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UNIDAD PROFESIONAL INTERDISCIPLINARIA DE BIOTECNOLOGIA DEL INSTITUTO
POLITECNICO NACIONAL
REPORTE FINAL DEL PROYECTOREPORTE FINAL DEL PROYECTOREPORTE FINAL DEL PROYECTOREPORTE FINAL DEL PROYECTO
MEDICIÓN DE PROPIEDADES TÉRMICAS Y ÓPTICAS DE SOLUCIONES POR MEDIO DE
TÉCNICAS FOTOACÚSTICAS
CLAVE CGPI: 20060702
Dr. JOSÉ ABRAHAM BALDERAS LOPEZ
MÉXICO, D. F., 25 DE ENERO DE 2007.
RESÚMEN
Se elaboró el esquema teórico y el sistema experimental correspondiente para una nueva
metodología fotoacústica por transmisión para la medición de propiedades ópticas y
térmicas de colorantes en solución. Se llevaron a cabo pruebas preliminares para
determinar los rangos de concentración de colorantes en los cuales se aplican los
supuestos de la teoría, utilizando para ello soluciones de azul de metileno en agua
destilada a diversas concentraciones. Se demostró en éste caso que los límites de
concentración en los cuales se cumplen los supuestos de la teoría para medición de
propiedades ópticas de éste colorante se encuentran entre 0.1 y 0.25 mM, a una longitud
de onda de 650 nm. Se demostró también que a concentraciones superiores a 10 mM se
puede utilizar la técnica para caracterización óptica validando los resultados con otras
metodologías fotoacústicas ya reportadas. Se llevaron a cabo también pruebas
preliminares para evaluar la presente metodología fotoacústica, con una longitud de
onda de 655 nm, para la cuantificación de proteínas (albúmina de suero bovino) y
clorofilas, utilizando el método de Bradford para colorear las primeras, encontrándose
excelentes perspectivas en éste campo de la química analítica.
I. INTRODUCCIÓN.
Las técnicas espectroscópicas son técnicas analíticas ampliamente utilizadas para
llevar a cabo la caracterización óptica (a través de la determinación de espectros de
absorción relativos) y, en muchos casos, la cuantificación de especies químicas en
solución; muchas de éstas últimas determinaciones se llevan a cabo en la región visible
del espectro.1 En virtud de que la absorción de radiación por moléculas en la región
visible del espectro corresponde a transiciones electrónicas, las que a su vez tienen
asociadas una gran variedad de transiciones vibracionales y rotacionales, los espectros
de absorción moleculares en el espectro visible resultan, en general, en una serie bordes
muy anchos que involucran la superposición de otros bordes de absorción
correspondientes a diferentes longitudes de onda de la radiación. Por éste motivo los
espectros de absorción en la región visible del espectro electromagnético no son útiles
para identificación de especies químicas sino más bien, si ésta especie química está
suficientemente purificada, la absorción de radiación luminosa a una longitud de onda
convenientemente seleccionada puede ser útil para la cuantificación de la especie
química bajo estudio. La propiedad óptica utilizada para éstos propósitos es la
absorbancia (denotada por A), la cual se define por A=-log(I/I0), donde I0 e I son,
respectivamente, las intensidades del haz luminoso (monocromático) incidente y
después de pasar a través de un grosor dado de la muestra absorbente. El esquema
teórico se basa en el cumplimiento de la ley de Beer-Lambert, la cual establece que la
relación entre I e I0 viene dada por una función exponencial de la forma I= I0e-βL, siendo
L el grosor de la capa de material absorbente y β, denomina coeficiente de absorción
óptico, es el producto de la concentración de la especie química absorbente, denotada en
éste caso por c y una propiedad óptica molecular, denominada coeficiente de
absorbitividad molar, usualmente denotado por η(λ) es decir β=η(λ)c, de ésta manera
A=η(λ)cL/ln(10). La manera práctica de medir, a través de la medición de absorbancias,
la concentración de una especie química se lleva a cabo a través de un espectrómetro. El
espectrómetro consiste de un detector de radiación y una cubeta de vidrio o cuarzo, en
forma de paralelepípedo, en el cual se deposita la muestra y/o el blanco. La radiación
monocromática se hace incidir perpendicularmente sobre una de las caras del
paralelepípedo con la muestra de interés y es detectada en la cara opuesta del mismo. En
éste contenedor se establece el grosor de la sustancia a ser atravesada por el haz, la cual
se establece usualmente en 1 cm. Muchos aparatos comerciales tienen dos cubetas, una
como blanco, para medir la intensidad incidente y otra para medir la intensidad a través
de la muestra. En los casos en los que el aparato solamente cuenta con una cubeta, el
protocolo experimental establece primero medir la absorbancia del blanco y después
medir la absorbancia de la muestra. Los aparatos comerciales cuentan con el software
apropiado para dar directamente las lecturas de absorbancia como se definió antes. De
ésta manera la cuantificación de una especie química en solución involucra la medición
de absorbancias para un conjunto de muestras de referencia y la construcción de la
correspondiente curva de calibración. Esta curva de calibración tiene un doble
propósito: el establecer los límites de concentraciones apropiados para la cuantificación
y al mismo tiempo, para la determinación de la concentración de la muestra problema.
