RNA reagenciemi Agencourt®.


Nové reagencie pro průtokovou cytometrii

CD23-PE, IOTest®, PN A33099Liquid 2 mL – 20 μL / testMolekula CD23 je přítomna na lymfo-cytech B a monocytech. Dále je pří-tomna na širokém spektru lymfocytů T, eozinofi lech, krevních destičkách, Langerhansových buňkách a subpo-pulacích epiteliálních buněk tymu a neutrofi lech.

CD5-ECD, IOTest®, PN A33096Liquid 1 mL – 10 μL / testMolekula CD5 je přítomna na povrchu zralých lym-focytů T, na povrchu většiny tymocytů a dále u subpopulace lymfocytů B. Není exprimována na granulocytech, monocytech ani krevních destič-kách.

CD13-ECD, IOTest®, PN A33097Liquid 1 mL – 10 μL / testAntigen CD13 je přítomen na buňkách myeloidní-ho původu včetně neutrofi lů, eozinofi lů, bazofi lů a monocytů normální periferní krve. Chybí na lym-focytech T a B, erytrocytech a krevních destičkách. Existuje pět variant molekuly CD13 s odlišnou gly-kosylací, což vysvětluje odlišné vazebné vlastnosti různých protilátek CD13.

CD16-ECD, IOTest®, PN A33098Liquid 1 mL – 10 μL / testMonoklonální protilátka 3G8 se váže na FcγRIIIA a FcγRIIIB.Schopnost klonu 3G8 specifi cky vázat CD16 byla testována v rámci 5. konference o lidských leuko-cytárních diferenciačních antigenech („5th HLDA Workshop on Human Leukocyte Differentiation Antigens“), která se konala v Bostonu v USA, v roce 1993.

Regulační lymfocyty TV současné době se věnuje velká pozornost stano-vení regulačních lymfocytů T (Tregs). Nejčastěji používaným znakem pro identifi kaci této subpopu-lace CD4+CD25+ lymfocytů T je transkripční faktor FoxP3. Pro stanovení tohoto znaku je nezbytná permeabilizace, která je zdrojem metodických pro-blémů. Řada současných publikací se věnuje mem-bránovému znaku CD127, jehož exprese je snížena na regulačních lymfocytech T ( Liu et al., CD127 expression inversely correlates with FoxP3 and suppressive function of human CD4+ T reg cells, JEM, 2006, 203, 7, 1701-1711).

CD127 je α podjednotka IL-7R. Molekula je asociována s γ řetězcem (CD132), který je společný pro IL-2R, IL-4R, IL-9R, IL-15R, and IL-21R. Nachází se na tymocytech, progenitorech buněk T a B, zralých buňkách T, monocytech a některých dalších lymfoidních a myeloidních buňkách.

Stanovení regulačních lymfocytů T v kombinaci CD3+CD4+CD25brightCD127dim-to-neg Tregs je možné provést monoklonálními protilátkami s různými fl uorochromy:

CD3, IOTest, 100 testů, FITC A07746CD127, IOTest, 100 testů, PE IM1980CD8, CYTO-STAT, 50 testů,ECD 6604728CD25, IOTest, 100 testů,PC5 IM2646UCD4, IOTest, 100 testů, PC7 6607101CD4, CYTO-STAT, 50 testů, ECD 6604727CD4, IOTest, 100 testů, FITC A07750

CoulterCounter.comV průběhu ledna byly zprovozněny nové webové stránky s názvem Coulter-Counter.com. Jsou určeny především uživatelům analyzátorů částic série LS, RapidVue, N5, SA 3100 a MultiSizer3. Stránky obsahují literaturu, vysvětlení principů (Coulterův princip, Miova teorie rozptylu světla apod. ) a popis jednot-livých aplikací pro uvedené přístroje.