Esto último se hace proyectando la absorbancia medida a la correspondiente
concentración a través de la curva de calibración. El método puede resultar en algunos
casos muy demandante en tiempo y en dificultad para establecer las condiciones
adecuadas para cada caso.
Desde hace algunos años las técnicas derivadas del efecto fotoacústico, colectivamente
denominadas técnicas fotoacústicas, han permitido el desarrollo de diversos métodos
para la medición de las propiedades térmicas y ópticas de la materia en sus diversos
estados físicos.2-5 Se tienen básicamente dos esquemas experimentales fotoacústicos:
La configuración frontal: básicamente utilizada para determinar espectros de absorción
relativos, para esto se utiliza la dependencia de la señal fotoacústica en la longitud de
onda de la radiación, asumiendo la ley de Beer-lambert como modelo de absorción.
La configuración trasera o por transmisión: frecuentemente utilizada para la medición
de difusividades térmicas de la materia en fase condensada, para lo cual se asume un
modelo de absorción superficial.
En éste trabajo se ha propuesto un modelo matemático que flexibiliza el modelo de
absorción superficial, de la configuración por transmisión, al modelo de absorción de
Beer-Lambert. Bajo éste modelo se demuestra que es posible, dependiendo de la
concentración de la muestra, determinar el coeficiente de absorción óptico o la
difusividad térmica de la muestra. Se llevó a cabo la construcción del sistema
experimental correspondiente y se realizaron algunas pruebas preliminares para
demostrar las potencialidades de ésta. Para esto se utilizó el sistema para determinar
propiedades ópticas y térmicas de diversas soluciones de azul de metileno en agua
destilada, se encontraron aproximadamente los límites de aplicación de ésta
metodología en éste caso y se hicieron también ensayos preliminares para demostrar sus
potencialidades para la cuantificación de proteínas (albúmina de suero bovino) y
clorofilas.
II. TEORÍA.
A) ASPECTOS BASICOS SOBRE EL EFECTO FOTOACÚSTICO
El efecto fotoacústico tiene su origen en la absorción, en el seno de un material,
de radiación modulada en intensidad y su posterior conversión en calor, por medio de
mecanismos de des-excitación no radiativos. El calor generado en el material da lugar a
fluctuaciones de temperatura en el interior del mismo, denominadas ondas térmicas, las
cuales son detectadas como sonido en una cavidad cerrada denominada Cámara
Fotoacústica, esta cavidad generalmente es de forma cilíndrica y tiene acoplada un
micrófono (ver Figura 1). El modelo básico para la generación del efecto fotoacústico
para la materia en la fase condensada lo establecieron dos científicos de la Bell
Company, y que ahora se le conoce como el modelo de Roscencwaig y Gersho.2 La
sección transversal de la cámara fotoacústica en éste caso se muestra en la figura 1.
Radiación Modulada
Muestra
Cámara Fotoacústica Hacia el Micrófono
Fig. 1. Sección Transversal de la Cámara Fotoacústica con muestra
líquida absorbente y medios transparentes para sellar la cámara.
B) ASPECTOS TEÓRICOS.
De acuerdo a la Figura 1, la aplicación práctica del efecto fotoacústico en la
configuración de transmisión para la determinación de propiedades térmicas y/o ópticas
en medios líquidos, requiere de un medio transparente sobre el cual se coloque la
muestra líquida y al mismo tiempo evite la entrada del líquido a la celda. Involucra
también sellar la celda con una ventana óptica transparente para evitar que el haz que
atraviesa la muestra no sea absorbida posteriormente. De ésta manera el modelo
matemático correspondiente involucra resolver un sistema de ecuaciones diferenciales
de difusión de calor para un modelo de dos capas, como el mostrado en la Figura 2. En
éste modelo se ha supuesto que el medio que llena la celda fotoacústica (generalmente
aire) es suficientemente grueso de tal manera que la onda térmica se ve completamente
atenuada a su paso por el mismo.
En éste esquema w es el medio transparente desde el cual viene la radiación modulada,
m es en este caso el medio líquido en el cual ocurre la absorción de la radiación y en el
cual se originan las anteriormente denominadas ondas térmicas, s es una capa delgada
de un material que sirve para prevenir la entrada del líquido a la cámara fotoacústica
(mostrada en la Figura 1) y finalmente, g es el medio (usualmente aire) en el cual se
genera la onda acústica a ser detectada. Para efectos del modelo matemático se asumen
los grosores mostrados a la derecha de la figura 2. Este esquema conduce al siguiente
sistema de ecuaciones diferenciales de difusión de calor:4
- l
x
0
w
m (Muestra Líquida)
g
s
- L-l
Fig. 2. Modelo matemático para la difusión de
calor a través de dos capas.
En el cual αi y Ti, i=w,m,s,g representan, respectivamente, la difusividad térmica y los
perfiles de temperatura para cada uno de los medios considerados en la Figura 2, β es el
coeficiente de absorción óptico para el medio absorbente m, siendo km su conductividad
térmica, I0 es la intensidad de la radiación incidente y ω=2πf, donde f es la frecuencia
de modulación de la radiación incidente. El sistema de ecuaciones (1) está sujeto a las
condiciones de frontera usuales de continuidad de la temperatura y flujos de calor en
cada interfase a fin de establecer la unicidad de la solución, las cuales vienen descritas
por las ecuaciones:
),(),(
),(),(
),0(),0(
),(),(
),(),(
),0(),0(
tLlx
TktLl
x
Tk
tlx
Tktl
x
Tk
tx
Tkt
x
Tk
tLlTtLlT
tlTtlT
tTtT
gg
ss
ss
mm
mm
ww
gs
sm
mw
−−∂
∂−=−−
∂
∂−
−∂
∂−=−
∂
∂−
∂
∂−=
∂
∂−
−−=−−
−=−
=
Utilizando las técnicas ordinarias de la teoría de ecuaciones diferenciales es posible
resolver el sistema de ecuaciones diferenciales descrito arriba para obtener el perfil de
temperaturas en la interfase s-g en la cual, según el modelo de Roscenwaig- Gersho,2 se
genera la señal fotoacústica. Siguiendo éste modelo es posible demostrar que dicha
señal, denotada por δP, se puede escribir como:
Llxt
T
x
T
lxLlt
T
x
T
xleek
I
t
T
x
T
xt
T
x
T
g
g
g
s
s
s
tix
m
m
m
m
w
w
w
−−≤<∞−=∂
∂−
∂
∂
−≤≤−−=∂
∂−
∂
∂
≤≤−−=∂
∂−
∂
∂
≤=∂
∂−
∂
∂
01
1) ( 01
0 1
0 01
2
2
2
2
02
2
2
2
α
α
β
α
α
ωβ
(2) )1()1(
)(2)1)(1()1)(1(
*)1(22
)(),,(
20
0
0
−Ψ−+Ω
+−+++−−
−=
−
−−−
−
lwm
lwm
wmll
wmll
wm
L
mmgg
mm
mm
s
ebeb
breerbeerb
er
r
k
I
alT
fGPLlfP
σσ
σβσβ
σ
σ
γδ
Donde Ω y Ψ se definen de la siguiente manera:
Lsmgssmgs
Lsmgssmgs
s
s
ebbbb
ebbbbσ
σ
2
2
)1)(1()1)(1(
)1)(1()1)(1(−
−
+−+−+=Ψ
−−+++=Ω
En la ecuación (2) P0 y T0 son, respectivamente, la presión y temperatura ambiente, γ es
el cociente de calores específicos del gas en el interior de la celda, lg es el grosor de la
misma y G(f ), usualmente denominada función de transferencia, representa la
influencia de la electrónica en la señal fotoacústica. Las magnitudes bjk, definidas por
bjk=ej /ek, son el cociente de efusividades térmicas de los medios j y k. El término r,
definido por r=β/σm involucra las propiedades ópticas y térmicas del medio m, éstas
últimas a través del coeficiente de difusión térmica σm, definido en general por
σj=(i+i)(πf/αj)1/2. Como es posible inferir, la señal fotoacústica expresada por la
ecuación (2) depende, en forma muy complicada, de las propiedades térmicas así como
de las propiedades ópticas del medio absorbente. Es posible sin embargo identificar dos
variables de control para un experimento fotoacústico dado, éstas son la frecuencia de
modulación f, a través de las magnitudes σ y r y el grosor de la muestra m, l. Como
puede observarse de éstas ecuaciones la dependencia en las variables antes citadas
resulta en una ecuación muy complicada, es posible sin embargo lograr una gran
simplificación de la ecuación (2) si se asumen ciertos límites teóricos que involucran a
las dos variables mencionadas.