Pro aplikace v biologii je používán Multisizer3, kterému jsou věnovány články na téma:■ Real Time Detemination of Cell Volume Changes of Sperm Used for Cryo-

preservation■ Determination of Cell Aggregation in Bacteria Cultures for Contact Lens Dis-

infection Effi cacy Testing ■ Beer, Evaluation of Final Product and Filtration Effi ciency

PAVEL KRUŽÍK

[email protected]

Využití tak nachází nejen pro přípravě vzorků pro prů-tokovou cytometrii, ale pře-devším pro DNA/RNA puri-fi kaci, pro PCR a sekvenční clean-up a další.


Stanovení základních biologických charakteristik

v laboratoři tkáňových kulturSoukup T., Rückerová H., Karbanová J., Suchánek

J., Kudrnáčová J., Vlček R., Moos J.

uňka je základní strukturní a funkční jednotkou živé hmoty – hovoříme o tzv. buněčném principu organizace živých systé-

mů. Každá buňka tak představuje hmotný, konečný, otevřený a hierarchicky uspořádaný systém, který je vysoce adaptivní, schopný autoregulace a autoreprodukce.Jednou ze základních vlastností biologického systému je růst.

Růst zahrnuje procesy syntézy jednotlivých stavebních komponent živého systému a odráží procesy transkripce a translace genetické infor-mace a navazuje na ně. U mnohobuněčných organismů je růst vyjádřen též proliferační aktivitou buněk. V průběhu ontogeneze je rychlost růstu proměnlivá a růst navíc souvisí s procesy regeneračními a některými pro-cesy adaptačními.

V podmínkách laboratoří buněčných/tkáňových kultur si denně ozře-jmujeme základní charakteristiky růstu studiem růstu individuálních buněk a buněčných populací. Růst individuální buňky sledujeme přímo (mikroskopicky) nebo nepřímo (mikrofotograficky či mikrokinematografic-ky). Růst buněčné populace se obvykle hodnotí pomocí parametrů růstu odvozených od proliferační aktivity buněk sledované buněčné populace. Za podmínek statické kultivace je možné růst populace rozdělit do čtyř fází: 1) Fáze klidová (tzv. lag fáze), 2) Fáze exponenciální, 3) Fáze stacio-nární a 4) Fáze odumírání. Grafickým vyjádření prvních tří fází je sigmoi-dální křivka.

„Proč tedy sledovat tzv. základní biologické charakteristiky?“Protože získáme lepší kontrolu nad celým procesem dlouhodobé kultivace buněk v podmínkách in vitro. Díky této nepopulární „matematice v labo-ratoři“ jsme schopni kvalitně hodnotit použité laboratorní postupy, kulti-vační média, separační metody, vhodnost/nevhodnost povrchů kultivač-ních nádob apod. Můžeme hodnotit celou řadu dalších parametrů

ovlivňujících naše in vitro experimenty. Za zcela klíčové, např. pro laboratoře kultivující kmenové buňky, považujeme stanovení počtu populač-ních zdvojnásobení a času potřebného na toto zdvojnásobení, abychom prokázali neomezený proliferační potenciál těchto buněk.

Jaké biologické chcarakteristiky nejčastěji stanovujeme?Jsou to: 1) Počet buněk, 2) Průměr buněk, 3) Distribuce průměrů, 4) Trend velikosti buněk (tzv. size trend), 5) Plating efficiency, CFU, 6) Počet populačních zdvojnásobení (tzv. No. of population doublings), 7) Čas potřebný na zdvojnásobení populace (tzv. doubling time) a 8) Viabilita.

Metodické přístupyPro stanovení výše jmenovaných biologických charakteristik je samozřejmě nutné patřičné vybavení. Do jisté míry vystačíme s mikrosko-pem a „Bürkerovou komůrkou“. Avšak pro repro-dukovatelné, přesné a rychlé stanovení je s výhodou použít některý z analyzátorů buněk a částic (viz. článek v IVD 3/2006 „Analyzátory buněk a částic“). Každý z analyzátorů má však své limity, které budeme demonstrovat dále.