1. Muestra Débilmente absorbente en el régimen térmicamente grueso.
Si el coeficiente de absorción óptica de la muestra, β, se considera relativamente
pequeño, de tal manera que r y exp(-βl) son menores que 1, lo cual corresponde a una
muestra débilmente absorbente, en el régimen térmicamente grueso para m, se tiene
también que exp(-σml)≈0 y |exp(σml)|>>1. Bajo éstas condiciones los términos aditivos
exp(-σml) y 2(r+bwm) en la Eq. (3) pueden ser despreciados en comparación con el
término aditivo exp(σml). Como una consecuencia la ecuación (2) se simplifica a
Esta última ecuación, considerada como función de f, es aún difícil de utilizar para
propósitos prácticos, sin embargo se puede ver que si se utiliza el grosor de la muestra
(3) )1(
)1)(1(
)1(22
)(),(
20
0
0 l
wm
wmL
mmgg
eb
rb
r
re
k
I
alT
fGPlfP
sβ
σ
σ
γδ −
−
+Ω
++
−=
m como variable de control en este caso, ésta puede expresarse en una forma
comparativamente muy simple como:
En donde C es una expresión compleja que depende de factores geométricos atribuibles
a la celda así como de las propiedades térmicas de los otros medios involucrados pero
que es independiente de la variable l. Esta última ecuación predice un decaimiento
exponencial para la amplitud de la señal fotoacústica mientras que la fase
correspondiente permanece constante. Es posible entonces, bajo las condiciones límite
antes establecidas, llevar a cabo la medición del coeficiente de absorción óptico de la
muestra líquida por medio de la Eq. (4), el esquema experimental implica el registro de
la señal fotoacústica como función del grosor de la muestra líquida. Si las condiciones
límite se cumplen la gráfica de la fase, como función del grosor de la muestra, debe
permanecer constante en el intervalo apropiado y en éste mismo rango, la
correspondiente gráfica para la amplitud debe disminuir en forma exponencial (en
forma lineal si se utiliza una escala semi-logarítmica) el siguiente paso consiste en
llevar a cabo un ajuste por mínimos para ésta última, la pendiente de la línea recta
corresponde directamente al coeficiente de absorción óptica de la muestra.
2. Muestra muy opaca en el régimen térmicamente grueso.
Bajo el supuesto de que el medio m es ópticamente muy opaco los parámetros β y r
pueden considerarse muy grandes (teóricamente β→∞ y r→∞), de esta manera exp(-
βl)≈0 y las siguientes expresiones límite son válidas
01
,11
,11
)1( ,1
1
)1( ,1
1
)1(
22
2
222
=−
−=−
−=−
+−=
−
−−=
−
−
∞→∞→
∞→∞→∞→
r
rLim
r
rLim
r
rrLim
r
rrLim
r
rrLim
rr
rrr
Aplicando éstas a la Eq. (2) se encuentra que ésta se simplifica a
(4) )( lCelP βδ −=
(5) 1
*)1)(1)(1(24
)(),(
2222
0
0
0
Llsgwm
lmswm
Lsmgs
lL
gssmwmmmgg
smms
ms
eeee
ee
k
I
alT
fGPlfP
σσσσ
σσ
γγγγγγ
γγγσ
γδ
−−−−
−−
+++
+++=
donde γjk, j,k=w,m,s,g, son coeficientes de acoplamiento térmico definidos por γjk=(1-
bjk)/( 1+bjk).3-5 Este límite corresponde al caso de la “saturación óptica” de la señal
fotoacústica; bajo ésta condición el haz luminoso es absorbido en una delgada capa en la
superficie de la muestra de tal manera que se generan ondas térmicas en la región
próxima a la superficie de la misma. Estas ondas térmicas viajan de la muestra a la
cámara fotoacústica llevando información solamente sobre las propiedades térmicas de
a muestra de tal manera que las propiedades ópticas no juegan entonces ningún papel.
Bajo ésta condición límite solamente se pueden determinar propiedades térmicas de la
muestra. Esta aproximción es equivalente a un esquema fotoacústico reportado por
Balderas-López y Mandelis,3 en el cual se utiliza un modelo de absorción superficial y
el cual ha sido exitosamente usado para medir propiedades térmicas de sistemas de dos
capas, utilizando la señal fotoacústica en el dominio de frecuencia. La principal
diferencia estriba en que en éste ultimo el coeficiente de absorción óptico aparece como
un factor global de la señal fotoacústica. En el regimen térmicamente grueso para la
muestra m, exp(-σml)≈0, y la Eq. (5) se simplifica más aún a
Si en ésta ecuación el grosor de la muestra se considera como variable de control
entonces ésta toma nuevamente una forma muy simple
Donde C es nuevamente una expresión compleja constante respecto a l. Esta última
ecuación es muy simple y muestra que la amplitud de la señal fotoacústica (en una
escala semi-logarítmica) y su fase se comportan linealmente como funciones del grosor
de la muestra. De éstas dos magnitudes se pueden obtener dos valores de difusividad
térmica independientes. El procedimiento es muy similar al ya reportado por Balderas-
Lopez y Mandelis5 usando un modelo de tres capas en el límite de absorción superficial.
Los correspondientes valores de difusividad térmica pueden ser obtenidos mediante el
parámetro de ajuste M=(πf /αm)1/2, el cual corresponde a la pendiente de las rectas de
ajuste a la amplitud y fase, las cuales pueden escribirse como:
lnR = ln|C| - Ml (8)
Φ = Φ0 – Ml (9)
(7) )( lmCelP σδ −=
(6) 1
)1)(1)(1(24
)(),( 2
0
0
0 lL
smgs
L
gssmwmmmgg
m
s
s
ee
e
k
I
alT
fGPlfP σ
σ
σ
γγγγγ
σ
γδ −
−
−
++++=
III. SISTEMA EXPERIMENTAL.
En la Figura 3 se muestra la sección transversal del sistema fotoacústico
utilizado en este caso. Este estuvo integrado por una fuente de radiación
monocromática, en éste caso un láser de semiconductor (Radio Shack, 2 mW, λ=650
nm, para el caso de las muestras de azul de metileno y Sanyo DL201S, λ=655 nm, para
los otros casos), cuya radiación es modulada en intensidad por medio de una fuente de
corriente (Thorlabs modelo LDC202B), controlada a través de la salida TTL de un
amplificador Lockin (Stanford Research Systems, Modelo SR830). La radiación
modulada es absorbida a través del volumen de la muestra líquida generando ondas
térmicas que viajan a través de las capas de materiales hasta alcanzar la cámara
fotoacústica en donde se transforman en sonido. La cámara fotoacústica consiste, en
éste caso, de una cavidad cilíndrica practicada en un bloque de latón y la cual se sella,
por su parte superior por una delgada lámina de vidrio (un cubre objetos para
microscopios) sobre el cual se deposita la muestra de interés. Para controlar el grosor de
la muestra líquida el sistema de láser, con óptica de colimación, se montó en una
cavidad cilíndrica movible cubierta en su parte inferior por una placa plana de vidrio
(vidrio de portaobjetos). Se llevaron a cabo las determinaciones de la señal fotoacústica
como función del grosor de la muestra líquida utilizando para ello un tornillo
micrométrico y un paso de 50 micras.
ENTRADA DE SEÑAL
VENTANA Y
SELLADOR
DE LA
CAMARA FA
AMPLIFICADOR LOCKIN (LIA)
DIODO LASER CON OPTICA
CUERPO
DE LA
CELDA
MICRO-
FONO
SALIDA DE CORRIENTE
HAZ LASER
COLIMADO
MUESTRA LIQUIDA
CAMARA FA
SALIDA TTL
ENTRADA DE MODULACION
FUENTE DE CORRIENTE
Fig. 3. Sección Transversal del Arreglo Fotoacústico utilizado
en éste trabajo.
Fig. 4. Vista del sistema fotoacústico real utilizado en este trabajo.
IV. RESULTADOS EXPERIMENTALES.
Se llevaron a cabo diversos estudios a fin de verificar la concordancia entre las
predicciones teóricas y los resultados experimentales, en particular se llevaron a cabo
para éste fin determinaciones térmicas y ópticas de soluciones de azul de metileno en
agua destilada a diversas concentraciones. Se eligió este colorante en virtud de que es
un colorante ampliamente utilizado en aplicaciones biológicas y puede también
adquirirse con facilidad, además de que este colorante tiene una muy buena absorbancia
a una de las longitudes de onda disponibles en el sistema experimental antes descrito
(650 nm). Las concentraciones de este colorante estudiadas en éste trabajo se enlistan en
la Tabla I (columna 1). Se hicieron también estudios preliminares para mostrar el
potencial de ésta nueva metodología para la cuantificación de proteínas (albúmina de
suero bovino), utilizando para esto el método de Bradford para formar complejos con
color azul, y para la cuantificación de clorofilas (muestras de clorofila disponibles
comercialmente). Para éstos dos últimos casos se empleó un láser de semiconductor con
una longitud de onda de 655 nm.
Celda Fotoacústica
Tornillo Micrométrico
Láser de Semiconductor
Fuente de Corriente
Amplificador lockin
TABLA I. Coeficiente de absorción óptica (β) así como difusividades
térmicas (α) para soluciones de azul de metileno en agua destilada,
medidas por medio de los métodos fotoacústicos aquí descritos. αAmp
se refiere a la difusividad térmica medida por medio de la amplitud
fotoacústica mientras que αPh se refiere a la correspondiente
difusividad térmica medida por medio de la fase fotoacústica.
Concentración
del colorante
(mM)
β
(cm-1)
ααααAmp
cm2/s (x 10-2)
ααααPh
cm2/s (x 10-2)
0.1
6.5818
--
--
0.25
15.225
--
--
2.5
--
--
--
10
--
0.138
0.156
100
--
0.142
0.144
El la figura 5 se muestran la fase (5a) y amplitud (5b) de la señal fotoacústica para dos
muestras de azul de metileno a concentraciones de 0.1 mM y 0.25 mM. Como puede
observarse de la figura 5a en un cierto rango de grosores de la muestra la fase
fotoacústica adquiere un comportamiento aproximadamente constante, la amplitud
fotoacústica a su vez (Figura 5b) decrece exponencialmente en el mismo rango de
grosor de muestra. El comportamiento de la fase fotoacústica valida, como se puede
observar, la aproximación para obtener el coeficiente de absorción óptica descrita en el
numeral IIB1. Los correspondientes ajustes a la ecuación (4) se muestran en la figura 5b
en línea continua. Como se apuntó antes las pendientes de las rectas de ajuste son los
coeficientes de absorción ópticos a la longitud de onda empleada para éste caso, los
valores correspondientes se muestran en la figura 5b y se resúmen en la Tabla I,
columna 2. Como se explicó antes β=η(λ)c, de aquí se puede calcular el coeficiente de
absorbitividad molar η(λ), el cual es una propiedad de las moléculas de azul de
metileno, los correspondientes valores para las dos concentraciones estudiadas
resultaron en 65818 cm-1 M-1 para la concentración de 0.1 mM y 60900 cm-1 M-1 para la
concentración de 0.25 mM. Estos valores concuerdan muy bien entre ellos y con el
valor reportado de6 62654 cm-1M-1.