V naší laboratoři pracujeme v zásadě se třemi typy buněčných kultur (obrázek 1-4): A) Kultury lidských kmenových buněk rostoucí adherentně, B) Kultury lidských nádorově transformovaných

Obr. 1 Lidské mezenchymové kmenové buňky izolované z kostní dřeně (primokultura)

Obr. 2 Spontánně transformované lidské stromální buňky izolované z lymfatické uzliny (40. pasáž)

Obr. 3 Kmenové buňky zubní pulpy rostoucí ve formě sfér


Obr. 4 Osteoblasty diferencované z kmenových buněk zubní pulpy, sféra vznikla spontánní sedimentací

Obr. 5 Mezenchymové kmenové buňky 10 minut po enzymatickém uvolnění od podkladu

buněk s různými subpopulacemi, a konečně C) Kultury buněk rostoucí ve formě trojrozměrných útvarů – sfér.

Jednotlivé buněčné typy je nutné pro analýzu připravit. Kolonie přisedlé k podkladu musíme enzymaticky rozvolnit (obrázek 5) a resuspen-dovat na jednotlivé buňky, které můžeme měřit podle použitého přístroje v rozsahu velikostí 2-70 mikrometrů. Buňky rostoucí ve formě sfér analyzujeme podle potřeby a odhadovaného průměru buďto vcelku, nebo opět enzymaticky rozvolněné.

Stanovení počtu, velikosti a distribuce průměrů patří mezi nejzákladnější charakteris-tiky. Stanovujeme je vždy (jsou základními kvantitativními daty pro výpočet dalších cha-rakteristik), a to za pomocí přístrojů Z2 Coulter a Vi-Cell XR.

Na výsledcích analýzy distribuce průměrů trans-formovaných stromálních buněk lze demonstrovat sílu jednotlivých analytických metod. Pomocí Coul-terova impedančního principu jsme schopni přesně analyzovat jednotlivé subpopulace buněčné kultu-ry v rozsahu průměrů 6-28 mikrometrů (obrázek 6). Informace o životnosti jednotlivých subpopulací však chybí.

Analýza stejné buněčné populace pomocí trypanové modři a analýzy obrazu přístrojem Vi-Cell XR (obrázek 6a) nám sice nepodá tak přesný pohled na distribuci průměrů, ale doplní tolik potřebný parametr – viabilitu. Víme tedy jaké procento buněk je životaschopných a pro další analýzy a nasazení buněk do nových kulti-vačních nádob již počítáme pouze s procentem viabilních buněk.

U buněk produkujících velké množství extra-celulární matrix (např. granulózové buňky z ova-riálního folikulu) může při analýze počtu a dis-tribuce průměrů dojít k problému, zejména použití analýzy obrazu je málo vhodné. Toto

Obr. 6 Distribuce průměrů čtyř lidských spontánně transformovaných stromálních linií

Obr. 6a Distribuce průměrů viabilních, spontánně transformovaných stromálních buněk (viabilita 95%)

Obr. 7 Distribuce průměrů granulózových buněk měřená přístrojem Vi-Cell XR.

demonstrujeme na následujících snímcích ana-lýzy granulózových buněk. Jednotlivé buňky jsme byli schopni hodnotit pouze pomocí impe-dančního principu přístroje Z2 (obrázky 7, 8). Populace v rozsahu průměrů 10-20 mikrometrů zůstala přístroji Vi-Cell skryta.

Nutno však podotknout, že analýza buněk men-ších průměrů než 7 mikrometrů může činit inter-pretační potíže naopak při použití přístroje Z2 Coulter. Takováto analýza vyžaduje vysoké nároky na čistotu nosného roztoku a kyvet. Za méně kva-litních podmínek pak analýza buněk menších prů-měrů není přesná a v poolu měřených buněk se nachází množství neživých částic a nečistot.

Zajímavou funkcí obou zmiňovaných přístrojů je záznam a hodnocení trendu velikosti buněk (obrázek 9). Tato charakteristika je velmi cenná při hodnocení průměrných dat v průběhu dlou-hodobé kultivace.

Mezi velmi důležité biologické charakteristiky odvozené od počtu buněk a času, který uplynul od nasazení buněk po jejich sběr jsou – počet populačních zdvojnásobení (total/cumulative population doublings) a čas potřebný na zdvojnásobení populace (doubling time).