0.03 0.05 0.07 0.09 0.11 0.13
0.03
0.05
0.03 0.05 0.07 0.09 0.11 0.13140
142
144
146
148
150
152
154
156
158
160
162
164
166
b
β=15.2 cm-1
β=6.58 cm-1
Am
plit
ud
(m
V)
Grosor de la muestra (cm)
a
Fase (
Gra
dos)
Fig. 5. Fase (a) y amplitud (b) fotoacústica para dos soluciones de azul de metileno a concentraciones de 0.1 mM (círculos) y 0.25 mM (cuadrados). Las líneas continuas en b representan los ajustes por mínimos cuadrados a la ecuación (5) para obtener el coeficiente de absorción óptico β. Los correspondientes valores de ésta propiedad óptica se muestran en la misma gráfica.
La figura 6 muestra el correspondiente comportamiento de la fase y amplitud para una
muestra de azul de metileno a una concentración de 2.5 mM. A diferencia del caso
anterior para las muestras de 0.1 mM y 0.25 mM la fase fotoacústica en este caso no
permanece constante, indicando en éste caso que la aproximación anterior no es válida.
0.03 0.05 0.07 0.09 0.11 0.130.0001
0.0003
0.0009
0.0025
0.0067
0.0183
0.0498
0.03 0.05 0.07 0.09 0.11 0.13-2.0
-1.5
-1.0
-0.5
0.0
0.5
1.0
1.5
b
m=50.58
Am
plit
ud
(m
V)
Grosor de la muestra (cm)
a
m=41.40
Fase (
rad)
Podría parecer en éste caso que la aproximación para obtener las propiedades térmicas
(numeral IIB2) puede aplicarse entonces, sin embargo, aunque la fase y la amplitud
parecen variar linealmente en éste caso los correspondientes valores de las pendientes
Fig. 6. Fase (a) y amplitud (b) fotoacústica para una solución de azul de metileno con una concentración de 2.5 mM. Las líneas continuas representan los ajustes por mínimos cuadrados a las ecuaciones (8) y (9). Los valores de pendientes tan diferentes muestran que ésta aproximación no es válida en éste caso.
son muy diferentes uno del otro (41.40 para la fase y 50.58 para la amplitud). Se puede
concluir entonces que ésta concentración representa la frontera entre las dos
aproximaciones estudiadas y como consecuencia, si se pretende obtener información
térmica y óptica en éste caso debe de hacerse el análisis sobre la ecuación completa (2).
0.03 0.05 0.07 0.09 0.11 0.13
0.002
0.007
0.018
0.050
0.135
0.03 0.05 0.07 0.09 0.11 0.13-2.0
-1.5
-1.0
-0.5
0.0
0.5
1.0
1.5
2.0
2.5
3.0
bm10 mM
=47.71m
100 mM=47.02
Am
plit
ud
(m
V)
Grosor de la muestra (cm)
a
m10 mM
=44.89m
100 mM=46.72
Fa
se
(ra
d)
Por último en la Figura 7 se muestran la amplitud y fase fotoacústica para dos muestras
de azul de metileno a 10 mM y 100 mM. Se puede observar en éste caso que tanto la
Fig. 7. Fase (a) y amplitud (b) fotoacústica para dos soluciones de azul de metileno a concentraciones de 10 mM (círculos) y 100 mM (cuadrados). Las líneas continuas representan los ajustes por mínimos cuadrados a las ecuaciones (8) para la amplitud y (9) para la fase. Las pendientes de los ajustes correspondientes se muestran en las mismas figuras. Los valores correspondientes de difusividad térmica se resúmen en la Tabla I, columnas 3 y 4.
amplitud como la fase varían de manera lineal en ambos casos. Los ajustes
correspondientes muestran que la aproximación descrita en IIB2 es válida en éste caso,
es decir que las soluciones son suficientemente concentradas para considerarlas
óptimamente opacas. De acuerdo a la aproximación descrita en éste inciso la difusividad
térmica de las muestras puede obtenerse a partir de los ajustes lineales para la amplitud
y fase por medio de las ecuaciones (8) y (9). Los valores de difusividad térmica
obtenidos para éstas muestras se resumen en las columnas 3 y 4 de la Tabla I.
TABLA II. Difusividades térmicas para las
soluciones de azul de metileno aquí estudiadas, en
el límite de absorción superficial, descrito por
Balderas-López y Mandelis.5 ααααAmp y ααααPh se
refieren, respectivamente, a la difusividad térmica
medida por medio del análisis de la amplitud y
fase fotoacústicas.
Concentración
de colorante
(mM)
ααααAmp
cm2/s (x 10-2)
ααααPh
cm2/s (x 10-2)
0.1
0.162
0.142
0.25
0.155
0.149
2.5
0.158
0.144
10
0.147
0.146
100
0.141
0.137
A fin de verificar los resultados obtenidos por medio de ésta aproximación la
difusividad térmica de éstas soluciones se midió utilizando la aproximación de
absorción superficial descrita por Balderas-López y Mandelis. Los resultados se
muestran en la Tabla II. Puede observarse una muy buena correlación entre los
resultados de difusividad térmica obtenidos por medio de las dos metodologías para
soluciones muy concentradas (por medio de la absorción superficial y la absorción de
Beer-Lambert en la aproximación IIB2).
0.00 0.05 0.10 0.1562
63
64
65
66
67
0.00 0.05 0.10 0.15
0.14
a
Fa
se
(G
rad
os)
β=2.69 cm-1
b
Am
plit
ud
(m
V)
Grosor de la muestra (cm)
Para probar la versatilidad de la técnica fotoacústica aquí descrita esta se aplicó para
obtener el coeficiente de absorción óptico de proteínas. Para esto se utilizó albúmina de
suero bovino y el método de Bradford para su coloración. Se preparó en éste caso una
Fig. 8. Fase (a) y amplitud (b) fotoacústica para una solución de albúmina de suero bovino a una concentración de 10 µg/ml. La línea continua en b representa el ajuste por mínimos cuadrados a la ecuación (5) para obtener el coeficiente de absorción óptico, β. El correspondiente valor de ésta propiedad óptica se muestra en la misma gráfica.
solución de dicha sustancia a 10 µg/ml. La amplitud y fase de la señal fotoacústica en
función del grosor de la muestra se llevó a cabo para una longitud de onda de 655 nm.
Los correspondientes comportamientos para la amplitud y fase se muestran en la figura
8. Como para el caso de las muestras de azul de metileno el comportamiento de la fase
(Fig. 8a) nuevamente valida la aproximación para la medición del coeficiente de
absorción óptico en éste caso. El ajuste por mínimos cuadrados correspondiente a la
ecuación (5) se muestra con línea continua en la figura 8b, con el coeficiente de
absorción óptica obtenido a ésta longitud de onda. Conociendo el coeficiente de
absorción óptico en éste caso y la concentración respectiva es posible obtener la
absorvitividad de ésta sustancia, de aquí que para una muestra a una concentración
desconocida de ésta proteína la obtención de β permite la cuantificación de ésta proteína
presente en la muestra.
Por último se llevó a cabo la determinación del coeficiente de absorción óptico a 655
nm para una muestra de clorofilas comerciales (Clorofila líquida, Natural Health) de
concentración desconocida. Se preparó para esto una dilución 50/50 en volumen de la
muestra descrita y se llevaron a cabo los experimentos correspondientes para ésta y la
muestra original. Las correspondientes gráficas se muestran en la Fig. 9. Como antes la
fase fotoacústica (9a) valida la aproximación para obtener el coeficiente de absorción
óptico en ambos casos. Las líneas continuas en la figura 9b corresponden a los ajustes
lineales a la Eq. (5) para la determinación de los coeficientes de absorción ópticos en
éste caso. Los correspondientes valores de ésta propiedad térmica se muestran en la
misma figura. Se puede observar en este caso que los valores de los coeficientes de
absorción ópticos concuerdan bastante bien de acuerdo a las diluciones descritas. Estos
últimos resultados permiten perfilar una metodología sistemática para llevar a cabo la
cuantificación de clorofilas en diversas especies vegetales y la posible utilización de
éstas medidas para llevar a cabo análisis de rendimientos fotosintéticos. La purificación
de los diversos pigmentos puede llevarse a cabo con la ayuda de cromatografías por
columna.
0.04 0.06 0.08 0.10 0.12
0.14
0.37
0.04 0.06 0.08 0.10 0.12
50
52
54
56
58
60
62
64
66
68
70
b
β=5.06 cm-1
β=12.07 cm-1
Am
plit
ud (
mV
)
Grosor de la muestra (cm)
a
Fa
se (
Gra
do
s)
V. CONCLUSIONES.
Se desarrolló el esquema teórico así como el sistema experimental
correspondiente para llevar a cabo la medición de propiedades ópticas y térmicas de
soluciones de colorantes. Se llevaron a cabo pruebas preliminares de ésta nueva
metodología con soluciones de azul de metileno a diferentes concentraciones, para ésta
sustancia se determinó el coeficiente de absorbitividad molar a 650 nm, la cual se
Fig. 9. Fase (a) y amplitud (b) fotoacústica para dos soluciones de una muestra de clorofila comercial. Los círculos representan las señales para una dilución 50/50 en volúmen de la muestra original y los cuadrados la correspondiente señal para la muestra entera. Las líneas continuas en b representan los ajustes por mínimos cuadrados a la ecuación (5) para obtener el coeficiente de absorción óptico, β. Los correspondientes valores de ésta propiedad óptica se muestran en la misma gráfica.