Počet populačních zdvojnásobení lze vypočí-tat dle následujícího vzorce:

No(PD) = (log Nt – log N0)/0,301kde No (PD) je počet populačních zdvojnásobe-ní, Nt je počet buněk po enzymatické disociaci/sběru buněk, N0 je počet nasazených buněk.

Výsledné číslo můžeme hodnotit buďto indivi-duálně, nebo kumulovaně v průběhu dlouhodo-bé kultivace. Regresní analýza individuálních hodnot při každé pasáži vypovídá o trendu pro-liferačního potenciálu buněčné kultury. Kumu-lace dat je významná pro zaznamenání překro-čení tzv. Hayflickova limitu (60 populačních zdvojnásobení), tj. k průkazu neomezeného pro-liferačního potenciálu (obrázek 10).

Čas potřebný na zdvojnásobení populace je veličinou odvozenou od počtu buněk a od doby, která uplynula od nasazení po sběr kultivova-ných buněk.

Obr. 8 Distribuce průměrů granulózových buněk měřená přístrojem Z2 Coulter.

Obr. 9 Příklad hodnocení trendu velikosti subpopulace lidských kmenových buněk v průběhu prvních 15-ti pasáží.

Obr. 10 Graf demonstrující kumulaci populačních zdvojnásobení u tří kultur lidských kmenových buněk. Kultury MPCs a MPCs/osteoporotic překročily tzv. Hayfl ickův limit.

Obr. 11 Graf generační doby tří kultur lidských kmenových buněk.


Stanovení počtu, velikosti a distribuce průměrů patří mezi nejzákladnější charak-teristiky. Stanovujeme je vždy, a to za pomocí přístroju Z2 Coulter a Vi-Cell XR.


G = (t x log2)/(log Nt – log N0)kde G je generační doba – čas potřebný na zdvojnásobení populace, t je čas, který uplynul od doby nasazení buněk po jejich sběr, Nt je počet buněk po enzymatické disociaci/sběru buněk, N0 je počet nasazených buněk.

Generační dobu nejčastěji vyjadřujeme grafic-ky pro celou dobu dlouhodobé kultivace (obrá-zek 11).

Závěrem bychom rádi demonstrovali raritní využití přístroje Vi-Cell XR pro analýzu trojroz-měrných sfér o velikosti kolem 50 mikrometrů. V experimentu jsme hodnotili nejprve počet a distribuci průměrů viabilních myších neurál-ních kmenových buněk (obrázky 12, 12a). Tyto po přenesení do kultivačních nádob s neošetře-ným, neadhezivním povrchem formovaly sféry různých velikostí. Tyto jsme průběžně analyzo-vali přístrojem Vi-Cell XR a kvantitativně jsme tak hodnotili schopnost neurálních kmenových buněk tvořit sféry viabilních buněk. Limitem našich měření byla maximální velikost 70 mikro-metrů. Měření sfér pomocí Coulterova impe-dančního principu plánujeme v brzké době.

MUDR. TOMÁŠ SOUKUP,

ÚSTAV HISTOLOGIE A EMBRYOLOGIE,

LF UK HRADEC KRÁLOVÉ,

ŠIMKOVA 870, 500 01 HRADEC KRÁLOVÉ


ROMAN VLČEK


JIŘÍ MOOS


Poděkování: Práce byla podpořena grantovými projekty MSM 0021620820, MŠMT 2006 č. 635-4c a grantovým projektem Nadace Tomáše Bati. Poděkování dále patří přednostovi Ústavu histo-logie a embryologie, LF v Hradci Králové Prof. MUDr. Jaroslavu Mokrému, Ph.D., laborantkám Ústavu histologie a embryologie, LF v Hradci Králové a Jiřímu Moosovi za uvedení do proble-matiky analýzy buněk a částic.

Obr. 12, 12A Výsledky analýzy viability a distribuce průměrů myších neurálních kmenových buněk

Obr. 13 Analýza trojrozměrných sfér neurálních kmenových buněk o průměrech 30-60 mikrometrů.