comparó muy bien con el valor correspondiente reportado en la literatura. Se demostró
en éste caso también que la técnica fotoacústica por absorción reportada en éste trabajo
es complementaria a las técnicas usuales por transmisión utilizando un espectrómetro
comercial, ya que en éste caso la relación señal ruido para mediciones confiables
empezó a ser adecuado para concentraciones mayores a 0.1 mM, la cual es el límite
superior para el segundo caso. Se llevaron a cabo también pruebas preliminares para
llevar a cabo la cuantificación de proteínas (albúminas) aplicando el método de
Bradford para colorear éstas, midiendo la absorción a 655 nm. Se llevó a cabo también
un estudio similar a fin de evaluar la potencialidad de ésta nueva metodología para
cuantificar clorofilas. Se ha demostrado en éste trabajo la potencialidad de ésta nueva
metodología fotoacústica para ser utilizada como una técnica de uso corriente para
cuantificar pigmentos en solución, adaptando en cada caso un láser de longitud de onda
apropiada, por ejemplo, si se requiere cuantificar pigmentos de color rojo, tales como
hemoglobina, un láser azul es suficiente. Más aún, adaptando al sistema una fuente de
luz continua así como un monocromador es posible llevar a cabo la cuantificación de
cualquier pigmento así como la construcción de espectros de absorción absolutos, una
característica que hasta ahora con ninguna metodología fotoacústica y muy difícilmente
con técnicas espectrofotométricas convencionales es posible de levar a cabo. Una
característica sobresaliente de ésta nueva metodología es su habilidad de llevar a cabo la
cuantificación sin la necesidad de tener una curva de calibración previa, como es
requerido por las técnicas usuales por transmisión con espectrómetros comerciales.
Por último cabe mencionar que como productos resultantes durante el desarrollo de éste
proyecto se publicaron dos artículos internacionales y se presentaron diversos trabajos
en congresos nacionales e internacionales, como se describe a continuación:
Photoacoustic Methodology for to Measure Thermal and Optical Properties of Dye solutions, J. A. Balderas-López, Rev. Sci. Instrum., 77, 086104 (2006), 4 páginas. Photoacoustic Signal Normalization Method and its Application to the Measurement of the Thermal Diffusivity for Optically Opaque Materials, J. A. Balderas-López, Rev. Sci. Instrum., 77, 064902 (2006), 3 páginas. XXVI Congreso Nacional de la Sociedad Mexicana de Ciencia de Superficies y Vacio.
Pueba, Puebla, México. Período: 25 al 29 de Septiembre de 2006.
*Metodología fotoacústica para la medición de propiedades térmicas y ópticas
de soluciones de colorantes.
*Comparison between photoacoustic methodologies for to measure termal
diffusivity of metals.
14th
International conference on Photothermal and Photoacoustic Phenomena. El
Cairo, Egipto. Período: 6 al 9 de Enero de 2007.
*Self-consistent photoacoustic methodology for thermal effusivity
measurements for liquids
*Photoacoustic methodologies for thermal diffusivity measurements for highly
opaque single-layered materials
*Optical and thermal properties of dye solutions by means of the photoacoustic
technique in the transmission configuration
V Encuentro Nacional de Biotecnología del IPN. México, D. F. Período: 28 y 29 de
Noviembre de 2006.
*Espectroscopia fotoacústica aplicada la cuantificación de clorofilas.
*Espectroscopia fotoacústica aplicada a la cuantificación de pigmentos
VI. REFERENCIAS.
1. Espectroscopías, Alberto Requena y José Zúñiga, Pearson Prentice Hall, España
2004.
2. A. Rosencwaig and A. Gersho. The Photoacoustic effect in solids, J. Appl. Phys.
47, 64 (1976).
3. J. A. Balderas-López and A. Mandelis, Thermal Diffusivity Measurements in the
Photoacoustic Open-Cell Configuration using simple signal Normalization
Techniques. Journal of Applied Physics, 90(5), September (2001) pp. 2273-2279
4. Balderas López, J. A., Photoacoustic Methodology for to Measure Thermal and
Optical Properties of Dye solutions, J. A. Balderas-López, Rev. Sci. Instrum.,
77, 086104 (2006).
5. Balderas López, J. A., and Mandelis, A., Novel Transmission Open Photoacustic
Cell Configuration for Thermal Diffusivity Measurements in liquids, Int. J. of
Thermophys., 23:605-614 (2002).
6. Ver la página web: http://omlc.ogi.edu/spectra/mb/mb-water.html
IMPACTO
Como se apuntó antes esta es la primera metodología fotoacústica mediante la cual es
posible llevar a cabo la determinación de espectros de absorción absolutos de manera
directa. En virtud de que no se requiere la determinación previa de una curva de
calibración para propósitos de cuantificación también ofrece ventajas comparativas
respecto a otras técnicas convencionales basadas en la medición de absorbancia por
medio de espectrómetros comerciales. Por último esta nueva metodología ofrece buenas
perspectivas para la construcción de un espectrómetro fotoacústico con grandes ventajas
en operación respecto a espectrómetros convencionales.