Vyhlášení vítězů soutěže „Pomozte nám chytit šotka“V minulém čísle jsme vás poprosili o pomoc, protože se v naší redakci usadil zlomyslný šotek, který zákeřně zaměňoval písmenka ve slovech. Všem, kteří se lovu na šotka zúčastnili, děkujeme. Se svým úlovkem se přihlásili čtyři lovci a lov-kyně, kteří dostali zaslouženou odměnu. Jsou to:

MUDr. Anežka Fišerová ze III.kliniky infekčních a tropických nemocí Fakultní nemocnice Na BulovceMUDr. Pavel Jindra z Hematologicko-onkologického oddělení Fakultní nemocnice v PlzniMichaela Valešová z Hematologického oddělení, KlinlabLenka Nováková OKB Nemocnice ZnojmoVšem úspěšným lovcům blahopřejeme!

VAŠE REDAKCE


Immunotech a.s. Beckman Coulter a jeho sponzorská

činnost

tohoto důvodu již několik let fi nančně podporujeme projekty zaměřené na integrování lidí se speciálními potřebami do většino-

vé společnosti.Immunotech a.s. byl v letech 2005-2006 hlavním sponzorem projektu

Dobromysl.cz, který realizuje občanské sdružení pro integraci lidí s postižením Máme otevřeno?. Dobromysl.cz je internetový portál o lidech a pro lidi se speciálními potřebami. Cílovou skupinou

tohoto projektu jsou rodiny lidí s mentálním postižením a lidé z pomáhají-

cích profesí (sociální pracovníci, psychologové, speciální pedagogové atd.). Jedná se o poměrně širokou skupinu lidí, protože v České republice je téměř 300 000 lidí s mentálním postižením, kteří potřebují služby sociálních organizací, opatrovní-ků a kteří mají své rodiny. Portál Dobromysl.cz umožňuje najít aktuální informace z oboru, sdílet informace z této oblasti, seznámit se a informo-vat o dostupných službách pro mentálně postižené. Jednou z ambicí projektu je prostřed-nictvím informování o tomto druhu zdravotního postižení zlepšit vztahy mezi většinovou společ-ností a členy minorit. Tematicky projekt pokrývá hlavní oblasti života, jako jsou rodina, vztahy, škola, práce, bydlení, zájmy, zdraví a zaměřuje se přitom především na možnosti začlenění člověka s postižením do běžného života a na jeho přiro-zené fungování v rámci komunity.

Tento portál v současné době měsíčně navštíví přes 11 000 uživatelů.

Společnost Immunotech a.s. patří mezi fi rmy, které se svým úspěchem alespoň nějakou

měrou snaží pomoci těm, kteří jsou určitým způsobem handicapovaní a jejichž startovní

čára je omezena nebo vůbec neexistuje.


IMMUNOMEDICAVážení přátelé,s blížícím se jarem se blíží také termín mezinárodního zdravotnického veletrhu Pragomedica. V době konání veletrhu, ve dnech 18. a 19. dubna 2007, jsme pro vás připravili přehlídku nabídky přístrojů fi rmy Beckman Coulter. Tým produk-tových specialistů a obchodních zástupců vám bude plně k dispozici. Přehlídka se jako již tradičně koná v prostorách fi rmy Immunotech.

Těšíme se na setkání s vámi!

FRIP 2007Inspekce rotorů do ultracentrifug a vysokovýkonných centrifug proběhne ve dnech 17. – 19. 4. 2007 v Praze, v Brně a v Bratislavě. Zajišťujeme svoz a inspekci rotorů a organizujeme přednášky o novinkách nejen v oblasti centrifugace. Prosíme zájemce, aby se informovali na adrese [email protected].

DNA analýza IV Seminář DNA analýza IV se koná v Praze v Lékařském domě v Praze ve dnech 24. – 25. 5. 2007. Přednášky z minulého ročníku si můžte prohlédnout zde: http://www.immuno-tech.cz/news/DNAIII/Prezentace.zip. Pokud máte zájem o podrobnější informace, informujte se, prosím, na adrese [email protected].

Pozvánky na akce

Naše společnosti dále zakoupila 60 kusů diářů na rok 2006, které vydává rovněž občanské sdružení pro lidi s postižením Máme otevřeno?. Tématem diáře pro rok 2006 byly příběhy o zaměstnávání lidí s mentálním postižením a grafi ckou značkou byl chameleon. Ptáte se proč právě chameleon? Tento ještěr se kromě jiného vyznačuje také tím, že jeho oči se hýbou nezávis-le na sobě všemi směry – může se dívat zároveň jedním okem dopředu a druhým dozadu. V našem obvyklém slova smyslu je schopnost chameleona měnit barvy symbolem bezpáteřnosti a prorad-nosti, naopak na ostrově Madagaskar jej lidé uctívají a říkají: „Dělej to jako chameleon při chů-zi – dívej se kupředu a zároveň se ohlížej zpátky.“ Cílem diáře pro rok 2006 bylo, aby svět byl cha-meleonem v madagaskarském významu, aby-chom uměli nejen hledět vstříc do budoucnosti, ale abychom se také druhým okem ohlíželi zpátky a pomohli všem těm, kteří nemohou jít tak, jako jdeme my.

V roce 2007 se stala společnosti Immunotech a.s. partnerem při realizaci projektu „Sociální automobil“ pro Prahu 10. Tento automobil je zvláštně upravený pro přepravu postižených lidí. Zakoupením reklamní plochy na sociálním vozi-dle jsme podpořili tvorbu a obnovu vozového parku v ústavech a zařízeních, která svou činnost zaměřují na výchovu, vzdělávání, rehabilitaci a integraci zdravotně či mentálně postižených lidí.

I v dalších letech bychom velmi rádi pokračova-li ve sponzorování podobných projektů, tj. v pomoci lidem se speciálními potřebami, jejichž integrace do společnosti by bez aktivní podpory okolí nebyla možná.

Dovolte, abychom poděkovali i vám – našim zákazníkům, protože bez vás bychom těmto lidem nemohli pomoci.

HANA MACHOVÁ

[email protected]

Jednou z ambicí projektu je prostřednictvím informování o tomto druhu zdravotního postižení zlepšit vztahy mezi většinovou společností a členy minorit.

21. 3. 2007Setkání pracovníků klinické biochemie a hematologie Plzeňského a Karlovarského krajeKlatovy

22. 3. 2007 Pracovní den ČSKB – sekce biochemických laborantůPraha

28. - 31. 3. 2007 V. Martinské imunologické dniMartin

1. - 3. 4. 200728. imunoanalytické dnyČeské Budějovice

16. – 20. 4. 2007 FRIP 2007 Praha, Brno, Bratislava

22. – 24. 4. 2007 Pracovní dny zdravotních laborantů a všeo-becných sester pracujících v hematologii a transfuzní služběŠpindlerův Mlýn

17. – 19. 5. 2007 XIV. česko – slovenská konference o he-mostáze a trombóze s mezinárodní účastíHradec Králové

23. - 25. 5. 2007 XXV. Setkání biochemiků Královéhradeckého, Pardubického a Jihočeského regionuTrutnov

24. - 25. 5. 2007DNA analýza Praha

1. 6. 2007 ES TOOLSBrno

11. - 12. 6. 2007Seminář Moravskoslezského krajeŽermanice

16. - 19. 6. 2007 XXI. Olomoucké hematologické dnyOlomouc

23. – 26. 6. 2007 Česká společnost analytické cytometrieBrno

Konference/seminář s účastí společnosti Immunotech formou stánku

Kde se můžeme setkat (březen – červen 2007)

Documents

UNICEL® DXC 800 V RUTINNÍM PROVOZU TŘÍLETÁ ... 2007-05.pdfinformační magazín číslo 5 - 2007 3 Obsah Automatický analyzátor UniCel® DxC 800 v rutinním provozu 4 Automatický